JP2017529559A - 少なくとも２つの波長範囲を区別する高解像度走査型顕微鏡検査法 - Google Patents

Abstract

高解像度走査型顕微鏡検査法のために、試料（２）は照明放射（５）により励起されて蛍光放射を発する。照明放射（５）は、試料（２）の中又は表面上のある点で合焦して回折限界照明スポット（１４）を形成する。この点は、空間解像度を有する２次元検出器（１９）上に回折像（１７）として回折限界様式で結像される。２次元検出器（１９）は、回折像（１７）の回折構造を解像する空間解像度を有する。試料（２）は、照明スポット（１４）の直径の半分より小さい増分の異なる走査位置によって走査される。２次元検出器（１９）のデータ及びそれらのデータに割り当てられた走査位置から、試料（２）の画像が結像の解像限界を超えて高められた解像度で生成される。試料（２）の蛍光放射における少なくも２つの所定の波長範囲を区別するために、少なくとも２つの所定の波長範囲に対応する多数のエアリーディスク（３０−３３）が、２次元検出器（１９）の上に生成される。これらのエアリーディスクは、回折像（１７）が相互にずれたエアリーディスク（３０−３３）から成るように外側方向に相互にずらされ、エアリーディスク（３０−３３）は、試料（２）の画像を生成する際に評価される。

Description

本発明は、試料の高解像度走査型顕微鏡検査のための方法に関する。試料は、照明放射によって励起されて蛍光放射を発する。照明放射は、試料の中又は表面上のある点で合焦して回折限界照明スポットを形成する。この点は、空間解像度を有する２次元検出器上に回折像として回折限界様式で結像される。２次元検出器は、回折像の回折構造を解像する空間解像度を有する。この点は、試料に関して、照明スポットの直径の半分より小さい増分で異なる走査位置に移動される。２次元検出器が読み取られ、当該２次元検出器のデータ及びそれらのデータに割り当てられた走査位置から、試料の画像が結像の解像限界を超えて高められた解像度で生成される。

本発明はさらに、高解像度走査型顕微鏡検査のための顕微鏡に関する。顕微鏡は、励起されて蛍光放射を発することのできる試料を受けるための試料空間と、試料空間内にある焦点面及び解像限界を含むレンズシステムと、照明放射を受ける入力部を含み、試料空間を照明放射によってレンズシステムを介して照明するための照明装置であって、レンズシステムは、照明放射を焦点面内のある点における回折限界照明スポットに合焦させる、照明装置と、焦点面内の点を、レンズシステムを通じて、焦点面と共役である検出器平面内にある空間解像度を有する２次元検出器上に、回折像として回折限界様式で結像するための結像装置であって、２次元検出器は、回折像の回折構造を解像する空間解像度を有する、結像装置と、その点を、照明スポットの直径の半分より小さい増分で異なる走査位置に移動させる走査装置と、２次元検出器を読み取り、当該２次元検出器のデータ及びそれらのデータに割り当てられた走査位置から、回折像の回折構造を評価して、試料の画像を解像限界を超えて高められた解像度で生成するための評価装置と、を含む。

生体標本を検査するための光学顕微鏡検査法の古典的な利用分野は、蛍光顕微鏡検査である。そこでは、特定の染料（いわゆる蛍光体又は蛍光色素分子）が試料（例えば細胞の一部）の個別のラベリングに使用される。試料は励起放射を表す照明放射で照明され、それによって励起された発光放射が適当な検出器で検出される。この手順により、顕微鏡内において、細胞の中の異なる染色が施された個々の部分を解像することが可能である。もちろん、標本の幾つかの部分を、その標本の異なる構造に個別に結び付けられる異なる染料で同時に染色することもできる。この方法は、マルチプルルミネッセンスと呼ばれる。それ自体が発光するために染料の添加が不要な試料も検査することができる。

ここで、一般的に当てはまるように、発光とは、燐光及び蛍光の一般的な用語であると理解され、したがって両プロセスのいずれも含まれる。本明細書で蛍光に言及するとき、これは全体を表すものであり、限定的とは理解されないものとする。

試料の検査には、レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭとも省略される）を使用することも知られている。レーザ走査型顕微鏡は、共焦点検出装置によって（そしてこれは共焦点ＬＳＭと呼ばれる）、又は非線形試料相互作用（いわゆる多光子励起顕微鏡検査法）によって、対物レンズの焦点面内にある平面だけを結像する。断面が光学的に取得され、試料内の異なる深さにおける幾つかの断面を記録することによって、試料の異なる光学断面から構成される３次元画像を生成することが可能になる。それゆえ、レーザ走査型顕微鏡検査法は、厚みのある標本の検査に適している。当然のことながら、蛍光顕微鏡検査法とレーザ走査型顕微鏡検査法との複合型も使用され、その場合、ＬＳＭを援用して蛍光試料が異なる深さの平面内で結像される。

原則として、光学顕微鏡の光学解像度には、ＬＳＭのそれを含めて、物理法則による回折限界が存在する。本明細書においては、「高解像度」という用語は、回折限界を超える解像度のために使用される。

特許文献１には、「オーバサンプリング」によって解像度を高める試みが記載されている。これは、顕微鏡の回折限界未満の大きな解像度の改善にはつながらない。

非線形デポピュレーションプロセスを援用すると、解像度を、回折限界共焦点ＬＳＭと比較して１０倍まで高めることができる。このような方法は、例えば特許文献２に記載されている。デポピュレーションプロセスのための種々の手法が知られており、例えば、特許文献３、特許文献４、又は特許文献５に記載されている。

更なる高解像度顕微鏡検査法が、特許文献６に記載されている。この場合、物体は周期的構造によって走査される。解像度を高めるための同様の方法が、特許文献７に記載されている。構造化照明は、非線形プロセス、例えば飽和蛍光を利用する。この方法では、画像生成のための再構成アルゴリズムと、１枚の画像のための複数の撮影の使用とが必要になる。

広視野で高解像度を実現する方法が、特許文献８及び特許文献９から知られている。この方法は、ＰＡＬＭ（Ｐｈｏｔｏ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）と略され、光学活性化信号によって活性化できる標識物質を使用する。標識物質だけが励起放射により励起可能であり、活性化された状態の特定の蛍光放射を発する。活性化は、活性化された標識分子のうちの少なくとも特定の割合が隣接する活性化分子から離間され、それによってこれらの標識分子が分離され、区別され、又はその後、顕微鏡検査法の光学解像度の範囲内で区別できるような方法で実行される。蛍光放射を捕捉した後、解像限界によって生成されるこれらの孤立分子の放射分布の中心が判断され、そこから、光学イメージングによって実際に可能となる場合よりも高い精度で分子の位置が計算される。試料全体を画像化するために、活性化放射の導入による小集合内の標識分子の分離と、その後の励起及び蛍光放射の結像が、標識分子のできるだけすべてが小集合に含められ、それまでに分離されるまで繰り返される。

更なる高解像度方式が、非特許文献１に記載されている。

冒頭に記載した種類の方法及び顕微鏡は、特許文献１０から知られている。この文献では、その中で図５に示されて記載されている実施形態において、試料の回折限界照明を２次元検出器と組み合わせている。ここでは、走査装置は、照明スポットによって照明される点の回折像が２次元検出器上で動かないように構成されている。この配置は、いわゆる「デスキャン」検出器配置と呼ばれている。これは通常、ビーム経路を偏向させるスキャナを、試料と、照明装置及び結像装置の合流点との間に配置することによって達成される。そうすると、このようなスキャナは、照明スポット及び照明スポットで照明される点の回折限界像の両方に作用し、その結果、スキャナ以降の結像方向へのビーム経路は移動しない。このようなスキャナの代替案は、試料を移動させる可動式サンプルステージである。そうすると同様に、回折像は２次元検出器上で移動しない。特許文献１０の方式では、
２次元検出器に空間解像度が提供され、これは画像拡大という意味において回折像をオーバサンプリングし、それゆえ、回折像の回折構造を解像する。

特許文献１０は、色分析が可能な実施形態を提供する。このために、幾つかの検出器が設けられ、これらはダイクロイックカラースプリッタによって形成される、それぞれに対応するスペクトルチャネル内にある。これまでしばらく、この方式はレーザ走査型顕微鏡検査法から知られていた。しかしながら、これには、各色チャネルについて、対応する検出器を有する１つの色スプリッタが必要になるという欠点がある。共焦点ピンホールダイアフラム（いわゆるピンホール）の背後にある空間解像度を持たない検出器を使用する従来のレーザ走査型顕微鏡検査法の場合、この要求事項は非常に簡単であるが、特許文献１０によるオーバサンプリング２次元検出器の場合、特にこのような２次元検出器が高価であることから、コストが大幅に増大する。それに加えて、特許文献１０によるオーバサンプリングの原理においては、これらの幾つかの２次元検出器をサブピクセルレベルで相互に正確に整列させなければならず、これはそうしないと、個々の色チャネル内で生成された画像間に色収差が発生し、これによって、［高解像度画像の場合］、照明スポットの直径に関して小さいステップで移動される各走査位置に関する２次元検出器のデータがずれる。すべての色チャネル内で２次元検出器が光軸とサブピクセルレベルまで正確に整列されたときにのみ、個々の色チャネルの画像を重畳させることができる。

米国特許第５０４３５７０号 米国特許第５８６６９１１号 独国特許第４４１６５５８Ｃ２号 米国特許第６６３３４３２号 独国特許出願公開第１０３２５４６０Ａ１号 米国特許第５８６７６０４号 欧州特許第１１５７２９７Ｂ１号 国際公開第２００６１２７６９２号 独国特許出願第１０２００６０２１３１７号 欧州特許出願公開第２３１７３６２Ａ１号

Ｈｅｌｌ，"Ｆａｒ−Ｆｉｅｌｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｎａｎｏｓｃｏｐｙ"，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６，１１５３−１１５８，２００７

したがって、本発明の目的は、色情報を取得可能であると共に、幾つかの色チャネルに必要な調整を軽減させ、又はさらには不要にするような方法で、冒頭に記載した種類の方法及び顕微鏡を開発することである。

この目的は、本発明によれば、試料の高解像度走査型顕微鏡検査のための方法によって達成される。試料は、照明放射によって励起されて蛍光放射を発する。照明放射は、試料の中又は表面上のある点で合焦して回折限界照明スポットを形成する。この点は、空間解像度を有する２次元検出器上に回折像として回折限界様式で結像される。２次元検出器は、回折像の回折構造を解像する空間解像度を有する。この点は、試料に関して、照明スポットの直径の半分より小さい増分で異なる走査位置に移動される。２次元検出器が読み取られ、当該２次元検出器のデータ及びそれらのデータに割り当てられた走査位置から、試料の画像が結像の解像限界を超えて高められた解像度で生成される。試料の蛍光放射における少なくとも２つの所定の波長範囲を区別するために、少なくとも２つの所定の波長範囲に対応する数の多数のエアリーディスクが、２次元検出器上に波長選択要素によって生成される。これらのエアリーディスクは、回折像が相互にずれたエアリーディスクから成るように外側方向に相互にずらされる。エアリーディスクは、完全に２次元検出器上にある。エアリーディスクは、試料の画像を生成する際に評価される。

この目的はさらに、高解像度走査型顕微鏡検査のための顕微鏡によっても達成される。顕微鏡は、励起されて蛍光放射を発することのできる試料を受けるための試料空間と、試料空間内にある焦点面及び解像限界を含むレンズシステムと、照明放射を受ける入力部を含み、試料空間を照明放射によってレンズシステムを介して照明するための照明装置であって、レンズシステムは、照明放射を焦点面内のある点における回折限界照明スポットに合焦させる、照明装置と、焦点面内のその点を、レンズシステムを通じて、焦点面と共役である検出器平面内にある空間解像度を有する２次元検出器上に、回折像として回折限界様式で結像するための結像装置であって、２次元検出器は、回折像の回折構造を解像する空間解像度を有する、結像装置と、その点を、照明スポットの直径の半分より小さい増分で異なる走査位置に移動させる走査装置と、２次元検出器を読み取り、当該２次元検出器のデータ及びそれらのデータに割り当てられた走査位置から、回折像の回折構造を評価して、試料の画像を解像限界を超えて高められた解像度で生成するための評価装置と、を含む。試料の蛍光放射内の少なくとも２つの所定の波長範囲を区別するために、顕微鏡は、少なくとも２つの所定の波長範囲に対応する多数のエアリーディスクを２次元検出器上に生成する波長選択要素を含む。これらのエアリーディスクは、外側方向に相互にずらされて回折像が相互にずれたエアリーディスクから成るようになっている。２次元検出器及び波長選択要素は、エアリーディスクが完全に２次元検出器上にあるように形成される。評価装置は、試料の画像を生成する際に、エアリーディスクを評価する。

本発明は、回折像が、検出器上で、相互に移動される少なくとも２つのエアリーディスクに分割され、唯一つの２次元検出器から、解像度の向上及びスペクトル画像情報の増大を同時に実現する。その目的のために、波長選択要素が使用される。各エアリーディスクについて、１つの波長範囲（色チャネルとも呼ばれる）が割り当てられる。

それゆえ、この方法及び顕微鏡により、少なくとも２つの波長範囲を区別することが可能になる。ＬＳＭの場合のように、試料の画像は、試料をスポットで走査し、各々が特定の走査場所、すなわち特定の走査位置に割り当てられる複数の個々の画像フレームを取り込むことによって得られる。

円形アパーチャにおける光ビームの回折は、エアリーディスクを生成させる。中心極大点、すなわちエアリーディスクが現れ、これは放射強度がより低くかつ減少するリングによって取り囲まれる。たとえ幾何光学の法則により完璧である、それゆえ結像エラーのない顕微鏡であっても、アパーチャにおける光の回折により、点を正確にある点の上に結像させることはできず、ぼけたスポットにしか結像できない。これは回折限界結像と呼ばれる。同じことが、ある点の回折限界照明にも当てはまる。古典的な幾何光学において、２つの点は、回折像内のその画像の極大点が少なくともエアリーディスクの半径ｒだけ相互に離れているときに、いわゆるレイリー基準にしたがって分離することができる。スポットの形状はアパーチャの形状に依存し、特にスポットの大きさはアパーチャの大きさに反比例する。エアリーディスクの大きさは、ｒ＝約０．６０９８である第１種ベッセル関数の第１の零点から得られる。エアリーディスク（すなわち、中心回折スポット）は、英国の天文学者、Ｇｅｏｒｇｅ Ｂｉｄｄｅｌｌ Ａｉｒｙ（ジョージ・ビデル・エアリー）から名付けられている。走査型顕微鏡では、アパーチャが円形であり、照明及び結像のどちらにおいても、レンズシステムの丸いフレームによって画定される。エアリーディスクの大きさは波長にも依存するため、励起放射として機能する回折限界照明の場合のほうが、蛍光放射の場合よりも小さい。なぜならば、蛍光放射ではストークスシフトが生じ、すなわち波長がより長いからである。

ここで、「回折限界」という用語は、アッベ理論による回折限界に限定されることは意図されず、理論的極大点が実際の不足や制約によって２０％失われるケースもカバーするものと意図される。そうすると同様に、個々の画像は、本明細書で回折構造と呼ばれる構造を有し、これはオーバサンプリングされる。

できるだけ経済的な検出器で動作させるために、本発明の１つの実施形態では、エアリーディスクは、重複するが相互を完全にはカバーしない。重複する領域は、好ましくは、各エアリーディスクの中心が他のエアリーディスクの外にあるようにするべきである。これは、２つのエアリーディスクの場合、その中心が２次元検出器の上の他方のエアリーディスクによってカバーされない領域にあることを意味する。幾つかのエアリーディスクの場合、これは各エアリーディスクに当てはまる。この要求事項は、特に４つのエアリーディスクまで容易に満たすことができる。

検出器の大きさは、波長選択要素が、相互にずれたエアリーディスクが同じ大きさとなるように彩色的であると、できるだけ小さく保てる。上記のようにエアリーディスクの大きさが波長に依存するため、これには波長選択要素が、より短い波長範囲のエアリーディスクについて、より長い波長範囲のエアリーディスクの大きさを縮小するような適正な大きさ補正を実行することが必要であった。このような色補正が行われなければ、個々の波長範囲に割り当てられるエアリーディスクの大きさは異なるものになる。これは好ましくは、隣接するエアリーディスクを外側方向にずらして、エアリーディスクの中心を分離すること、すなわち、それらが他のエアリーディスクの中に入らないようにすることによって補償されてもよい。

波長範囲ごとのエアリーディスクは、様々な方法で生成できる。第１の選択肢では、波長選択要素又はスペクトル分離は、照明放射も案内するビーム経路の部分の中ではなく、２次元検出器の前で実行される。そうすると、結像放射はビーム経路を通って波長選択要素に至り、これが回折像を個々の波長のエアリーディスクに分離する。第２の選択肢では、スペクトル分離は照明又は照明装置の中で行われ、その結果、結像はスペクトル分離の影響を受けない。このようにして、照明スポットは、試料の中で直接、外側方向に相互にずれた複数のエアリーディスクの形状を得る。

第１の選択肢では、スペクトル分離は試料の蛍光にのみ作用する。第２の選択肢では、スペクトル分離は試料の励起にのみ作用する。それゆえ、第１の選択肢は、試料における異なる色の蛍光を発する色チャネルを分離する。それに対して、第２の選択肢は、試料における異なる波長範囲で励起可能な成分を区別する。両方の選択肢に共通しているのは、波長選択要素がビーム経路の中の結像又は照明の両方ではなく、いずれかのみで照射される部分の中にあることである。そこからの変形として、ビーム経路の共通の部分にその要素を配置することも可能である。

本発明の中核は、２次元検出器上のエアリーディスクの位置を通じて、波長範囲を空間的に区別することにある。画像は２次元検出器上で移動しないため（いわゆるデスキャン型装置）、色チャネルとも呼ばれる個々の波長範囲に割り当てられたエアリーディスクの位置がわかり、画像生成中に、同時に捕捉された波長範囲を分離することが可能である。このようにして、単一の２次元検出器だけを使って、複数の色チャネルを同時に補足できる。

欧州特許出願公開第２３１７３６２Ａ１号による再構成方法は、試料内の個々の点の各々に関する複数の測定値を利用するため、照明スポットの大きさより小さい増分で走査が移動することから、過剰決定性によって連立方程式を立てて解くことがでる。その結果、個々の点に関する位置及び強度が高い解像度で得られるだけでなく、波長範囲、すなわち色も得られる。

本発明の特に有利な改良型において、相互に移動されるエアリーディスクの位置を、割り当てられた波長範囲について、調整可能な波長選択要素によって調整することができる。このようにして、色チャネルは、所望の波長範囲が区別されるように調整することができる。

また、本発明の方式は、レーザ走査型顕微鏡検査法について一般に知られているように、幾つかのスポットに関して同時に並列に実行することができる。そうすると、試料上で幾つかのスポットが走査され、幾つかのスポットの個々の像は依然として検出面内で相互に隣り合わせで存在する。以下の説明は、例として、１点スポットでの走査に焦点を当てる。しかしながら、これは限定のつもりではなく、説明されている特徴及び原理はまた、複数点スポットの並列走査及び線状スポットの使用にも同様に当てはまる。後者はもちろん、線の延長についてのみ回折限界があり、その結果、この説明の特徴は１方向（線の延長を横切る方向）にのみ当てはまる。

試料の所望の領域の結像は、従来のＬＳＭのように走査によって行われる。照明及び結像並びにそれらに対応する装置が光学走査装置を共有しており、これは照明スポットを試料上で案内し、それと同時に試料が結像され、照明スポットと再び検出器に関して一致する点をデスキャンするため、ズームレンズは照明及び結像装置の共通ビーム部分に設置することができる。これによって、回折像を２次元検出器の大きさと一致させ、さらに、入手可能な照明放射を完全に、損失なく、異なる対物レンズを選択する際に変わりえる対物レンズ瞳に結合することができる。

個々の画像の回折構造を解像することはさらに、試料の走査中にスポットが移動される移動方向を判断することを可能にする。この移動方向は原則として、スキャナの機構（例えば、走査ミラー又は可動式サンプルステージ）からわかるが、機械系に起因する残留不確実性が残るかもしれない。これらは、検出器アレイの個々のピクセルの信号が相互相関によって評価されることで排除することができる。ここで、照明されたスポットの回折限界結像により、試料内で相互に隣り合わせで存在する画像ピクセルはある程度まで重複し、その中心は相互に隣にあるという事実が利用される。このような画像ピクセルの信号が相互相関マッチングされる場合、走査機構の不可避的な誤差によって残る残留不確実性を減少させ、又は完全に排除することができる。

ある方法が本明細書で説明されるかぎり、顕微鏡の動作中に制御装置がこれらの方法ステップを実現する。

上述の特徴及び以下に説明する特徴は、記載されている組合せでのみ使用することができるのではなく、他の組合せ又は単独でも使用することができ、それらも本発明の主旨と範囲から逸脱しないと理解するべきである。

以下に更に詳しく、例として、同じく本発明にとって重要な特徴を開示している添付の図面を参照しながら、本発明を説明する。

高解像度顕微鏡検査のためのレーザ走査型顕微鏡の概略図である。 図１の顕微鏡の中で使用される２次元検出器の拡大図である。 種々の実施形態における、図１の顕微鏡を動作させた際に２次元検出器で生じる回折像を示す。 図１の顕微鏡の実施形態における、試料を照明したときに生じる照明回折像を示す。

図１は、試料２の顕微鏡検査用に構成されたレーザ走査型顕微鏡１を概略的に示している。レーザ走査型顕微鏡１（以下、ＬＳＭと略す）は、制御装置Ｃによって制御され、照明ビーム経路３及び結像ビーム経路４を含む。照明ビーム経路は試料２の中のスポットを照明し、結像ビーム経路４は、このスポットを検出のために回折限界の様式で結像する。照明ビーム経路３及び結像ビーム経路４は、レンズシステムを共有する。

ＬＳＭ１は、オプションの偏向ミラー６及びレンズ７を介してミラー８へと案内されるレーザビーム５によって、試料２を照明する。ミラー８によって、レーザビーム５は、確実に結合要素（例えばエミッションフィルタ９）に反射角で入射する。より明瞭に示すために、レーザビーム５の主軸のみが示されている。

エミッションフィルタ９で反射された後、レーザビーム５は、スキャナ１０によって２軸で偏向され、レンズ１１及び１２によって対物レンズ１３を通り、試料２内の焦点面２９に回折限界照明スポット１４として合焦される。図１の表現では、照明スポット１４は点状であるが、線形照明スポットも同様に使用可能である。照明スポット１４の場所（例えば、点）で励起された蛍光放射が、焦点面２９から出て対物レンズ１３、レンズ１２及び１１を介してスキャナ１０に戻るように案内され、その後再び結像方向に向かわない光ビームが存在する。このビームは、エミッションフィルタ９を通過する。エミッションフィルタ９は、ここではさらに照明スポット１４の蛍光放射をその波長に関して選択し、例えば励起放射の役割を果たすレーザビーム５の照明放射を遮断する機能を有する。最終的に、レンズ１６によって、照明スポット１４のロケーションが検出面１８内にある回折限界回折像１７に確実に結像される。検出面１８は、試料２内の照明スポット１４がその中に存在する焦点面２９と共役の平面である。

照明スポット１４の回折像１７は、検出面１８内で２次元検出器１９によって捕捉される。２次元検出器１９の例示的設計を、以下に図２を参照しながらより詳しく説明する。ここで重要なのは、検出面１８において、２次元検出器１９がスポット１４の回折限界像１７を空間的に解像し、したがってオーバサンプリングすることである。

制御装置Ｃは、ＬＳＭ１のすべての構成要素、特にスキャナ１０及び２次元検出器１９を制御する。制御装置は、個々の像１７の各々のデータを異なる走査位置について捕捉し、各像の回折構造を分析し、試料２の高解像度の全体像を生成する。

図１のＬＳＭ１は、試料上で走査される単一の照明スポット１４を使用する実施形態において示されている。しかしながら、実施形態はまた、例えば図１の図面の平面に垂直に延びる線状照明スポットによる走査にも使用できる。図１のＬＳＭ１を、試料内の相互に隣り合わせで存在する幾つかの点状照明スポットが走査されるような方法で設計することも可能である。その場合、検出面１８において、対応する回折像１７も同様に相互に隣り合わせに存在する。その場合、２次元検出器１９は、検出面１８内で相互に隣り合わせで存在する回折像１７を検出するために適正に設計される。

図２は、２次元検出器１９の拡大図を示している。これは検出器アレイ２４への供給を行う光ファイバ束２０を特徴とする。光ファイバ束２０は、個々の光ファイバ２１によって構成される。光ファイバ２１の端は、光ファイバ束の入力部２２を形成し、検出面１８の中にある。それゆえ、光ファイバ２１の個々の端はピクセルを表し、それによって照明スポット１４の回折像１７が捕捉される。図１の実施形態では、照明スポット１４が一例として点状スポットであるため、回折像１７はエアリーディスクであり、その範囲は図１及び図２の検出面１８を表す円の中にある。言及すべき点として、図１ではこの点が簡略化されている。光ファイバ束の入力部２２の範囲は広く、回折像の範囲をカバーする。その出力部において、光ファイバ束２０内の個々の光ファイバ２１は、光ファイバ束の入力部２２における配置とは異なる幾何学的配置に再配置される。すなわち、光ファイバ２１の出力側の端は、相互に隣り合わせに存在する長いコネクタ２３の形状に再配置される。コネクタ２３は、検出器の行２４の幾何学的配置と一致するように形成され、すなわち、光ファイバ２１の出力側の各端は、検出器の行２４のピクセル２５の真正面に存在する。

言及すべき点として、図２による２次元検出器１９の設計は純粋に例示にすぎない。原則として、顕微鏡１には１つの２次元検出器１９があれば十分であり、２次元検出器１９は、照明スポット１４によって照明された点の回折限界結像によって焦点面２９内に生成される回折像１７を、検出面１８においてオーバサンプリングする。特に、２次元検出器１９は、後述の図４〜６の場合のように、検出面１８の中の長方形の検出面とすることもできる。

顕微鏡１の説明の中で、要素１５についてはまだ述べられていなかった。これは波長選択要素であり、結像装置４又は照明装置３の中にある。照明装置３の中に配置する場合について、図１では波長選択要素を破線でのみ示している。以下において、まず、結像装置４の中の波長選択要素１５の効果及び構成について説明する。

波長選択要素１５がないと、照明スポット１４によって照明された点の焦点面２９における回折限界結像により、割り当てられた共役検出面１８に回折像１７が生成される。この像は、対物レンズ１３のアパーチャが円形であることから、エアリーディスクである。このようなエアリーディスクの形成については、説明の概説部分ですでに述べた。欧州特許出願公開第２３１７３６２Ａ１号に記載されている顕微鏡検査法の場合、回折像１７の構造はオーバサンプリングによって分析され、照明スポット１４の最小寸法と比較して小さい増分での走査位置に関連して、回折限界結像の解像限界を超える構造判断が行われる。これを理解するために、焦点面２９において相互に近く存在するために、それらが回折限界解像度内では解像できないような２つの場所を見てもよい。（この理論上の実験においては円形の）照明スポットの直径と比較して小さい増分で照明スポット１４を走査するとき、２つの場所の一方が先に照明スポットに入る。回折像１７の放射強度は、この第１の場所が照明スポット１４に入るとさらに増大する。その回折限界特性に起因して、照明スポット１４の強度は中心に向かって増大する。それゆえ、回折像１４における放射強度は、観察されている第１の場所が照明スポット１４の中心へと進む程度に応じて増大する。観察されている場所が照明スポット１４の中心を通過してそこから離れると、この第１の位置からの放射の強度は再び減少する。理論的に想定される第２の場所が隣接していなければ、回折像１７の放射強度は再び減少する。ここで、回折像１７における放射強度の増減は、照明スポット１４の照明強度の過程と正確に対応する（増分と第１の場所の蛍光感度とを考慮に入れる）。しかしながら、第２の場所が近接して存在するため、この第２の場所も同様に蛍光放射を回折像１７へと提供し始め、実際に第２の場所が照明スポット１４の中心に近いほど多くなる。それとは別に、もちろん、第１の場所に当てはまるのと全く同じことが第２の場所にも当てはまる。その結果、回折像１７の照明強度がステップ位置について得られ、これらは１つの発光場所しかない場合に発生する強度とは異なる。それゆえ、２次元検出器１９のデータの評価を通じて、実際の走査位置を考慮した上で、焦点面２９の中で２つの場所が発光していたこと、及びその間隔を数学的に判断できるが、これら２つの場所は回折限界解像度内では分解できなかったものである。当業者であれば、複数の走査位置に関する２次元検出器１９のデータを評価するための実現方法を知っている。その場合、幾つかの未知数、特に焦点面２９内の場所の強度及び間隔を含む方程式を立てることができる。複数の走査位置があるため、連立方程式が得られ、これは過剰決定状態であり、それによって発光位置の放射強度及び間隔、すなわち位置もまた計算することができる。これを以下に説明する。

高解像度顕微鏡検査法のこの原理は、顕微鏡１によって、波長選択要素１５が、２つの波長範囲（色チャネル）について、相互に移動された２つのエアリーディスクが形成されるように、焦点面２９と共役の検出面１８内の回折像１７を変化させるという点で改善される。そこで、回折像は図３に示される状況によって得られる。例として、ピクセル２２の正方形のアレイとして示されている２次元検出器１９上に、相互に移動された２つのエアリーディスク３０、３１が存在し、第１のエアリーディスク３０が第１の色チャネルに割り当てられ、第２のエアリーディスク３１が第２の色チャネルに割り当てられる。これらの色チャネルの波長範囲は波長選択要素によって画定され、これはしたがって、ある実施形態においては、所定の色チャネル（波長範囲）と一致するように選択される。ある実施形態においては、エアリーディスク３０、３１は、それらの中心（大きい丸い点で表示される）がそれぞれ他方のエアリーディスクの重複領域の外に存在するように、相互にずらされる。

エアリーディスク３０及び３１の組合せは回折像１７であり、すなわち、エアリーディスクは顕微鏡検査中に空間的に移動しない。欧州特許出願公開第２３１７３６２Ａ１による顕微鏡においては１つのエアリーディスクであった回折像１７は、今度は２つのエアリーディスク３０及び３１に置き換えられる。

焦点面２９の中にあって相互に近く、回折限界結像自体では解像できない間隔で離間された２つの場所を再び見ると、顕微鏡１では波長選択要素１５によって以下のような挙動が起こる。すなわち、第１の位置が、エアリーディスク３０が割り当てられた第１の色チャネル内で発光し、第２の位置が、エアリーディスク３１が割り当てられた第２の色チャネル内で発光すると仮定すると、照明スポット１４が第１の場所をカバーするとすぐに、第１のエアリーディスク３０が回折像１７内で明るくなり始める。これに対して、第２のエアリーディスク３１は、第２の位置もまた照明スポット１４によって照明されないかぎり、第２の色チャネルには放射が入らないため、暗いままである。エアリーディスク３０の強度は、第１の位置が照明スポット１４の中心によってカバーされるまで増大し、第１の色チャネルのエアリーディスク３０の強度は極大点になる。同様のことが、エアリーディスク３１と第２の色チャネル及び第２の位置にも当てはまる。その結果、２つの場所が照明スポット１４によって提供されるために、第１のエアリーディスク３１の明化及び再度の褪色と、それより幾分遅れて発生する第２のエアリーディスク３１の明化及び褪色とが観察される。

走査位置と組み合わされた２次元検出器１９のデータの評価により、各走査位置に関して方程式を立てることができる。これは、２つの位置及び蛍光強度だけでなく、第１又は第２の場所が第１又は第２の色チャネルについて、（割当は事前にはわかっていない）限定するか否かに関する表明も含む。複数の走査位置によって再び、過剰決定状態の連立方程式が立てられ、これによってさらに、発光場所を２つの色チャネルのうちの一方に割り当てることが可能になる。

このようにして、顕微鏡１及び割り当てられた顕微鏡検査法では、高解像度画像の中の２つの波長範囲（色チャネル）を区別し、２色の画像を得ることができ、追加の検出器は不要である。

エアリーディスク３０及び３１の間の間隔は顕微鏡検査中に一定であることが強調され、特に間隔はいずれの色情報も増減させない。それによって確実になるのは、エアリーディスク３０及び３１が完全には相互に重複しないことであり、なぜなら、そうしなければこれらは区別できないからである。

もちろん、エアリーディスクを分離して、重複しないようにすることも可能である。しかしながら、そうすると比較的大きい検出器が必要になる。

図３に示される波長選択要素１５の実施形態において、エアリーディスク３０及び３１は同じ直径を有している。しかしながら、説明の概説部分で、エアリーディスクの大きさは波長に依存すると述べた。したがって、実際には、より短い波長のエアリーディスク（例えばエアリディスク３０）の直径は、より長い波長のエアリーディスク（例えばエアディスク３１）の直径より大きくなるであろう。この状況は図４にも示されている。これは図３の場合には当てはまらない。なぜならば、波長選択要素１５が放射分割中に色補償を行って、エアリーディスク３０及び３１がそれらの色チャネルの違いに関わらず同じ大きさとなるようにするからである。

上記の方法は、２つの波長範囲（色チャネル）の使用のみに限定されない。図５は第３の色チャネル３１の構成を示し、図６ではさらに第４の色チャネル３３が存在する。説明文の概説部分に記した説明は、ここでも同様に等しく当てはまる。幾つかの色チャネルが使用可能であり、なぜならば得られる連立方程式が、複数の走査位置によって別の未知数、例えば色チャネルの影響があるため、過剰決定状態であるからである。

ここまでの説明では、波長選択要素１５が結像装置４の中、それゆえビーム経路の中の、結像のためだけに機能する部分の中にあると仮定した。換言すれば、この実施形態において、波長選択要素１５には照明放射が入らない。それゆえ、波長選択要素１５によってエアリーディスクの相互の移動を通じて生成される色チャネルは、発光する試料の色チャネルである。顕微鏡又は顕微鏡検査法のこれらの実施形態は、発光放射をその波長範囲（色チャネル）について区別する。

しかしながら、波長選択要素１５はまた、照明装置３の中にも配置できる。この配置は図１において破線で示されている。そうすると、波長選択要素は、ビーム経路の中の照明放射だけが入る領域内にあり、これはそれゆえ、結像ではなく照明にのみ作用する。その場合、波長選択要素１５は、照明スポット１４を、図７に示されるように、２つの照明エアリーディスク３４、３５に分割する。それゆえ、照明ビーム経路の中にある波長選択要素１５は、照明色チャネルを作る。これに対して、結像ビーム経路内の波長選択要素１５の配置は、検出色チャネルを生成するものであった。それによって、試料はもはや、例えば１つのエアリーディスクによって照明されなくなり、相互にずれている２つの照明エアリーディスク３４及び３５によって照明される。その結果、図３のような状況が２次元検出器１９上で得られる。しかしながら、エアリーディスク３０及び３１は、今度は蛍光放射、すなわち試料２の蛍光反応の異なる色チャネルに対応しなくなり、その代わりに励起の異なる色チャネル、すなわち試料２の蛍光感度に対応する。それ以外の、結像装置４の中に波長選択要素１５を配置した場合についての図３〜６で説明した変形型はすべて、照明装置３の中に波長選択要素１５を配置した代替案にも同様に使用できる。しかしながら、幾何学的位置が異なることから、結像装置４の中に配置される波長選択要素１５の設計は一般に、照明装置３の中に配置した場合とは異なって見えるであろう。原則として、色効果を有する複数の要素については、波長選択要素１５、例えば、ウェッジ、プリズム、ミラー、又はダブレットレンズが問題となる。

上述の代替案からの変形型では、波長選択要素１５を、ビーム経路の中の照明と結像の両方が通過する部分に設置することもでき、又は２つの波長選択要素１５が使用される。このようにして、１つの波長で２つの染料を同時に励起している間のクロストークを抑制することができる。それに加えて、これによって較正のための測定の可能性が開ける。

照明装置３の中に波長選択要素１５を配置することによって、２つ以上の照明色チャネルで照明されると、より短い照明波長が、より長い波長の照明によって刺激された蛍光の波長範囲内の蛍光信号を刺激するというケースが生じえる。その結果として、構造のうちの１つが再び、移動された影像として現れるであろう。適当な相関計算によって影像部分を判断して排除することができる。

図３及び図４による実施形態は、エアリーディスクを２次元検出器１９の対角線に沿って移動させることが好ましいことを示している。これは、そのようにするとその表面を最大限に利用できるからである。

例として、図２に示されるように光ファイバを有する２次元検出器１９を使用する際、２つのエアリーディスクの重複しない領域が、できるだけ相互に隣り合っていない検出器の要素に案内されるように、すなわちエアリーディスク３０の重複しない領域が検出器の要素の第１の群に案内され、エアリーディスク３１の重複しない領域が検出器の要素の第２の群に案内され、２つの群はできるだけ相互に重なり合わないようにファイバを配線することが好ましい。

連立方程式の策定の数学的分析をより詳細に説明するために、まず初歩として、１色のみの場合、すなわち波長選択要素１５を用いない場合を考える。物体がＯ（ｒ）、励起の点広がり関数（ＰＳＦ）がＥ（ｒ）、検出のＰＳＦがＨ（ｒ）で識別される場合、各ピクセルの信号Ｄ（ｒ，ｐ）は、次式から得られる。ただし、ｒは照明スポットの場所ｐからの間隔を示す。

場所ｐに関するＤ（ｒ，ｐ）のフーリエ変換により、

が得られる。
実領域の積により、フーリエ領域内の以下の畳み込みが得られる。

場所ｒにサポート関数が導入されると、

となり、次式（２）が得られる。

２次元検出器上の異なる場所ｒがウィーナーフィルタによって結合されて、

となり、この式中、

及び

は、信号（“Ｏ”）及びノイズ（ｎ）の対応するスペクトルパワー密度である。

とはいえ、２次元検出器１９の各ピクセルにおいて混合される幾つかの色チャネルについて、ＰＳＦによって予め設定された以下の重み付けが得られる。

この式中、ｃは色チャネルのインデックスである。式（７）が行列として書かれると、以下が得られる。

追加のノイズを考慮した場合、式（８）は以下の形態をとる。

物体［Ｏ_ｃ（ω）］_ｃは、作用素［Ｇ_ｃ（ｒ，ω）］_ｒ，ｃによって得ることができ、これは周波数フィルタ処理及び色チャネル成分分離を組み合わせる。

ウィーナーフィルタを導出する場合のように、再構成された物体と実際の物体との間の距離の二乗を、今度は各周波数及び各色チャネルについて最小化しなければならない。

式（９）を使用することによって、以下が得られる。

当業者には、例えばｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｗｉｅｎｅｒ＿ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎから知られている、ウィーナーフィルタを導出する場合と同じ原理を利用して、以下が得られる。

ここで、［Ｉ］_ｃ及び［σ^２］_ｒは、各色チャネルに関する信号及びノイズのスペクトルパワー密度である。

蛍光色素分子の発光スペクトルが重複する場合、１つの色チャネル内で、ある物体の影が他の色チャネネルから生じることがありえる。このような影像は、実際の色チャネルの中の主像と同じ検出ＰＳＦにより歪められる。したがって、チャネルｃで検出される像Ｏ_ｃ（ω）は、異なる色チャネルに割り当てられた物体に対応する像

であり、

である。ここで、［Ｍ］_ｃは成分分離行列である。例えば２色の場合、以下が得られる。

真の像

を得ることは、その混合行列［Ｍ］_ｃが分かっている場合には単純である。そうでない場合には、これは生成された像の間の相互相関を最小化することによって得ることができる。すなわち、行列は、その数値が最もよく分離された物体について相互相関が最も低くなるように決定されることになる。

Claims (17)

1. 試料（２）の高解像度走査型顕微鏡検査のための方法であって、
   − 前記試料（２）は、照明放射（５）によって励起されて蛍光放射を発し、前記照明放射は、前記試料（２）の中又は表面上のある点で合焦して回折限界照明スポット（１４）を形成し、
   − 前記点は、空間解像度を有する２次元検出器（１９）上に回折像（１７）として回折限界様式で結像され、前記２次元検出器（１９）は、前記回折像（１７）の回折構造（３０−３３）を解像する空間解像度を有し、
   − 前記点は、前記試料（２）に関して、前記照明スポット（１４）の直径の半分より小さい増分で異なる走査位置に移動され、
   − 前記２次元検出器（１９）が読み取られ、該２次元検出器（１９）のデータ及びそれらのデータに割り当てられた走査位置から、前記試料（２）の画像が結像の解像限界を超えて高められた解像度で生成される、
   方法において、
   − 前記試料（２）の前記蛍光放射における少なくとも２つの所定の波長範囲を区別するために、前記少なくとも２つの所定の波長範囲に対応する数の多数のエアリーディスク（３０−３３）が、前記２次元検出器（１９）上に波長選択要素（１５）によって生成され、これらのエアリーディスクは、前記回折像（１７）が前記相互にずれたエアリーディスク（３０−３３）から成るように外側方向に相互にずらされ、前記エアリーディスク（３０−３３）は、完全に前記２次元検出器（１９）上にあり、
   − 前記エアリーディスク（３０−３３）は、前記試料（２）の画像を生成する際に評価されることを特徴とする、試料（２）の高解像度走査型顕微鏡検査のための方法。
2. 前記エアリーディスク（３０−３３）は、重複するが相互を完全にはカバーしないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記波長選択要素（１５）は、前記２次元検出器（１９）上で前記エアリーディスク（３０−３３）を、各エアリーディスク（３０−３３）の中心が他のエアリーディスク（３０−３３）の外側にあるように分離することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記波長選択要素（１５）は、前記相互にずれたエアリーディスク（３０−３３）が同じ大きさとなるように色補正されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記波長選択要素（１５）は、前記照明スポット（１４）が外側方向に相互にずらされた照明エアリーディスク（３４、３５）から成るように、照明だけを変更することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記波長選択要素（１５）は、結像にのみ影響を与え、特に前記２次元検出器（１９）の上流に配置されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記点は、前記試料（２）に関して異なる走査位置に移動され、それゆえ前記試料（２）がシフトされることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 外側方向に相互にずらされた前記エアリーディスク（３０−３３）が、共通の結像面内にあることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 高解像度走査型顕微鏡検査のための顕微鏡であって、
   − 励起されて蛍光放射を発することのできる試料（２）を受けるための試料空間と、
   − 前記試料空間内にある焦点面（２９）及び解像限界を含むレンズシステム（１１−１３）と、
   − 照明放射（５）を受けるための入力部（６）を含み、前記試料空間を前記照明放射（５）によって前記レンズシステム（１１−１３）を介して照明するための照明装置（３）であって、前記レンズシステム（１１−１３）は、前記照明放射（５）を前記焦点面（２９）内のある点における回折限界照明スポット（１４）に合焦させる、照明装置（３）と、
   − 前記焦点面（２９）内の前記点を、前記レンズシステム（１１−１３）を通じて、前記焦点面（２９）と共役である検出器平面（１８）内にある空間解像度を有する２次元検出器（１９）上に、回折像（３０−３３）として回折限界様式で結像するための結像装置（４）であって、前記２次元検出器（１９）は、前記回折像（３０−３３）の回折構造を解像する空間解像度を有する、結像装置（４）と、
   − 前記点を、前記照明スポット（１４）の直径より小さい増分で異なる走査位置に移動させる走査装置（１０）と、
   − 前記２次元検出器（１９）を読み取り、該２次元検出器（１９）のデータ及それらのデータに割り当てられた走査位置から、前記回折像（３０−３３）の前記回折構造を評価して、前記試料（２）の画像を前記解像限界を超えて高められた解像度で生成するための評価装置（Ｃ）と
   を含む顕微鏡において、
   − 前記試料（２）の前記蛍光放射内の少なくとも２つの所定の波長範囲を区別するために、前記顕微鏡（１）は、前記少なくとも２つの所定の波長範囲に対応する多数のエアリーディスク（３０−３３）を前記２次元検出器（１９）上に生成する波長選択要素（１５）を含み、これらのエアリーディスクは、外側方向に相互にずらされて前記回折像（１７）が該相互にずれたエアリーディスク（３０−３３）から成るようになっており、
   − 前記２次元検出器（１９）及び前記波長選択要素（１５）は、前記エアリーディスク（３０−３３）が完全に前記２次元検出器上にあるように形成され、
   − 前記評価装置（Ｃ）は、前記試料（２）の画像を生成する際に、前記エアリーディスク（３０−３３）を分析することを特徴とする、高解像度走査型顕微鏡検査のための顕微鏡。
10. 前記エアリーディスク（３０−３３）は、重複するが相互を完全にはカバーしないことを特徴とする、請求項９に記載の顕微鏡。
11. 前記波長選択要素（１５）は、前記２次元検出器（１９）上で前記エアリーディスク（３０−３３）を、各エアリーディスク（３０−３３）の中心が他のエアリーディスク（３０−３３）の外側にあるように分離することを特徴とする、請求項９又は１０に記載の顕微鏡。
12. 前記波長選択要素（１５）は、前記相互にずれたエアリーディスク（３０−３３）が同じ大きさとなるように色補正されることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記波長選択要素（１５）は、前記照明装置（３）の中に配置され、結像のためにも機能する前記レンズシステム（１１−１３）の中には配置されず、その結果、前記照明スポット（１４）は、外側方向に相互にずれた照明エアリーディスク（３４、３５）から成ることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡。
14. 前記波長選択要素（１５）は、前記結像装置（４）の中に配置され、照明のためにも機能する前記レンズシステム（１１−１３）の中には配置されないことを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡。
15. 前記走査装置は、前記試料空間内で前記試料をシフトさせるためのサンプルステージであることを特徴とする、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
16. 前記波長選択要素（１５）は、格子、プリズム、ウェッジプレート及び／又はダブレットレンズを含むことを特徴とする、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
17. 前記エアリーディスク（３０−３３）は、共通の結像面内で外側方向に相互にずれていることを特徴とする、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の顕微鏡。

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