DE102020131047A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Aufnahme nanoskopischer Bilder mehrfach gefärbter Proben - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf lokalisationsmikroskopische Untersuchungen an mit mehreren Farbstoffen gefärbten Proben. Erfindungsgemäß ist entweder vorgesehen, dass ein vereinzelt anregbares Fluorophor einer ersten Sorte mit Anregungslicht zweier unterschiedlicher Wellenlängen angeregt wird und dass für jede der beiden Wellenlängen eine Lokalisation des Fluorophors erhalten wird, von denen eine geringere Unsicherheit aufweist, oder dass zunächst testweise angeregt wird, um dann eine Wellenlänge für Anregungslicht auszuwählen, mit der ein vereinzeltes Fluorophor lokalisiert wird. Im ersten Fall wird der Unterschied der so erhaltenen Lokalisationen des einen oder bevorzugt mehrerer einzelner Fluorophore bestimmt und genutzt, um Lokalisationen von Fluorophoren einer anderen Sorte und die der ersten Sorte in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem zu erhalten. Der zweite Fall ist vorteilhaft für das Verfolgen von Strukturen anwendbar. Auch im zweiten Fall können die Vorteile des ersten Falls zusätzlich verwirklicht sein.

Description

• TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
• Die Erfindung bezieht sich auf die Lokalisationsmikroskopie, insbesondere auf die MINFLUX-Mikroskopie. Die Erfindung ermöglicht eine verbesserte nanoskopische Bildgebung mehrfach gefärbter, das heißt mit mehreren unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern gefärbter Proben, sowie ein Verfolgen einzelner Moleküle, das heißt Fluorophore, in mehrfach gefärbten Proben.
• STAND DER TECHNIK
• Lokalisationsmikroskopie erlaubt die Abbildung von Proben mit einer Auflösung unterhalb des Abbe'schen Beugungslimits. Für die Abbildung einer Probe wird diese mit Markern angefärbt, die sich so verhalten, dass sie jeweils mindestens für einen Zeitabschnitt fluoreszenzfähig sind, das heißt in einem Zustand sind, in dem sie zur Fluoreszenz angeregt werden können, und die meiste Zeit nicht fluoreszenzfähig sind. Man spricht allgemein davon, dass die verwendeten Marker blinken. Dies kann beispielsweise darauf beruhen, dass sich die Gesamtmenge der Marker in einem Gleichgewichtszustand befinden, in dem jeweils ein kleiner Anteil der Marker fluoreszenzfähig ist und ein großer Anteil nicht. Die Probe wird so präpariert oder behandelt, dass im Mittel über die Probe verteilt zwar einige oder sogar viele Marker fluoreszenzfähig sind, die fluoreszenzfähigen Marker aber untereinander typischerweise Abstände aufweisen, die ungefähr gleich groß wie oder größer sind als beispielsweise der Durchmesser eines beugungsbegrenzten Anregungslichtflecks. Wird die Probe nun mit Anregungslicht beaufschlagt, so kann das Licht der einzelnen fluoreszenzfähigen Fluorophore derart ortsaufgelöst detektiert werden, dass für jedes einzelne Fluorophor ein Abbild erhalten wird, dessen Position mit einer Unsicherheit bestimmt werden kann, die viel kleiner ist als das Abbe'sche Beugungslimit. Alternativ kann auch die Probe in einer Weise mit Anregungslicht, beispielsweise mit einer Sequenz strukturierter Anregungslichtverteilungen beaufschlagt werden, dass aus dem detektierten Fluoreszenzlicht auf Grund der Kenntnis über die Anregung die Positionen der fluoreszenzfähigen Marker mit einer Unsicherheit bestimmt werden können, die viel kleiner ist als das Abbe'sche Beugungslimit. In zeitlicher Abfolge werden nun die Positionen einer Vielzahl von Markern bestimmt, wobei bei Anwendung von Lokalisationsmikroskopie im Weitfeld oder bei parallelisierten lokalisationsmikroskopischen Verfahren gleichzeitig bereits eine Mehrzahl von Markern erfasst werden. Schließlich wird aus der Menge der so bestimmten Positionen ein Bild der Probe erhalten.
• Soll nun mittels eines lokalisationsmikroskopischen Verfahrens ein Bild einer Probe, die mit verschiedenartigen Markern, beispielsweise zur Markierung verschiedener Strukturen, angefärbt ist, gewonnen werden, so ergeben sich verschiedene Probleme. Selbst wenn jede Sorte der gewählten Marker für sich genommen geeignet für die Lokalisationsmikroskopie ist, so gilt dies für das Paar der Sorten oder die gesamte Markermenge häufig nicht. Denn werden die Bedingungen derart eingestellt, dass die eine Markersorte einen geeigneten Gleichgewichtszustand aufweist, so kann unter denselben Bedingungen die oder eine andere Markersorte entweder zu selten oder gar nicht fluoreszenzfähig oder zu häufig fluoreszenzfähig sein. Weiter sind die Abbildungsbedingungen für verschiedene Farben, das heißt Wellenlängen immer leicht unterschiedlich, sodass eine Unsicherheit hinsichtlich der Ko-Lokalisation von Markern verschiedener Sorten auftritt.
• Wird in Publikationen, die sich auf Daten nicht überauflösender Mikroskopieverfahren wie beispielsweise der einfachen Fluoreszenzmikroskopie oder der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie beziehen, der Begriff Ko-Lokalisation verwendet, so wird darunter regelmäßig verstanden, dass Signale der ko-lokalisierten Fluorophore im Bild nicht örtlich getrennt werden können, das heißt, dass sie innerhalb desselben Bild-Pixels erscheinen (siehe beispielsweise in „New Methods to Evaluate Colocalization of Fluorophores in Immunocytochemical Preparations as Exemplified by a Study on A_2A and D₂ Receptors in Chinese Hamster Ovary Cells“, Luigi F. Agnati et al., J Histochem Cytochem 53:941-953, 2005). Mit Blick auf lokalisationsmikroskopische Verfahren wird dieser Begriff allgemeiner verstanden, nämlich in dem Sinne, dass unter Ko-Lokalisation verschiedenartiger Fluorophore die Bestimmung, in welcher räumlichen Beziehung die verschiedenartigen Fluorophore angeordnet sind, verstanden wird. Darunter fällt auch die Bestimmung, dass die Orte verschiedenartiger Fluorophore räumlich im Bild nicht trennbar sind.
• In dem als „Tutorial Review“ bezeichneten Artikel „A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy“, S. Bolte und F. P. Cordelieres, Journal of Microscopy, Vol. 224, Pt 3, pp. 213-232, (2006), wird herausgestellt, dass es essenziell sei, zu vermeiden, dass Fluoreszenzlicht einer Fluorophorsorte in einem einer anderen Fluorophorsorte zugeordneten Detektionskanal ein Signal erzeugt, das heißt, ein Übersprechen (englisch „bleed-through“) zwischen Detektionskanälen sei zu vermeiden; weiter sei zu vermeiden, dass Anregungslicht, welches eine Fluorophorsorte anregen soll, auch eine andere Fluorophorsorte anregt, das heißt eine Kreuz-Anregung (englisch „cross-talk“) oder ein Übersprechen der Fluoreszenzanregung sei zu vermeiden. Weiter wird geraten, die Bildaufnahmen zu verschiedenartigen Fluororophoren nicht gleichzeitig, sondern sequenziell durchzuführen. Sowohl ein Übersprechen zwischen Detektionskanälen als auch eine Kreuz-Anregung führten zu einer Vermischung der Spektralkanäle. Trete diese als nachteilige Störung auf, könnten Verfahren zur spektralen Entmischung angewendet werden. Grundsätzlich wird eine Vermischung der Spektralkanäle aber als Störung aufgefasst.
• In der Publikation „Ultrahigh-Resolution Colocalization of Spectrally Separable Point-like Fluorescent Probes“, Xavier Michalet et al., METHODS 25, 87-102 (2001), https://doi.org/10. 1006/meth.2001.1218, wird ein Verfahren zur Ko-Lokalisation verschiedener quasi-punktförmiger Fluoreszenzemitter gezeigt. Die Emitter werden in einer konfokalen, abtastenden Anordnung mit ein und derselben Anregungslichtquelle bzw. Anregungswellenlänge angeregt. In einer der verwendeten Anordnungen wird der Detektionspfad mittels eines spektralen Strahlteilers in zwei Spektralkanäle geteilt, wobei die Detektion in jedem der Kanäle mit einem Photonen zählenden Detektor erfolgt, in einer anderen Anordnung erfolgt die Detektion unter Verwendung eines Prismas und einer Kamera spektral aufgelöst. Solange sichergestellt ist, dass sich innerhalb der Auflösungsbreite für jeden Spektralkanal nur jeweils ein einzelner Punktemitter befindet, können für jeden Spektralkanal aus den abtastend aufgenommenen Punktverbreiterungsfunktionen die Orte der einzelnen Emitter mit einer Genauigkeit weit besser als die Auflösungsgrenze bestimmt werden. Somit können auch Abstände verschiedener Emitter mit sehr hoher Auflösung, die letztlich insbesondere von der Menge der detektierten Photonen abhängt, bestimmt werden, das heißt, im Detektionslicht trennbare, aber mit derselben Anregungswellenlänge anregbare Fluoreszenzemitter können mit Superauflösung ko-lokalisiert werden. Als Vorteil der Nutzung nur einer Anregungswellenlänge stellen die Autoren heraus, dass chromatische Fehler im Anregungspfad vollkommen eliminiert werden.
• Aus der Publikation von Leila Nahidiazar et.al, „The molecular architecture of hemidesmosomes, as revealed with super-resolution microscopy“, Journal of Cell Science 128, p. 3714-3719 (2015); https://doi.org/10.1242/jcs.171892, in Verbindung mit der zugehörigen „Supplementary information“ sind Verfahren zur Lokalisationsmikroskopie in zwei sowie in drei Farben unter Nutzung eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops bekannt. Eine Probe wird mit den Farbstoffen Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 488 und gegebenenfalls Alexa Fluor 532 gefärbt. Es wird eine spezielle Pufferlösung, die die Autoren OXEA nennen, verwendet, die es ermöglicht, alle drei Farbstoffe für lokalisationsmikroskopische Bildgebung, konkret für ein als GSDIM-Mikroskopie (ground-state depletion followed by individual molecule return) bezeichnetes Verfahren, zu verwenden. Für Bildgebung in zwei Farben wird zunächst eine Abbildung unter Nutzung des Farbstoffs Alexa Fluor 647 durchgeführt, der mittels eines Lasers mit Licht einer Wellenlänge von 647 nm angeregt wird. Anschließend erfolgt eine Abbildung mit Nutzung des Farbstoffs Alexa Fluor488, der mittels eines Lasers mit Licht einer Wellenlänge von 488 nm angeregt wird. Beide Farbstoffe können gemäß der Autoren unabhängig und ohne wechselseitige Störung aufgenommen werden. Für Bildgebung in drei Farben wird zusätzlich der Farbstoff Alexa Fluor 532 genutzt. Hierbei werden zunächst die oben genannten Schritte durchgeführt, wobei bei der Nutzung von Alexa Fluor 488 ein Bandpassfilter im Detektionspfad genutzt wird, um Fluoreszenzlicht, welches vom dritten Farbstoff Alexa Fluor 532 emittiert wird, nicht mitzudetektieren. Abschließend wird eine Abbildung unter Nutzung des Farbstoffs Alexa Fluor 532 durchgeführt, der mittels eines Lasers mit Licht einer Wellenlänge von 532 nm angeregt wird. Bei der Nutzung dieses dritten Farbstoffs wird ausgenutzt, dass bei den vorangehenden Schritten der Farbstoff Alexa Fluor 488 so stark gebleicht wurde, dass hinreichend wenig störende Fluoreszenz von ihm ausgeht. Die so erhaltenen Bilddaten werden einzeln nachbearbeitet, folgend hinsichtlich auftretender Drift korrigiert, anschließend werden Bilder erzeugt, die abschließend bezüglich auftretender chromatischer Abbildungsfehler korrigiert werden. Um Abstände der in unterschiedlichen Farben beobachteten Strukturen zu bestimmen, werden die Bilder unter Nutzung der Kenntnis über die Form abgebildeter Strukturen ausgewertet. Auf diese Weise werden die Abstände markierter Strukturen mit geringerer Unsicherheit bestimmt als der Unsicherheit, die sich aus den Unsicherheiten der einzelnen Lokalisationen zweier verschiedener Fluorophore ergibt. Aus der späteren Publikation von Leila Nahidiazar et.al, „Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution“, PLoS ONE 11 (7): e0158884. (2016), https://doi.org/10.1371/journal.pone.0158884, ist bekannt, dass sich die oben genannte Korrektur hinsichtlich auftretender Driften entweder auf Kreuzkorrelationstechniken oder aber auf die Abbildung in die Proben integrierter spezieller Referenzmarker, nämlich fluoreszierender Kügelchen (beads) stützt.
• Aus der Publikation „Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes“, Hari Shroff et. al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 104 (51) 20308-20313; (2007), https://doi.org/10.1073/pnas.0710517105, ist ein weiteres Verfahren zur Lokalisationsmikroskopie in zwei Farben unter Nutzung eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops bekannt. Es werden zwei verschiedene photoaktivierbare Farbstoffe genutzt, die beide mit Licht einer Wellenlänge von 405 nm aktiviert werden können, aber mit unterschiedlichen Wellenlängen angeregt und gegebenenfalls gebleicht werden. In einer ersten Schrittfolge wird Aktivierunglicht und längerwelliges Anregungslicht appliziert und die fluoreszierenden Moleküle werden lokalisiert; dies wird durchgeführt, bis eine Vielzahl von Fluorophoren lokalisiert ist. Dabei bleicht der angeregte Farbstoff aus. Anschließend werden erst diejenigen kürzerwelligen Fluorophore, die sich dann in einem anregbaren Zustand befinden, mit einem intensiven Lichtpuls bei 488 nm, das ist die kürzere Anregungswellenlänge, deaktiviert, sodass anschließend alle kürzerwelligen Fluorophore in einem nicht anregbaren Zustand sind. Danach erfolgt wie für die erste Fluorophorsorte eine Lokalisierung der mit der kürzeren Wellenlänge anregbaren Fluorophore. Es wird betont, dass die Fluorophore nur ein sehr geringes Übersprechen zeigen, das heißt, dass die Bildgebungen in den unterschiedlichen Kanälen sich wechselseitig wenig beeinflussen.
• Aus der Publikation „A user-friendly two-color super-resolution localization microscope“, Teng Zhao et. al., Opt. Express 23, 1879-1887 (2015), ist ein Verfahren der Lokalisationsmikroskopie an zweifach gefärbten Proben bekannt. Eine Probe wird mit zwei Farbstoffen, Alexa Fluor 647 und Alexa Fluor 750, angefärbt. Es wird eine spezielle Pufferlösung verwendet, die derart eingestellt wird, dass sich beide Farbstoffe hinsichtlich der für die Lokalisationsmikroskopie wichtigen Schalteigenschaften möglichst gleich verhalten. Die Probe wird gleichzeitig im TIRF-Weitfeld-Mode (TIRF: total internal reflection microscopy) mit Fluoreszenzanregungslicht für beide Farbstoffe beaufschlagt. Im Detektionspfad wird die Fluoreszenz des einen Farbstoffs von der des anderen separiert. Die Fluoreszenzsignale werden jeweils in unterschiedlichen Hälften ein und desselben Kamerasensors detektiert. Zur Vermeidung von farbabhängigen Abweichungen der bestimmten Orte unterschiedlicher Fluorophore erfolgt eine Kalibrierung. Für die Kalibrierung werden Aggregate erzeugt, die jeweils Fluorophore beider Sorten enthalten und insgesamt eine Größe unterhalb des Abbe'schen Beugungslimits aufweisen. Eine Anzahl solcher Aggregate wird auf ein Deckglas aufgebracht, das Deckglas mit den Aggregaten wird unter dem Mikroskop beobachtet, die Aggregate werden lokalisiert. Da die Aggregate Fluorophore beider Sorten enthalten, wird zu jedem Aggregat in beiden Sensorhälften Fluoreszenzlicht detektiert. Anhand dieser Messung werden die Detektorhälften aufeinander gemappt. Das so kalibrierte Mikroskop könne für mehrere Wochen für Aufnahmen, die frei von chromatischen Fehlern seien, genutzt werden.
• In der Publikation „Multicolor Super-resolution Imaging with Photo-switchable Fluorescent Probes“, W. Mark Bates et.al., Science; 317(5845): 1749pp, (2007), https://doi.org/10.1126/science. 1146598, wird eine weitere Methode zur Weitfeld-Lokalisationsmikroskopie an mehrfach gefärbten Proben vorgestellt. Anstelle einfacher Fluorophore werden jeweils Farbstoffpaare verwendet. Ein Partner des Farbstoffpaars, genannt Aktivator, fungiert dabei als Substanz, die die Aktivierungswellenlänge des Farbstoffpaars bestimmt, der andere Partner, genannt Reporter, ist eine Substanz, die die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge des Farbstoffpaars bestimmt. Durch die Verwendung verschiedener Aktivator-Reporter-Paare wird ermöglicht, dass eine selektive Aktivierung und damit eine sequenzielle Lokalisation der unterschiedlichen Paare erfolgen kann, oder aber, dass eine simultane Aktivierung und simultane Lokalisation in verschiedenen Detektionskanälen erfolgen kann, nämlich wenn sich die Emissionswellenlängen der Reporter unterscheiden. Demonstriert, das heißt anhand experimentell erhaltener Bilder belegt, wird das sequenzielle Verfahren basierend auf in den Aktivierungswellenlängen unterschiedlichen Aktivator-Reporter-Paaren. Ein Übersprechen zwischen Farbkanälen wird angesprochen. Diesbezüglich wird festgestellt, dass es bei den verwendeten Aktivator-Reporter-Paaren gering sei.
• In der Publikation „Multicolor Fluorescence Nanoscopy in Fixed and Living Cells by Exciting Conventional Fluorophores with a Single Wavelength“, Ilaria Testa et. al., Biophysical Journal, Volume 99, 2686-2694, (2010), https://doi.org/10.1016/j.bpj.2010.08.012, wird ein weiteres GSDIM-Verfahren zur Weitfeld-Lokalisationsmikroskopie in mehreren Farben vorgestellt. Für die Anregung aller Farbstoffe sowie für die Entvölkerung des Grundzustands aller Farbstoffe wird ein und derselbe Laser, konkret ein cw-Laser einer Wellenlänge von 488 nm, verwendet. Das Fluoreszenzsignal aller Fluorophore wird im Detektionspfad in zwei Farbkanäle aufgeteilt und jeweils innerhalb zweier Teilbereiche ein und desselben Kamerasensors detektiert, sodass im Wesentlichen auf dem einen Teil des Sensors Fluoreszenzlicht mit einer Wellenlänge oberhalb und auf dem anderen mit einer Wellenlänge unterhalb einer Grenzwellenlänge detektiert wird. Auf diese Weise wird zu jedem Emitter in der Probe ein Paar von Punktbildern erhalten. Anhand des Verhältnisses der Fluoreszenzmengensignale jedes einzelnen Fluorophors in den beiden Sensorhälften wird erschlossen, was für ein Fluorophor jeweils ein konkretes Punktbildpaar hervorgerufen hat. Anschließend kann jedem Punktbild nicht nur ein Ortswert, sondern auch eine Farbinformation zugeordnet werden. Das Verfahren basiert darauf, dass sichergestellt wird bzw. bekannt ist, dass jeder einzelne Spot durch ein Molekül hervorgerufen wird, also kein Signal, welches als Mischung verschiedener Fluoreszenzemission entstanden sein könnte, vorliegt.
• In der Publikation „Multicolor Far-Field Fluorescence Nanoscopy through Isolated Detection of Distinct Molecular Species“, Mariano Bossi et. al., Nano Lett, 8, 8, 2463-2468, (2008), https:// doi.org/10.1021/nl801471d, wird ein weiteres Verfahren zur Weitfeld-Lokalisationsmikroskopie in mehreren Farben vorgestellt. Es werden verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe genutzt, die alle durch Aktivierungslicht mit einer Wellenlänge von 375 nm aus einem nicht fluoreszenzfähigen Zustand in einen fluoreszenzfähigen geschaltet werden können und außerdem alle mittels Anregungslicht ein und derselben Wellenlänge von 532 nm zur Fluoreszenz angeregt werden können. Dabei weisen die Fluorophore stark unterschiedliche Emissionsspektren auf. Es erfolgt nun jeweils eine Aktivierung und Anregung im Weitfeld, die resultierende Fluoreszenz wird in zwei Kanälen mit unterschiedlicher spektraler Empfindlichkeit jeweils ortsaufgelöst detektiert, aus dem Verhältnis der jeweils für einen Einzelemitter detektierten Fluoreszenzmengen wird auf die Art des Emitters geschlossen, auf Basis der örtlichen Verteilung der Fluoreszenz erfolgt jeweils eine Lokalisation. In der zugehörigen „Supplementary information“ wird explizit erwähnt, dass die Ortskoordinaten der beiden Spektralkanäle mittels der Abbildung fluoreszenter Beads, die in beiden Spektralkanälen emittieren, einander zugeordnet werden.
• In der Publikation „Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging“, Graham T Dempsey et al., Nat Methods 8, 1027-1036 (2011),.https://doi.org/10.1038/nmeth.1768, wird ein Verfahren zur Bildgebung mittels STORM an mit vier unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbten Proben beschrieben. Es werden gezielt vier Farbstoffe ausgewählt, die sich sowohl in ihren Anregungsspektren als auch in ihren Emissionsspektren stark unterscheiden. Diese werden jeweils einzeln mit einem zugehörigen Laser angeregt und die zugehörige Fluoreszenz wird in einem zugehörigen Spektralkanal detektiert. Die Auswahl der Farbstoffe und der Anregungswellenlängen stellt sicher, das keine Kreuz-Anregung stattfindet, sodass die einzelnen Bilder jeweils nur minimal von Fluoreszenz der jeweils anderen Farbstoffe gestört sind. Die Farbkanäle werden aufeinander registriert, indem vor jeder einzelnen Bildaufnahme an der Probe jeweils Goldbeads unter Weitfeldbeleuchtung in allen Detektionskanälen abgebildet werden. Die Autoren geben als Unsicherheit der Ko-Registrierung den Wert kleiner 20 nm an. Drifts, die während der Aufnahme über die Zeit auftreten, werden mit Hilfe von Bildkorrelationsverfahren korrigiert.
• In der Publikation „Nanoscale subcellular architecture revealed by multicolor three-dimensional salvaged fluorescence imaging“, Yongdeng Zhang et al., Nat Methods 17, 225-231 (2020), https://doi.org/10.1038/s41592-019-0676-4, wird ein Verfahren zur Lokalisation von Fluorophoren in einer mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen gefärbten Probe vorgestellt, welches an einem Mikroskop mit einer 4-PI-Detektionsanordnung durchgeführt wird. Anregungslicht wird über ein dichroitisches Element durch ein Objektiv auf die Probe geleitet. Von Fluorophoren in der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht wird zum einen über dasselbe Objektiv auf einen ersten ortsauflösenden Detektor geleitet, wobei nur der Teil des Fluoreszenzlichts mit längeren Wellenlängen als das Anregungslicht das dichroitische Element passiert und auf den ersten Detektor gelangt; zum anderen wird in Gegenrichtung Fluoreszenzlicht durch ein weiteres, dem ersten entsprechendes dichroitisches Element über einen Spiegel auf denselben Detektor geleitet und am weiteren dichroitischen Element wird Licht mit kürzeren Wellenlängen, insbesondere Wellenlängen unterhalb bzw. bis knapp oberhalb der Anregungswellenlänge herausgespiegelt; das herausgespiegelte Licht wird durch ein weiteres Filter, welches die Wellenlänge des Anregungslichts gerade nicht passieren lässt, auf einen weiteren Detektor geleitet. Anhand der zu einzelnen Fluorophoren gemessenen Intensitäts- oder Lichtmengenverteilungen werden die Fluorophore lokalisiert. Zur Unterscheidung zwischen Fluorophoren werden gleichzeitig auf den beiden Detektoren detektierte Burst einander zugeordnet, aus dem Verhältnis der gemessenen Intensitäten oder Lichtmengen wird die Art des Fluorophors erschlossen. Hierbei wird ausgenutzt, dass gerade der Anteil der kurzwelligen Fluoreszenz mit Wellenlängen unterhalb einer gegebenen Anregungswellenlänge im Verhältnis zu der langwelligen Fluoreszenz mit Wellenlängen oberhalb einer gegebenen Anregungswellenlänge sich zwischen verschiedenen Fluorophoren stark unterscheidet. Der kurzwellige Anteil ist dabei zumeist so klein, dass eine gute Lokalisation anhand gemessener Intensitäts- oder Lichtmengenverteilungen kaum möglich wäre. Die Lokalisation erfolgt daher nur anhand der Intensitäts- oder Lichtmengenverteilung der langwelligen Fluoreszenz und die Messwerte der kurzwelligen Fluoreszenz werden ausschließlich für die Identifikation der Fluorophorsorte genutzt.
• In der Publikation „Visualizing Intracellular Organelle and Cytoskeletal Interactions at Nanoscale Resolution on Millisecond Timescales“, Yuting Guo et al., Cell (2018), https://doi.org/10.1016/ i.cell.2018.09.057, wird ein Verfahren zur hochauflösenden Abbildung mittels strukturierter Beleuchtung beschrieben, welches nicht auf der Lokalisation einzelner Fluorophore basiert. Es werden Bilder gezeigt, die auf der Nutzung dreier verschiedener fluoreszenter Proteine basieren, wobei jeweils mit voneinander unterschiedlichen Fluorophoren markierte biologische Strukturen hoch aufgelöst in ihrer räumlichen Beziehung zueinander abgebildet sind. Daneben wird demonstriert, dass das Verfahren auch geeignet ist, einzelne Fluorophore zu detektieren.
• Bei der MINFLUX-Nanoskopie handelt es sich um Verfahren der Lokalisationsmikroskopie. Die Lokalisation der Fluorophore erfolgt mittels strukturierter Anregungslichtverteilungen. Die grundlegende Besonderheit der MINFLUX-Nanoskopie ist, dass die Anregung der Fluorophore jeweils so erfolgt, dass ein zu lokalisierendes Fluorophor immer nah an einem oder in einem Minimum der Anregungslichtverteilung, welches idealerweise eine Nullstelle ist, platziert ist, wobei die Anregungslichtverteilung benachbart zum Minimum einen Intensitätsanstiegsbereich aufweist. Hierdurch wird eine bessere Ausnutzung der Fluoreszenzphotonen hinsichtlich der Gewinnung von Information über die Lage des jeweiligen emittierenden Fluorophors erreicht. Dies gilt auch für Anwendungen, in denen die Bewegung von Fluorophoren über die Zeit verfolgt werden soll. Die Beobachtung einer Probe unter Nutzung eines Anregungsminimums, der Grundlage der MINFLUX-Nanoskopie, ist bekannt aus den Patenten DE 10 2011 055 367 B4 , hier zunächst nur zur Verfolgung der Bewegung einzelner Moleküle in einer Probe, und DE 10 2013 114 860 B3 .ln DE 10 2011 055 367 B4 wird auch die Möglichkeit angesprochen, zwei verschiedene Fluorophore gleichzeitig zu verfolgen. Hierfür sollen zwei verschiedene Lichtquellen verwendet werden, zwischen denen im schnellen Wechsel umgeschaltet wird.
• Auf Basis dieser Grundlage sind eine Reihe von Verfeinerungen zur Informationsgewinnung entstanden, die eine Lokalisation der Fluorophore mit einer Unsicherheit im Bereich unterhalb von 2 nm ermöglichen. Diese Größe der Unsicherheit entspricht der Ausdehnung von Fluorophoren. Eine ausführliche Darstellung zur MINFLUX-Mikroskopie findet sich in „Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes“, Francisco Balzarotti et. al., arXiv:1611.03401 [physics.optics] (2016). Grundsätzlich muss, um ein Fluorophor mittels MINFLUX-Mikroskopie lokalisieren zu können, das Intensitätsminimum bzw. die Intensitätsnullstelle an einer Mehrzahl von Positionen relativ zur Lage des Fluorophors platziert werden. Hierfür muss in einem vorbereitenden Schritt eine Position des Fluorophors mit einer ersten, geringeren Genauigkeit abgeschätzt werden. Dies kann beispielsweise mittels gewöhnlicher Lokalisationsmikroskopie (PALM, STORM) geschehen oder mittels anderer bekannter Verfahren, In der genannten Publikation wird hierfür ein Verfahren beschrieben, bei dem eine Probe mit einer Gauß'schen Intensitätsverteilung abgetastet wird, bis an einer Abtastposition Fluoreszenz detektiert wird, die mit gewisser Wahrscheinlichkeit von einem vereinzelten Molekül stammt. Die Abtastung wird dann gestoppt und die Intensitätsverteilung wird anschließend an mehreren Orten, konkret an vier Orten, im Abstand von weniger als der Wellenlänge des Lichts zur Abtastposition um diese herum positioniert. Aus den zu den einzelnen Positionen gemessenen Photonenzahlen wird die Position des vereinzelten Emitters nach einem in der Publikation beschriebenen Verfahren abgeschätzt. Die Abschätzung entspricht im Kern einer ratiometrischen Auswertung der zu den verschiedenen Positionen detektierten Photonenzahlen. Anschließend wird eine Intensitätsverteilung von Anregungslicht mit einem zentralen Minimum, beispielsweis in der Form eines Donuts, wie aus der STED-Mikroskopie bekannt, an einer bekannten Position platziert, die derart gewählt ist, dass das Fluorophor nah am Minimum der Intensitätsverteilung liegt. Die Fluoreszenzantwort des Fluorophors wird gemessen. Dasselbe wird für eine oder mehrere weitere Positionen der Intensitätsverteilung wiederholt. Mittels einer ratiometrischen Auswertung der gemessenen Intensitäts- oder Lichtmengenverhältnisse wird die Position des Fluorophors mit höherer Genauigkeit bestimmt. Grundsätzlich steigt die Emissionsrate, je weiter das Fluorophor vom Anregungsminimum entfernt ist bzw. je weiter das Fluorophor in einen Intensitätsanstiegsbereich hinein verschoben ist. Diese genauer bestimmte Position kann nun als Ausgangsposition für eine Wiederholung der Abfolge der vorgenannten Schritte verwendet werden, wobei die Mehrzahl von Positionen dichter an die abgeschätzte Fluorophorposition gelegt werden kann. Insbesondere mit Blick auf die Verfolgung der Bewegung von Fluorophoren kann auch die Veränderung der Emissionsrate bei einer Verlagerung des Fluorophors in den Intensitätsanstiegsbereich hinein oder zum Minimum hin genutzt werden, um die Verlagerung des Fluorophors hochgenau abzuschätzen. Je näher die Minimumspositionen der Intensitätsverteilung jeweils am tatsächlichen Ort des Fluorophors liegen, umso weniger Fluoreszenzphotonen werden für eine Lokalisation mit einer vorgegebenen Unsicherheit bzw. Genauigkeit benötigt. Das MINFLUX-Verfahren kann beispielweise unter Nutzung sogenannter Bottle-Beams zur Anregung auch zur Lokalisation in drei Dimensionen angewendet werden.
• Als Patentoffenlegungsschriften zur MINFLUX-Mikroskopie sind insbesondere die Schriften WO 2018/069 283 A1 , US 2019/0235220 A1 , US 2019/0234882 A1 und US 2019/0234879 A1 zu nennen, wobei die genannten US-Patentanmeldungen alle Folgeanmeldungen zu der zuerst genannten vorläufigen internationalen Patentanmeldung sind, in der alle in der Folge mit Bezug zu den US-Offenlegungsschriften genannten Konzepte ebenfalls offenbart sind.
• Die US 2019/0235220 A1 richtet sich auf ein Verfahren mit einer geringen oder minimalen Anzahl von Positionen, an denen ein Intensitätsminimum, welches in jeder Raumrichtung, in der eine Lage des Fluorophors bestimmt werden soll, beiderseits von Intensitätsanstiegsbereichen benachbart ist, platziert wird, um die Lage des Fluorophors zu bestimmen.
• Die US 2019/0234882 A1 richtet sich auf das weiter oberhalb beschriebene Verfahren, bei dem die aus einem ersten MINFLUX-Schritt gewonnene Ortsinformation genutzt wird, um in einem Folgeschritt das Minimum der Intensitätslichtverteilung jeweils näher an dem Fluorophor zu platzieren und hieraus genauere Ortsinformation abzuleiten.
• Die US 2019/0234879 A1 richtet sich auf ein Verfahren, bei dem das Intensitätsminimum sehr schnell, quasi gleichzeitig, an einer Mehrzahl von Positionen um die abgeschätzte Lage des Fluorophors herum platziert wird. Eine einzelne Position wird dann näher an das vermutete Minimum herangeschoben, wenn an ihr eine erhöhte Emissionsrate festgestellt wird.
• In der Publikation „MINFLUX monitors rapid molecular jumps with superior spatiotemporal resolution“, Yvan Eilers et. al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 115 (24) 6117-6122, (2018); https://doi.org/10.1073/pnas.1801672115, wird insbesondere beschrieben, wie mittels MINFLUX die Bewegung einzelner Moleküle mit einer Auflösung der Bewegung im Bereich weniger Nanometer verfolgt werden kann. Im Ausblick wird erwähnt, dass Mehrfarbenanwendungen der MINFLUX-Technologie vorhersehbar seien. Hierzu werden aber keine konkreten Angaben gemacht.
• Die Veröffentlichung „MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells“, Klaus C. Gwosch et. al., Nat Methods 17, 217-224 (2020), https://doi.org/10.1038/s41592-019-0688-0, richtet sich auf dreidimensionale Nanoskopie mit mehreren verschiedenen Fluorophoren. In der Publikation wird auch der Nachweis dokumentiert, dass mittels des iterativen Annäherns der Minimumspositionen an den tatsächlichen Ort des betreffenden Fluorophors eine Verringerung der Unsicherheit der Lokalisation gegenüber einer ratiometrischen Lokalisation mit festen Minimumspositionen erreicht wird. Weiter wird gezeigt, dass auf diese Weise eine isotrope Auflösung in drei Dimensionen erreicht wird. Es wird nachgewiesen, dass MINFLUX-Nanoskopie auch mit Nutzung photoaktivierbarer fluoreszenter Proteine, konkret von mMaple, insbesondere auch an lebenden Zellen durchgeführt werden kann. Für Bildgebung unter Verwendung verschiedener Fluorophore werden jeweils Farbstoffe verwendet, die wechselseitig einen großen Überlapp der spektralen Absorptionskurven aufweisen und somit mit ein und derselben Anregungswellenlänge angeregt werden können. Konkret dargestellt wird dreidimensionale Nanoskopie mit jeweils zwei verschiedenen Fluorophoren, wobei insgesamt zwei verschiedene Paare (A: CF660C und Alexa Fluor 647; B: CF680C und Alexa Fluor 647), wobei bei beiden Paaren ein Partner des Paars der Farbstoff Alexa Fluor 647 ist, verwendet werden. Im Rahmen der MINFLUX-Aufnahme wird für die Anregung beider Farbstoffe eines Paars jeweils derselbe Laser genutzt. Außerdem wird eine MINFLUX-Aufnahme von Kernporen lebender Zellen gezeigt, für die die Fluoreszenz des von der entsprechend modifizierten Zelle exprimierten Nup96-mMaple, also lediglich eines Farbstoffs, genutzt wird. Der experimentelle Aufbau weist zwei verschiedene Laser für die Anregung mit einem Anregungsdonut auf, einen mit einer Wellenlänge von 642 nm, dieser ist geeignet für die Anregung der oben genannten Farbstoffpaare, und einen mit einer Wellenlänge von 560 nm, der geeignet ist für die Anregung von Nup96-mMaple. Die jeweils zwei Farbstoffe des Paars unterscheiden sich in ihrer Emissionscharakteristik. Der Detektionspfad der verwendeten Nanoskopie-Anordnung wird mittels eines dichroitischen Strahlteilers in einen spektralen Detektionskanal für Licht einer Wellenlänge oberhalb von 685 nm und einen für Licht einer Wellenlänge unterhalb von 685 nm aufgeteilt. Bei Durchführung der Messung wird, da die spektrale Emissionskurve aller verwendeten Fluorophore sowohl oberhalb als auch unterhalb der Grenzwellenlänge deutlich ungleich 0 (null) ist, für alle verwendeten Fluorophore Licht in beiden Spektralkanälen detektiert. Das Summensignal wird für die Lokalisation des Fluorophors verwendet. Da regelmäßig im Lokalisationsbereich nur ein Fluorophor, abgesehen von Hintergrundfluoreszenz, fluoresziert und da die verschiedenen Fluorophore eines Paars sich in der spektralen Emission unterscheiden, kann jeweils aus dem Verhältnis der Signale in den verschiedenen Detektionskanälen erschlossen werden, welche Fluorophorsorte des Farbstoffpaars das Signal verursacht hat. Im Ergebnis kann daher jeder Lokalisation ein konkreter Farbstoff zugeordnet werden. Hierbei mögliche Fehlzuordnungen werden im Rahmen einer Datenanalyse mittels einer Hauptkomponentenanalyse der spektralen Anteile aller MINFLUX-Iterationen minimiert. Da die Lokalisation auf der Kenntnis über die Positionen der Minima der Intensitätsverteilungen alleine des Anregungslichts basiert, gibt es keinen farbabhängigen Versatz zwischen Lokalisationen der verschiedenen Fluorophore, da diese mit identischen Anregungswellenlängen angeregt werden. In der Publikation wird als bedeutend angesprochen, dass, da die Fluorophore lediglich Marker für abzubildende biologische Strukturen seien, die mittels der MINFLUX-Nanoskopie erreichte Auflösung der Abbildung der biologischen Strukturen letztlich bestimmt sei durch die Größe der genutzten Fluorophore. Um das Potential der MINFLUX-Nanoskopie vollständig zu nutzen, müsse daher die Fluoreszenzmarkierung optimiert werden, wobei Größe und Ausrichtung der Fluorophore zu berücksichtigen seien. Günstig sei, dass bei der MINFLUX-Nanoskopie weniger Photonen zur genauen Lokalisation nötig seien, sodass für MINFLUX grundsätzlich eine größere Auswahl von Fluorophoren verwendet werden könne.
• Ein im Wesentlichen identisches Verfahren wie in der oberhalb genannten Publikation wird zur Untersuchung anderer Proben in der Veröffentlichung „Multicolor 3D MINFLUX nanoscopy of mitochondrial MICOS proteins“, Jasmin Pape et. al., PNAS,117 (34) 20607-20614, (2020), https://doi.org/10.1073/pnas.2009364117, behandelt.
• In der europäischen Offenlegungsschrift EP 3 372 990 A1 wird neben weiteren MINFLUX-Verfahren ein dem MINFLUX-Verfahren in einem Aspekt ähnliches Verfahren beschrieben. Wie bei einem MINFLUX-Verfahren wird ein vereinzeltes Molekül fokussiert mit einer Intensitätsverteilung beaufschlagt, die ein zentrales Minimum, bevorzugt eine Nullstelle, und dieses umgebende Anstiegsbereiche aufweist; ebenfalls wie bei MINFLUX wird dieses Minimum an eine Mehrzahl von Abtastpunkten um den vermuteten Ort des vereinzelten Moleküls platziert und es wird für jeden Abtastpunkt eine Fluoreszenzemission detektiert; aus den so erhaltenen Intensitätswerten oder Photonenzahlen wird die tatsächliche Position hochgenau abgeschätzt. Im Unterschied zu MINFLUX ist die Intensitätsverteilung eine Verteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht, insbesondere von STED-Licht. Diese wird gemeinsam mit Anregungslicht angewendet, wobei die Intensitätsverteilung des Anregungslichts kein zentrales lokales Minimum aufweist. Während bei MINFLUX die Fluoreszenzemission dann höher ist, wenn das vereinzelte Moleküle weiter vom zentralen Minimum der Intensitätsverteilung entfernt ist, ist es bei diesem Verfahren umgekehrt. Dieses Verfahren richtet sich, wie auch in der Schrift beschriebene MINFLUX-Verfahren auf Messungen an mehrfach gefärbten Nanostrukturen, wobei die Färbung derart gewählt ist, dass verschiedene Fluorophore, die räumlich näher als eine Auflösungsgrenze benachbart sind, unterschieden werden können. Dies könne beispielsweise dadurch sichergestellt werden, dass Fluorophore verwendet werden, die mit zueinander unterschiedlichen Anregungswellenlängen angeregt werden.
• In der Publikation „MINSTED fluorescence localization and nanoscopy“, Michael Weber et al., bioRxiv 2020.10.31.363424; doi: https://doi.org/10.1101/2020.10.31.363424, wird eine Variante des oben genannten MINFLUX-ähnlichen Lokalisationsverfahrens beschrieben. Für die Lokalisation vereinzelter Fluorophore wird eine Intensitätsverteilung eines STED-Lichts mit einem zentralen Intensitätsminimum mit einer gaußförmigen Intensitätsverteilung eines Anregungslichts überlagert. Zu Beginn des Lokalisierens wird eine geringe STED-Intensität verwendet, aus der sich eine gegenüber einer einfachen Anregung nur wenig verengte effektive Anregungsspreizfunktion ergibt. Die überlagerten Intensitätsverteilungen werden auf einer Kreisbahn um den aus einer Vorlokalisation abgeschätzten Ort eines vereinzelten Fluorophors geführt, während ein Detektor eingerichtet ist, aus dem kreisförmig abgetasteten Bereich emittierte Fluoreszenzphotonen zu detektieren. Wird nun ein Photon detektiert, wird das Zentrum der Kreisbahn in Richtung auf den Ort, an dem sich das Zentrum der überlagerten Lichtverteilungen befand, als das Photon emittiert wurde, verschoben um einen Wert, der ein Anteil des Radius der ursprünglichen Kreisbahn ist. Gleichzeitig wird die STED-Intensität erhöht, sodass sich die Halbwertsbreite der effektiven Anregungsspreizfunktion verringert. Dieses Verfahren wird iterativ fortgesetzt, wobei allerdings die Erhöhung der STED-Intensität bei einem festen Wert beendet wird, sodass in späteren Schritten gegebenenfalls das Zentrum der Kreisbahn verschoben wird, ohne dass gleichzeitig die STED-Intensität erhöht würde. Die Lage des Zentrums der Kreisbahn nähert sich dabei immer mehr der Lage des zu lokalisierenden Fluorophors an. Die Iterationen werden beendet, wenn das vereinzelte Fluorophor keine Photonen mehr emittiert. Auch dieses Verfahren bietet wie MINFLUX eine hervorragende Ausnutzung der in den detektierten Photonen enthaltenen Information. In der Publikation wird angekündigt, dass mehrere Farbkanäle durch Anwendung spektral verschobener Fluorophore ermöglicht werden sollen. Das Verfahren sei insbesondere geeignet zum Verfolgen sich schnell in einer Probe bewegender Emitter. Die Autoren nennen das vorgeschlagene Verfahren MINSTED.
• Mittels MINFLUX-Nanoskopie konnte die Position von Fluorophoren in zwei Raumrichtungen experimentell mit einer Unsicherheit von nur 1 nm bestimmt werden, das heißt die Genauigkeit der Lagebestimmung ist vergleichbar mit der Ausdehnung der Fluorophore selbst. Soll die Lage eines einzelnen Fluorophors mit einer gegeben Messunsicherheit bestimmt werden, so wird hierfür eine geringere Zeit und insbesondere eine geringere Anzahl von Fluoreszenzphotonen benötigt als bei einer Lagebestimmung eines einzelnen Fluorophors mittels herkömmlicher Lokalisationsmikroskopie. Ähnliches gilt auch für MINSTED-Nanoskopie.
• Alle lokalisationsmikroskopischen Verfahren aus dem Stand der Technik weisen den Nachteil auf, dass eine Abbildung mehrfach gefärbter Proben nur gelingt, wenn die Fluorophorpaare speziell mit Blick auf das gewählte Abbildungsverfahren ausgewählt sind. Dies erschwert die Auswahl, optimal auf die abzubildenden Strukturen abgestimmter Fluorophore.
• AUFGABE DER ERFINDUNG
• Der Erfindung liegt dementsprechend die Aufgabe zugrunde, lokalisationsmikroskopische Verfahren und Vorrichtungen für eine Untersuchung mit mehreren Farbstoffen gefärbter Proben anzugeben, die die Abbildung mit mehreren Farbstoffen gefärbter Proben oder die Verfolgung der Bewegung einzelner fluoreszenter Moleküle in mit mehreren Farbstoffen gefärbten Proben insoweit verbessern, als sie es erleichtern, auf die zu untersuchende Probe abgestimmte Fluorophore auszuwählen.
• LÖSUNG
• Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und durch ein weiteres lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe mit den Merkmalen des nebengeordneten Patentanspruchs 21 gelöst. Die abhängigen Ansprüche 2 bis 20 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß Patentanspruch 1, die abhängigen Ansprüche 22 bis 31 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß Patentanspruch 21. Weiter wird die Aufgabe gelöst durch ein Mikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 32, welches eingerichtet ist zur Ausführung eines bevorzugten Verfahrens mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und des abhängigen Patentanspruchs 6 oder zur Ausführung eines bevorzugten Verfahrens mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 21 und den Merkmalen der abhängigen Patentansprüche 24 und 25. Die abhängigen Patentansprüche 33 und 34 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Mikroskops.
• BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
• Im Rahmen dieser Anmeldung werden bestimmte Begriffe verwendet, deren Bedeutung eingangs klargestellt werden soll. Unter lokalisationsmikroskopischen Verfahren werden alle die Verfahren verstanden, bei denen eine Kenntnis über eine Lage eines Emitters zumindest auch auf dem Wissen darüber basiert, dass der Emitter vereinzelt vorgelegen hat. Hierunter fallen die typischerweise im Weitfeld durchgeführten Verfahren wie PALM oder STORM sowie Verfahren der structured illumionation microscopy, soweit diese an vereinzelten Emittern durchgeführt werden. Hierunter fallen auch die im folgenden genannten Verfahren MINFLUX und STED-Lokalisation sowie Verfahren, bei denen ein Lokalisieren unter Nutzung der Verlagerung einer fokussierten Anregungslichtverteilung mit einem zentralen Intensitätsmaximum innerhalb eines Kleinfeldbereichs erfolgt.
• Unter MINFLUX-Verfahren werden im Rahmen dieser Anmeldung solche Verfahren verstanden, bei denen eine Lokalisation gemäß einem der aus dem Stand der Technik bekannten MINFLUX-Verfahren unter Nutzung einer Anregungslichtverteilung mit einem lokalen, zumeist einem zentralen, das heißt auf der optischen Achse liegenden, Intensitätsminimum erfolgt. Beispielsweise kann eine Anregungslichtverteilung mit einem zentralen Minimum entweder gemeinsam mit einer Verteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht mit einem zentralen Minimum bewegt werden oder aber das zentrale Minimum einer Anregungslichtverteilung wird innerhalb eines Bereichs um ein Minimum einer Verteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht bewegt.
• Unter STED-Lokalisationsverfahren werden im Rahmen dieser Anmeldung solche Verfahren verstanden, bei denen eine Lokalisation gemäß einem der aus dem Stand der Technik bekannten MINFLUX-ähnlichen Verfahren oder gemäß einem ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannten MINSTED-Verfahren unter Nutzung einer Fluoreszenzverhinderungslichtverteilung erfolgt, wobei der Einfluss der Fluoreszenzverhinderungslichtverteilung wesentlich für das Lokalisieren ist. Beispielsweise kann eine Anregungslichtverteilung mit einem zentralen Maximum entweder gemeinsam mit einer Verteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht mit einem zentralen Minimum bewegt werden oder aber das zentrale Minimum einer Fluoreszenzverhinderungslichtverteilung wird innerhalb eines Bereichs um ein Maximum einer Verteilung von Anregungslicht bewegt. In dieser Anmeldung wird die Bezeichnung MINSTED auch auf solche Verfahren angewendet, bei denen die Lokalisation beendet wird, bevor der vereinzelte Emitter seine Anregbarkeit verloren hat oder bei denen kein Schwellwert für eine maximale STED-Intensität existiert, ab der die Intensität des STED-Lichts nicht weiter erhöht wird oder bei denen die Halbwertsbreite der effektiven Anregungsspreizfunktion durch andere Maßnahmen als eine Erhöhung der STED-Intensität verändert wird sowie jeweils auch solche, bei denen das Fluoreszenzverhinderungslicht kein STED-Licht ist.
• Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird zunächst gelöst, durch ein erstes lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe, das im Folgenden beschrieben wird.
• Dieses erfindungsgemäße Verfahren umfasst zunächst ein erstes Anregen und Detektieren, wobei ein Teilbereich der Probe mit Anregungslicht einer ersten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ersten Wellenlänge von einem vereinzelten Molekül eines Farbstoffs emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und ein erstes Detektionssignal erhalten wird. Das Detektionssignal umfasst dabei einen Wert, der repräsentativ für die Menge des detektierten Fluoreszenzlichts ist. Dieser Wert wird in der Folge als Lichtmengenwert bezeichnet. Das Anregen und Detektieren kann dabei derart erfolgen, dass unmittelbar eine erste Lokalisation eines vereinzelten anregbaren Fluorophors erhalten werden kann. In jedem Fall umfasst das Verfahren ein erstes Lokalisieren des vereinzelten Moleküls auf Grundlage des ersten Detektionssignals und ein Erhalten einer ersten Lokalisation.
• Weiter umfasst es ein zweites Anregen und Detektieren, wobei der Teilbereich der Probe mit Anregungslicht einer zweiten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der zweiten Wellenlänge von dem vereinzelten Molekül des Farbstoffs emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und ein zweites Detektionssignal erhalten wird. Dieses zweite Detektionssignal umfasst einen Lichtmengenwert. Das zweite Anregen und Detektieren erfolgt in einer Weise, dass es ein zweites Lokalisieren des vereinzelten Moleküls ist und dass auf Grundlage des zweiten Detektionssignals eine zweite Lokalisation erhalten wird. Diese zweite Lokalisation muss nicht notwendigerweise nach der ersten Lokalisation erhalten werden. Sie ist deswegen als zweite Lokalisation bezeichnet, weil sie unter Nutzung von Anregungslicht einer zweiten Wellenlänge erhalten wird.
• Schließlich umfasst diese Verfahren ein Bestimmen eines Unterschieds zwischen der ersten Lokalisation und der zweiten Lokalisation. Der so bestimmte Unterschied kann bei einer Bildgebung an mit mehreren Farbstoffen gefärbten Proben dazu dienen, eine Ko-Lokalisation oder Ko-Registrierung der mehreren Farbstoffe in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem zu ermöglichen.
• In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Teilbereich der Probe ein Kleinfeldbereich. Unter einem Kleinfeldbereich wird ein Bereich verstanden, der nur wenig größer ist, als sich aus den dem Maß für eine beugungsbegrenzte Trennbarkeit von Strukturen in der Probe ergibt. Ein Kleinfeldbereich kann beispielsweise eine Ausdehnung von weniger als 3 µm, bevorzugt von weniger 2 µm, weiter bevorzugt von weniger als 1,5 µm aufweisen, wobei der Kleinfeldbereich die entsprechende Ausdehnung in einer, bevorzugt aber in zwei oder drei Raumrichtungen aufweist, das heißt in Bezug zu einer Lokalisierung in zwei oder drei Raumrichtungen steht.
• Wenn der Teilbereich ein Kleinfeldbereich ist, erfolgt das Anregen und Detektieren bevorzugt jeweils unter Anwendung von fokussiertem Anregungslicht. Das heißt, sowohl das Anregungslicht der ersten Wellenlänge als auch das der zweiten Wellenlänge werden fokussiert in den Kleinfeldbereich eingestrahlt.
• Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, bei der der Teilbereich ein Kleinfeldbereich ist, erfolgt das erste Anregen und Detektieren mit fokussiertem Anregungslicht der ersten Wellenlänge, das im Fokusbereich eine Intensitätsverteilung mit einem zentralen Minimum aufweist, die insbesondere im Wesentlichen eine Donut-Verteilung oder eine Bottle-Beam-Verteilung ist. Der Fokuspunkt, der hier mit dem Zentrum des zentralen Minimums zusammenfällt, wird dabei an einem Ort innerhalb des Teilbereichs positioniert. Wie ein solcher Teilbereich, das heißt ein Kleinfeldbereich mit einem vereinzelten anregbaren Fluorophor aufgefunden werden kann, ist aus dem Stand der Technik bekannt. Die hier beschriebene bevorzugte Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens weist den Vorteil auf, dass mit der Intensitätsverteilung mit einem zentralen Minimum sowohl ein Auffinden eines Kleinfeldbereichs mit einem vereinzelten anregbaren Fluorophor als auch ein folgendes hochgenaues Lokalisieren mit einem MINFLUX-Verfahren besonders gut möglich ist. Für das Auffinden wird daher vorteilhaft weder eine besondere Lichtquelle benötigt noch ist eine Änderung der Intensitätsverteilung erforderlich. Für das Auffinden kann beispielsweise das Anregungslicht in Spiralbahnen über die Probe geführt werden, bis in einem Teilbereich der Probe pro Zeitraum eine Fluoreszenzmenge detektiert wird, die auf das Vorliegen eines vereinzelten anregbaren Fluorophors hindeutet. An der betreffenden Stelle kann nun das spiralförmige Abtasten beendet werden. Der Fokuspunkt ist dann, wie oben geschrieben, an einem Ort innerhalb des Teilbereichs positioniert. Ebenso wird unmittelbar auch ein Lichtmengenwert erhalten, der mit der beim Auffinden detektierten Fluoreszenzmenge korrespondiert.
• Eine erste Lokalisation kann erhalten werden, indem das Anregen mit der ersten Wellenlänge und das zugehörige Detektieren nach dem Abstoppen der Spiralbewegung fortgesetzt wird, während das Fluoreszenzlicht in einer Ebene, die konjugiert zu der Ebene ist, in der der Fokuspunkt liegt, das heißt, konfokal ist, mit einem ortsauflösenden Detektor detektiert wird oder während eine Detektionsapertur innerhalb einer Ebene, die senkrecht zu einer optischen Achse orientiert ist, an einer Mehrzahl von Positionen um die optische Achse herum positioniert wird. Das in der konfokalen Ebene detektierte Signal ist dann in dieser Ebene vom Ort abhängig, wobei die Ortsabhängigkeit von der Lage des vereinzelten anregbaren Fluorophors relativ zum Fokuspunkt der Anregung abhängt. Für das Fluorophor kann somit eine Lokalisation erhalten werden. Diese hat zwar, verglichen mit einer Lokalisation nach einem MINFLUX-Verfahren, eine hohe Unsicherheit. Die erzielbare Genauigkeit reicht aber aus, um anschließend beispielsweise ein MINFLUX-Lokalisieren beginnen zu können. Sie kann auch ausreichen, um in Verbindung mit weiteren Informationen eine Ko-Lokalisation oder Ko-Registrierung der mehreren Farbstoffe in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem zu ermöglichen.
• Eine alternative Möglichkeit, die gut geeignet ist, um das Auffinden des Kleinfeldbereichs mit dem vereinzelten anregbaren Fluorophor eng mit dem ersten Anregen mit der ersten Wellenlänge zu verbinden, ist, dass die Intensitätsverteilung des fokussierten Lichts der ersten Wellenlänge ein zentrales Maximum aufweist, insbesondere im Wesentlichen eine Gauß'sche Verteilung ist, und dass das erste Anregen und Detektieren, wobei ein Teilbereich der Probe mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge beaufschlagt wird, erfolgt, indem der Fokuspunkt des Anregungslichts der ersten Wellenlänge an einer Abfolge von Orten innerhalb des Teilbereichs positioniert wird. Wie bei der oberhalb beschriebenen Ausführungsform wird eine Detektionssignal mit einem Lichtmengenwert erhalten. Aus den zu der Abfolge von Orten innerhalb des Teilbereichs erhaltenen Teildetektionssignalen kann eine erste Lokalisation erhalten werden.
• Das erste Anregen und Detektieren kann beispielsweise nach einer vorbestimmten Zeitspanne beendet werden. Alternativ kann das erste Anregen und Detektieren beendet werden, wenn ein Lichtmengenwert des ersten Detektionssignals einen Schwellwert erreicht hat, das heißt, wenn eine Mindestzahl von Fluoreszenzphotonen oder eine Mindestlichtmenge detektiert worden sind. Es können auch andere Kriterien definiert sein, bei deren Erfüllen das erste Anregen und Detektieren beendet wird. Beispielsweise kann während des Anregens das Detektionssignal schon während es vollständig aufgenommen wird, untersucht werden, ob ein bestimmtes Verhältnis zu einem Hintergrund erreicht ist. Ein Hintergrund kann beispielsweise mit einer zusätzlichen Detektionseinrichtung gemessen werden.
• Die Intensitätsverteilung des fokussierten Lichts der zweiten Wellenlänge weist bevorzugt ein zentrales Minimum auf, sie ist insbesondere im Wesentlichen eine Donut-Verteilung oder eine Bottle-Beam-Verteilung, wie sie jeweils aus der STED-Mikroskopie bekannt sind. Das zweite Anregen erfolgt dann bevorzugt, indem der Fokuspunkt des Anregungslichts der zweiten Wellenlänge an einer Abfolge von nominellen Orten, die die erste Lokalisation als Bezugspunkt, das heißt als zentralen Ort umschließen, wobei der umschlossene Bereich eine erste Ausdehnung aufweist, innerhalb des Teilbereichs positioniert wird. Diese Abfolge von Orten kann eine bestimmte Anzahl von Orten aufweisen, es kann sich aber auch um eine kontinuierliche Abfolge von Orten handeln. Dass der Bereich der ersten Lokalisation umschlossen ist, umfasst auch, dass die erste Lokalisation in der Abfolge von nominellen Orten enthalten ist. Die Orte werden deswegen als nominelle Orte bezeichnet, weil ein Versatz der Fokuspunkte der Anregungslichtverteilungen, der aufgrund der unterschiedlichen Anregungswellenlängen vorhanden sein kann, vor Durchführung des Verfahren nicht gut bekannt ist. Die Einrichtung, mit der das Verfahren durchgeführt wird, kann daher beispielsweise so eingestellt werden, als träte kein Versatz auf, wobei natürlich beispielsweise bereits vorhandene Kalibrierwerte berücksichtigt werden. Dann weichen die tatsächlichen Fokuspunkte in der Probe um ungefähr den Wert für den Versatz, der der auch nach Berücksichtigung von Kalibrierwerten übrig bleibende sein kann, von den nominellen Fokuspunkten ab.
• Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen, bei denen schließlich ein Kleinfeldbereich mit einem Kleinfeldverfahren untersucht wird, werden im Folgenden genannte weiteren Schritte durchgeführt. Auf Basis eines der Detektionssignale oder auf Basis beider Detektionssignale wird eine Wellenlänge ausgewählt, mit der das vereinzelte Fluorophor weiter lokalisiert werden soll. Die ausgewählte Wellenlänge kann dabei ausgewählt werden aus der ersten oder zweiten Wellenlänge, zu denen bereits jeweils ein Detektionssignal erhalten wurde, oder es kann eine weitere Wellenlänge ausgewählt werden, wenn das Mikroskop mehr als zwei Anregungswellenlängen bereitstellt. Mit dem Licht der ausgewählten Wellenlänge erfolgt dann ein weiteres Anregen innerhalb des Kleinfeldbereichs der Probe, wobei von aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge von dem vereinzelten Molekül des Farbstoffs emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und ein weiteres Detektionssignal erhalten wird. Für das vereinzelte Molekül wird dann auf Grundlage des weiteren Detektionssignals eine weitere Lokalisation erhalten. Wird beispielsweise ein Kleinfeldbereich mit fokussiertem Licht der weiteren Wellenlänge, welches an einem Fokuspunkt verweilt, beleuchtet und erfolgt das Detektieren mit einem konfokal angeordneten Detektor, der ein Beugungsbild in der konfokalen Ebene örtlich auflöst, so kann aus dem Detektionssignal eine Lokalisation bestimmt werden. Bei einer bevorzugten Methode erfolgt das Anregen mit der weiteren Wellenlänge, indem der Fokuspunkt an einer Abfolge von Orten, die den aufgrund der im Verfahren früher erhaltenen Informationen vermuteten Ort des vereinzelten Fluorophors umschließen, platziert wird, das heißt, das Anregen und Detektieren wird insgesamt als ein Lokalisieren ausgeführt.
• Das Auswählen der Wellenlänge erfolgt dabei bevorzugt durch ein Auswerten des ersten oder des zweiten Detektionssignals oder beider Detektionssignale. Diese Auswertung kann beispielsweise darauf gerichtet sein, die Farbstoffsorte des vereinzelten Fluorophors, das das detektierte Fluoreszenzlicht emittiert hat, zu bestimmen. Beispielsweise kann aus der pro Zeit empfangenen Lichtmenge schon nur einer Wellenlänge erschlossen werden, ob das vereinzelte Fluorophor stark oder schwach angeregt wurde. Es können auch ein oder mehrere Referenzwerte hinterlegt sein, mit denen ein Detektionssignal oder beide verglichen werden. Eine bevorzugte Methode stützt sich auf einen Vergleich der beiden Detektionssignale, der in vielen Fällen ein guter Indikator der Fluorophorsorte ist. Ist beispielsweise die pro Zeit empfangene Lichtmenge des einen Detektionssignals ein Vielfaches der des anderen Detektionssignals, so kann auch ohne den Zwischenschritt des Rückschließens auf die Fluorophorsorte die Wellenlänge des stärkeren Signals ausgewählt werden. Die ausgewählte Wellenlänge kann also die erste Wellenlänge oder die zweite Wellenlänge sein.
• Hierbei kann aber auch eine weitere Wellenlänge ausgewählt werden, die sich sowohl von der ersten Wellenlänge als auch von der zweiten Wellenlänge unterscheidet. Dies kann insbesondere in Fällen sinnvoll sein, in denen in der Probe Fluorophore einer Sorte lokalisiert werden soll, die mit Wellenlängen, mit denen in der Probe enthaltene Fluorophore einer anderen Sorte gut lokalisiert werden können, nicht hinreichend gut lokalisiert werden können, um das Ziel einer Ko-Lokalisation erreichen zu können. Wird eine solche weitere Wellenlänge ausgewählt, dann umfasst das Verfahren auch ein Bestimmen eines Unterschieds zwischen der ersten Lokalisation und der weiteren Lokalisation, die mit der weiteren Wellenlänge erhalten wird oder der zweiten Lokalisation und dieser weiteren Lokalisation oder ein Bestimmen beider dieser Unterschiede. Bevorzugt ist das Licht der weiteren Wellenlänge fokussiertes Licht. Es weist weiter bevorzugt im Fokusbereich eine Intensitätsverteilung mit einem zentralen Minimum auf. Diese Intensitätsverteilung kann bevorzugt eine Donut-Verteilung oder eine Bottle-Beam-Verteilung sein. Das weitere Anregen und Detektieren kann dann in allen den Weisen erfolgen, die oberhalb mit Blick auf das zweite Anregen und Detektieren beschrieben sind. Dabei kann der Bezugspunkt aus der ersten oder der zweiten oder aus der ersten und der zweiten Lokalisation berechnet sein, wobei die erste Lokalisation nur berücksichtigt werden kann, wenn sie bereits erhalten wurde. Bevorzugt wird der Bezugspunkt aus der ersten Lokalisation bestimmt oder ist unmittelbar durch die erste Lokalisation gegeben, wenn die ausgewählte Wellenlänge die erste Wellenlänge ist. Entsprechend wird der Bezugspunkt bevorzugt aus der zweiten Lokalisation bestimmt oder ist unmittelbar durch die zweite Lokalisation gegeben, wenn die ausgewählte Wellenlänge die zweite Wellenlänge ist. Wenn die ausgewählte Wellenlänge eine weitere Wellenlänge ist, die zwischen der ersten und der zweiten Wellenlänge liegt, kann der Bezugspunkt durch Interpolation aus der ersten und der zweiten Lokalisation bestimmt werden und wenn die ausgewählte Wellenlänge eine weitere Wellenlänge ist, die größer als die erste und die zweite Wellenlänge oder kleiner als die erste und die zweite Wellenlänge ist, kann er durch Extrapolation aus der ersten und der zweiten Lokalisation bestimmt werden.
• Es wurde bereits darauf hingewiesen, dass das erste Anregen und Detektieren nicht zwingend mit einem ersten Lokalisieren verbunden ist. Insbesondere in einem solchen Fall erfolgt das erste Lokalisieren nach dem Auswählen einer Wellenlänge. Dann ist die ausgewählte Wellenlänge die erste Wellenlänge und das weitere Lokalisieren ist das erste Lokalisieren. Das weitere Anregen und Detektieren und das weitere, das heißt das erste Lokalisieren des vereinzelten Fluorophors werden dann bevorzugt zusammenhängend oder iterativ solange durchgeführt, bis eine weitere Lokalisation mit höchstens einer vorbestimmten Unsicherheit erhalten wird, die dann die erste Lokalisation ist. In einem solchen Fall erfolgt das zweite Anregen und Detektieren und das zweite Lokalisieren erst nach dem Beenden des weiteren Anregens und Detektierens.
• Um nun ein Bild der mehrfach gefärbten Probe oder eines Bereichs der Probe, zum Beispiel einer bestimmten biologischen Struktur zu gewinnen, kann eines der im Kleinfeld durchgeführten Verfahren wiederholt oder parallelisiert an verschiedenen vereinzelten Fluorophoren durchgeführt werden. Dabei kann eine Abbildung, in der die Mehrfachfärbung zum Informationsgewinn beiträgt, erhalten werden, wenn insgesamt vereinzelte Fluorophore der mehreren Fluorophorsorten lokalisiert werden. Hierzu sind dann insgesamt mehrere Kleinfeldbereiche zu untersuchen, die aber bevorzugt überlappen und, wenn die zu untersuchende Struktur selbst sehr klein ist, auch gemeinsam einen Kleinfeldbereich bilden. Eines der Kleinfeldverfahren wird dann also für eine Menge von Teilbereichen, das heißt Kleinfeldbereichen der Probe durchgeführt, wobei die Menge von Teilbereichen sowohl Teilbereiche enthält, aus denen von jeweils einem vereinzelten Fluorophor eines ersten Farbstoffs Fluoreszenzlicht emittiert und detektiert wurde als auch solche, aus denen von jeweils einem vereinzelten Fluorophor eines anderen Farbstoffs Fluoreszenzlicht emittiert und detektiert wurde.
• Die jeweils bestimmten Unterschiede zwischen den Lokalisationen, also zwischen den ersten und den zweiten oder zwischen den ersten und den zweiten und den weiteren, können genutzt werden, um alle Lokalisationen in ein gemeinsames Bezugssystem zu übertragen, das heißt, um für vereinzelte Fluorophore verschiedener Sorten eine Ko-Lokalisation zu erhalten. Hierfür kann bevorzugt aus den Lokalisationen und den Unterschieden der Lokalisationen der einzelnen vereinzelten Fluorophore, die mit Anregungslicht verschiedener Wellenlängen erhalten wurden, eine Karte mit Korrekturvektoren für die Ko-Registrierung aller Lokalisationen in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem bestimmt werden. Bevorzugt ist zu jeder der Lokalisationen Information über die Zeit, zu der das Anregen und Detektieren für das Lokalisieren erfolgte, gespeichert. Diese Information kann dann im jeweiligen Detektionssignal enthalten sein. Die Karte mit Korrekturvektoren kann dann eine von einer Zeitkoordinate abhängende Karte sein. Die Korrekturvektoren können dabei jeweils Mittelwerten über mehrere oder viele Unterschiede entsprechen. Wenn die Probe oder die Eigenschaften der Abbildung der Probe zeitlich schwanken, ist es vorteilhaft, solche Mittelwerte über Unterschiede zu bilden, die in enger zeitlicher Nachbarschaft erhalten wurden. Entsprechend kann bei räumlicher Variabilität die Mittelwertbildung über enge räumliche Nachbarschaften erfolgen. Um dann beispielsweise längerfristige zeitliche Driften im Bild, das heißt hier im Bildstapel zu korrigieren, stehen dann aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren zur Verfügung. Entweder kann eine aktive Stabilisierung erfolgen, dann sind die relativen Driften der Farbkanäle zueinander die wesentliche Korrektur, die mittels der Erfindung korrigiert werden können, oder es kann eine Nachbearbeitung erfolgen, die sich bei Anwendung erfindungsgemäßer Verfahren auf verbesserte Grunddaten stützt.
• Für die Bildgewinnung können grundsätzlich alle erhaltenen Lokalisationen und alle bestimmten Unterschiede genutzt werden. Ein Bild der Probe kann also aus den ersten und den zweiten Lokalisationen und/oder den ersten und den weiteren Lokalisationen und/oder den zweiten und den weiteren Lokalisationen und optional aus anderen Lokalisationen, die mittels Anregen mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge oder der zweiten Wellenlänge oder einer der weiteren Wellenlängen und Detektieren erhalten wurden, erzeugt werden.
• Grundsätzlich kann auch bei Anwendung eines Kleinfeldverfahrens das erste Anregen und Detektieren und das zweite Anregen und Detektieren in gleichen oder überlappenden Zeiträumen erfolgen. Bevorzugt erfolgt es bei Anwendung eines Kleinfeldverfahrens aber in voneinander unterschiedlichen Zeiträumen, die weiter bevorzugt nicht überlappen. Dabei erfolgt das erste Anregen und Detektieren zeitlich vor dem zweiten Anregen und Detektieren. Das schließt, wie weiter oben geschrieben, nicht aus, dass das erste Lokalisieren nach dem zweiten Anregen und Detektieren erfolgt.
• Das erste erfindungsgemäße Verfahren kann auch im Weitfeld durchgeführt werden. Dann ist der Teilbereich der Probe ein Weitfeldbereich und das Detektieren ist ein Abbilden des Teilbereichs auf einen Weitfelddetektor, wobei von dem vereinzelten Molekül emittiertes Fluoreszenzlicht auf dem Weitfelddetektor örtlich aufgelöst detektiert wird, sodass ein örtlich aufgelöstes Detektionssignal erhalten wird. Weitfeldverfahren ermöglichen vorteilhaft, mehrere oder viele vereinzelte Fluorophore auf vergleichsweise einfache Weise gleichzeitig zu lokalisieren. Bei dem ersten Anregen und Detektieren und dem zweiten Anregen und Detektieren wird dann von aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit Anregungslicht der jeweiligen Wellenlänge von mehreren vereinzelten Molekülen emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und zu mehreren vereinzelten Molekülen wird jeweils ein erstes und ein zweites örtlich aufgelöstes Detektionssignal erhalten. Das erste und das zweite Lokalisieren mehrerer vereinzelter Moleküle, das heißt Fluorophore erfolgt dann auf Grundlage der jeweiligen ersten und zweiten örtlich aufgelösten Detektionssignale, aus denen jeweils die ersten und zweiten Lokalisationen erhalten werden. Wie aus Weitfelddaten eine Lokalisation erfolgt, ist dem Fachmann bekannt. Das Lokalisieren ist bei Weitfeldverfahren letztlich ein Analysieren von Bilddaten, während bei einigen der vorgehend genannten Kleinfeldverfahren das Lokalisieren ein Prozess ist, der ein Abtasten in einer bestimmten Weise umfasst. Wird ein erfindungsgemäßes Verfahren im Weitfeld durchgeführt, dann erfolgt jeweils zumindest ein Bestimmen eines Unterschieds zwischen der ersten Lokalisation und der zweiten Lokalisation.
• Auch bei Anwendung von Weitfeldverfahren kann zu den mehreren vereinzelten Molekülen, von denen emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert wurde, jeweils anhand des ersten und/oder des zweiten Detektionssignals bestimmt werden, zu welchem Farbstoff das vereinzelte Molekül gehört. Bei Anwendung von Weitfeldverfahren kann bevorzugt das erste Anregen und Detektieren und das zweite Anregen und Detektieren gleichzeitig erfolgen. Sinnvoll ist dies, wenn für die Detektion Detektoren zur Verfügung stehen, die in unterschiedlichen spektralen Kanälen detektieren. Auch bei Weitfeldverfahren kann das erste Anregen und Detektieren nach einer vorbestimmten Zeitspanne beendet werden. Es kann auch eine weitere Wellenlänge für ein weiteres Anregen und Detektieren ausgewählt werden. Dies erfolgt dann bevorzugt aus einer vorbestimmten Menge von mindestens zwei Wellenlängen. Dem Auswählen nachfolgend erfolgt dann das weitere Anregen und Detektieren, wobei der Teilbereich der Probe mit Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge von mehreren vereinzelten Molekülen emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und jeweils ein weiteres Detektionssignal erhalten wird. Ein weiteres Lokalisieren der mehreren vereinzelten Moleküle erfolgt dann auf Grundlage jeweils des weiteren Detektionssignals, sodass jeweils für mehrere vereinzelte Fluorophore eine weiteren Lokalisation erhalten wird. Es ist dabei nicht notwendig, dass tatsächlich für alle vereinzelten Fluorophore, die angeregt wurden, auch eine Lokalisation erhalten wird.
• Das Auswählen der Wellenlänge kann bei Anwendung eines Weitfeldverfahrens bevorzugt erfolgen durch ein Auswerten der Menge der ersten und der zweiten Detektionssignale hinsichtlich der Sorte des Farbstoffs, dessen vereinzelte Moleküle das detektierte Fluoreszenzlicht emittiert haben, das den überwiegenden Anteil der Menge der erhaltenen Detektionssignale hervorgerufen hat. Auch ohne eine Analyse hinsichtlich der Farbstoffsorte kann ein Auswählen erfolgen, beispielsweise indem untersucht wird, zu welcher Anregungswellenlänge mehr Fluoreszenz vereinzelter Fluorophore beobachtet wird. Die ausgewählte Wellenlänge kann auch hier nicht nur die erste oder die zweite Wellenlänge sein, sondern sie kann auch eine weitere Wellenlänge sein, die sich von der ersten und der zweiten Wellenlänge unterscheidet. Dann umfasst das erste erfindungsgemäße Verfahren ein Bestimmen jeweils eines Unterschieds zwischen der jeweiligen ersten Lokalisation und der jeweiligen weiteren Lokalisation und/oder jeweils zwischen der jeweiligen zweiten Lokalisation und der jeweiligen weiteren Lokalisation.
• Weiter wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst, durch ein zweites lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe, das im nun Folgenden beschrieben wird.
• Das zweite Verfahren umfasst ein testweises Anregen und Detektieren, wobei ein Teilbereich der Probe mit Anregungslicht einer Testwellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der Testwellenlänge von einem vereinzelten Fluorophor emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und ein Testdetektionssignal erhalten wird.
• Auf Basis dieses Testsignals, optional gestützt auf weitere Informationen wie ein zweites Testsignal erfolgt in einer Alternative ein Auswählen einer ersten Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge von mindestens zwei Wellenlängen für ein folgendes Anregen des Teilbereichs der Probe. Mit Licht dieser ausgewählten ersten Wellenlänge erfolgt ein erstes Anregen und Detektieren, wobei der Teilbereich der Probe mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ersten Wellenlänge von dem vereinzelten Molekül emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und ein erstes Detektionssignal erhalten wird. Das vereinzelte anregbare Fluorophor wird auf Grundlage des ersten Detektionssignals lokalisiert, sodass eine ersten Lokalisation erhalten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erste Wellenlänge auf Basis zweier Testdetektionssignale ausgewählt. In dieser Alternative erfolgt vor dem Auswählen und nach dem testweisen Anregen und Detektieren ein zweites testweises Anregen, wobei der Teilbereich der Probe mit Anregungslicht einer zweiten Testwellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der zweiten Testwellenlänge von einem vereinzelten Molekül emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und ein zweites Testdetektionssignal erhalten wird.
• In einer anderen Alternative erfolgt auf Basis des Testsignals ein Auswählen eines Kleinfeldbereichs für ein folgendes Anregen des Teilbereichs, das heißt, eines Kleinfeldbereichs, in dem das folgende Anregen und Detektieren durchgeführt wird. In diesem Fall kann von vornherein festgelegt sein, mit welcher Wellenlänge das folgende Anregen und Detektieren erfolgt. Diese tritt dann an die Stelle der ausgewählten Wellenlänge der ersten Alternative. Die Alternativen schließen sich aber nicht aus. Vielmehr ist es möglich, dass sowohl ein Kleinfeldbereich als auch eine Wellenlänge ausgewählt werden.
• Unabhängig davon, ob ein oder zwei Testdetektionssignale bestimmt werden, kann jedes Testdetektionssignal ein Wert, der repräsentativ für die Menge des detektierten Fluoreszenzlichts ist, sein. Das Auswählen der ersten Wellenlänge kann, wenn zwei Testdetektionssignale bestimmt werden,. auf Basis auf Basis des Verhältnisses des ersten Testsignals zu dem zweiten Testsignal erfolgen. Es kann auch auf Basis eines Vergleichs des ersten, des zweiten oder des ersten und zweiten Testdetektionssignals mit einem vorbestimmten Referenzwert oder mit vorbestimmten Referenzwerten erfolgen. Die Testwellenlängen können jeweils Wellenlängen sein, die für ein verfahrensgemäßes Lokalisieren genutzt werden, das heißt, sowohl die erste Testwellenlänge als auch die zweite Testwellenlänge kann eine Wellenlänge sein, die in der vorbestimmten Menge von Wellenlängen für das Anregen enthalten ist.
• Dieses Verfahren ist zunächst nicht durch das Merkmal des Bestimmens eines Unterschieds zwischen zwei Lokalisationen gekennzeichnet. Ebenso wenig ist es gekennzeichnet durch ein zweites Lokalisieren mit einer zweiten Wellenlänge. Auch ohne diese Merkmale wird ein entscheidender Vorteil erreicht. Wenn beispielsweise eine Bewegung von mit Fluorophoren markierten Strukturen in einer mehrfarbig gefärbten Probe verfolgt werden soll, so ermöglicht das Verfahren, dass eine für das Verfolgen besonders geeignete Wellenlänge ausgewählt wird. Auch bei einem Verfolgen einer Struktur kann jeweils ein Lokalisieren mit der ersten Wellenlänge erfolgen, wobei über die Zeit jeweils neue Lokalisierungen anhand desselben Fluorophors bestimmt werden.
• Dem testweisen Anregen und Detektieren nachfolgend kann aber auch bei diesem zweiten erfindungsgemäßen Verfahren ein Auswählen einer zweiten Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge von mindestens zwei Wellenlängen für ein folgendes Anregen des Teilbereichs der Probe und ein zweites Anregen und Detektieren erfolgen. Dabei wird der Teilbereich der Probe mit Anregungslicht der zweiten Wellenlänge beaufschlagt und aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der zweiten Wellenlänge von dem vereinzelten Molekül emittiertes Fluoreszenzlicht wird detektiert, sodass ein zweites Detektionssignal erhalten wird. Auf Grundlage dieses Detektionssignals erfolgt ein zweites Lokalisieren des vereinzelten Fluorophors, sodass eine zweite Lokalisation erhalten wird. Schließlich kann auch bei dem zweiten erfindungsgemäßen Verfahren ein Unterschied zwischen der ersten Lokalisation und der zweiten Lokalisation bestimmt werden. Erfolgt bei dem zweiten erfindungsgemäßen Verfahren ein zweites Anregen und Detektieren mit einer zweiten Wellenlänge, können somit die meisten Vorteile des ersten Verfahren ebenfalls realisiert werden.
• Wie das erste Verfahren, kann auch das zweite Verfahren nicht nur als Weitfeldverfahren, sondern auch vollständig als Kleinfeldverfahren ausgeführt werden. Dann ist der Teilbereich der Probe von vornherein ein Kleinfeldbereich, der beispielsweise eine Ausdehnung von 3 µm oder von weniger als 2 µm aufweist. Das zweite Verfahren kann aber bevorzugt auch ausgeführt werden, indem das testweise Anregen und Detektieren, hier jeweils unabhängig voneinander sowohl das erste als auch das optionale zweite, in einem Weitfeldverfahren erfolgt, während das erste oder das zweite oder das erste und zweite Lokalisieren jeweils in einem Kleinfeldverfahren erfolgt. Ist dies der Fall, dann wird nach dem testweisen Detektieren ein Kleinfeldbereich ausgewählt, in dem dann das erste oder das erste und zweite Lokalisieren durchgeführt wird.
• Bevorzugt erfolgt sowohl bei dem ersten als auch dem zweiten erfindungsgemäßen Verfahren das erste Lokalisieren nach einem MINFLUX-Verfahren, einem MI NSTED-Verfahren oder einem STED-Lokalisationsverfahren. Ein MINSTED-Verfahren ist dabei besonders vorteilhaft anwendbar, wenn das erste Lokalisieren im Rahmen des Verfolgens einer fluoreszenzmarkierten Struktur angewendet wird. Auch das zweite Verfahren kann auch dann, wenn das Lokalisieren jeweils im Kleinfeld erfolgt, im Rahmen des Abbildens von Strukturen in einer Probe angewendet werden. Dann wird auch dieses Verfahren für eine Menge von Teilbereichen der Probe durchgeführt, sodass die schließlich untersuchte Menge von Teilbereichen sowohl Teilbereiche enthält, aus denen von jeweils einem vereinzelten Molekül eines ersten Farbstoffs Fluoreszenzlicht emittiert und detektiert wurde als auch solche, aus denen von jeweils einem vereinzelten Molekül eines anderen Farbstoffs Fluoreszenzlicht emittiert und detektiert wurde.
• Wie bei dem ersten Verfahren, kann auch bei dem zweiten Verfahren aus den Lokalisationen und den Unterschieden der Lokalisationen der einzelnen vereinzelten Moleküle, die mit Anregungslicht verschiedener Wellenlängen erhalten wurden, eine Karte mit Korrekturvektoren für die Ko-Registrierung aller Lokalisationen in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem bestimmt werden. Dies gilt auch insofern, dass zu jeder der Lokalisationen Information über die Zeit, zu der das Anregen und Detektieren für das Lokalisieren erfolgte, gespeichert sein kann und dass die Karte mit Korrekturvektoren eine von einer Zeitkoordinate abhängende Karte sein kann. Ebenso kann aus den ersten und den zweiten und optional aus anderen Lokalisationen, die mittels Anregen mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge oder der zweiten Wellenlänge erhalten wurden, ein Bild der Probe erzeugt werden.
• Schließlich wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst durch ein erfindungsgemäßes Mikroskop. Das Mikroskop ist eingerichtet zur Ausführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere zur Ausführung eines Verfahrens, bei dem ein Auswählen einer Wellenlänge erfolgt. Das Mikroskop weist eine Lasereinheit für die Anregung von Fluoreszenz auf, die eingerichtet ist, schmalbandiges Licht zweier Wellenlängen abzugeben, oder zwei Lasereinheiten für die Anregung von Fluoreszenz, die zusammen eingerichtet sind, schmalbandiges Licht zweier Wellenlängen abzugeben. Weiter weist es eine Detektionseinheit auf und eine Auswahleinheit, die eingerichtet ist, auf Basis eines Detektionssignals hinsichtlich einer Fluoreszenzemission eines einzelnen Fluorophors eine Wellenlänge für ein Anregen auszuwählen. Zudem weist es eine Berechnungseinheit, die eingerichtet ist, aus zwei Detektionssignalen hinsichtlich einer Fluoreszenzemission eines einzelnen Fluorophors jeweils eine Lokalisation und einen Unterschied der Lokalisationen zu bestimmen, auf. Bevorzugt kann das Mikroskop Anregungslicht zweier Wellenlängen bereitstellen, die sich um einen Wert zwischen 200 nm und 50 nm voneinander unterscheiden. Weiter bevorzugt weist das Mikroskop eine Lasereinheit auf, die eingerichtet ist, schmalbandiges Licht einer dritten Wellenlänge abzugeben. Dies schließt nicht aus, dass es insgesamt eine Lasereinheit aufweist, die eingerichtet ist, insgesamt der Wellenlängen abzugeben, die die oben genannten Bedingungen zueinander erfüllen. Weiter bevorzug weist das Mikroskop einen oder mehrere STED-Laser auf. Bevorzugt weist es eine Steuereinheit auf, die bevorzugt eingerichtet zur Durchführung eines MINFLUX-Verfahrens, ein STED-Lokalisationsverfahrens oder eines MINSTED-Verfahrens. Weitere vorteilhafte Merkmale des erfindungsgemäßen Mikroskops ergeben sich insbesondere aus den im Zusammenhang mit den Verfahren genannten Angaben.
• Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen und den zugehörigen Erläuterungen zu den Zeichnungen. Einige der Zeichnungen sind Ablaufdiagramme, anhand derer die erfindungsgemäßen Verfahren insgesamt sehr ausführlich erläutert werden.
• Die Ansprüche sind nicht dahingehend zu verstehen, dass nur solche Gegenstände, Vorrichtungen oder Verfahren, die jeweils nur alle oder keines der Merkmale eines Unteranspruchs zusätzlich zu den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche 1, 21 und 32 aufweisen, mögliche Weiterbildungen der Erfindung sein können. Vielmehr können sich weitere Weiterbildungen aus in der Beschreibung genannten sowie aus den Zeichnungen und den zugehörigen Erläuterungen entnehmbaren Merkmalen, die einzeln oder kumulativ zur Wirkung kommen können, ergeben. Insbesondere sind viele Merkmale, die in dieser eingereichten Fassung nur im Zusammenhang mit einem der beiden erfindungsgemäßen Verfahren nach Anspruch 1 oder nach Anspruch 21 erläutert werden, auch Merkmale vorteilhafter Weiterbildungen des jeweils anderen erfindungsgemäßen Verfahrens.
• Figurenliste
• 1 zeigt Absorptions- und Emissionsspektren zweier Fluoreszenzfarbstoffe, die geeignet sind für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren.
• 2 zeigt ein Ablaufdiagramm des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens.
• 3 zeigt ein Ablaufdiagramm einer Durchführung einer ersten Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem ein Anregen und Detektieren in einem Kleinfeldbereich erfolgt.
• 4 zeigt ein Ablaufdiagramm einer anderen Durchführung der auch in 3 dargestellten Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens.
• 5 zeigt ein Ablaufdiagramm einer weiteren Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens.
• 6 zeigt ein Ablaufdiagramm zu Schritten, die in mehreren der Ausführungsformen beider erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden können.
• 7 ist eine schematische Darstellung zum Auswählen einer Wellenlänge aus einer Menge von Wellenlängen.
• 8 illustriert, dass jeder Schritt Anregen und Detektieren die zwei Elemente Anregen und Detektieren umfasst.
• 9 zeigt ein Ablaufdiagramm einer weiteren Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Auswählen einer weiteren Wellenlänge.
• 10 zeigt ein Ablaufdiagramm einer ersten Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens.
• 11 zeigt ein Ablaufdiagramm einer zweiten Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Auswählen eines Kleinfeldbereichs.
• 12 zeigt einen Teilbereich einer mehrfarbig gefärbten Probe mit einem Kleinfeldbereich mit einem vereinzelten anregbaren Fluorophor und weiteren anregbaren Fluorophoren.
• 13 zeigt ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der ein testweises Anregen und Detektieren mit zwei Testwellenlängen durchgeführt wird.
• 14 zeigt ein Ablaufdiagramm einer weiteren Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der ein testweises Anregen und Detektieren mit zwei Testwellenlängen durchgeführt wird mit einem Auswählen eines Kleinfeldbereichs.
• 15 zeigt ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem Erhalten einer ersten und einer zweiten Lokalisation und dem Erhalten eines Unterschieds der Lokalisationen durch ein Vergleichen.
• 16 zeigt ein Schema zur Illustration, auf welche Weise eine Ko-Lokalisation verschiedenartiger Fluorophore in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem ermöglicht wird.
• 17 zeigt ein weiteres Schema zur Illustration, auf welche Weise eine Ko-Lokalisation verschiedenartiger Fluorophore in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem ermöglicht wird.
• 18 zeigt ein noch weiteres Schema zur Illustration, auf welche Weise eine Ko-Lokalisation verschiedenartiger Fluorophore in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem ermöglicht wird.
• 19 zeigt ein Schema hinsichtlich der Ko-Lokalisation von mehr als zwei Farbstoffsorten.
• 20 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Mikroskop.
• FIGURENBESCHREIBUNG UND ERLÄUTERUNG DER ERFINDUNG ANHAND DER FIGUREN
• Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
• In 1 sind Anregungsspektren 6,7- und Emissionsspektren 8,9 der zwei Fluoreszenzfarbstoffe Alexa Fluor 568 und Alexa Fluor 647 gezeigt. Dieses Paar von Farbstoffen ist für die Durchführung erfindungsgemäßer Verfahren geeignet. Alle Anregungsspektren 6,7 und Emissionsspektren 8,9 sind auf ihren jeweiligen Maximalwert normiert, die Werte an der Ordinate sind Verhältniswerte in Prozent des zugehörigen Maximalwerts. Die Werte an der Abszisse geben die Wellenlänge in der Einheit Nanometer an. Alle folgenden Angaben zu den Anregungsspektren 6,7 und Emissionsspektren 8,9 sind aus der Darstellung abgeleitet, also nicht einer Wertetabelle entnommen. Der Grund hierfür ist, dass es nicht auf die exakten Werte ankommt, sondern nur auf bestimmte Eigenschaften, die anhand der Figur verdeutlicht werden. Das Anregungsspektrum 6 des Fluoreszenzfarbstoffs Alexa Fluor 568 weist demnach bei einer Wellenlänge von 525 nm einen Wert von etwa 30% auf, bei einer Wellenlänge von 568 nm weist es das Maximum auf, bei einer Wellenlänge von 600 nm beträgt der Wert des Anregungsspektrums 6 noch knapp 40%, bei etwa 625 nm noch rund 5% und bei einer Wellenlänge von 647 nm liegt der Wert nahe Null (0). Das Anregungsspektrum 7 von Alexa Fluor 647 weist sein Maximum bei 647 nm auf, bei 625 nm beträgt sein Wert etwa 40%, bei 600 nm etwa 30%, bei einer Wellenlänge von 568 nm beträgt der Wert etwa 10% und bei einer Wellenlänge von 525 nm beträgt der Wert weniger als 5%. Entscheidend für die Anwendbarkeit des Farbstoffpaares ist, dass einerseits die Anregungsspektren 6,7 einen Überlapp zeigen, das heißt, dass es Wellenlängen gibt, mit deren Licht sowohl der eine als auch der andere Farbstoff angeregt werden können, und dass andererseits Wellenlängen existieren, mit deren Licht nur jeweils einer der beiden Farbstoffe gut angeregt werden kann oder mit deren Licht einer der Farbstoffe wesentlich stärker, beispielsweise zehnmal so stark wie der andere, angeregt werden kann. Für die dargestellte Farbstoffpaarung kann beispielsweise mit einer Wellenlänge von 525 nm der Farbstoff Alexa Fluor 568 gut angeregt werden, konkret mit etwa 30% der maximal für diesen Farbstoff erzielbaren Anregungswahrscheinlichkeit, während der Farbstoff Alexa Fluor 647 nur mit weniger als 5% der maximal erzielbaren Anregungswahrscheinlichkeit angeregt werden kann. Ähnlich günstige Verhältnisse ergeben sich beispielsweise für den gesamten Wellenlängenbereich von 525 nm bis etwa bei 568 nm. Umgekehrt kann mit einer Wellenlänge von 625 nm der Farbstoff Alexa Fluor 647 gut, mit einer relativen Anregungswahrscheinlichkeit von etwa 40%, angeregt werden und der Farbstoff Alexa Fluor 568 wird bei dieser Wellenlänge kaum, mit einer relativen Anregungswahrscheinlichkeit von etwa 5%, angeregt.
• In 2 ist ein Ablaufdiagramm zu einem ersten erfindungsgemäßen Verfahren dargestellt. Das Verfahren wird ausgeführt an einer mehrfarbig gefärbten Probe mit vereinzelten anregbaren Fluorophoren oder genauer an einem Teilbereich 1 einer mehrfarbig gefärbten Probe mit vereinzelten anregbaren Fluorophoren, wobei der Teilbereich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe auch die ganze Probe umfassen kann. Ein vereinzeltes anregbares Fluorophor ist dabei ein Fluorophor, welches lokalisiert werden kann, wobei der aus der Lokalisationsmikroskopie bekannte Begriff des Lokalisierens 11,21,113 den Prozess bezeichnet, durch den eine Lokalisation 12,22,114 eines Fluorophors erhalten wird. Wie in einer Probe dafür Sorge getragen werden kann, dass in der Probe oder in Teilbereichen der Probe vereinzelt anregbare Fluorophore vorliegen, ist dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt. In der linken Spalte sind von oben nach unten folgende Verfahrensschritte beziehungsweise Verfahrenselemente angegeben: erstes Anregen und Detektieren 10, erstes Lokalisieren 11, erste Lokalisation 12. Das erste Anregen und Detektieren 10 erfolgt unter Nutzung von Anregungslicht einer ersten Wellenlänge. Entsprechend sind in der rechten Spalte von oben nach unten weitere Verfahrensschritte beziehungsweise Verfahrenselemente angegeben: zweites Anregen und Detektieren 20, zweites Lokalisieren 21 und zweite Lokalisation 22. Das zweite Anregen und Detektieren 20 erfolgt unter Nutzung von Anregungslicht einer zweiten Wellenlänge, die sich von der ersten Wellenlänge unterscheidet. Die Schritte erstes Anregen und Detektieren 10 und erstes Lokalisieren 11 sowie zweites Anregen und Detektieren 20 und zweites Lokalisieren 21 sind jeweils durch eine Linie verbunden; die Schritte erstes Anregen und Detektieren 10 und erstes Lokalisieren 11 stehen nämlich in einem engen Zusammenhang, dessen Art abhängig ist von der konkreten Ausführung beziehungsweise Ausführungsform. In manchen Ausführungsformen erfolgen das erste Anregen und Detektieren 10 und das erste Lokalisieren 11 gleichzeitig, das heißt, während des ersten Anregens und Detektierens 10 wird der Prozess des ersten Lokalisierens 11 durchgeführt, oder das Ergebnis des Detektierens 71 aus dem ersten Anregen und Detektieren 10 wird unmittelbar für das Bestimmen der ersten Lokalisation 12 genutzt. In anderen Ausführungsformen wird das Ergebnis des Detektierens 71 aus dem ersten Anregen und Detektieren 10 nicht unmittelbar für das Bestimmen der ersten Lokalisation 12 genutzt oder das Lokalisieren 11 wird nicht in unmittelbarem Zusammenhang mit dem ersten Anregen und Detektieren 10 durchgeführt, sondern der Schritt des ersten Lokalisierens 11 wird separat in Zusammenhang mit einem weiteren Anregen und Detektieren 15 durchgeführt. Als Ergebnis des ersten Lokalisierens 11 wird schließlich eine erste Lokalisation 12 erhalten. Das Gesagte gilt sinngemäß ebenso für die Schritte beziehungsweise Elemente zweites Anregen und Detektieren 20, zweites Lokalisieren 21 und zweite Lokalisation 22. Im Regelfall wird hier allerdings das zweite Anregen und Detektieren 21 und das zweite Lokalisieren 21 gleichzeitig erfolgen, das heißt, während des zweiten Anregens und Detektierens 20 wird der Prozess des zweiten Lokalisierens 21 durchgeführt, oder das Ergebnis des Detektierens 71 aus dem zweiten Anregen und Detektieren 20 wird unmittelbar für das zweite Lokalisieren 21 genutzt. Die Schritte der linken und der rechten Spalte können gleichzeitig durchgeführt werden. Dann ist es notwendig, dass für das Detektieren 71 mindestens zwei Spektralkanäle genutzt werden, von denen mindestens einer derart eingerichtet ist, dass in ihm Fluoreszenz von zwei der verwendeten Farbstoffe detektiert werden kann, und zwar derart, dass für die zwei der verwendeten Farbstoffe ein Lokalisieren 11,21,113 erfolgen kann. Sie können zeitlich nacheinander durchgeführt werden, dann reicht für das Detektieren 71 ein einzelner Spektralkanal aus. Das erste Anregen und Detektieren 10 und das zweite Anregen und Detektieren 20 können, wie beispielsweise bei PALM oder STORM üblich, im Weitfeld erfolgen oder es kann jeweils, wie bei MINFLUX, in einem Kleinfeldbereich erfolgen. Das erste und/oder das zweite Anregen und Detektieren 10,20 kann jeweils auch unter Nutzung einer Verteilung von zusätzlichem Fluoreszenzverhinderungslicht erfolgen, insbesondere auch derart, dass das Lokalisieren mittels eines STED-Lokalisationsverfahrens oder eines MINSTED-Verfahrens erfolgt.
• Es ist zwar aus dem Stand der Technik bekannt, lokalisationsmikroskopische Verfahren im Weitfeld unter Nutzung zweier Anregungswellenlängen und zweier Spektralkanäle durchzuführen. Die Kombination aus Farbstoffen, Anregungswellenlägen und der für das Detektieren genutzten Spektralkanäle ist dann aber immer gerade so gewählt, dass in jedem einzelnen Detektionskanal, der mit einer Anregungswellenlänge korrespondiert, möglichst ausschließlich Fluoreszenz nur einer einzelnen Farbstoffsorte detektiert wird. Hierdurch soll vermieden werden, dass das Lokalisieren der Fluorophore einer Farbstoffsorte durch Fluoreszenz einer anderen Farbstoffsorte gestört wird. Damit ist aber im betreffenden Stand der Technik auch ausgeschlossen, dass ein einzelnes vereinzeltes Fluorophor in einem einzelnen der Spektralkanäle einmal unter Nutzung von Licht der einen Anregungswellenlänge und ein weiteres Mal unter Nutzung von Licht der anderen Anregungswellenlänge lokalisiert wird. Im Unterschied hierzu wird erfindungsgemäß ein einzelnes vereinzeltes Fluorophor oder eine Menge einzelner vereinzelter Fluorophore einmal unter Nutzung von Licht einer ersten Anregungswellenlänge, Wellenlänge A 111, und ein weiteres Mal unter Nutzung von Licht einer anderen Anregungswellenlänge, Wellenlänge B 112, lokalisiert. Bei der ersten Lokalisation 12 der linken Spalte handelt es sich also um eine Lokalisation 114 desselben Fluorophors, für das auch die zweite Lokalisation 21 erhalten wird. Erfolgen das ersten Anregen und Detektieren 10 und das zweite Anregen und Detektieren 20 im Weitfeld, können jeweils mehrere erste Lokalisationen 12 und mehrere zweite Lokalisationen 22 gleichzeitig erhalten werden.
• Nach dem Erhalten der ersten Lokalisation 12 oder der ersten Lokalisationen 12 und dem Erhalten der zweiten Lokalisation 22 oder der zweiten Lokalisationen 22 erfolgt ein Vergleichen der ersten Lokalisation 12 oder der ersten Lokalisationen 12 mit der zweiten Lokalisation 22 oder den zweiten Lokalisationen 22, sodass, gegebenenfalls jeweils, ein Unterschied 31 der ersten Lokalisation 12 oder der ersten Lokalisationen 12 und der zweiten Lokalisation 22 oder den zweiten Lokalisationen 22 erhalten wird.
• In 3 ist ein Ablaufdiagramm einer Durchführung einer Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. Bei dieser Ausführungsform erfolgt ein Anregen und Detektieren 10,15,20 in einem Kleinfeldbereich, der der zu untersuchende Teilbereich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe ist. Das Verfahren beginnt mit dem Auffinden 2 des Kleinfeldbereichs. Dies kann erfolgen, indem die Probe oder ein Bereich der Probe im Weitfeld beleuchtet wird, die Fluoreszenz die Probe oder den Bereich der Probe im Weitfeld abbildend detektiert wird und das Bild ausgewertet wird, um einen Kleinfeldbereich zu identifizieren, in dem Fluoreszenz detektiert wird, die von einem vereinzelten Fluorophor stammt. Dies kann aber auch abtastend erfolgen, indem die Probe oder ein Bereich der Probe mit fokussiertem Anregungslicht 3 abgetastet und das aus der Probe oder dem Bereich der Probe emittierte Fluoreszenzlicht detektiert wird. Ein Kleinfeldbereich mit einem vereinzelten anregbaren Fluorophor kann dann anhand der zu einem Beleuchtungsort detektierten Menge von Fluoreszenzlicht identifiziert werden, beispielsweise anhand zweier Grenzwerte, wobei die detektierte Menge von Fluoreszenzlicht einen unteren Grenzwert, der abhängig von einem Hintergrundsignal gewählt sein kann, überschreiten muss und einen oberen Grenzwert unterschreiten muss. Nach dem Auffinden 2 eines Kleinfeldbereichs oder zusammen mit dem Auffinden 2 eines Kleinfeldbereichs erfolgt ein erstes Anregen und Detektieren 10, wobei fokussiertes Anregungslicht 3 einer ersten Wellenlänge genutzt wird. In der dargestellten Ausführungsform weist das fokussierte Anregungslicht 3 ein zentrales Intensitätsmaximum 4 auf. Das Anregen 70 des ersten Anregens und Detektierens 10 erfolgt innerhalb eines Kleinfeldbereichs. Das bedeutet, der Fokuspunkt des Anregungslichts wird während des ersten Anregens und Detektierens 10 entweder gar nicht verschoben oder er wird jeweils nur innerhalb eines höchstens wenige Mikrometer ausgedehnten Bereichs, beispielsweise mit 3 µm Durchmesser oder nur 2 µm Durchmesser platziert. Das erste Anregen und Detektieren 10 erfolgt in der dargestellten Ausführungsform während einer Zeitspanne 40, nach der ein Beenden 34 des ersten Anregens und Detektierens erfolgt. Als Ergebnis des ersten Anregens und Detektierens 10 wird ein erstes Detektionssignal 51 erhalten, das insbesondere einen Lichtmengenwert 50, der ein Maß für die Menge der während der Zeitspanne 40 detektierten Fluoreszenz ist, umfasst.
• Weiter erfolgt ein Auswerten 32 des ersten Detektionssignals 51. Beispielsweise kann dessen Lichtmengenwert 50 ausgewertet werden, indem er mit einem in dieser Figur nicht dargestellten Referenzwert 27 verglichen wird. Wird beispielsweise eine mit Alexa Fluor 568 und Alexa Fluor 647 angefärbte Probe bei einem ersten Anregen und Detektieren 10 mit Licht einer Wellenlänge von 640 nm angeregt, so wird dann ein vergleichsweise großer Lichtmengenwert 50 erhalten, wenn das vereinzelte anregbare Fluorophor ein Fluorophor des Farbstoffs Alexa Fluor 568 ist, während dann, wenn das vereinzelte anregbare Fluorophor ein Fluorophor des Farbstoffs Alexa Fluor 647 ist, ein vergleichsweise niedriger Lichtmengenwert 50 erhalten wird. Zusätzlich zum Lichtmengenwert 50 können auch weitere Eigenschaften des ersten Detektionssignals 51, wenn solche erfasst werden, wie beispielsweise eine Variation der in einzelnen Zeitabschnitten der Zeitspanne 40 erhaltenen Anteile des gesamten Lichtmengenwerts 50 oder Werte von Anteilen des gesamten Lichtmengenwerts 50, die in verschiedenen spektralen Detektionskanälen erfasst wurden, ausgewertet werden. Im dargestellten Beispiel erfolgt anhand des Auswertens 32 ein Auswählen einer Wellenlänge 33 derart, dass anschließend ein weiteres Anregen und Detektieren 15 unter Verwendung der ersten Wellenlänge durchgeführt wird.
• Dieses weitere Anregen und Detektieren 15 wird durchgeführt, um eine erste Lokalisation 12 zu erhalten. Dementsprechend erfolgt zusammen mit dem weiteren Anregen und Detektieren 15 ein erstes Lokalisieren 11. Das erste Lokalisieren 11 kann unter Anwendung eines MINFLUX-Verfahrens erfolgen. In diesem Fall erfolgt das weitere Anregen und Detektieren 15 unter Nutzung von fokussiertem Anregungslicht 3, dessen Fokus ein zentrales Intensitätsminimum 5 aufweist. Der Kleinfeldbereich kann, auch bei Anwendung eines MINFLUX-Verfahrens, zusätzlich zu dem fokussierten Anregungslicht 3 der ersten Wellenlänge mit weiterem fokussierten Licht als Fluoreszenzverhinderungslicht mit einer Intensitätsverteilung mit einem zentralen Intensitätsminimum beaufschlagt werden, wobei die Fokuspunkte der beiden Lichtverteilungen entweder jeweils zusammenfallen oder wobei das Fluoreszenzverhinderungslicht jedenfalls derart in die Probe eingestrahlt wird, dass der Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichts 3 immer in einem Bereich des Minimums des Fluoreszenzverhinderungslichts platziert ist. Alternativ kann das erste Lokalisieren 11 unter Anwendung eines STED-Lokalisationsverfahrens oder eines MINSTED-Verfahrens erfolgen, wobei in beiden Fällen zusätzlich zum Anregungslicht der ersten Wellenlänge fokussiertes Fluoreszenzverhinderungslicht mit einer Intensitätsverteilung mit einem zentralen Intensitätsminimum genutzt wird. Dies ist insbesondere dann günstig, wenn von zwei Farbstoffen der Farbstoff mit der kleineren Wellenlänge des Maximums des Anregungsspektrums einen großen Stokesshift aufweist, sodass beide Farbstoffe im Wesentlichen einzeln angeregt, aber dennoch mit demselben Fluoreszenzverhinderungslicht abgeregt werden können. Im dargestellten Beispiel wird das erste Lokalisieren 11 in Verbindung mit dem weiteren Anregen und Detektieren 15 solange durchgeführt, bis ein Kriterium 41 erfüllt ist. Im konkret dargestellten Fall ist als Kriterium 41 eine vorbestimmte Genauigkeit der Lokalisation angegeben. Andere mögliche Kriterien 41 sind beispielsweise eine durchgeführte Anzahl von Iterationen von MINFLUX-Iterationen oder bei Anwendung von MINSTED eine erreichte Intensität des Fluoreszenzverhinderungslichts. Weiter ist es jeweils möglich, dass zusätzlich Information aus dem ersten Detektionssignal 51 für das Erhalten der ersten Lokalisation 12 genutzt wird.
• In Fällen, bei denen das vereinzelte anregbare Fluorophor seine Anregbarkeit verliert, bevor das Kriterium 41 erreicht ist, kann das Verfahren an diesem vereinzelt anregbaren Fluorophor nicht vollständig ausgeführt werden. Dennoch kann aber eine erste Lokalisation 12 erhalten werden, die beispielsweise für eine Bildgewinnung der Probe oder eines Bereichs der Probe genutzt werden kann.
• Wenn das Kriterium 41 dagegen erreicht wird, befindet sich das vereinzelte anregbare Fluorophor auch nach Erhalt der ersten Lokalisation 12 in einem anregbaren Zustand. Dies wird nun genutzt, indem ein weiteres Anregen und Detektieren mit einer zweiten Wellenlänge erfolgt, wobei dieses weitere Anregen und Detektieren das zweite Anregen und Detektieren 20 ist, mit dem eine zweite Lokalisation 22 erhalten wird. Für das zweite Anregen und Detektieren 20 mit dem zweiten Lokalisieren 21, aus dem die zweite Lokalisation 22 erhalten wird, gilt hinsichtlich der anwendbaren Verfahren sinngemäß dasselbe wie für das weitere Anregen und Detektieren 15 mit dem ersten Lokalisieren 11, aus dem die erste Lokalisation 12 erhalten wird.
• Nach dem Erhalten der ersten Lokalisation 12 und dem Erhalten der zweiten Lokalisation 22 erfolgt ein Vergleichen der ersten Lokalisation 12 mit der zweiten Lokalisation 22, sodass, ein Unterschied 31 der ersten Lokalisation 12 und der zweiten Lokalisation 22 erhalten wird.
• In 4 ist ein Ablaufdiagramm einer anderen Durchführung derselben Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens wie in 3 dargestellt. Der Ablauf unterscheidet sich, da ein Fluorophor einer anderen Farbstoffsorte als im in 3 dargestellten als vereinzeltes anregbares Fluorophor im betrachteten Kleinfeldbereich vorliegt. Beim Auswählen einer Wellenlänge 33 auf Basis des Auswertens 32 des ersten Detektionssignals 51 wird daher eine zweite Wellenlänge ausgewählt. In diesem Falle erfolgt nach dem Auswählen das zweite Anregen und Detektieren 20 zusammen mit dem zweiten Lokalisieren 21, sodass eine zweite Lokalisation 22 erhalten wird. Hier werden dieses Schritte durchgeführt, bis ein Kriterium 41 erfüllt ist, beispielsweise bis eine zweite Lokalisation 22 mit einer vorbestimmten Genauigkeit erhalten ist. Im Anschluss daran erfolgt ein weiteres Anregen und Detektieren 15 zusammen mit dem ersten Lokalisieren 11, wodurch eine erste Lokalisation 12 erhalten wird.
• Nach dem Erhalten der zweiten Lokalisation 22 und dem Erhalten der ersten Lokalisation 12, das hier erst nach dem Erhalten der zweiten Lokalisation 22 erfolgt, erfolgt ein Vergleichen 30 der ersten Lokalisation 12 mit der zweiten Lokalisation 22, sodass ein Unterschied 31 der ersten Lokalisation 12 und der zweiten Lokalisation 22 erhalten wird.
• In 5 ist ein Ablaufdiagramm einer anderen Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. In dieser Ausführungsform sind das Auffinden eines Kleinfeldbereichs 2 und das erste Lokalisieren 11, aus dem eine erste Lokalisation 12 erhalten wird, enger miteinander verknüpft. Sowohl das Auffinden eines Kleinfeldbereichs 2 als auch das erste Lokalisieren 11 erfolgen mit fokussiertem Anregungslicht 3, im dargestellten Beispiel mit einem zentralen Intensitätsminimum 5. Möglich ist aber auch, dass sowohl das Auffinden eines Kleinfeldbereichs 2 als auch das erste Lokalisieren 11 mit fokussiertem Anregungslicht 3 mit einem zentralen Intensitätsmaximum erfolgt. Vor dem Auffinden 2 eines Kleinfeldbereichs wird ein Teilbereich 1 einer mehrfarbig gefärbten Probe mit fokussiertem Anregungslicht 3 abgetastet, bis ein Fluoreszenzsignal erhalten wird, das von einem vereinzelten anregbaren Fluorophor stammt. Die Abtastung kann dabei rasternd erfolgen, sie kann aber auch auf Spiralbahnen oder auf Kreisbahnen, die jeweils bei Vollendung eines Kreises entlang einer Richtung versetzt werden, erfolgen. Ein Bereich mit wenigen Mikrometern Ausdehnung um den Ort, zu dem ein Fluoreszenzsignal erhalten wird, das von einem vereinzelten anregbaren Fluorophor stammt, ist der Kleinfeldbereich, der mit einem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht wird. Hierfür erfolgt mit dem Auffinden des Kleinfeldbereichs 2 ein Übergehen in das erste Anregen und Detektieren 10 mit einem erstes Lokalisieren 11, aus dem eine erste Lokalisation 12 erhalten wird. Zudem wird beim ersten Anregen und Detektieren 10 ein erstes Detektionssignal 51 erhalten, dass einen Lichtmengenwert 50 umfasst. Beispielsweise kann das erste Anregen und Detektieren 10 erfolgen, wenn die Intensitätsverteilung des fokussierten Anregungslichts 3 eine Donut-Verteilung oder eine Bottle-Beam-Verteilung ist, indem der Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichts 3 der ersten Wellenlänge an einem Ort innerhalb des Kleinfeldbereichs, das heißt des Teilbereichs 1 der mehrfarbig gefärbten Probe positioniert wird, wobei das Detektieren 71 das Detektieren des als Folge der Anregung mit dem fokussierten Anregungslicht der ersten Wellenlänge von dem vereinzelten Molekül, das heißt von dem vereinzelten Fluorophor emittierten Fluoreszenzlichts umfasst, wobei das Fluoreszenzlicht in einer Ebene, die konjugiert zu der Ebene ist, in der der Fokuspunkt liegt, mit einem ortsauflösenden Detektor detektiert wird oder wobei eine Detektionsapertur innerhalb einer Ebene, die senkrecht zu einer optischen Achse orientiert ist, an einer Mehrzahl von Positionen um die optische Achse herum positioniert wird. In beiden Fällen erfolgt eine Detektion, die in der Detektionsebene ortsaufgelöst ist. Aus der so erhaltenen örtlichen Verteilung des Fluoreszenzsignals in der Detektionsebene kann eine erste Lokalisation 12 erhalten werden.
• Anschließend erfolgt ein zweites Anregen und Detektieren 20 innerhalb desselben Teilbereichs 1 der mehrfarbig gefärbten Probe, wobei anhand der ersten Lokalisation 12 ein Kleinfeldbereich 42 gemäß der ersten Lokalisation 12 festgelegt sein kann, der kleiner ist als der Teilbereich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe. Zusammen mit dem zweiten Anregen und Detektieren 20 erfolgt ein zweites Lokalisieren 21, aus dem eine zweite Lokalisation 22 erhalten wird. Dies kann grundsätzlich auf die Weisen durchgeführt werden wie im Zusammenhang mit den 3 und 4 beschrieben.
• Nach dem Erhalten der zweiten Lokalisation 22 und dem Erhalten der ersten Lokalisation 12 erfolgt ein Vergleichen der ersten Lokalisation 12 mit der zweiten Lokalisation 22, sodass ein Unterschied 31 der ersten Lokalisation 12 und der zweiten Lokalisation 22 erhalten wird. Außerdem erfolgt ein Auswerten 32 des ersten Detektionssignals 51 und des zweiten Detektionssignals 52, hier konkret der jeweiligen Lichtmengenwerte 50. Aus dem Auswerten 32 wird Information über die Farbstoffsorte 62 erhalten, zu der das vereinzelte anregbare Fluorophor, zu dem eine erste und eine zweite Lokalisation 12,22 erhalten wurden, gehört; in der Regel kann die Farbstoffsorte bestimmt werden, da häufig vorbekannt ist, welche Farbstoffsorten für die Färbung der Probe genutzt wurden. Die aus dem Verfahren erhaltene Gesamtinformation 63 umfasst den Unterschied 61 der ersten Lokalisation 12 und der zweiten Lokalisation 22 sowie die Information über die Farbstoffsorte 62.
• Anhand von 6 soll ein wichtiger Aspekt der Erfindung verdeutlicht werden. Sie zeigt ein Ablaufdiagramm zu Schritten, die in mehreren der Ausführungsformen beider erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden können. Ein Kernpunkt der Erfindung ist, dass vereinzelte anregbare Fluorophore von zumindest einer Sorte der Fluorophore, mit denen Teilbereiche 1 der mehrfarbig gefärbten Probe gefärbt sind, einmal unter Verwendung von Anregungslicht einer ersten Wellenlänge, in dieser Figur die Wellenlänge A 111, lokalisiert werden und einmal unter Verwendung von Anregungslicht einer zweiten Wellenlänge, in dieser Figur die Wellenlänge B 112, lokalisiert werden, wobei sich die Wellenlänge A von der Wellenlänge B unterscheidet.. Es kann auch für Fluorophore beider oder aller, wenn die Probe mit mehr als zwei Farbstoffsorten gefärbt ist, möglich sein, dass vereinzelte anregbare Fluorophore einmal mit Licht einer Wellenlänge A 111 und einmal mit Licht einer Wellenlänge B 112 lokalisiert werden. In der linken Spalte ist schematisch dargestellt, dass mit einer Wellenlänge A 111 ein Anregen und Detektieren 110 und ein Lokalisieren 113 mit dem Erhalten einer Lokalisation 114 erfolgt. Zudem wird ein Detektionssignal 115 erhalten, das einen Lichtmengenwert 50 umfasst. In der rechten Spalte ist schematisch dasselbe für eine Wellenlänge B 112 dargestellt. Die in den beiden Spalten schematisch dargestellten Prozesse können gleichzeitig durchgeführt werden, sofern das Detektieren des Anregens und Detektierens 110 in unterschiedlichen spektralen Detektionskanälen durchgeführt wird. Wenn das Anregen und Detektieren 1 10 jeweils in einem Kleinfeld erfolgt, kann es vorteilhaft sein, die Schritte der linken Spalte (Wellenlänge A 111) und der rechten Spalte (Wellenlänge B 112) nacheinander durchzuführen. Die Schritte können beispielsweise derart durchgeführt werden, dass das Lokalisieren jeweils nach einem MINFLUX-Verfahren, einem MINSTED-Verfahren oder einem STED-Lokalisationsverfahren erfolgt. Die Schritte der rechten und der linken Spalte können auch alternierend durchgeführt werden, bis das vereinzelte anregbare Fluorophor seine Anregbarkeit verloren hat. Auf diese Weise kann aus den jeweils zur Wellenlänge A 111 durchgeführten Schritten entweder eine Lokalisation 114, die aus der Menge einzelner Lokalisationen bestimmt ist, oder eine Menge mit mehreren Lokalisationen 114 erhalten werden. Zusätzlich wird entweder ein gesamtes Detektionssignal 115, dass sich aus der Menge der einzelnen Detektionssignale ergibt, oder eine Menge von Detektionssignalen 115 erhalten. Dasselbe gilt für die Wellenlänge B 112. Anschließend erfolgt ein Vergleichen 30 der beiden Lokalisationen 114 zu den Wellenlängen A 111 und B 112 oder der beiden Mengen mit mehreren Lokalisationen 114, sodass ein Unterschied der Lokalisationen zu den beiden Wellenlängen bestimmt wird. Zudem erfolgt ein Auswerten der beiden gesamten Detektionssignale 115 oder der beiden Mengen von Detektionssignalen 115, wobei Information über die Farbstoffsorte 62 des vereinzelten anregbaren Fluorophors erhalten wird, das mit Licht der beiden Wellenlängen A 111 und B 112 lokalisiert wurde. Die aus dem Verfahren erhaltene Gesamtinformation 63 umfasst die Unterschiede 61 der Lokalisationen 114 sowie jeweils die Information über die Farbstoffsorte 62.
• 7 illustriert das Auswählen einer Wellenlänge aus einer Menge von Wellenlängen. Die Menge 117 umfasst eine Wellenlänge A 111, eine Wellenlänge B 112 und eine weitere Wellenlänge 116, die sich wechselseitig voneinander unterscheiden. Das Auswählen 33 einer Wellenlänge, hier der Wellenlänge B 112, erfolgt hier auf Basis zweier Detektionssignale 115. Das Auswählen 33 einer Wellenlänge umfasst hier einen in den 3 und 4 separat dargestellten Schritt des Auswertens 32, der sich dort auf das Auswerten eines ersten Detektionssignals 51 richtet. Durch den Pfeil von der Menge 117 zu dem Schritt des Auswählens 33 einer Wellenlänge soll angedeutet werden, dass die Elemente aus der Menge 117 durch das Auswählen 33 der Wellenlänge für die Nutzung bereitgestellt werden können.
• 8 stellt den Sachverhalt dar, dass jeder Schritt des Anregens und Detektierens 110 die beiden Elemente Anregen 70 und Detektieren 71 umfasst. Ein Schritt Anregen und Detektieren 110 tritt in dieser Anmeldung als erstes Anregen und Detektieren 10, zweites Anregen und Detektieren 20, weiteres Anregen und Detektieren 15 sowie allgemein als Anregen und Detektieren 110 auf. In jedem Fall umfasst das Anregen und Detektieren 10,15,20,110 korrespondierende Elemente Anregen 70 und Detektieren.
• Anhand von 9 soll ein wichtiger Aspekt der Erfindung verdeutlicht werden. Sie zeigt ein Ablaufdiagramm zu Schritten, die in mehreren der Ausführungsformen beider erfindungsgemäßer Verfahren durchgeführt werden können. Der obere Teil stellt die schon in 6 dargestellten Schritte Anregen und Detektieren 110 einmal für eine Wellenlänge A 111 und einmal für eine Wellenlänge B 112 jeweils mit dem zugehörenden Schritt Lokalisieren 113 und den zugehörenden Elementen Lokalisation 114 und Detektionssignal 115, welches jeweils einen Lichtmengenwert 50 umfasst, dar. Die weiteren in 6 dargestellten Schritte Vergleichen 30 und Auswerten 32 sowie die Elemente Unterschied 61 der Lokalisationen und Information über die Farbstoffsorte 62 des vereinzelten anregbaren Fluorophors sind in 9 ebenfalls enthalten, hier aber zusätzlich verknüpft mit einem Schritt Anregen und Detektieren 110, der mit einer weiteren Wellenlänge 116 durchgeführt wird. Für alle aus 6 bekannten Schritte gelten im Übrigen die in deren Beschreibung gemachten Ausführungen. Die in dieser 9 dargestellte weitere Wellenlänge 116 kann identisch sein mit einer der Wellenlängen A 111 und B 112, sie kann sich aber auch von beiden unterscheiden. Die Ergänzung zu den in 6 dargestellten Abläufen besteht darin, dass zu einem Zeitpunkt, zu dem sowohl zu der Wellenlänge A 111 als auch zu der Wellenlänge B 112 je mindestens eine Lokalisation 114 und je mindestens ein Detektionssignal 115 erhalten worden sind, ein Auswählen 33 einer weiteren Wellenlänge 116 für eine weiteres Anregen und Detektieren 110 erfolgt. Das Auswählen 33 umfasst auch hier ein an anderer Stelle separat dargestelltes Auswerten 32. Das Auswählen einer der Wellenlängen A 111 oder B 112 als weitere Wellenlänge 116 kann beispielsweise dann erfolgen, wenn zu einem vereinzelten anregbaren Fluorophor in jedem Falle zu jeder der Wellenlängen A 111 und B 112 mindestens je eine Lokalisation 114 erhalten werden soll und wenn außerdem insgesamt eine möglichst genaue Lokalisation 114, zusätzlich möglicherweise mit dem Ziel, die Probe möglichst wenig zu belasten, erhalten werden soll. Dann erfolgen zunächst eben genau die beiden zugehörigen Lokalisierungen 113, sodass zu jeder der Wellenlängen A 111 und B 112 mindestens je eine Lokalisation 114 erhalten wird.
• Bei dem Auswählen 33 kann nun eine weitere Wellenlänge 116 ausgewählt werden, die das vereinzelte anregbare Fluorophor möglichst effizient anregt. Dadurch kann das vereinzelte anregbare Fluorophor bei insgesamt möglichst geringer Belastung Probe gut lokalisiert werden. Stehen nur zwei Wellenlängen für die Auswahl zur Verfügung, kann beispielsweise die Wellenlänge der beiden Wellenlängen A 111 oder B 112 ausgewählt werden, für die bei dem zugehörigen Anregen und Detektieren 115 der größere Lichtmengenwert 50 oder ein größerer, aus dem Lichtmengenwert 50 unter Berücksichtigung der eingestrahlten Lichtmenge, die beispielsweise als Teil des Detektionssignals 115 bekannt ist, abgeleiteter Wert, erhalten wurde.
• Eine weitere Möglichkeit, insbesondere wenn eine von den Wellenlängen A 111 und B 112 verschiedene Wellenlänge zur Verfügung steht, ist, aus einem Verhältnis der Lichtmengenwerte 50 oder entsprechend aus diesem abgeleiteten Werten auf die Sorte des Farbstoffs zu schließen, zu dem das vereinzelte anregbare Fluorophor gehört, und dementsprechend diejenige Wellenlänge aus der Menge 117 der Wellenlängen auszuwählen, mit der die betreffende Farbstoffsorte am besten anregbar ist. Beispielsweise kann ein solcher Vergleich bei Untersuchungen an einer Probe, die zumindest mit den Farbstoffen Alexa Fluor 568 und Alexa Fluor 647 gefärbt ist und die mit einer Wellenlänge A 111 von 525 nm und einer Wellenlänge B von 625 nm untersucht wurde, ergeben, dass das vereinzelte anregbare Fluorophor, das lokalisiert wurde, zu der Farbstoffsorte Alexa Fluor 647 gehört. Dann kann, wenn als weitere Wellenlänge 116 eine Wellenlänge von 647 nm auswählbar ist, diese Wellenlänge, bei der das erste Anregungsspektrum 7, das das Anregungsspektrum der Farbstoffsorte Alexa Fluor 647 ist, für das folgende Anregen und Detektieren 110 ausgewählt werden. Bei dieser Wellenlänge ist nicht nur die Anregbarkeit des Farbstoffs Alexa Fluor 647 maximal, sondern auch die Anregbarkeit des Farbstoffs Alexa Fluor 568 kaum vorhanden, sodass beim Anregen 70 mit der weiteren Wellenlänge 116 von 647 nm kaum Hintergrundfluoreszenz des Farbstoffs Alexa Fluor 568 angeregt wird.
• Anschließend erfolgt ein Vergleichen 30 der Lokalisationen 114, sodass Unterschiede 61 der Lokalisationen 114 erhalten werden, und ein Auswerten 32 der Detektionssignale 115, in der Figur konkret dargestellt der Lichtmengenwerte 50, um Information über die Farbstoffsorte 62 zu erhalten oder diese abzusichern. Wenn das Auswählen 33 einer weiteren Wellenlänge bereits ein Auswerten 32 hinsichtlich der Farbstoffsorte umfasst hat, dann kann das letzte Auswerten 32 auch unterbleiben, wobei dann die Information über die Farbstoffsorte 62 aus dem nicht dargestellten ersten Auswerten 32 für die Gesamtinformation 63 übernommen werden muss. Die aus dem Verfahren erhaltene Gesamtinformation 63 umfasst dann die Unterschiede 61 der Lokalisationen 114 sowie die Information über die Farbstoffsorte 62.
• In 10 ist ein Ablaufdiagramm zu einer ersten Ausführungsform eines zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. Auch dieses Verfahren wird ausgeführt an einer mehrfarbig gefärbten Probe mit vereinzelten anregbaren Fluorophoren oder genauer an einem Teilbereich 1 einer mehrfarbig gefärbten Probe mit vereinzelten anregbaren Fluorophoren, wobei der Teilbereich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe auch die ganze Probe umfassen kann. Bei diesem Verfahren erfolgt in einem ersten Schritt ein Anregen und Detektieren 110, welches testweise mit einer Testwellenlänge 25 durchgeführt wird. Beim testweisen Anregen und Detektieren 110 wird ein Detektionssignal 115 erhalten, das einen Lichtmengenwert 50 umfasst. Auf Basis des Detektionssignals 115 erfolgt bei dieser ersten Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens ein Auswählen 33 einer ersten Wellenlänge, die für ein erstes Lokalisieren 11 verwendet wird. Während bei dem ersten Verfahren bei dem ersten durchgeführten Schritt des Anregens und Detektierens 110 zwingend eine Wellenlänge verwendet wird, mit der ein erstes Lokalisieren 11 durchgeführt wird, ist dies hier zwar möglich, aber nicht notwendig. Nach dem Auswählen 33 einer ersten Wellenlänge erfolgt dann ein erstes Anregen und Detektieren 10 mit einem ersten Lokalisieren 11, woraus eine erste Lokalisation 12 erhalten wird. Für das Auswählen 33 der ersten Wellenlänge stehen mehrere Möglichkeiten zur Verfügung. In der Figur dargestellt ist ein Referenzwert 27. Durch die Strichelung des Pfeils zum Schritt des Auswählens 33 der ersten Wellenlänge soll angedeutet werden, dass die Verwendung eine Referenzwerts 27 nur eine der Möglichkeiten ist. Sie ist insbesondere dann eine gute Möglichkeit, wenn der Teilbereich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe ein Kleinfeldbereich ist. Wie ein solcher Kleinfeldbereich mit einem vereinzelten anregbaren Fluorophor aufgefunden werden kann, ist unter anderem aus dem Stand der Technik bekannt. Ist der Teilbereich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe ein Weitfeldbereich und soll dieser mittels im Weitfeld durchgeführter Verfahren weiter untersucht werden, kann Beispielsweise anhand des Detektionssignals 115 festgestellt werden, ob und wie viele vereinzelte anregbare Fluorophore im Bildfeld sowie gegebenenfalls wie viele schwache und wie viele starke Fluoreszenzemission zeigen. Anhand dieser Analyse kann dann eine Wellenlänge ausgewählt werden, mit der zum betreffenden Aufnahmezeitpunkt eine möglichst große Zahl vereinzelter Fluorophore gleichzeitig lokalisiert werden können.
• Anhand von 11 soll ein Ablauf einer weiteren Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens erläutert werden. Auch bei dieser Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in einem ersten Schritt ein Anregen und Detektieren 110, welches testweise mit einer Testwellenlänge 25 durchgeführt wird. Beim testweisen Anregen und Detektieren 110 wird ein Detektionssignal 115 erhalten, dass einen Lichtmengenwert 50 umfasst. Grundsätzlich kann das testweise Anregen und Detektieren 11 in einer Menge von Teilbereichen der Probe erfolgen, die Kleinfeldbereiche sind. Bevorzugt erfolgt das testweise Anregen und Detektieren 11 bei dieser Ausführungsform aber im Weitfeld. Auf Basis des Detektionssignals 115 erfolgt bei dieser weiteren Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens ein Auswählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 (in dieser Figur nicht dargestellt), in dem ein erstes Lokalisieren 11 erfolgen soll. Anschließend erfolgt, wie auch in der ersten Ausführungsform dieses Verfahrens, ein erstes Anregen und Detektieren 10 mit einem ersten Lokalisieren 11, als dessen Ergebnis eine erste Lokalisation 12 erhalten wird. Optional erfolgt vor dem ersten Anregen und Detektieren 10 zusätzlich zu dem Auswählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 ein Auswählen 33 einer Wellenlänge. Grundsätzlich kann beides Auswählen 33,43 parallel oder abhängig voneinander erfolgen.
• 12 zeigt einen Teilbereich 1 einer mehrfarbig gefärbten Probe mit einem Klein¬feld¬be¬reich 42 mit einem vereinzelten anregbaren Fluorophor 44 und weiteren anregbaren Fluorophoren 44,45.
• Eine Möglichkeit des in 11 dargestellten Auswählens 43 eines Kleinfeldbereichs 44 kann nun anhand der 11 und 12 erläutert werden. Es wird ein Weitfeldbild eines Teilbereichs 1 einer mehrfarbig gefärbten Probe aufgenommen. In diesem Bild können dann Fluorophore 44,45 aus dem Teilbereich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe abgebildet sein. Die Abbildung entspricht bis auf Messunsicherheiten und Abbildungsfehler der Probe. Die Messunsicherheiten können groß sein, weil das testweise Anregen und Detektieren 110 mit der Testwellenlänge 25 nicht dazu dient, eine genaue Lokalisation zu erhalten, sondern hier lediglich zum Auffinden eines Kleinfeldbereichs 42 dient, bei dessen Untersuchung eine genaue Lokalisation erhalten werden soll. Als zu untersuchender Kleinfeldbereich 42 kann anhand der Abbildung nur ein solcher Bereich ausgewählt werden, in dem ein vereinzeltes anregbares Fluorophor 42 vorhanden ist. Im Teilbereich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe sind drei vereinzelte anregbare Fluorophore 42 vorhanden, von denen zwei stark emittieren, was durch den größeren Radius angedeutet ist, und eines schwächer emittiert, was durch den geringeren Radius angedeutet ist.. Rechts im Teilbereich sind mehrere Fluorophore 45, schwächer emittierende und stärker emittierende, vorhanden, die aber nicht vereinzelt sind. Es kann nun ein Kleinfeldbereich 42 ausgewählt werden, indem die Abbildung des Teilbereichs 1 der mehrfarbig gefärbten Probe untersucht wird. Anhand der nicht dargestellten Abbildung kann nun um den Ort der Abbildung des stark emittierenden Fluorophors 42, welches den größeren Abstand zu den nicht vereinzelten anregbaren Fluorophoren 45 aufweist, ein Kleinfeldbereich 42 festgelegt werden. Dieser Kleinfeldbereich 42 ist gegenüber dem tatsächlichen Ort des vereinzelten anregbaren Fluorophors 42 wegen der Messunsicherheit leicht verschoben. Nach dem Auswählen kann die Testwellenlänge als erste Wellenlänge eingesetzt werden. Sofern das Auswählen 43 des Kleinfeldbereichs 42 derart erfolgt, dass die Testwellenlänge als erste Wellenlänge genutzt werden kann, so gibt es an dieser Stelle keinen Schritt des Auswählens 33 einer Wellenlänge.
• Eine andere Möglichkeit ist, dass als Kleinfeldbereich 42 ein Bereich um den Ort des einzigen vereinzelten anregbaren Fluorophors 44, das schwächere Emission zeigt, ausgewählt würde, weil die Untersuchung des Abbildes darauf hindeutet, dass eine besonders gute Lokalisation dieses Fluorophors mit Verwendung einer anderen Wellenlänge als der Testwellenlänge für das erste Lokalisieren 10 möglich ist. In diesem Fall würde für das folgende erste Anregen und Detektieren 10 also sowohl ein Auswählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 als auch eine Auswählen 33 einer Wellenlänge für das erste Anregen und Detektieren 10 erfolgen.
• In 13 ist ein Ablaufdiagramm zu einer weiteren Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. Das Diagramm enthält sämtliche in 10 dargestellten Elemente. Für die Beschreibung der mit diesen Elementen verbundenen Zusammenhänge wird auf die Angaben zur 10 verwiesen. Zusätzlich ist in der 13 ein weiteres testweises Anregen und Detektieren 110, welches mit einer zweiten Testwellenlänge 26, die sich von der ersten Testwellenlänge 25 unterscheidet, durchgeführt wird, dargestellt. Dieses weitere testweise Anregen und Detektieren 110 kann, wenn das Detektieren 71 in mehreren unterschiedlichen spektralen Detektionskanälen erfolgt, gleichzeitig erfolgen und kann im Allgemeinen nach dem testweisen Anregen und Detektieren 110 mit der ersten Testwellenlänge 25 erfolgen. Auch zu dem weiteren testweisen Anregen und Detektieren 110 mit der zweiten Testwellenlänge 26 wird ein Detektionssignal 115 erhalten, welches einen Lichtmengenwert 50 umfasst. Das Auswählen 33 einer ersten Wellenlänge, die für ein erstes Lokalisieren 11 verwendet wird, erfolgt bei der in dieser Figur dargestellten Ausführungsform auf Basis der beiden Detektionssignale 115, die zu der ersten Testwellenlänge 25 beziehungsweise der zweiten Testwellenlänge 26 erhalten wurden. Beispielsweise kann ein Verhältnis der beiden Lichtmengenwerte charakteristisch für eine Farbstoffsorte eines vereinzelten anregbaren Fluorophors sein, für dessen erstes Anregen und Detektieren 10 mit dem zugehörigen ersten Lokalisieren 11 dann die am besten geeignete Wellenlänge ausgewählt wird. Wenn das testweise Anregen und Detektieren 110 im Weitfeld durchgeführt wird, können beispielsweise die Abbilder des Teilbereichs 1 der mehrfarbig gefärbten Probe darauf untersucht werden, bei Verwendung welcher der Testwellenlängen 25,26 mehr vereinzelte anregbare Fluorophore, die stark emittieren, enthalten sind. Diese Testwellenlänge 25,26 kann dann als Wellenlänge für das erste Anregen und Detektieren 10 ausgewählt werden. Zusätzlich zu den beiden Detektionssignalen 115 kann für das Auswählen 33 einer Wellenlänge auch auf einen Referenzwert 27 zurückgegriffen werden. Der Referenzwert 27, der kein skalarer Wert sein muss, kann beispielsweise Einträge für Vergleichslichtmengenwerte enthalten oder Einträge für Vergleichsverhältnisse von Lichtmengenwerten, mit denen die beiden Lichtmengenwerte 50 oder deren Verhältnis verglichen wird, um eine Wellenlänge für das erste Anregen und Detektieren 10 auszuwählen.
• In 14 ist eine Ausführungsform dargestellt, in der sowohl der Schritt eines weiteren testweisen Anregens und Detektierens 110 mit einer zweiten Testwellenlänge 26 und der des Auswählens 43 eines Kleinfeldbereichs 42 enthalten sind. In dieser Ausführungsform kann das Auswählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 (in dieser Figur nicht dargestellt), in dem ein erstes Lokalisieren 11 erfolgen soll, auf Basis der beiden Detektionssignale 115, die einmal unter Nutzung der ersten Testwellenlänge 25 und einmal unter Nutzung der zweiten Testwellenlänge 26 gewonnen wurden, erfolgen. Anschließend erfolgt ein erstes Anregen und Detektieren 10 mit einem ersten Lokalisieren 11, als dessen Ergebnis eine erste Lokalisation 12 erhalten wird. Optional erfolgt vor dem ersten Anregen und Detektieren 10 zusätzlich zu dem Auswählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 ein Auswählen 33 einer Wellenlänge. Grundsätzlich kann beides Auswählen 33,43 parallel oder abhängig voneinander erfolgen, im Wesentlichen entsprechend den Angaben, die im Zusammenhang mit 11 sowie im Zusammenhang mit den 11 und 12 gemacht wurden.
• In 15 ist eine Ausführungsform dargestellt, bei der schließlich durch ein Vergleichen 30 einer ersten Lokalisation 12 und einer zweiten Lokalisation 22 eines vereinzelten anregbaren Fluorophors ein Unterschied zwischen der ersten Lokalisation 12 und der zweiten Lokalisation 22 erhalten wird. Im oberen Teil der Figur finden sich Elemente, die aus 14 bekannt sind. Die Gruppe der 14 mit den Elementen erstes Anregen und Detektieren 10, erstes Lokalisieren 11 und erste Lokalisation 12 findet sich in der 15 ergänzt um das Element Detektionssignal 115, welches ein Element Lichtmengenwert 50 umfasst, nach unten versetzt im linken Teil der Figur, ist aber im Übrigen im Wesentlichen genauso mit der Gruppe der Elemente Auswählen eines Kleinfeldbereichs 43 und Auswählen einer Wellenlänge 33 verknüpft wie in 14. In der 15 sind solche Verknüpfungen gestrichelt dargestellt, die beim Ablauf des Verfahrens optionalen Schritten beziehungsweise Verknüpfungen entsprechen. Gegenüber der 14 ist im oberen Teil ein Schritt des Auswählen einer zweiten Wellenlänge 33' ergänzt.
• Für die Beschreibung der auch 14 enthaltenen Elemente beziehungsweise der darin dargestellten Verfahrensschritte, Verknüpfungen und Elemente wird zunächst auf die Beschreibung der 14 verwiesen. In den in 15 illustrierten Ausführungsformen tritt nun neu hinzu das Auswählen einer zweiten Wellenlänge 33' und ein zweites Anregen und Detektieren 20 mit einem zweiten Lokalisieren 21, aus dem eine zweite Lokalisation 22 erhalten wird. Zusätzlich wird sowohl neben der ersten Lokalisation 12 als auch neben der zweiten Lokalisation 22 je ein Detektionssignal 115, welches jeweils einen Lichtmengenwert 50 umfasst, erhalten. Wird nun der untere Teil mit den Elementen erstes Anregen und Detektieren 10 und zweites Anregen und Detektieren 20 sowie aller unterhalb eingetragenen Element verglichen, so ist zu sehen, dass dieser Teil der 6 entspricht mit dem Unterschied, dass in 6 allgemein auf bestimmte Elemente wie Wellenlängen A 111 und B 112, ein Lokalisieren 113 und so weiter Bezug genommen wird, während in 15 auf konkrete Elemente wie beispielsweise das erste Lokalisieren 11 und das zweite Lokalisieren 22 und so weiter Bezug genommen wird. Für die Verknüpfung der Elemente und die jeweiligen Verfahrensabläufe wird daher hier zunächst auf die Beschreibung der 6 verwiesen. In 15 ist eine als optional gekennzeichnete Verknüpfung zwischen dem linken Elementeblock mit dem ersten Anregen und Detektieren 10 und dem korrespondierenden rechten Block eingetragen. Diese ist zwar in 6 nicht eingetragen, in der Beschreibung wird aber angegeben, dass der rechte Block unter bestimmten Bedingungen nach dem linken Block ausgeführt werden soll.
• Die Schritte nach dem Auswählen 33 der Wellenlänge für das erste Detektieren 10 oder dem Auswählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 entsprechen somit Schritten, die auch aus dem ersten Verfahren bekannt sind. Bei dem Auswählen 33' einer zweiten Wellenlänge für das zweite Anregen und Detektieren 20 wird eine Wellenlänge ausgewählt, die sich von der Wellenlänge für das erste Anregen und Detektieren 20 unterscheidet. Diese Wellenlänge kann dabei so gewählt werden, dass sie für das Lokalisieren einer anderen Sorte der Fluorophore als derjenigen, zu der das in diesem Schritt zu lokalisierende Fluorophor gehört, besonders geeignet ist. Gleichzeitig muss sie so gewählt werden, dass ein Lokalisieren des in diesem Schritt zu lokalisierenden Fluorophors möglich ist. Wie dies zu verstehen ist, wird aus 1 mit der zugehörigen Beschreibung deutlich. Insgesamt wird dadurch erreicht, dass zu dem vereinzelten anregbaren Fluorophor zwei Lokalisationen 114 erhalten werden, von denen eine hochgenau sein kann und eine andere eine geringere Genauigkeit, oder höhere Unsicherheit, aufweisen kann.
• Anhand von 16 wird eine Möglichkeit zur Ko-Lokalisation von Fluorophoren mehrerer, konkret zweier, Fluoreszenzfarbstoffe in einem gemeinsamen Bezugssystem gezeigt. Eine Mehrzahl 62 von Fluorophoren eines ersten Farbstoffs 54 wird mittels irgendeines der erfindungsgemäßen Verfahren lokalisiert, wobei bei je einzelnem Fluorophor zu einer Wellenlänge A 111 eine oder mehrere Lokalisationen L 56 und zu einer Wellenlänge B 112 eine oder mehrere Lokalisationen U 57 erhalten werden. Die Wellenlänge A 111 ist dabei eine Wellenlänge, die für das Lokalisieren 113 vereinzelter anregbarer Fluorophore des ersten Farbstoffs 54 gut geeignet ist. Sie, die Wellenlänge A 111, kann dabei je nach Verfahren und nach konkretem Verfahrensablauf die erste Wellenlänge sein, das heißt, jede einzelne Lokalisation L 56 kann eine erste Lokalisation 12, oder sie kann die zweite Wellenlänge, das heißt, jede einzelne Lokalisation L 56 kann eine zweite Lokalisation 22 sein. Die Wellenlänge B 111 kann dabei eine Wellenlänge sein, die für das Lokalisieren 113 vereinzelter anregbarer Fluorophore des ersten Farbstoffs 54 weniger gut geeignet ist, gleichzeitig aber für das Lokalisieren 113 vereinzelter anregbarer Fluorophore des zweiten Farbstoffs 55 gut geeignet ist. Auch diese, die Wellenlänge B 112, kann dabei je nach Verfahren und nach konkretem Verfahrensablauf die erste Wellenlänge oder die zweite Wellenlänge sein, das heißt, jede einzelne Lokalisation U 57 kann eine erste Lokalisation 12 oder eine zweite Lokalisation 22 sein. Insgesamt wird eine Mehrzahl von Lokalisationen 58 erhalten. Bei dieser Mehrzahl kann es sich um die Menge der Lokalisationen L 56 handeln oder um eine Untermenge oder eine aus dieser abgeleitete Menge. Beispielsweise ist es möglich, dass mehrere Lokalisationen L 56 als Lokalisationen ein und desselben vereinzelten Fluorophors zu verschiedenen Zeitpunkten identifiziert werden und zu einer einzelnen Lokalisation dieses Fluorophors zusammengefasst in der Mehrzahl von Lokalisationen 58 enthalten sind. Zu den Lokalisationen L 56 und U 57 wird jeweils ein Unterschied 61 bestimmt. Aus der Menge von Unterschieden 61 wird ein mittlerer Unterschied 59 zwischen den Lokalisationen bestimmt. Dieser mittlere Unterschied 59 kann abhängig von der Anzahl der einzelnen Unterschiede 61 mit höherer Genauigkeit, das heißt geringerer Unsicherheit als ein einzelner Unterschied 61 bestimmt werden. Deswegen kann hingenommen werden, dass die einzelnen Unsicherheiten der Lokalisationen U 57, die bestimmend in die Unsicherheiten der Unterschiede 61 eingehen, größer sind als die der Lokalisationen L 57, wie sich in der Regel aus den unterschiedlichen Eignungen der Wellenlängen A 111 und B112 für das Lokalisieren des ersten Farbstoffs 54 ergibt. Bei der Mehrzahl der Lokalisationen L 56 und U 57 kann es sich dabei um Ergebnisse des Lokalisierens 113 innerhalb eines räumlich eingeschränkten Gebiets einer Probe oder Ergebnisse des Lokalisierens 113 innerhalb eines beschränkten Zeitraums handeln. Letzteres ist vorteilhaft, wenn die Probe oder die Eigenschaften des Mikroskops, mit dem die Probe untersucht wird, zeitlichen Schwankungen unterliegen.
• Ein vereinzeltes anregbares Fluorophor eines zweiten Farbstoffs 55 wird mit einer Wellenlänge B 112 lokalisiert, die hierfür gut geeignet ist. Es wird eine Lokalisation L 56 erhalten. Der mittlere Unterschied 59, der sich aus den unterschiedlichen Wellenlängen A 111 und B 112 beim Lokalisieren ergibt, ist aus den Lokalisationen des ersten Farbstoffs 54 bekannt. Die Lokalisation L 56 dieses vereinzelten Fluorophors des zweiten Farbstoffs 55 wird nun um diesen mittleren Unterschied 59 zusammen mit der Mehrzahl der Lokalisationen 58 in eine Gesamtmenge von Lokalisationen 60 eingeordnet, womit eine Ko-Lokalisation von Fluorophoren verschiedener Farbstoffe erreicht ist. Bevorzugt sind dabei die Lokalisation L 56 des Fluorophors des zweiten Farbstoffs 55 und der mittlere Unterschied 59 aus Daten bestimmt, die innerhalb einer räumlichen oder zeitlichen Nachbarschaft, bevorzugt innerhalb einer räumlichen und zeitlichen Nachbarschaft erhoben wurden.
• Es ist unmittelbar klar, dass auf dieselbe Weise Lokalisationen L 56 zu mehreren oder vielen Fluorophoren des zweiten Farbstoffs 55 mit Fluorophoren des ersten Farbstoffs 54 ko-lokalisiert werden können. Ebenso ist unmittelbar klar, dass auch Fluorophore des ersten Farbstoffs 54, zu der nur Lokalisationen L 56 unter Verwendung der Wellenlänge 111, aber keine Lokalisationen U 57 unter Verwendung der Wellenlänge B 112 erhalten wurden, ebenso ko-lokalisiert werden können. Um also eine Bild einer mehrfarbig gefärbten Probe oder eines Teilbereichs 1 einer mehrfarbig gefärbten Probe, in dem Fluorophore mehrerer, beispielsweise zweier Farbstoffe ko-lokalisiert, insbesondere mit hoher Genauigkeit ko-lokalisiert sind, zu erhalten, reicht es aus nur eine Teilmenge der Fluorophore, die zur Bildgewinnung genutzt werden, mit zwei Wellenlängen zu lokalisieren.
• Anhand von 17 wird eine weitere Möglichkeit zur Ko-Lokalisation von Fluorophoren mehrerer, konkret zweier, Fluoreszenzfarbstoffe in einem gemeinsamen Bezugssystem illustriert. Bei dieser Ausführungsform ist es nicht nötig, dass für Fluorophore eines der Farbstoffe mit einer Wellenlänge, die für das Lokalisieren von Fluorophoren des anderen Farbstoffs eine besonders geeignete Wellenlänge ist, Lokalisationen U 57 zur Bestimmung eines Unterschieds 61 von Lokalisationen verschiedener Wellenlängen erhalten werden. Vielmehr wird für Fluorophore beider Farbstoffe 54,55 eine gemeinsame weitere Wellenlänge 116 verwendet, um jeweils zugehörige Lokalisationen U 57 zu erhalten. Lokalisationen L 56 werden hier für eine Mehrzahl 62 von Fluorophoren des ersten Farbstoffs 54 mit einer Wellenlänge A 111 erhalten und für eine Mehrzahl 62 von Fluorophoren des zweiten Farbstoffs 55 mit einer Wellenlänge B 112. Auf diese Weise werden für beide Farbstoffsorten Mehrzahlen 58 von Lokalisationen 59 und ein mittlerer Unterschied 59 erhalten. Dieser mittlere Unterschied 59 bezieht sich jeweils auf eine für beide Farbstoffsorten gemeinsame weitere Wellenlänge 116. Dementsprechend wird die Mehrzahl 58 der Lokalisationen L 56 der vereinzelten Fluorophore des zweiten Farbstoffs 55 unter Berücksichtigung beider mittlerer Unterschiede 59 zusammen mit der Mehrzahl 58 der Lokalisationen L 56 der vereinzelten Fluorophore des ersten Farbstoffs 54 in eine Gesamtmenge von Lokalisationen 60 eingeordnet, womit eine Ko-Lokalisation von Fluorophoren verschiedener Farbstoffe erreicht ist. Entsprechend den Erläuterungen zu 16 gilt auch hier, und zwar für jeden der beiden Farbstoffe, dass nicht für alle vereinzelten Fluorophore, die für eine Bildgebung an einer mehrfarbig gefärbten Probe genutzt werden, Lokalisationen U 57 erhalten werden müssen. Vielmehr reicht es beispielsweise aus, diese für eine solche Menge vereinzelter Fluorophore zu gewinnen, dass der mittlere Unterschied 59 jeweils mit einer angestrebten Genauigkeit erhalten wird.
• Anhand von 18 wird eine weitere Möglichkeit zur Ko-Lokalisation von Fluorophoren mehrerer, konkret zweier, Fluoreszenzfarbstoffe in einem gemeinsamen Bezugssystem illustriert. Bei dieser Ausführungsform werden sowohl Fluorophore eines ersten Farbstoffs 54 als auch Fluorophore eines zweiten Farbstoffs 55 jeweils mit Licht einer Wellenlänge A 111 als auch mit Licht einer Wellenlänge B 112 lokalisiert, wobei für Fluorophore des ersten Farbstoffs 54 mit der Wellenlänge A 111 Lokalisationen L 56 und mit der Wellenlänge B 112 Lokalisationen U 57 erhalten werden. Umgekehrt werden für Fluorophore des zweiten Farbstoffs 55 mit der Wellenlänge B 112 Lokalisationen L 56 und mit der Wellenlänge A 112 Lokalisationen U 57 erhalten. Dies bedeutet, die Wellenlängen A 111 und B 112 sind so ausgewählt, dass sie jeweils einen der Farbstoffe gut und den anderen hinreichend anregen, wobei die Rollen der Wellenlängen vom jeweils betrachteten Farbstoff abhängen. Die jeweiligen Mehrzahlen 58 der Lokalisationen L zu beiden Farbstoffsorten werden nun unter Berücksichtigung der beiden mittleren Unterschiede 59, aus denen beispielsweise ein vorzeichenkorrekter Mittelwert gebildet werden kann, zu einer Gesamtmenge von Lokalisationen 60, in der vereinzelte Fluorophore beider Farbstoffe ko-lokalisiert sind, zusammengefasst. Auch hier gilt wieder, entsprechend dem zu den vorigen Figuren erläuterten, dass nicht für alle vereinzelten Fluorophore, die für eine Bildgebung an einer mehrfarbig gefärbten Probe genutzt werden, Lokalisationen U 57 erhalten werden müssen.
• Fluorophore von mehr als zwei Farbstoffsorten können ebenfalls ko-lokalisiert werden. Dies kann beispielsweise entsprechend einem in 18 dargestellten Verlauf geschehen. Wie beispielsweise in 9 dargestellt, können zu den jeweiligen Lokalisationen 114 Detektionssignale 115, die jeweils einen Lichtmengenwert 50 umfassen, vorliegen. Es ist daher möglich, dass beispielsweise Farbstoffmoleküle zweier Farbstoffsorten mit einer gemeinsamen Wellenlänge gut lokalisiert werden können und anhand der Lichtmengenwerte 50 unterschieden werden können. Dafür ist es vorteilhaft, für die beiden Farbstoffsorten jeweils für alle vereinzelten anregbaren Fluorophore auch mit einer zweiten Wellenlänge von Anregungslicht Lichtmengenwerte 50 aufzunehmen, beispielsweise indem jeweils für alle vereinzelten anregbaren Fluorophore auch Lokalisationen U 57 erhalten werden. Eine weitere Möglichkeit ergibt sich aus der Zusammenschau beispielsweise der 16 und 17.
• Eine weitere Möglichkeit, für Fluorophore von mehr als zwei Farbstoffsorten unter Nutzung eines erfindungsgemäßen Verfahrens Ko-Lokalisationen zu erhalten, wird hier anhand von 19 erläutert. Wie oben ausgeführt, reicht es für das Ko-Lokalisieren aus, dass für eine von zwei Farbstoffsorten Lokalisationen unter Nutzung zweier Wellenlängen für das Anregungslicht durchgeführt werden, wenn Fluorophore des zweiten Farbstoffs mit Anregungslicht einer der beiden Wellenlängen lokalisiert werden. In der 19 sind nun die Beziehungen von Fluorophoren eines ersten Farbstoffs 54, von Fluorophoren eines zweiten Farbstoffs 55 und von Fluorophoren eines weiteren Farbstoffs 155 zu einer Wellenlänge A 111, einer Wellenlänge B 112 und einer weiteren Wellenlänge 116 dargestellt. Durch die durchgezogenen Verbindungen wird ausgedrückt, dass die Wellenlänge A 111 zum Lokalisieren von Fluorophoren eines ersten Farbstoffs 54, die Wellenlänge B 112 zum Lokalisieren von Fluorophoren eines zweiten Farbstoffs 55 und die weitere Wellenlänge 116 zum Lokalisieren von Fluorophoren eines weiteren Farbstoffs 155 gut geeignet sind. Zudem ist die Wellenlänge A 111 hinreichend zum Lokalisieren von Fluorophoren des zweiten Farbstoffs 55 und die Wellenlänge B 112 hinreichend zum Lokalisieren von Fluorophoren des ersten Farbstoffs 54 geeignet, um Unterschiede 61 der Lokalisationen mit den verschiedenen Wellenlängen zu erfassen; dies wird durch die gestrichelte Verbindung zum Ausdruck gebracht. Die Wellenlänge B 112 ist hinreichend zum Lokalisieren von Fluorophoren des weiteren Farbstoffs 155 geeignet, um Unterschiede 61 der Lokalisationen mit den verschiedenen Wellenlängen, hier also der Wellenlänge B 112 und der weiteren Wellenlänge 116, zu erfassen. Die jeweilige Bestimmung der Unterschiede 61 der Lokalisationen ermöglicht, alle Lokalisationen in einer Gesamtmenge von Lokalisationen 60 zusammenzufassen. Auch hierbei kann zu jeder Lokalisation der Gesamtmenge von Lokalisationen 60 Information über die Farbstoffsorte vorliegen, die jeweils, wie im entsprechenden Zusammenhang dargelegt, aus den Detektionssignalen 115 mit den Lichtmengenwerten 50 erhalten werden kann.
• 20 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Mikroskop 80. In der dargestellten Ausführungsform weist es eine Steuereinheit 89 auf, in die eine Auswahleinheit 87, die eingerichtet ist, auf Basis eines Detektionssignals 51,52,115 hinsichtlich einer Fluoreszenzemission eines einzelnen Fluorophors eine Wellenlänge für ein Anregen auszuwählen, und eine Berechnungseinheit 89, die eingerichtet ist, aus zwei Detektionssignalen 51,52,115 hinsichtlich einer Fluoreszenzemission eines einzelnen Fluorophors jeweils eine Lokalisation und einen Unterschied der Lokalisationen zu bestimmen, integriert ist. Dass auf Basis eines Detektionssignals 51,52,115 eine Wellenlänge ausgewählt wird, umfasst, dass bei dem Auswählen 33 auch weitere Informationen wie beispielsweise ein Referenzwert 27 oder ein weiteres Detektionssignal 115 ausgewertet werden. Die Auswahleinheit 87 ist über Steuerleitungen verknüpft mit einer Lasereinheit 81, die eingerichtet ist, schmalbandiges Licht zweier Wellenlängen abzugeben, und einer Lasereinheit 82, die eingerichtet ist, schmalbandiges Licht einer dritten Wellenlänge abzugeben, die sich von den zwei Wellenlängen der ersten Lasereinheit 81 unterscheidet. Weiter weist das Mikroskop 80 eine Detektionseinheit 86 auf, mit der aus einer Probe emittiertes Fluoreszenzlicht erfasst werden kann. Die Detektionseinheit 86 ist mittels der Steuereinheit 89 mit der Auswahleinheit 87 verbunden. Das schmalbandige Licht 83,84,85 wird über Strahlkoppler 90,90' in einen Strahlengang 93 eingekoppelt, durch den das Licht auf eine oder in eine Probe geleitet werden kann. Der grundsätzliche Aufbau verschiedener Mikroskope ist dem Fachmann bekannt. Auf die Darstellung weiterer Komponenten zum Beispiel des Strahlengangs 93 wird daher hier verzichtet. Über den Strahlengang 93 kann aus einer Probe emittiertes Fluoreszenzlicht 92 auf die Detektionseinheit 86 geleitet werden. Weiter verfügt das Mikroskop 1 über ein Berechnungseinheit 88, die eingerichtet ist, aus zwei Detektionssignalen 51,52,115 hinsichtlich einer Fluoreszenzemission eines einzelnen Fluorophors jeweils eine Lokalisation 12,22 und einen Unterschied 61 der Lokalisationen zu bestimmen. Die Wellenlängen der schmalbandigen Lichte 83,84,85 umfassen dabei zwei Wellenlängen, die sich um einen Wert zwischen 200 nm und 50 nm voneinander unterscheiden, beispielsweise kann es sich bei dem schmalbandigen Licht 85 um Licht einer Wellenlänge von 488 nm oder 525 nm und bei dem schmalbandigen Licht 83 kann es sich um Licht einer Wellenlänge von etwa 525 nm handeln und das schmalbandige Licht 84 kann beispielsweise Licht einer Wellenlänge von etwa 650 nm sein. Unter schmalbandigem Licht ist hier Licht mit spektralen Breiten im Bereich bis zu einigen Nanometern zu verstehen. Ist das schmalbandige Licht 83,84,85 vorgesehen, Fluorophore durch Zweiphotonen-Absorption oder allgemeiner Mehrphotonen-Absorption anzuregen, so kann die Bandbreite des schmalbandigen Lichts 83,84,85 bis zu 50 nm betragen. Ist das schmalbandige Licht 83,84,85 vorgesehen, Fluorophore durch Einphotonen-Absorption anzuregen, weist es typischerweise Bandbreiten im Bereich unterhalb von 20 nm, bervorzugt unterhalb von 15 nm oder unterhalb von 10 nm auf.
• Bezugszeichenliste

1

Teilbereich

2

Auffinden eines Kleinfeldbereichs

3

fokussiertes Anregungslicht

4

zentrales Intensitätsmaximum

5

zentrales Intensitätsminimum

6

erstes Anregungsspektrum

7

zweites Anregungsspektrum

8

erstes Emissionsspektrum

9

zweites Emissionsspektrum

10

erstes Anregen und Detektieren

11

erstes Lokalisieren

12

erste Lokalisation

13

erste Wellenlänge

15

Weiteres Anregen und Detektieren

20

zweites Anregen und Detektieren

21

zweites Lokalisieren

22

zweite Lokalisation

23

zweite Wellenlänge

25

Testwellenlänge

26

zweite Testwellenlänge

27

Referenzwert

30

Vergleichen

32

Auswerten

33

Auswählen einer Wellenlänge

33'

Auswählen einer zweiten Wellenlänge

34

Beenden Anregen und Detektieren

40

Zeitspanne

41

Kriterium

42

Kleinfeldbereich

43

Auswählen eines Kleinfeldbereichs

44

vereinzeltes anregbares Fluorophor

45

anregbare Fluorophore

50

Lichtmengenwert

51

erstes Detektionssignal

52

zweites Detektionssignal

53

Mehrzahl

54

Fluorophor eines ersten Farbstoffs

55

Fluorophor eines zweiten Farbstoffs

56

Lokalisation L

57

Lokalisation U

58

Mehrzahl Lokalisationen

59

Mittlerer Unterschied

60

Gesamtmenge von Lokalisationen

61

Unterschied

62

Information über Farbstoffsorte

63

Gesamtinformation

70

Anregen

71

Detektieren

80

Mikroskop

81

Lasereinheit

82

Lasereinheit

83

schmalbandiges Licht

84

schmalbandiges Licht

85

schmalbandiges Licht

86

Detektionseinheit

87

Auswahleinheit

88

Berechnungseinheit

89

Steuereinheit

90,90'

Strahlkoppler

92

Fluoreszenzlicht

93

Strahlengang

110

Anregen und Detektieren

111

Wellenlänge A

112

Wellenlänge B

113

Lokalisieren

114

Lokalisation

115

Detektionssignal

116

weitere Wellenlänge

117

Menge

155

Fluorophor eines weiteren Farbstoffs

• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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• Zitierte Patentliteratur
• DE 102011055367 B4 [0016]
• DE 102013114860 B3 [0016]
• WO 2018/069283 A1 [0018]
• US 2019/0235220 A1 [0018, 0019]
• US 2019/0234882 A1 [0018, 0020]
• US 2019/0234879 A1 [0018, 0021]
• EP 3372990 A1 [0025]

Claims (34)

1. Lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe umfassend: - ein erstes Anregen und Detektieren 10, wobei ein Teilbereich 1 der Probe mit Anregungslicht einer ersten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich 1 der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ersten Wellenlänge von einem vereinzelten Fluorophor eines Farbstoffs emittiertes Fluoreszenzlicht 92 detektiert und ein erstes Detektionssignal 51 erhalten wird, - ein erstes Lokalisieren 11 des vereinzelten Fluorophors und Erhalten einer ersten Lokalisation 12, - ein zweites Anregen und Detektieren 20, wobei der Teilbereich 1 der Probe mit Anregungslicht einer zweiten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich 1 der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der zweiten Wellenlänge von dem vereinzelten Fluorophor des Farbstoffs emittiertes Fluoreszenzlicht 92 detektiert und ein zweites Detektionssignal 52 erhalten wird, - ein zweites Lokalisieren 21 des vereinzelten Fluorophors und Erhalten einer zweiten Lokalisation 22, - ein Bestimmen eines Unterschieds 61 zwischen der ersten Lokalisation 12 und der zweiten Lokalisation 22.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Teilbereich 1 der Probe ein Kleinfeldbereich 42 ist, der eine Ausdehnung von weniger als 3 µm, bevorzugt von weniger als 2 µm aufweist und dass das Anregungslicht der ersten Wellenlänge und das Anregungslicht der zweiten Wellenlänge fokussiertes Licht 3 mit einem Fokuspunkt und mit einer Intensitätsverteilung ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsverteilung des fokussierten Lichts 3 der ersten Wellenlänge ein zentrales Minimum 4 aufweist, insbesondere im Wesentlichen eine Donut-Verteilung oder eine Bottle-Beam-Verteilung ist, und dass das erste Anregen erfolgt, indem der Fokuspunkt des Anregungslichts der ersten Wellenlänge an einem Ort innerhalb des Teilbereichs 1 positioniert wird, weiter dadurch gekennzeichnet, dass das Detektieren das Detektieren des als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ersten Wellenlänge von dem vereinzelten Fluorophor emittierten Fluoreszenzlichts 92 umfasst, dass das Fluoreszenzlicht 92 in einer Ebene, die konjugiert zu der Ebene ist, in der der Fokuspunkt liegt, mit einem ortsauflösenden Detektor detektiert wird oder dass eine Detektionsapertur innerhalb einer Ebene, die senkrecht zu einer optischen Achse orientiert ist, an einer Mehrzahl von Positionen um die optische Achse herum positioniert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsverteilung des fokussierten Lichts 3 der ersten Wellenlänge ein zentrales Maximum 4 aufweist, insbesondere im Wesentlichen eine Gauß'sche Verteilung ist, und dass das erste Anregen und Detektieren 10, wobei ein Teilbereich 1 der Probe mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge beaufschlagt wird, erfolgt, indem der Fokuspunkt des Anregungslichts der ersten Wellenlänge an einer Abfolge von Orten innerhalb des Teilbereichs 1 positioniert wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsverteilung des fokussierten Lichts 3 der zweiten Wellenlänge ein zentrales Minimum 5 aufweist, insbesondere im Wesentlichen eine Donut-Verteilung oder eine Bottle-Beam-Verteilung ist, und dass das zweite Anregen erfolgt, indem der Fokuspunkt des Anregungslichts der zweiten Wellenlänge an einer Abfolge von nominellen Orten, die die erste Lokalisation 12 umschließen, wobei der umschlossene Bereich eine erste Ausdehnung aufweist, innerhalb des Teilbereichs 1 positioniert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: - ein Auswählen 33 einer Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge 117 von mindestens zwei Wellenlängen für ein weiteres Anregen des Teilbereichs 1 der Probe auf Basis des ersten Detektionssignals 51 und/oder des zweiten Detektionssignals 52, sodass eine ausgewählte Wellenlänge erhalten wird, und - dem Auswählen 33 nachfolgend ein weiteres Anregen und Detektieren 15, wobei der Teilbereich 1 der Probe mit Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich 1 der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge von dem vereinzelten Fluorophor des Farbstoffs emittiertes Fluoreszenzlicht 92 detektiert und ein weiteres Detektionssignal erhalten wird, - zusammen mit dem Erhalten des weiteren Detektionssignals 115 ein weiteres Lokalisieren 113 des vereinzelten Fluorophors und Erhalten einer weiteren Lokalisation 114.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Auswählen 33 der Wellenlänge erfolgt durch ein Auswerten 32 des ersten Detektionssignals 51 und/oder des zweiten Detektionssignals 52 hinsichtlich des Farbstoffs, dessen vereinzeltes Fluorophor das detektierte Fluoreszenzlicht 92 emittiert hat.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgewählte Wellenlänge die erste Wellenlänge oder die zweite Wellenlänge ist.
9. Verfahren einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge fokussiertes Licht 3 mit einem Fokuspunkt und mit einer Intensitätsverteilung ist, die ein zentrales Minimum 5 aufweist, insbesondere im Wesentlichen eine Donut-Verteilung oder eine Bottle-Beam-Verteilung ist, und dass das weitere Anregen und Detektieren 110, erfolgt, indem der Fokuspunkt des Anregungslichts der ausgewählten Wellenlänge an einer nominellen Abfolge von Orten innerhalb des Teilbereichs positioniert wird, die einen zentralen Ort, der aus der ersten Lokalisation 12 und/oder der zweiten Lokalisation 22 berechnet ist, umschließen, wobei der umschlossene Bereich eine zweite Ausdehnung aufweist, die kleiner ist als die erste Ausdehnung, innerhalb des Teilbereichs positioniert wird, wobei der zentrale Ort - wenn die ausgewählte Wellenlänge die erste Wellenlänge ist, die erste Lokalisation ist, - wenn die ausgewählte Wellenlänge die zweite Wellenlänge ist, die zweite Lokalisation ist, - wenn die ausgewählte Wellenlänge eine weitere Wellenlänge ist, die zwischen der ersten und der zweiten Wellenlänge liegt, durch Interpolation aus der ersten und der zweiten Lokalisation bestimmt wird, und - wenn die ausgewählte Wellenlänge eine weitere Wellenlänge ist, die größer als die erste und die zweiten Wellenlänge oder kleiner als die erste und die zweiten Wellenlänge ist, durch Extrapolation aus der ersten Lokalisation 12 und der zweiten Lokalisation 22 bestimmt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Anregen und Detektieren 10 nach einer vorbestimmten Zeitspanne 40 oder dann, wenn ein Lichtmengenwert 50 des ersten Detektionssignals 51 einen Schwellwert erreicht hat, beendet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgewählte Wellenlänge die erste Wellenlänge ist und dass das weitere Anregen und Detektieren 15 und das weitere Lokalisieren des vereinzelten Fluorophors zusammenhängend oder iterativ solange durchgeführt wird, bis eine weitere Lokalisation mit höchstens einer vorbestimmten Unsicherheit erhalten wird, wobei die weitere Lokalisation in diesem Fall die erste Lokalisation 12 ist, und dass erst nach dem Beenden des weiteren Anregens und Detektierens 15 das zweite Anregen und Detektieren 20 und das zweite Lokalisieren 21 durchgeführt wird.
12. Lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11 für eine Menge von Teilbereichen 1 der Probe durchgeführt wird, wobei die so erhaltene Menge von Teilbereichen 1 sowohl Teilbereiche 1 enthält, aus denen von jeweils einem vereinzelten Fluorophor eines ersten Farbstoffs Fluoreszenzlicht 92 emittiert und detektiert wurde als auch solche, aus denen von jeweils einem vereinzelten Fluorophor eines anderen Farbstoffs Fluoreszenzlicht 92 emittiert und detektiert wurde.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass aus den Lokalisationen 12,22,56,57,114 und den Unterschieden 61 der Lokalisationen der einzelnen vereinzelten Fluorophore, die mit Anregungslicht verschiedener Wellenlängen erhalten wurden, eine Karte mit Korrekturvektoren für die Ko-Registrierung aller Lokalisationen in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem bestimmt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass zu jeder der Lokalisationen 12,22,56,57,114 Information über die Zeit, zu der das Anregen und Detektieren 10,15,20,110 für das Lokalisieren erfolgte, gespeichert ist und dass die Karte mit Korrekturvektoren eine von einer Zeitkoordinate abhängende Karte ist.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass aus den ersten Lokalisationen 12 und den zweiten Lokalisationen 22 und/oder den ersten und den weiteren Lokalisationen und/oder den zweiten und den weiteren Lokalisationen und optional aus anderen Lokalisationen, die mittels Anregen mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge oder der zweiten Wellenlänge oder einer der weiteren Wellenlängen und Detektieren erhalten wurden, ein Bild der Probe erzeugt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Teilbereich 1 der Probe ein Weitfeldbereich ist und dass das Detektieren ein Abbilden des Teilbereichs 1 auf einen Weitfelddetektor ist, wobei von dem vereinzelten Fluorophor emittiertes Fluoreszenzlicht auf dem Weitfelddetektor örtlich aufgelöst detektiert wird, sodass ein örtlich aufgelöstes Detektionssignal erhalten wird, wobei bei dem erstes Anregen und Detektieren 10 und dem zweiten Anregen und Detektieren 20 von aus dem Teilbereich 1 der Probe als Folge der Anregung mit Anregungslicht der jeweiligen Wellenlänge insgesamt von mehreren vereinzelten Fluorophoren emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert wird und zu mehreren vereinzelten Fluorophoren jeweils ein erstes und ein zweites örtlich aufgelöstes Detektionssignal 51,52 erhalten wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: - ein erstes und ein zweites Lokalisieren 11,12 mehrerer vereinzelter Fluorophore auf Grundlage der jeweiligen ersten und zweiten örtlich aufgelösten Detektionssignale 51,52 und Erhalten von jeweils ersten und zweiten Lokalisationen 12,22 und - jeweils ein Bestimmen eines Unterschieds 61 zwischen der jeweiligen ersten Lokalisation 12 und der jeweiligen zweiten Lokalisation 22.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Anregen und Detektieren 10 und das zweite Anregen und Detektieren 20 gleichzeitig erfolgen.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: - ein Auswählen 33 einer Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge 117 von mindestens zwei Wellenlängen für ein weiteres Anregen des Teilbereichs 1 der Probe auf Basis zumindest der Menge der ersten und der zweiten Detektionssignale 51,52, sodass eine ausgewählte Wellenlänge erhalten wird, und - dem Auswählen 33 nachfolgend ein weiteres Anregen und Detektieren 110, wobei der Teilbereich 1 der Probe mit Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich 1 der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge von mehreren vereinzelten Fluorophoren emittiertes Fluoreszenzlicht 92 detektiert und jeweils ein weiteres Detektionssignal 115 erhalten wird, - ein weiteres Lokalisieren 113 der mehreren vereinzelten Fluorophore auf Grundlage jeweils des weiteren Detektionssignals 115 und Erhalten jeweils einer weiteren Lokalisation 114, wobei das Auswählen 33 der Wellenlänge erfolgt durch ein Auswerten 32 der Menge der ersten und der zweiten Detektionssignale 51,52 hinsichtlich der Sorte des Farbstoffs, dessen vereinzelte Fluorophore das detektierte Fluoreszenzlicht 92 emittiert haben, das den überwiegenden Anteil der Menge der erhaltenen Detektionssignale hervorgerufen hat.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgewählte Wellenlänge die erste Wellenlänge oder die zweite Wellenlänge ist.
21. Lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe umfassend: - ein testweises Anregen und Detektieren 110, wobei ein Teilbereich 1 der Probe mit Anregungslicht einer Testwellenlänge 25 beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich 1 der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der Testwellenlänge 25 von einem vereinzelten Fluorophor emittiertes Fluoreszenzlicht 92 detektiert und ein Testdetektionssignal erhalten wird, - ein Auswählen 33 einer ersten Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge 117 von mindestens zwei Wellenlängen und/ oder ein Auswählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 innerhalb des Teilbereichs 1 für ein folgendes Anregen des Teilbereichs 1 der Probe auf Basis zumindest des Testdetektionssignals, - ein erstes Anregen und Detektieren 10, wobei der Teilbereich 1 der Probe oder der Kleinfeldbereich 42 innerhalb des Teilbereichs 1 der Probe mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich 1 der Probe oder aus dem Kleinfeldbereich 42 innerhalb des Teilbereichs 1 der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ersten Wellenlänge von dem vereinzelten Fluorophor emittiertes Fluoreszenzlicht 92 detektiert und ein erstes Detektionssignal erhalten wird, - ein erstes Lokalisieren 11 des vereinzelten Fluorophors und Erhalten einer ersten Lokalisation 12.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: - ein Auswählen 33 einer ersten Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge 117 von mindestens zwei Wellenlängen für ein folgendes Anregen des Teilbereichs 1 der Probe auf Basis zumindest des Testdetektionssignals - vor dem Auswählen 33 der ersten Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge 117 von mindestens zwei Wellenlängen und nach dem testweisen Anregen und Detektieren ein zweites testweises Anregen, wobei der Teilbereich 1 der Probe oder der Kleinfeldbereich 42 innerhalb des Teilbereichs 1 der Probe mit Anregungslicht einer zweiten Testwellenlänge 26 beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich 1 der Probe oder aus dem Kleinfeldbereich 42 innerhalb des Teilbereichs 1 der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der zweiten Testwellenlänge 26 von einem vereinzelten Fluorophor emittiertes Fluoreszenzlicht 92 detektiert und ein zweites Testdetektionssignal erhalten wird, und dass das Auswählen 33 einer ersten Wellenlänge auf Basis zumindest des ersten und des zweiten Testdetektionssignals erfolgt, wobei das erste Testdetektionssignal und/oder das zweite Testdetektionssignal ein Lichtmengenwert 50 des detektierten Fluoreszenzlichts 92 ist.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Auswählen 33 der ersten Wellenlänge auf Basis eines Vergleichs des ersten und/oder des zweiten Testdetektionssignals mit einem vorbestimmten Referenzwert 27 oder mit vorbestimmten Referenzwerten 27 oder auf Basis des Verhältnisses des ersten Testdetektionssignals zu dem zweiten Testdetektionssignal erfolgt.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: - ein Auswählen 33 einer zweiten Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge von mindestens zwei Wellenlängen für ein folgendes Anregen des Teilbereichs der Probe, - ein zweites Anregen und Detektieren 20, wobei der Teilbereich 1 der Probe mit Anregungslicht der zweiten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich 1 der Probe oder dem Kleinfeldbereich 42 innerhalb des Teilbereichs 1 der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der zweiten Wellenlänge von dem vereinzelten Fluorophor emittiertes Fluoreszenzlicht 92 detektiert und ein zweites Detektionssignal 52 erhalten wird, - ein zweites Lokalisieren 21 des vereinzelten Fluorophors und Erhalten einer zweiten Lokalisation 22 und - ein Bestimmen eines Unterschieds 61 zwischen der ersten Lokalisation 12 und der zweiten Lokalisation 22.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Teilbereich 1 der Probe ein Kleinfeldbereich 42 ist, der bevorzugt eine Ausdehnung von weniger als 3 µm, bevorzugt von weniger 2 µm aufweist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem testweisen Anregen und Detektieren ein Auswählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 innerhalb des Teilbereichs 1 erfolgt, wobei der Kleinfeldbereich 42 bevorzugt eine Ausdehnung von weniger als 3 µm, bevorzugt von weniger 2 µm aufweist.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 und 26, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Lokalisieren 11 und/oder das zweite Lokalisieren 21 innerhalb des Kleinfeldbereichs 42 nach einem MINFLUX-Verfahren erfolgt.
28. Lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein Verfahren nach Anspruch 24 und einem der Ansprüche 25 bis 27 für eine Menge von Kleinfeldbereichen 42 der Probe durchgeführt wird, wobei die so erhaltene Menge von Kleinfeldbereichen 42 sowohl Kleinfeldbereiche 42 enthält, aus denen von jeweils einem vereinzelten Fluorophor eines ersten Farbstoffs Fluoreszenzlicht 92 emittiert und detektiert wurde als auch solche, aus denen von jeweils einem vereinzelten Fluorophor eines anderen Farbstoffs Fluoreszenzlicht 92 emittiert und detektiert wurde.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass aus den Lokalisationen 12,22,56,57,114 und den Unterschieden 61 der Lokalisationen der einzelnen vereinzelten Fluorophore, die mit Anregungslicht verschiedener Wellenlängen erhalten wurden, eine Karte mit Korrekturvektoren für die Ko-Registrierung aller Lokalisationen in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem bestimmt wird.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass zu jeder der Lokalisationen Information über die Zeit, zu der das Anregen und Detektieren für das Lokalisieren erfolgte, gespeichert ist und dass die Karte mit Korrekturvektoren eine von einer Zeitkoordinate abhängende Karte ist.
31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass aus den ersten und den zweiten und optional aus anderen Lokalisationen, die mittels Anregen mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge oder der zweiten Wellenlänge oder optional einer weiteren Wellenlänge erhalten wurden, ein Bild der Probe erzeugt wird, in dem Fluorophore verschiedener Farbstoffsorten ko-lokalisiert sind.
32. Mikroskop 1 zur Ausführung eines Verfahrens nach Anspruch 6 oder nach den Ansprüchen 24 und 25 oder 26, aufweisend: - eine Lasereinheit 81,82 für die Anregung von Fluoreszenz, die eingerichtet ist, schmalbandiges Licht zweier Wellenlängen abzugeben, oder zwei Lasereinheiten 81,82 für die Anregung von Fluoreszenz 92, die zusammen eingerichtet sind, schmalbandiges Licht 83,84,85 zweier Wellenlängen abzugeben, - eine Detektionseinheit 86, - eine Auswahleinheit 87, die eingerichtet ist, auf Basis eines Detektionssignals hinsichtlich einer Fluoreszenzemission eines einzelnen Fluorophors eine Wellenlänge für ein Anregen auszuwählen, - eine Berechnungseinheit 88, die eingerichtet ist, aus zwei Detektionssignalen hinsichtlich einer Fluoreszenzemission eines einzelnen Fluorophors jeweils eine Lokalisation und einen Unterschied 61 der Lokalisationen zu bestimmen.
33. Mikroskop 1 nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass sich die zwei Wellenlängen um einen Wert zwischen 200 nm und 50 nm voneinander unterscheiden
34. Mikroskop nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Lasereinheit 81,82 aufweist, die eingerichtet ist, schmalbandiges Licht einer dritten Wellenlänge abzugeben, die sich von den zwei Wellenlängen unterscheidet..

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