DE102013114860B3 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Orte einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Orte einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe Download PDF

Info

Publication number
DE102013114860B3
DE102013114860B3 DE102013114860.3A DE102013114860A DE102013114860B3 DE 102013114860 B3 DE102013114860 B3 DE 102013114860B3 DE 102013114860 A DE102013114860 A DE 102013114860A DE 102013114860 B3 DE102013114860 B3 DE 102013114860B3
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
sample
light
minimum
fluorescent
substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
DE102013114860.3A
Other languages
English (en)
Inventor
Stefan W. Hell
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to DE102013114860.3A priority Critical patent/DE102013114860B3/de
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority to RU2016130016A priority patent/RU2660301C2/ru
Priority to CN201480076127.XA priority patent/CN106030287B/zh
Priority to JP2016539105A priority patent/JP6452005B2/ja
Priority to EP14816202.7A priority patent/EP3087372B1/de
Priority to PCT/EP2014/077527 priority patent/WO2015097000A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE102013114860B3 publication Critical patent/DE102013114860B3/de
Priority to US15/189,300 priority patent/US9719928B2/en
Priority to HK16114563A priority patent/HK1226479A1/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01B—MEASURING LENGTH, THICKNESS OR SIMILAR LINEAR DIMENSIONS; MEASURING ANGLES; MEASURING AREAS; MEASURING IRREGULARITIES OF SURFACES OR CONTOURS
    • G01B11/00—Measuring arrangements characterised by the use of optical techniques
    • G01B11/14—Measuring arrangements characterised by the use of optical techniques for measuring distance or clearance between spaced objects or spaced apertures
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/008—Details of detection or image processing, including general computer control
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/58—Optics for apodization or superresolution; Optical synthetic aperture systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/068—Optics, miscellaneous
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/10—Scanning

Abstract

Zur Bestimmung des Ortes (xM) einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe, wobei sich die einzelnen Moleküle der Substanz in einem fluoreszenten Zustand befinden, in dem sie mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sind und wobei Abstände der einzelnen Moleküle der Substanz in einem interessierenden Bereich der Probe einen Mindestwert d = λ/(2nsinα √(1 + I/IS)) einhalten, werden die einzelnen Moleküle der Substanz mit dem Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt, wobei eine Intensitätsverteilung des Anregungslichts mindestens eine Nullstelle aufweist. Das Fluoreszenzlicht von den angeregten einzelnen Molekülen der Substanz wird für verschiedene Positionen (xN) der mindestens einen Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts in dem interessierenden Bereich der Probe registriert. Dabei sind Abstände zwischen nächstbenachbarten Positionen (xN) der mindestens einen Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts, in denen das Fluoreszenzlicht von den angeregten einzelnen Molekülen der Substanz registriert wird, nicht größer als der halbe Mindestwert d. Dann werden die Orte (xM) der einzelnen Moleküle der Substanz aus dem Verlauf der Intensität (I) des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen Molekül über den Positionen (xN) der mindestens einen Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts in dem interessierenden Bereich der Probe abgeleitet.

Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung der Orte einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe und auf eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens. Das Verfahren und die Vorrichtung dienen insbesondere dem Zweck, eine Verteilung der Moleküle der Substanz in der Probe oder einer mit der Substanz markierten Struktur der Probe mit hoher Ortsauflösung abzubilden.
  • Allgemein ist die Erfindung dem Gebiet der Fluoreszenzlichtmikroskopie zuzuordnen. Das heißt, der Ort eines Moleküls der Substanz in der Probe wird unter Ausnutzung seiner Fluoreszenzeigenschaften bestimmt.
  • Wenn hier von einem fluoreszenten Zustand eines Moleküls die Rede ist, bedeutet dies, dass es mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar ist, nicht aber, dass es sich schon in einem angeregten, fluoreszierenden Zustand befindet.
  • Wenn hier von einem nichtfluoreszenten Zustand eines Moleküls die Rede ist, bedeutet dies entsprechend, dass es mit Anregungslicht nicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar ist und auch sonst wie nicht fluoresziert, d. h. Fluoreszenzlicht emittiert. Dabei ist nur von Bedeutung, dass das Molekül in dem nichtfluoreszenten Zustand kein Fluoreszenzlicht emittiert, das registriert wird, wenn das Fluoreszenzlicht registriert wird, zu dessen Emission das Molekül in dem fluoreszenten Zustand anregbar ist. So kann das Molekül in dem nichtfluoreszenten Zustand zum Beispiel zur Emission von Fluoreszenzlicht anderer Farbe, d. h. Wellenlänge, anregbar sein, das von dem Fluoreszenzlicht unterscheidbar ist, zu dessen Emission es in dem fluoreszenten Zustand anregbar ist. Konkret kann das Molekül in dem fluoreszenten Zustand zur Emission von grünem Fluoreszenzlicht und in dem nichtfluoreszenten Zustand zur Emission von rotem Fluoreszenzlicht anregbar sein. Ein nichtfluoreszenter Zustand eines Moleküls, in dem es überhaupt nicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar ist, wird hier auch als Dunkelzustand bezeichnet.
  • STAND DER TECHNIK
  • Um die Orte von Fluoreszenzlicht emittierenden Molekülen in einer Probe zu bestimmen, gibt es zwei grundsätzliche Vorgehensweisen. Bei der ersten Vorgehensweise werden die Orte aus der räumlichen Verteilung des mit einem Lichtsensorarray registrierten Fluoreszenzlichts bestimmt. Bei der zweiten Vorgehensweise werden die Orte der Moleküle den Positionen einer räumlich begrenzten Anregung zur Emission des Fluoreszenzlichts gleichgesetzt, an denen Fluoreszenzlicht von den Molekülen registriert wird.
  • Bei der ersten Vorgehensweise, bei der das von der Substanz emittierte Fluoreszenzlicht mit einem Lichtsensorarray registriert wird, auf das die Probe mit einem Objektiv abgebildet wird, ist die erzielbare räumliche Genauigkeit bei der Abbildung der Verteilung der Moleküle der Substanz in der Probe oder einer damit markierten Struktur der Probe normalerweise durch die sogenannte Abbesche Beugungsgrenze beschränkt. So kann aus einzelnen Photonen, die an einer bestimmten Position des Lichtsensorarrays registriert werden, nur mit einer Ortsunschärfe der Größenordnung λ/2nsinα, wobei λ die Wellenlänge des Fluoreszenzlichts ist, n der Brechungsindex des optischen Materials zwischen Probe und Objektiv ist und α der halbe Öffnungswinkel des Objektivs ist, auf einen bestimmten Ort des sie emittierenden Moleküls in der Probe geschlossen werden.
  • Wenn jedoch das an dem Lichtsensorarray registrierte Fluoreszenzlicht einem einzelnen fluoreszierenden Molekül in der Probe zugeordnet werden kann, kann der Ort des Moleküls, soweit es eine größere Anzahl von Photonen emittiert, mit einer Genauigkeit jenseits der Beugungsgrenze bestimmt werden. Dazu wird der Schwerpunkt der Verteilung der Positionen des Lichtsensorarrays bestimmt, an denen die einzelnen Photonen registriert werden, und daraus der Ort des emittierenden Moleküls abgeleitet. Die bei dieser, Lokalisierung genannten Methode erzielte Genauigkeit wächst mit √n an, wobei n die Anzahl der Photonen ist, die von dem Molekül emittiert und mit dem Lichtsensorarray registriert werden.
  • Wenn ein Molekül Fluoreszenzlicht mit einer gerichteten räumlichen Verteilung emittiert, wirkt sich dies bei der Bestimmung seines Ortes aus der Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts über einem Lichtsensorarray durch Lokalisierung in Form eines Ortsfehlers aus. Dieser Ortsfehler hängt von der Orientierung des Moleküls in der Probe ab. Eine gerichtete Verteilung des emittierten Fluoreszenzlichts zeigt sich beispielsweise bei Molekülen, deren Rotationsdiffusionszeiten länger sind als ihre Verweildauer in dem angeregten Zustand, aus dem heraus sie das Fluoreszenzlicht emittieren. (Siehe Engelhardt, J. et al., Molecular orientation affects localization accuracy in superresolution far-field fluorescence microscopy, Nano Lett. 2011 Jan 12; 11(1): 209–13).
  • Aus der WO 2006/127692 A2 ist es bekannt, eine interessierende Struktur in einer Probe mit Molekülen einer Substanz zu markieren, die sich in einem nichtfluoreszenten Ausgangszustand befinden, aber mit Einstelllicht in einen fluoreszenten Zustand umgeschaltet werden können. So kann mit dem Einstelllicht ein geringer Anteil der Moleküle in den fluoreszenten Zustand gebracht werden, bei dem nächstbenachbarte Moleküle in dem fluoreszenten Zustand einen größeren Abstand als die Beugungsgrenze aufweisen. Bei einer anschließenden Beaufschlagung mit Anregungslicht emittieren nur die in dem fluoreszenten Zustand befindlichen Moleküle Fluoreszenzlicht. So kann das Fluoreszenzlicht von den einzelnen Molekülen in dem fluoreszenten Zustand getrennt registriert werden; und die Orte der einzelnen Moleküle können trotz hoher absoluter Konzentration der Moleküle der Substanz durch Lokalisierung mit einer Genauigkeit jenseits der Beugungsgrenze bestimmt werden. Eine Abbildung der Verteilung der Moleküle der Substanz wird schrittweise dadurch erreicht, dass die Schritte des Einstellens eines geringen Anteils der Moleküle in dem fluoreszenten Zustand, des Anregens dieser Moleküle zur Emission von Fluoreszenzlicht und des Registrierens des Fluoreszenzlicht mit einem Lichtsensorarray wiederholt und damit statistisch bedingt für immer andere Moleküle der Substanz durchgeführt werden.
  • Die WO 2006/127692 A2 beschreibt auch, dass das Aktivieren einer Teilmenge der Moleküle der Substanz in einen fluoreszenten Zustand auf andere optische Abbildungsverfahren übertragen werden kann. Dabei können durch eine Intensitätsverteilung des Anregungslichts mit durch Minima begrenzte Maxima die Moleküle der Substanz speziell in bestimmten Ebenen oder anderen räumlichen Untereinheiten der Probe zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt werden.
  • Das aus der WO 2006/127692 A2 bekannte Verfahren benötigt zur Bestimmung der Position jedes Moleküls der Substanz mit einer Genauigkeit jenseits der Beugungsgrenze eine mit der gewünschten räumlichen Genauigkeit ansteigende Anzahl von Photonen von dem Molekül. Zudem stellt das Verfahren hohe Anforderungen an die Moleküle, damit diese zu einem kleinen Anteil in den fluoreszenten Zustand geschaltet werden können, wobei die in dem fluoreszenten Zustand befindlichen Moleküle einen größeren Abstand als die Beugungsgrenze aufweisen. Typischerweise handelt es sich bei den Molekülen um zwischen zwei Konformationszuständen schaltbare Proteinen, von denen nur einer fluoreszent ist, oder um photochrome Fluorophore.
  • Das aus der WO 2006/127692 A2 bekannte Verfahren wird auch als PALM, d. h. als photoaktivierte Lokalisierungsmikroskopie, bezeichnet. Ein sehr ähnliches, als STORM (Stochastische Optische Rekonstruktionsmikroskopie) bezeichnetes Verfahren weist grundsätzlich dieselben Vor- und Nachteile auf.
  • Aus der US 8,174,692 B2 ist es bekannt, dass auch normale Farbstoffe, die nicht einschaltbar sind, sondern einen fluoreszenten Ausgangszustand aufweisen, und auch nicht zwischen zwei Konformationszuständen geschaltet werden können, von denen nur einer fluoreszent ist, als Substanz genutzt werden können, um den Ort einzelner Moleküle der Substanz durch Lokalisierung zu bestimmen. Dabei wird die Probe mit Anregungslicht, das die Moleküle der Substanz zugleich mit einer gewissen Übergangswahrscheinlichkeit in einen relativ langlebigen elektronischen Dunkelzustand überführt, mit einer so hohen Intensität beaufschlagt, dass sich zwischen den aktuell in ihrem fluoreszenten Zustand befindlichen Molekülen Abstände oberhalb der Beugungsgrenze einstellen.
  • Die jeweils in dem fluoreszenten Zustand befindlichen Moleküle werden von dem Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt, das mit einem Lichtsensorarray ortsaufgelöst registriert wird. Auf diese Weise werden sukzessive verschiedene Moleküle der Substanz lokalisiert, da Moleküle, von denen bereits Photonen registriert wurden, in den Dunkelzustand gelangen, aus dem andere Moleküle mit einer gewissen Übergangswahrscheinlichkeit in den fluoreszenten Zustand zurückkehren. Dieses bekannte Verfahren kann kontinuierlich durchgeführt werden, d. h. es können ständig Frames aus dem Lichtsensorarray ausgelesen werden, während die Probe mit einer hohen Intensität des Anregungslichts beaufschlagt wird, die die Substanz im Wesentlichen in ihrem Dunkelzustand hält und nur vereinzelte Moleküle zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt.
  • Das aus der US 8,174,692 B2 bekannte Verfahren wird auch als GSDIM (Ground State Depletion Individual Molecule Return Microscopy) bezeichnet.
  • Die hohe Genauigkeit bei der Bestimmung der Orte einzelner fluoreszenter Moleküle durch Lokalisierung wird nur in der x- und y-Richtung quer zur optischen Achse erreicht, nicht aber in der z-Richtung der optischen Achse des Objektivs mit dem die jeweilige Probe auf das Lichtsensorarray abgebildet wird. Aus Aquino, D. et al., Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores, Nature Meth. 8, 353–359 (2011) ist es jedoch bekannt, dass die Orte der einzelnen fluoreszenten Moleküle bei einem PALM-, STORM- oder GSDIM-Verfahren durch eine 4Pi-Methode mit einander entgegen gerichteten Objektiven in der z-Richtung der optischen Achse durch Abtasten mit einer x–y-Messebene bestimmt werden können.
  • Wenn die Orte von Fluoreszenzlicht emittierenden Molekülen den Positionen ihrer räumlich begrenzten Anregung zur Emission des Fluoreszenzlichts gleichgesetzt werden, wobei die jeweilige Probe mit den Orten ihrer räumlich begrenzten Anregung abgetastet oder abgescannt wird, spricht man von Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie. Auch für die räumliche Genauigkeit, die bei der Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie erzielt wird, gilt normalerweise die Abbesche Beugungsgrenze, hier bei der Wellenlänge des Anregungslichts. Es sind aber verschiedene Verfahren bekannt, mit denen die Genauigkeit bei der Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie durch Verkleinerung des wirksamen räumlichen Bereichs der Anregung der Moleküle der Substanz zur Emission von Fluoreszenzlicht über die Beugungsgrenze hinweg erhöht werden kann.
  • Bei der Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie reicht die Registrierung irgendwelcher Photonen aus, um zu erkennen, dass im aktuellen Bereich der Anregung Fluoreszenzlicht emittierende Moleküle der Substanz vorliegen. Die Anzahl der registrierten Photonen wird ausschließlich zur Bestimmung der lokalen Konzentration der Moleküle der Substanz im aktuellen Bereich der Anregung verwendet.
  • Bei der STED(Stimulated Emission Depletion)-Fluoreszenzlichtmikroskopie wird eine mit Anregungslicht bewirkte Anregung von Molekülen der Substanz, mit der eine Struktur einer Probe markiert ist, in einem Umfeld eines interessierenden Messpunkts durch gerichtete Emission wieder beseitigt. Die gerichtete Emission wird mit STED-Licht stimuliert und verhindert die Emission von Fluoreszenzlicht von den Molekülen, so dass das Fluoreszenzlicht nur noch aus dem Bereich stammen kann, in dem die Anregung nicht beseitigt wird. Der Bereich, in dem die Anregung nicht beseitigt wird, kann sehr klein gehalten werden, indem er durch eine Nullstelle der Intensitätsverteilung des STED-Lichts definiert wird und die absolute Intensität des STED-Lichts hoch gewählt wird, so dass es bereits sehr nahe der Nullstelle die Anregung der Moleküle vollständig beseitigt.
  • Statt eine vorher bewirkte Anregung der Moleküle in Teilen der Probe wieder abzuregen, kann Licht mit einer eine Nullstelle aufweisenden Intensitätsverteilung auch dazu genutzt werden, die Moleküle der Substanz außerhalb der Nullstelle durch Konformationsänderung in einen nichtfluoreszenten Zustand zu schalten, wie dies bei der RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie geschieht, oder in einen elektronischen Dunkelzustand, wie es bei der GSD(Ground State Depletion)-Fluoreszenzlichtmikroskopie der Fall ist.
  • Aus der DE 10 2005 034 443 A1 ist ein GSD-Verfahren bekannt, bei dem nur mit Licht einer Wellenlänge gearbeitet wird. Bis zu einer bestimmten Intensität regt dieses Licht die Moleküle der Substanz in der Probe primär zur Emission von Fluoreszenzlicht an. Oberhalb dieser Intensität überführt das Licht die Moleküle der Substanz im Wesentlichen vollständig in einen Dunkelzustand. Indem eine Intensitätsverteilung, mit der das Licht auf eine Probe aufgebracht wird, ein unterhalb der beschriebenen Intensität gelegenes lokales Minimum aufweist, wird der Bereich, in dem die Moleküle der Substanz effektiv zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt werden, räumlich eingeschränkt.
  • Aus der WO 2012/171999 A1 ist ein Verfahren bekannt, bei dem durch schnelles Abtasten einer Probe mit einem Anregungslichtstrahl, der von einer Intensitätsverteilung von STED-Licht mit einem Minimum am Fokus des Anregungslichtstrahls umgeben ist, bei jedem von vielen aufeinanderfolgenden Scandurchgängen Fluoreszenzlicht nur von einzelnen Molekülen registriert wird. Die Orte der Moleküle, von denen Fluoreszenzlicht registriert wird, werden den zugehörigen Positionen des Fokus des Anregungslichtstrahls gleichgesetzt.
  • Aus der DE 10 2011 055 367 A1 ist ein Verfahren zum Verfolgen eines einzelnen fluoreszenten Moleküls bekannt. Das Molekül wird mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht veranlasst, und das Fluoreszenzlicht wird registriert. Dabei wird das Anregungslicht mit einer ein lokales Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet, und das Minimum wird dem sich in der Probe bewegenden Molekül nachgeführt. Zu diesem Zweck wird die Intensitätsverteilung des Anregungslichts so gegenüber der Probe verschoben, dass eine Intensität des von dem Partikel emittierten Fluoreszenzlichts minimal bleibt. Tatsächlich handelt es sich bei der Intensität des von dem Partikel emittierten Fluoreszenzlichts um eine Rate, mit der einzelne Photonen aus dem Minimum der Intensitätsverteilung des Anregungslichts von dem jeweiligen Molekül emittiert werden. Bei dem Minimum kann es sich um eine Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts handeln.
  • Aus der DE 10 2010 028 138 A1 ist ein Verfahren zum Bestimmen der Verteilung einer Substanz in einem Messgebiet durch Abtasten mit einer Messfront bekannt. Über eine Tiefe der Messfront, die kleiner als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge eines optischen Signals ist, steigt die Intensität des optischen Signals derart an, dass ein Anteil der Substanz in einem Messzustand zunächst von nicht vorhanden anwächst und dann wieder auf nicht vorhanden abfällt. Die Messfront wird in Gegenrichtung zu dem Anstieg der Intensität des optischen Signals über das Messgebiet verschoben. Das Messsignal wird zumindest aus dem Bereich der Messfront erfasst und der jeweiligen Position der Messfront in dem Messgebiet zugeordnet.
  • Aus der DE 10 2009 008 646 A1 ist ein Verfahren zum Erfassen eines Chromophors an einer Fläche in einer Probe bekannt, das insbesondere zum Abbilden einer Konzentration des Chromophors an der Fläche dient. Die Fläche in der Probe wird mit Licht einer ersten Photonenenergie bestrahlt, die einem ersten Übergang des Chromophors in einen ersten Zustand entspricht. Ein Bereich in der Umgebung der Fläche wird mit Licht einer zweiten Photonenenergie bestrahlt, die einem zweiten Übergang des Chromophors in einen zweiten Zustand entspricht. Die Intensität des Lichts mit der zweiten Photonenenergie weist in der Fläche ein Minimum auf. Eine Teilmenge des Chromophors, die sich nach dem Bestrahlen der Probe mit dem Licht der ersten Photonenenergie und mit dem Licht der zweiten Photonenenergie in dem ersten Zustand befindet, wird erfasst, um den Chromophor in der Fläche zu erfassen. Eine dazu verwendete abbildende Optik ist senkrecht zu der Fläche ausgerichtet.
  • Bei der sogenannten SSIM (Saturated Structured Illumination Microscopy, siehe Gustafsson, M. G. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 13081–13086 (2005)) wird eine Probe in unterschiedlichen Richtungen mit einer Intensitätsverteilung von Anregungslicht abgetastet, die eine linienförmige Nullstelle und außerhalb der Nullstelle so hohe Intensitäten aufweist, dass eine Sättigung der Intensität des Fluoreszenzlichts von angeregten Molekülen einer fluoreszenten Substanz in der Probe erreicht wird. Während des Abtastens registriertes Fluoreszenzlicht aus der Probe variiert durch die jeweils im Bereich der Nullstelle befindlichen Moleküle der fluoreszenten Substanz, die nicht zu dem Fluoreszenzlicht beitragen. Ausgewertet wird dieses Fluoreszenzlicht nach Raumfrequenzen, die beim Scannen in den verschiedenen Richtungen auftreten und aus denen dann eine Abbildung der Verteilung der fluoreszenten Moleküle in der Probe rekonstruiert wird.
  • Die SSIM nutzt keine Verteilung der fluoreszenten Moleküle in der Probe, bei der ein mittlerer Abstand der Moleküle größer als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Anregungslichts oder des Fluoreszenzlichts ist. Durchführbar ist die SSIM nur mit fluoreszenten Molekülen, die bis zur Sättigung der Intensität des von ihnen erhaltenen Fluoreszenzlichts anregbar sind, ohne dadurch in einen Dunkelzustand überführt zu werden. Erhalten wird nur eine indirekte Abbildungen der Verteilung der Moleküle der fluoreszenten Substanz in der Probe. Positionen einzelner fluoreszenter Moleküle in der Probe werden nicht bestimmt.
  • AUFGABE DER ERFINDUNG
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung des Ortes einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe aufzuzeigen, mit denen eine räumlich hochaufgelöste Abbildung einer Verteilung der Moleküle in der Substanz in der Probe unter Auswertung von Fluoreszenzlicht von den einzelnen Molekülen erhalten werden kann, wobei das Fluoreszenzlicht zusätzlich zur Bestimmung des Ortes der einzelnen Moleküle durch Lokalisierung verwendet werden kann.
  • LÖSUNG
  • Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren nach den unabhängigen Patentanspruch 1 und eine Vorrichtung nach dem nebengeordneten Patentanspruch 23 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen des Verfahrens und der Vorrichtung sind in den abhängigen Patentansprüchen definiert.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung der Orte einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe bereit, wobei sich die einzelnen Moleküle der Substanz in einem fluoreszenten Zustand befinden, in dem sie mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sind, und wobei Abstände zwischen den einzelnen Molekülen der Substanz in einem interessierenden Bereich der Probe einen Mindestwert einhalten.
  • Das Verfahren weist die bereits aus der WO 2006/127692 A1 bekannten Schritte des Anregens der einzelnen Moleküle der Substanz mit dem Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht, wobei eine Intensitätsverteilung des Anregungslichts mindestens ein lokales Minimum aufweist, und des Registrierens des Fluoreszenzlichts von den angeregten einzelnen Molekülen der Substanz für verschiedene Positionen des mindestens einen Minimums in dem interessierenden Bereich der Probe auf.
  • Erfindungsgemäß ist der Mindestwert der Abstände der einzelnen Moleküle der Substanz in dem interessierenden Bereich der Probe d = λ/(2nsinα √(1 + I/IS)), wobei λ die Wellenlänge des Anregungslichts ist, n der Brechungsindex des optischen Materials ist, in dem das mindestens eine Minimum ausgebildet wird, α der halbe Öffnungswinkel einer optischen Anordnung ist, mit der das Anregungslicht auf die Probe gerichtet wird, I die maximale Intensität des Anregungslichts in der Probe ist und IS eine von der Substanz abhängige Fluoreszenzanregungssättigungsintensität des Anregungslichts ist. Bei der Fluoreszenzanregungssättigungsintensität IS wird ein bestimmter Prozentsatz der theoretisch möglichen Intensität des Fluoreszenzlichts von den Molekülen der Substanz erreicht, ab dem man auch von der Sättigung der Intensität des Fluoreszenzlichts spricht. Typischerweise beträgt dieser Prozentsatz 50% der theoretisch möglichen Intensität des Fluoreszenzlichts. Der Mindestwert d entspricht der Genauigkeit bei der räumlichen Abbildung, wie sie bei der hoch auflösenden STED-, GSD- und RESOLFT-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie erreicht wird.
  • Es ist nicht unbedingt von Bedeutung, wie erreicht wird, dass die Abstände zwischen den einzelnen Molekülen der Substanz, die sich in dem fluoreszenten Zustand befinden, in dem interessierenden Bereich der Probe den Mindestwert d einhalten. Es ist auch nicht notwendig, dass alle Moleküle der Substanz in dem fuoreszenten Zustand mit ihren Abständen den Mindestwert einhalten. Die Orte von fluoreszenten Molekülen in einem geringeren Abstand können mit dem hier beschriebenen Verfahren jedoch nicht bestimmt werden.
  • Erfindungsgemäß ist die Intensität des Fluoreszenzlichts von einem einzelnen Molekül am Ort des lokalen Minimums der Intensitätsverteilung des Anregungslichts maximal halb so groß wie an einem Ort der maximalen Intensität des Anregungslichts in der Probe. Es versteht sich, dass ein größerer Intensitätskontrast, das heißt ein noch ausgeprägteres lokales Minimum, in dem die Intensität des Fluoreszenzlichts von einem einzelnen Molekül auf einen kleineren Anteil der maximalen Intensität des Fluoreszenzlichts von dem einzelnen Molekül zurückgeht, günstig ist. So kann die Intensität des Fluoreszenzlichts von dem einzelnen Molekül beispielsweise um mindestens 80% auf höchsten 20% oder um mindestens 90% auf höchstens 10% der maximalen Intensität zurückgehen. Idealerweise geht die Intensität des Fluoreszenzlichts von dem einzelnen Molekül in dem lokalen Minimum auf null zurück, d. h. es handelt sich um eine Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts.
  • Erfindungsgemäß sind Abstände zwischen nächstbenachbarten Positionen des mindestens einen Minimums, in denen das Fluoreszenzlicht von den angeregten einzelnen Molekülen der Probe registriert wird, nicht größer als der halbe Mindestwert d. Die Orte der einzelnen Moleküle der Substanz werden dann erfindungsgemäß aus dem Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen Molekül über den Positionen des mindestens einen Minimums in dem interessierenden Bereich der Probe abgeleitet.
  • Wenn ein fluoreszentes Molekül in den Bereich des Minimums gelangt, geht die Anregung des Moleküls zur Emission von Fluoreszenzlicht und entsprechend die Intensität des von ihm emittierten und in der Folge registrierten Fluoreszenzlichts zurück. Da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren einzelne fluoreszente Moleküle betrachtet werden, von denen das Fluoreszenzlicht individuell registriert und entsprechend ausgewertet werden kann, lässt sich aus dem Verlauf der Intensität des registrierten Fluoreszenzlichts in Abhängigkeit von den Positionen des Minimums der Ort des jeweiligen fluoreszenten Moleküls in der Probe mit erhöhter räumlicher Genauigkeit bestimmen.
  • Dies gilt auch dann, wenn der oben definierte Mindestabstand d = λ/(2nsinα √(1 + I/IS)) der einzelnen Moleküle in der Probe deutlich kleiner als die Beugungsgrenze λ/2nsinα bei der Wellenlänge λ des Anregungslichts und auch bei der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts ist, weil die maximale Intensität I des Anregungslichts in der Probe deutlich größer als die Fluoreszenzanregungssättigungsintensität IS ist. Auch dann kann das Fluoreszenzlicht, das von der Probe registriert wird zumindest einer kleinen Gruppe von einzelnen Molekülen zugeordnet werden, und die Intensität der Fluoreszenzlichts geht zu einem signifikanten Anteil zurück, wenn jeweils eines der Moleküle in den Bereich des lokalen Minimums der Intensität des Anregungslichts gelangt. Dieser Rückgang ist beim Einhalten des Mindestabstands d der einzelnen Moleküle in der Probe jeweils genau einem einzelnen Molekül zuzuordnen.
  • Dafür, dass dieser Rückgang erfasst und sein Verlauf räumlich aufgelöst wird, sorgen die kleinen Abstände der Positionen des Minimums, für die das Fluoreszenzlicht registriert wird, von maximal d/2. D. h. bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der interessierende Bereich der Probe mit dem lokalen Minimum der Intensitätsverteilung des Anregungslichts mit einer Schrittweite von maximal d/2 abgetastet.
  • Die optische Anordnung, mit der das Anregungslicht auf die Probe gerichtet wird, kann ein Objektiv sein, es kann sich aber auch um eine andere optische Anordnung handeln, mit der zwei Teilstrahlen des Anregungslichts unter einem Winkel überlagert werden, um das mindestens eine Minimum durch Interferenz auszubilden. Dann ist α der halbe Winkel zwischen diesen Teilstrahlen oder der Winkel zwischen jedem der Teilstrahlen und der optischen Achse. n kann der Brechungsindex der Probe sein, wenn das Minimum direkt in der Probe ausgebildet wird, oder der Brechungsindex eines an die Probe angrenzenden Materials, wenn das Minimum in diesem ausgebildet wird. Dies ist zum Beispiel dann der Fall, wenn eine ähnliche optische Anordnung wie bei der TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) für die Ausbildung des Minimums verwendet wird.
  • Da die Bestimmung der Orte der einzelnen Moleküle allein auf der in jeder Position des Minimums bestimmten Intensität des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen Molekül beruht, ohne dass die genaue Richtung Berücksichtigung findet, in der das Fluoreszenzlicht von dem Molekül emittiert wird, zählt das erfindungsgemäße Verfahren zur Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie; und die Bestimmung der Orte der einzelnen Moleküle ist von der Orientierung der Moleküle unabhängig.
  • Konkret kann zur Ableitung der Orte der einzelnen Moleküle der Substanz aus dem Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichts eine Funktion mit lokalem Minimum an den Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen Molekül über den Positionen des mindestens einen Minimums angefittet werden. Dann kann der Ort des jeweiligen Moleküls der Position des lokalen Minimums der angefitteten Funktion gleichgesetzt werden. Die Funktion kann eine quadratische Funktion sein. Eine Grundform der Funktion, die angefittet wird, kann aber auch individuell an den Intensitätsverlauf des Fluoreszenzlichts von einem Molekül der jeweiligen Substanz als Antwort auf den Intensitätsverlauf des Anregungslichts im Umfeld des mindestens einen Minimums angepasst werden.
  • Es fällt auch in den Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der Ort des jeweiligen Moleküls einer Position des mindestens einen Minimums gleichgesetzt wird, die sich dadurch auszeichnet, dass von dem jeweiligen Molekül weniger Fluoreszenzlicht registriert wird, als in in verschiedenen Richtungen nächstbenachbarten Positionen des Minimums. Wenn das Minimum bzw. ein anregungsschwacher Bereich um das Minimum, in dem das jeweilige Molekül nur zur Emission von Fluoreszenzlicht mit einer Minimalintensität angeregt wird, das jeweilige Molekül trifft, wird für diese Position des Minimums nur die Minimalintensität des Fluoreszenzlichts von dem Molekül registriert. Da dies grundsätzlich auch andere Ursachen haben kann, kann eine Position des Minimums, in der nur die Minimalintensität des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen Molekül registriert wird, aber nur dann dem Ort des Moleküls gleichgesetzt werden, wenn in in verschiedenen Richtungen nächstbenachbarten Positionen des Minimums mehr Fluoreszenzlicht als die Minimalintensität registriert wird. Soweit diese Bedingungen erfüllt sind, kann der Ort des jeweiligen Moleküls in der Probe mit einer räumlichen Genauigkeit von den Abmessungen des anregungsschwachen Bereichs um das Minimum bestimmt werden.
  • Wenn die Minimalintensität null oder nahe bei null ist, werden für diese Art der Ortsbestimmung nur sehr wenige Photonen des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen Molekül benötigt, nämlich nur sehr wenige Photonen in der Position des Minimums, in der die Minimalintensität des Fluoreszenzlichts registriert wird, und jeweils nur wenige Photonen mehr in den in verschiedenen Richtungen nächstbenachbarten Positionen des Minimums, bis klar ist, dass die Intensität des Fluoreszenzlichts dort über die Minimalintensität hinaus geht. Dadurch kann das Minimum sehr schnell zwischen seinen einzelnen Positionen verschoben werden. Bei einer Minimalintensität von null reicht es aus, festzustellen, ob Fluoreszenzlicht von dem jeweiligen Molekül kommt oder nicht. Hierfür muss nur so lange an der jeweiligen Position gewartet werden, wie es maximal dauern sollte, zumindest mehrere Photonen des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen Molekül zu erhalten. Eine Minimalintensität von null wird in der Regel nur dann in einem anregungsschwachen Bereich um ein lokales Minimum realisiert, wenn das lokale Minimum eine Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts ist.
  • Wenn der anregungsschwache Bereich um das Minimum zur Bestimmung der Orte der einzelnen Moleküle ausgenutzt werden soll, muss sichergestellt werden, dass jedes einzelne Molekül mit dem anregungsschwachen Bereich getroffen wird. Dies wird erreicht, wenn die Abstände zwischen nächst benachbarten Positionen des mindestens einen Minimums, in denen das Fluoreszenzlicht von den angeregten einzelnen Molekülen der Substanz registriert wird, d. h. die Schrittweiten, mit denen der interessierende Bereich der Probe abgetastet wird, nicht größer als ein Durchmesser des anregungsschwachen Bereichs sind, so dass der interessierende Bereich der Probe vollständig mit dem anregungsschwachen Bereich abgetastet wird.
  • Wenn die Intensität des Anregungslichts angrenzend an das mindestens eine Minimum so hoch eingestellt wird, dass eine Sättigung bei der Intensität des Fluoreszenzlichts erreicht wird, das von dem mit dem Anregungslicht angeregten einzelnen Molekülen emittiert wird, wird der anregungsschwache Bereich um das Minimum, in dem das jeweilige Molekül nur zur Emission von Fluoreszenzlicht mit der Minimalintensität angeregt wird, und auch ein darum liegender Bereich, in dem die Intensität des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen Molekül von seiner Entfernung zu dem Minimum abhängt, stark räumlich eingeengt. Dies ist gleichbedeutend mit einer Steigerung der Ortsgenauigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens. Hiervon kann zwar nur dann Gebrauch gemacht werden, wenn die Positionen des Minimums in der Probe, in denen die Intensität des Fluoreszenzlichts von den einzelnen Molekülen bestimmt wird, entsprechend kleine Abstände aufweisen. Dies ist aber durch die maximalen Abstände zwischen nächst benachbarten Positionen des mindestens einen Minimums, in denen das Fluoreszenzlicht von den angeregten einzelnen Molekülen der Substanz registriert wird, von d/2 sichergestellt.
  • Die einzelnen Moleküle in dem fluoreszenten Zustand, deren mittlerer Abstand in dem interessierenden Bereich der Probe größer als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Anregungslichts und des Fluoreszenzlichts ist, können insbesondere dadurch realisiert werden, dass die Moleküle der Substanz mit einem Einstellsignal aus ihrem fluoreszenten Zustand in einen nichtfluoreszenten Zustand oder aus einem nichtfluoreszenten Zustand in ihren fluoreszenten Zustand überführbar sind, wobei eine Übergangswahrscheinlichkeit zwischen den Zuständen (bis eine Sättigung erreicht ist) mit der Intensität des Einstellsignals ansteigt. Dann kann bei einer so hohen Dichte der Moleküle in dem interessierenden Bereich der Probe, dass die Abstände zwischen nächstbenachbarten Molekülen der Substanz kleiner als der Mindestwert d sind, mit dem Einstellsignal jeweils nur ein Anteil der Moleküle in dem fluoreszenten Zustand belassen bzw. in den fluoreszenten Zustand überführt werden. Dieser Anteil der Moleküle der Substanz kann mittels der Intensität des Einstellsignals so eingestellt werden, dass die Abstände zwischen den einzelnen Molekülen der Substanz in dem fluoreszenten Zustand den Mindestwert d einhalten. Da es von Übergangswahrscheinlichkeiten abhängt, welche Moleküle der Substanz jeweils zu dem Anteil gehören, der sich in dem fluoreszenten Zustand befindet, können so nacheinander die Orte verschiedener Moleküle der Substanz in der Probe bestimmt werden.
  • Mit den Molekülen, deren Orte bereits bestimmt wurden, kann unterschiedlich verfahren werden. Sie können grundsätzlich dauerhaft weggebleicht werden. Sie können auch unter Einwirkung eines Rückführsignals und/oder spontan, d. h. allein durch thermische Anregung, in ihren ursprünglichen nichtfluoreszenten Zustand zurückkehren oder mit dem Einstelllicht wie die meisten anderen Moleküle in ihren nichtfluoreszenten Zustand überführt werden. Dann können mit dem Einstellsignal und ggf. dem Rückführsignal wiederholt oder fortlaufend für jeweils andere einzelne Moleküle in dem fluoreszenten Zustand die Abstände zwischen nächsten Nachbarn auf den Mindestwert d eingestellt werden. Wenn dabei jeweils die Positionen der einzelnen Moleküle in dem fluoreszenten Zustand bestimmt werden, wird sukzessive eine Abbildung der Verteilung der Moleküle der Substanz in der Probe erhalten.
  • Beim nacheinander Ermitteln der Orte verschiedener Anteile der Substanz kann die Probe kontinuierlich oder intermittierend mit dem Einstellsignal und ggf. mit dem Rückführsignal beaufschlagt werden. Das Registrieren des Fluoreszenzlichts von der Probe kann ebenfalls kontinuierlich oder intermittierend erfolgen. In jedem Fall erfolgt es aber getrennt für jede Position des Minimums des Anregungslichts in der Probe. Dies schließt aber nicht aus, dass die Position des Minimums in der Probe kontinuierlich verschoben wird, soweit sich das Minimum während eines Zeitraums, für den das Fluoreszenzlicht registriert wird, nur wenig, jedenfalls nicht weiter als d/4 bewegt.
  • Das Einstellsignal, mit dem die Moleküle der Substanz zwischen ihrem fluoreszenten Zustand und ihrem nichtfluoreszenten Zustand überführbar sind, um einen Anteil der Moleküle in dem fluoreszenten Zustand einzustellen, in dem die Abstände zwischen nächsten Nachbarn den Mindestwert einhalten, kann grundsätzlich irgendein chemisches oder physikalisches Signal sein. Bevorzugt handelt es sich um Einstelllicht.
  • Konkret können die Moleküle der Substanz mit dem Einstelllicht aus ihrem fluoreszenten Zustand in ihren nichtfluoreszenten Zustand überführt werden, wobei der nichtfluoreszente Zustand der Moleküle der Substanz ein elektronischer Energiezustand sein kann. Im letzteren Fall regt das Einstelllicht die fluoreszenten Moleküle der Substanz typischerweise auch zur Emission von Fluoreszenzlicht an, und sie werden erst nach der Emission einiger Photonen des Fluoreszenzlichts in den nichtfluoreszenten Zustand überführt. Das Einstelllicht kann damit zugleich das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Anregungslicht sein, so dass nur Licht mit einer Wellenlänge zum Einsatz kommen muss.
  • Stellt man die zuletzt beschriebene Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Abgrenzung zu dem als GSDIM bekannten Stand der Technik dar, handelt es sich wie bei GSDIM übereinstimmend um ein Verfahren zur Bestimmung des Ortes einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe, um eine räumlich hochaufgelöste Abbildung einer Verteilung der Moleküle der Substanz in der Probe zu erhalten, wobei die Moleküle der Substanz anfangs einen fluoreszenten Zustand aufweisen, wobei die Moleküle der Substanz in ihrem fluoreszenten Zustand mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sind, wobei die Moleküle der Substanz mit dem Anregungslicht aus ihrem fluoreszenten Zustand in einen nichtfluoreszenten Dunkelszustand überführbar sind, wobei die Moleküle der Substanz aus ihrem nichtfluoreszenten Zustand in ihren fluoreszenten Zustand zurückkehren und wobei Abstände zwischen den Molekülen der Substanz in der Probe kleiner als ein Mindestwert sind.
  • Auch noch übereinstimmend mit GSDIM weist diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Schritte auf des Einstellens eines solchen Anteils der Moleküle der Substanz in dem fluoreszenten Zustand mit dem Anregungslicht, dass Abstände zwischen den Molekülen der Substanz, die sich aktuell in dem fluoreszenten Zustand befinden, in einem interessierenden Bereich der Probe den Mindestwert einhalten, und des Registrierens des Fluoreszenzlichts von den mit dem Anregungslicht angeregten Molekülen der Substanz in dem fluoreszenten Zustand.
  • Erfindungsgemäß kommt hinzu, dass der Mindestwert der Abstände der einzelnen Moleküle der Substanz in dem interessierenden Bereich der Probe d = λ/(2nsinα √(1 + I/IS)) ist, Die Intensitätsverteilung des Anregungslichts weist mindestens ein lokales Minimum auf, wobei die Intensität des Fluoreszenzlichts von einem einzelnen Molekül am Ort des lokalen Minimums der Intensitätsverteilung des Anregungslichts maximal halb so groß ist wie an einem Ort der maximalen Intensität des Anregungslichts in der Probe. Die Position des mindestens einen lokalen Minimums in dem interessierenden Bereich der Probe wird verändert. Das Fluoreszenzlicht von den mit dem Anregungslicht angeregten Molekülen der Substanz in dem fluoreszenten Zustand wird für verschiedene Positionen des mindestens einen lokalen Minimums in der Probe für einen das mindestens eine lokale Minimum umschließenden Registrierungsbereich trennbar von aus anderen Bereichen der Probe emittiertem Fluoreszenzlicht registriert. Dabei sind Abstände zwischen nächstbenachbarten Positionen des mindestens einen lokalen Minimums, in denen das Fluoreszenzlicht von den angeregten einzelnen Molekülen der Substanz registriert wird, nicht größer als der halbe Mindestwert d. D. h. der interessierende Bereich der Probe wird in Schritten mit dem mindestens einen lokalen Minimum abgetastet, die nicht größer als d/2 sind.
  • Die Orte der einzelnen Moleküle der Substanz werden dann aus dem Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichts aus dem Registrierungsbereich über den Positionen des mindestens einen lokalen Minimums in dem interessierenden Bereich der Probe abgeleitet. Dieses Ableiten der Orte der einzelnen Moleküle aus dem Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichts kann genauso erfolgen, wie bereits oben an Beispielen erläutert wurde. Auch die Einstellung der Intensität des Anregungslichts und der Abstände zwischen nächstbenachbarten Positionen des mindestens einen lokalen Minimums kann so erfolgen, wie oben dargelegt wurde.
  • Bei dem mindestens einen lokalen Minimum kann es sich insbesondere um ein punktförmiges Minimum handeln, dessen Position in dem interessierenden Bereich der Probe in allen Ausdehnungsrichtungen der Probe verändert wird, d. h. bei einer zweidimensionalen Probe in zwei und bei einer dreidimensionalen Probe in drei Richtungen. Bei einem punktförmigen Minimum können die Orte der einzelnen Moleküle der Substanz in alle Ausdehnungsrichtungen der Probe aus dem Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen Molekül über den Positionen des mindestens einen lokalen Minimums in dem interessierenden Bereich der Probe abgeleitet werden. Es versteht sich, dass dabei sinnvoller Weise der Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichts über den Positionen des Minimums in allen Ausdehnungsrichtungen der Probe berücksichtigt wird. Entsprechend ist bei einer zwei- oder dreidimensionalen Probe eine zwei- bzw. dreidimensionale Funktion mit einem Minimum an den Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichts anzufitten.
  • Bei einem punktförmigen Minimum kann das Fluoreszenzlicht aus einem das mindestens eine Minimum umschließenden Registrierungsbereich mit einem konfokal zu dem jeweiligen Minimum angeordneten Punktdetektor registriert werden. Der Registrierungsbereich sollte dabei Abmessungen von mehreren, vorzugsweise mindestens drei Abständen der Positionen des Minimums haben und konzentrisch zu dem Minimum angeordnet sein.
  • Das mindestens eine Minimum kann sich auch längs einer Linie oder Ebene erstrecken. Dann wird die Position des Minimums in dem interessierenden Bereich der Probe in einer Abtastrichtung quer zu der Linie oder Ebene verändert. Die Orte der einzelnen Moleküle der Substanz werden dabei jeweils in der Abtastrichtung aus dem Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen Molekül über den Positionen des mindestens einen lokalen Minimums abgeleitet. Um die Orte der einzelnen Moleküle in weiteren Richtungen zu bestimmen, kann die Linie oder Ebene unterschiedlich gegenüber der Probe ausgerichtet und in entsprechend unterschiedliche Abtastrichtungen verschoben werden. Die Orte der einzelnen Moleküle in weiteren Richtungen können aber grundsätzlich auch auf andere Weise, wie beispielsweise durch Lokalisierung, bestimmt werden.
  • Die Intensitätsverteilung des Anregungslichts kann nicht nur ein, sondern mehrere lokale Minima aufweisen. Die Positionen dieser mehreren Minima werden dann in dem interessierenden Bereich der Probe gemeinsam verändert, wobei das Fluoreszenzlicht von den angeregten einzelnen Molekülen der Substanz für jedes der Minima separat registriert wird.
  • Insbesondere können die Minima in Form eines Gitters angeordnet werden. Bei punktförmigen Minima kann das Gitter zwei- oder dreidimensional sein. Die Abstände zwischen den mehreren Minima müssen in jedem Fall größer als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts sein. Sie sind auch größer als etwaige Registrierungsbereiche zu wählen, aus den das Fluoreszenzlicht zu jedem Minimum registriert wird. Vorzugsweise sind die Abstände zwischen den Minima zudem um ein Mehrfaches größer als die Abstände der Positionen, in die denen die einzelnen Minima in der Probe angeordnet werden, um die zugehörigen Intensitäten des Fluoreszenzlichts zu messen. Vorzugsweise sind die Abstände der Minima mindestens dreimal so groß wie die Abstände der Positionen der Minima in der Probe, in denen das Fluoreszenzlicht gemessen wird.
  • Das Fluoreszenzlicht von den einzelnen fluoreszenten Molekülen in der Probe kann mit einem gegenüber der Probe ruhenden Lichtsensorarray registriert wird, auf das die Probe abgebildet wird, d. h. mit einer digitalen Kamera, wie beispielsweise einer CCD- oder CMOS-Kamera. Wenn zudem die Abstände der einzelnen Moleküle der Substanz in dem interessierenden Bereich der Probe größer als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts sind, können die Orte der einzelnen Moleküle der Substanz zusätzlich aus der Verteilung des von dem jeweiligen Molekül insgesamt, d. h. unabhängig von der Position des Minimums, registrierten Fluoreszenzlichts über dem Lichtsensorarray durch Lokalisierung bestimmt werden. Damit werden dieselben Photonen des Fluoreszenzlichts, mit denen die Orte der Moleküle abhängig von den Positionen des Minimums in der Probe bestimmt wurden, unter Ausnutzung ihrer Verteilung über das Lichtsensorarray zu einer zweiten Ortsbestimmung der Moleküle verwendet, wobei das Minimum und dessen Verschiebung in der Probe irrelevant ist. Die Ergebnisse der beiden Methoden der Ortsbestimmung können zur Erhöhung der Gesamtgenauigkeit zusammengeführt werden.
  • Wenn einzelne Abstände der einzelnen Molekülen der Substanz in dem interessierenden Bereich der Probe kleiner als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts sind, so dass das Fluoreszenzlicht den jeweiligen Molekülen nicht völlig getrennt zugeordnet werden kann, können die Orte dieser Moleküle durch komplexere Lokalisierungsalgorithmen bestimmt werden. In diese Algorithmen können die nach den erfindungsgemäßen Verfahren ermittelten Orte als Startwerte eingebracht werden.
  • Wenn nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und durch Lokalisierung unterschiedliche Orte für die einzelnen Moleküle bestimmt werden, können diese hinsichtlich einer festen Orientierung der einzelnen Moleküle in der Probe ausgewertet werden. Dies beruht darauf, dass die Bestimmung der Orte der Moleküle der Substanz in der Probe abhängig von der Verteilung des von ihnen registrierten Fluoreszenzlichts über dem Lichtsensorarray von einer festen Orientierung der Moleküle abhängig ist, nicht aber die Bestimmung der Orte mit Hilfe des verschobenen Minimums.
  • So kann das erfindungsgemäße Verfahren als Ergänzung zu einem bekannten Verfahren wie PALM, STORM, GSDIM oder dergleichen durchgeführt werden, ohne das bekannte Verfahren zu stören, aber um zusätzliche Ortsinformationen zu den einzelnen Molekülen auf eine andere Weise zu erlangen, auch wenn dieselben registrierten Photonen ausgewertet werden.
  • Wenn das Fluoreszenzlicht mit einem Lichtsensorarray registriert wird, können fortlaufend Frames aus dem Lichtsensorarray ausgelesen und den jeweiligen Positionen des mindestens einen Minimums in der Probe zugeordnet werden. Dabei können mehrere Frames einer Position aber nicht mehrere Positionen des Minimums einem Frame zugeordnet werden. Dies schließt aber nicht aus, dass das mindestens eine Minimum kontinuierlich in der Probe verschoben wird, wenn die damit eingeführt „Bewegungsunschärfe” klein bleibt.
  • Eine erfindungsgemäße Vorrichtung, die speziell zur Durchführung bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist, weist eine Anregungslichtquelle auf, die Anregungslicht abgibt, mit dem Moleküle einer Substanz, die sich in einem fluoreszenten Zustand befinden, zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sind und mit dem die Moleküle der Substanz aus ihrem fluoreszenten Zustand in einen nichtfluoreszenten Zustand überführbar sind. Darüber hinaus ist eine optische Anordnung vorhanden, die das Anregungslicht auf die Probe richtet. Eine Detektoreinrichtung registriert das Fluoreszenzlicht, das von den mit dem Anregungslicht angeregten Molekülen der Substanz in dem fluoreszenten Zustand emittiert wird. Erfindungsgemäß formt eine Lichtformungsoptik eine Intensitätsverteilung des Anregungslichts in der Probe, die mindestens ein lokales Minimum aufweist, wobei die Intensität des Fluoreszenzlichts von einem einzelnen Molekül am Ort des lokalen Minimums der Intensitätsverteilung des Anregungslichts maximal halb so groß ist wie an einem Ort der maximalen Intensität des Anregungslichts in der Probe. Weiterhin ist eine Rastereinrichtung vorgesehen, mit der das mindestens eine Minimum des Anregungslichts in verschiedenen Positionen in der Probe positionierbar ist. Die Detektoreinrichtung registriert das aus einem beugungsbegrenzten, das mindestens eine Minimum umschließenden Registrierungsbereich emittierte Fluoreszenzlicht trennbar von aus anderen Bereichen der Probe emittiertem Fluoreszenzlicht. Abstände zwischen nächstbenachbarten Positionen des mindestens einen Minimums, in denen die Detektoreinrichtung das Fluoreszenzlicht aus dem Registrierungsbereich registriert, sind dabei nicht größer als λ/(4nsinα √(1 + I/IS)). D. h. die Abtasteinrichtung tastet einen interessierenden Bereich einer Probe in Schritten ab, die nicht größer als der halbe Mindestwert d sind.
  • Vorzugsweise richtet die Lichtformungsoptik das Anregungslicht mit einem Gitter von lokalen Minima auf die Probe, und die Rastereinrichtung verschiebt die Intensitätsverteilung so gegenüber der Probe, dass ein interessierender Bereich der Probe vollständig mit anregungsschwachen Bereichen um die Minima abgetastet wird, innerhalb derer die Substanz nicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt wird. Wie ein Gitter von Nullstellen realisiert werden kann, ist in Chmyrov, A. et al: Nanoscopy with more than 100,000 'doughnuts', Nature methods 10 737–740 (2013) beschrieben.
  • Um das mindestens eine lokale Minimum oder die lokalen Minima bei dreidimensionalen Proben in der z-Richtung der optischen Achse einzugrenzen, kann von der 4Pi-Methode Gebrauch gemacht werden. Dabei können dieselben Maßnahmen zur Formung eines Minimums in z-Richtung ergriffen werden, wie in Schmidt, R. et al.: Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells, Nature Meth. 5, 539–544 (2008) zur Formung der Intensitätsverteilung des STED-Lichts in derselben Richtung. Wenn kohärente Teilstrahlen des Anregungslichts durch zwei einander entgegen gerichteten Objektive in die Probe gerichtet und dort zur Interferenz gebracht werden, können auch dreidimensional Gitter aus lokalen Minima in der Probe ausgebildet werden.
  • Die Detektoreinrichtung weist vorzugsweise ein gegenüber der Probe ruhendes Bildsensorarray auf, auf das die Probe abgebildet wird. Dies kann durch eine CCD- oder CMOS-Kamera realisiert sein.
  • Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
  • Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs ”mindestens” bedarf. Wenn also beispielsweise von einem Element die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau ein Element, zwei Elemente oder mehr Elemente vorhanden sind. Diese Merkmale können durch andere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, aus denen das jeweilige Erzeugnis besteht.
  • Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
  • 1 zeigt einen interessierenden Bereich einer Probe mit einer Vielzahl von darin angeordneten Molekülen einer Substanz, mit der eine interessierende Struktur in der Probe markiert ist, wobei sich nur einzelne Moleküle der Substanz in einem fluoreszenten Zustand befinden.
  • 2 zeigt für einen interessierenden Bereich der Probe das Abtasten mit einem lokalen Minimum einer Intensitätsverteilung von Anregungslicht, wobei ein einzelnes fluoreszentes Molekül in der Probe dargestellt ist.
  • 3 ist eine Auftragung der Intensität des von dem einzelnen fluoreszenten Molekül gemäß 2 in verschiedenen Positionen des Minimums registrierten Fluoreszenzlichts.
  • 4 ist eine Auftragung der Intensität des Fluoreszenzlichts von einem einzelnen fluoreszenten Molekül beim Abtasten der Probe mit dem Minimum gemäß 2 bei einer deutlich höheren Intensität des Anregungslichts.
  • 5 ist eine Auftragung der Intensität des Fluoreszenzlichts von zwei einzelnen fluoreszenten Molekül beim Abtasten der Probe mit dem Minimum gemäß 2 bei der hohen Intensität des Anregungslichts gemäß 4.
  • 6 ist ein Schnitt durch die Verteilung des von einem fluoreszenten Molekül mit einem Lichtsensorarray insgesamt registrierten Fluoreszenzlichts über dem Lichtsensorarray.
  • 7 skizziert das Abtasten eines interessierenden Bereichs einer Probe mit einer linienförmigen Nullstelle aus zwei unterschiedlichen Richtungen.
  • 8 skizziert das Abtasten eines interessierenden Bereichs einer Probe mit einem Gitter von punktförmigen Nullstellen.
  • 9 ist ein Flussdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • 10 ist ein Flussdiagramm einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens; und
  • 11 skizziert eine erfindungsgemäße Vorrichtung.
  • FIGURENBESCHREIBUNG
  • In 1 ist ein interessierender Bereich 1 einer Probe 2 gezeigt, in dem eine Struktur 3 mit Molekülen 4 einer Substanz markiert ist, die einen fluoreszenten und einen nichtfluoreszenten Zustand aufweist. Bei Betrachtung aller Moleküle 4, d. h. unabhängig von ihrem Zustand, liegen diese in sehr kleinen Abständen zu ihren nächsten Nachbarn vor, die deutlich kleiner als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge von Fluoreszenzlicht sind, das von den Molekülen 4 erhalten werden kann, wenn sie in ihrem fluoreszenten Zustand mit Anregungslicht angeregt werden. Die Abstände sind auch kleiner als ein Mindestwert d = λ/(2nsinα √(1 + I/IS)), wobei λ die Wellenlänge des Anregungslichts ist, n der Brechungsindex des optischen Materials ist, in dem das mindestens eine Minimum ausgebildet wird, α der halbe Öffnungswinkel einer optischen Anordnung ist, mit der das Anregungslicht auf die Probe gerichtet wird, I die maximale Intensität des Anregungslichts in der Probe 2 ist und IS eine von der Substanz abhängige Fluoreszenzanregungssättigungsintensität des Anregungslichts ist. Dieser Mindestwert d entspricht der Genauigkeit bei der räumlichen Abbildung, wie sie bei der hoch auflösenden STED-, GSD- und RESOLFT-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie erreicht wird.
  • Es sind jedoch nur einzelne Moleküle 5, die jeweils mit einem ”x” markiert sind, in dem fluoreszenten Zustand, während die anderen Moleküle, die hier nur durch Punkte wiedergegeben sind, in dem nichtfluoreszenten Zustand sind und daher von dem Anregungslicht nicht zur Emission von Fluoreszenzlicht veranlasst werden. Die einzelnen fluoreszenten Moleküle 5 weisen Abstände in dem interessierenden Bereich 1 auf, die den Mindestwert d einhalten und vorzugsweise auch die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts. Letzteres ermöglicht es, das von den einzelnen Molekülen 5 emittierte Fluoreszenzlicht getrennt, d. h. jeweils unter Zuordnung zu einem bestimmten einzelnen Molekül 5, zu registrieren. Das Einstellen eines entsprechenden kleinen Anteils der Moleküle 4 in den fluoreszenten Zustand 5 kann auf unterschiedlich Weise erfolgen, wie sie von den unter den Stichworten PALM, STORM und GSDIM bekannten Verfahren geläufig sind.
  • 2 illustriert, wie der jeweils interessierende Bereich 1 der Probe 2 mit Anregungslicht 23 beaufschlagt und dabei mit einem lokalen Minimum 6 der Intensitätsverteilung des Anregungslichts 23 in durch Pfeile angedeuteten Schritten abgetastet wird. Dabei sind diese Schritte und die resultierenden Abstände 7 nächstbenachbarter Positionen des Minimums 6 in der Probe 2 nicht größer als die halbe Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Anregungslichts und des damit angeregten Fluoreszenzlichts von den einzelnen Molekülen 5. Von diesen ist hier in 2 nur ein einziges durch ein ”x” wiedergegeben. In einem Bereich 8 um das Minimum 6 hängt die Intensität des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen einzelnen Molekül 5 von seinem Abstand zu dem Minimum 6 ab. Außerhalb des Bereichs 8 möge sie hier gesättigt sein. Das heißt, die Intensität des Anregungslichts 23 ist außerhalb des Bereichs 8 so groß, dass eine maximale Intensität des Fluoreszenzlichts von den einzelnen Molekülen 5 erhalten wird.
  • 3 zeigt die Intensität IF des Fluoreszenzlichts von einem einzelnen Molekül 5, das mit dem punktförmigen Minimum 6 gemäß 2 überfahren wird, wobei das Molekül 5 gemäß 2 zwar genau überfahren wird, aber dabei nicht genau mit einer der Positionen xN des Minimums 6 getroffen wird, an der die Intensität IF des Fluoreszenzlichts gemessen wird. Dabei sind in 3 mit jeweils einem ”x” die registrierten Intensitäten IF des Fluoreszenzlichts über den verschiedenen Positionen xN des Minimums 6 in der Probe 2 aufgetragen. Bei dem Minimum 6 handelt es sich hier um eine Nullstelle der Intensität des Anregungslichts 23 und entsprechend auch der Intensität IF des Fluoreszenzlichts. Zumindest geht die Intensität IF des Fluoreszenzlichts in dem Minimum auf 50% der Intensität IF des Fluoreszenzlichts außerhalb des Bereichs 8 zurück. Wenn an den Verlauf der zu den Positionen xN registrierten Intensitäten IF eine Funktion 9 mit einem lokalen Minimum angefittet wird, ist aus der Position des Minimums der Ort xM des Moleküls in der Probe ableitbar, und dies mit einer höheren räumlichen Genauigkeit als dem Abstand der Positionen xN. Der Abstand der Positionen xN ist nicht größer, hier sogar kleiner als die Hälfte des Mindestwerts d. Der Mindestwert d entspricht der Halbwertsbreite des von dem Minimum 6 beeinflussten Verlaufs der Intensität IF.
  • Die Funktion 9 mit dem lokalen Minimum kann an den erwarteten Verlauf der Intensität IF beim Überfahren des Moleküls 5 mit dem Minimum 6 gemäß 2 adaptiert sein. Mit gestrichelter Linie 10 ist in 3 ein entsprechender Verlauf der Intensität IF des Fluoreszenzlichts aufgetragen, wenn das Minimum 6 gemäß 2 das Molekül 5 um eine Zeile verfehlt. Eine strichpunktierte Linie 11 zeigt die Intensität IF beim Verfehlen des Moleküls um zwei Zeilen an. Aus den entsprechenden tatsächlichen Messwerten der Intensität IF des Fluoreszenzlichts kann der Ort des Moleküls auch in der zur x-Richtung senkrechten y-Richtung ermittelt werden.
  • 4 zeigt den Verlauf 12 der Intensität IF des Fluoreszenzlichts über den verschiedenen Positionen xN des Minimums 6 gemäß 2 in Form einer Nullstelle für eine deutlich höhere absolute Intensität des Anregungslichts 23 außerhalb des Minimums 6. Hier wird außerhalb eines anregungsschwachen Bereichs 32 unmittelbar um das Minimum 6 herum sehr schnell eine Sättigung der Intensität IF des Fluoreszenzlichts erreicht, das von dem jeweiligen fluoreszenten Molekül 5 emittiert wird. Unter diesen Randbedingungen kann die Position xN des Minimums 6, an der die Intensität IF des Fluoreszenzlichts von null registriert wird, dem Ort des Moleküls xM gleichgesetzt werden, soweit an diese ausgezeichnete Position xN andere Positionen xN des Minimums 6 angrenzen, in denen Fluoreszenzlicht von dem jeweiligen fluoreszenten Molekül 5 registriert wird.
  • 5 zeigt den Verlauf der Intensität IF des Fluoreszenzlichts über der Position xN des Minimums in der Probe im Falle zweier Moleküle 5 in dem fluoreszentem Zustand, die in sehr dichtem Abstand in der Probe 2 zusammenliegen. Dieser dichte Abstand liegt deutlich unter der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts. Daher kann hier die Intensität IF nicht mit einem Lichtsensorarray, auf das die Probe 2 abgebildet wird, den einzelnen Molekülen 5 getrennt zugeordnet werden. Der Einbruch der Intensität IF des Fluoreszenzlichts über der Position xN des Minimums tritt jedoch für die beiden Moleküle bei auf den Mindestabstand der Moleküle abgestimmter Intensität des Anregungslichts 23 getrennt auf, weil sich mit der Intensität des Anregungslichts die Abmessungen des Bereichs 8 und auch des Mindestwerts d, der der Halbwertsbreite der Intensität IF im Bereich des Minimums entspricht, reduzieren. Wenn der Abstand der Moleküle 5 mindestens so groß ist wie der oben definierte Mindestwert d, steigt die Intensität IF des Fluoreszenzlichts bei einer Position des Minimums 6 zwischen den Molekülen 5 wieder an, so dass die einzelnen Einbrüche der Intensität IF den einzelnen Molekülen zugeordnet werden können.
  • In 5 ist ein Fall gezeigt, in dem die Intensität IF des Fluoreszenzlichts auch von einem fluoreszenten Molekül 5, das voll von dem Minimum 6 getroffen wird, nicht auf Null zurückgeht, weil es sich hier bei dem Minimum 6 nicht um eine Nullstelle handelt. Vielmehr geht die Intensität IF, wenn eines der Moleküle 5 in den Bereich des Minimums 6 gelangt, nur um etwa 90% ihres Maximalwerts zurück. Zumindest solange der Einbruch der Intensität IF bei mindestens 50% bleibt, beeinträchtigt dies die Bestimmung der Orte xM1 und xM2 der einzelnen Moleküle 5 aus dem Verlauf der Intensität IF jedoch nicht.
  • 6 zeigt die über die einzelnen Positionen xN aufsummierte Intensität ΣI des Fluoreszenzlichts von einem einzelnen Molekül 5 in einem Schnitt durch die Verteilung der aufsummierte Intensität ΣI über einem Lichtsensorarray, auf das die Probe abgebildet wird und mit dem das Fluoreszenzlicht registriert wird. Während es für die bislang in den 3 und 4 skizzierte Auswertung nur darauf ankam, welche Intensität I des Fluoreszenzlichts von dem einzelnen fluoreszenten Molekül 5 für welche Position xN des Minimums 6 registriert wird, aber nicht, wo dieses Fluoreszenzlicht, solange es dem einzelnen fluoreszenten Molekül 5 zugeordnet werden kann, registriert wird, wird gemäß 6 die Verteilung 13 des für das einzelne fluoreszente Molekül 5 insgesamt registrierten Fluoreszenzlichts über das Lichtsensorarray ausgewertet. Aus deren Schwerpunkt kann ebenfalls der Ort des Moleküls in der Probe bestimmt werden, und zwar unabhängig von der Position des Minimums 6 und auf eine Weise, die als Lokalisierung bekannt ist. Dabei hängt der scheinbare Ort x'M des Moleküls 5 in der Probe 2 jedoch von einer etwaigen festen Orientierung und einem entsprechend immer ähnlich ausgerichteten elektrischen Dipolmoment des Moleküls in der Probe 2 ab, das zu einer räumlich gerichteten Verteilung des emittierten Fluoreszenzlichts führt (siehe Engelhardt, J. et al., Molecular orientation affects localization accuracy in superresolution far-field fluorescence microscopy, Nano Lett. 2011 Jan 12; 11(1): 209–13). Dies ist bei den anhand der 3 und 4 erläuterten Verfahren der Ortsbestimmung nicht der Fall.
  • In 2 wurde ein punktförmiges Minimum 6 illustriert. Mit diesem kann beim einmaligen Abtasten der Probe – einer zweidimensionalen Probe in zwei Richtungen, einer dreidimensionalen Probe in drei Richtungen – die Position jedes einzelnen fluoreszenten Moleküls bestimmt werden. Wenn gemäß 7 ein linienförmiges Minimum oder ein Minimum in Form einer (senkrecht zur Zeichenebene ausgerichteten) Ebene verwendet wird, ist die Probe quer zum Verlauf des Minimums mit dem Minimum abzutasten, um ihre Position in der jeweiligen Abtastrichtung 14, 15 zu bestimmen. Entsprechend muss eine zweidimensionale Probe, wie in 7(a) und (b) dargestellt, in wenigstens zwei, vorzugsweise orthogonalen, Abtastrichtungen 14, 15 abgetastet werden, um die Orte der einzelnen Moleküle vollständig zu bestimmen. Dabei können sich auch gleichzeitig mehrere fluoreszente Moleküle 5 im Bereich eines Minimums in Form einer Linie oder Ebene befinden, solange das von ihnen jeweils emittierte Fluoreszenzlicht getrennt werden kann.
  • Das Anregungslicht 23 muss auch nicht die gesamte Probe 2 und auch nicht den gesamten interessierenden Bereich 1 der Probe 2 außerhalb des Minimums 6 mit einer solchen Intensität beaufschlagen, dass immer Fluoreszenzlicht von den einzelnen Molekülen 5 registriert werden kann, soweit sie sich nicht genau in dem anregungsschwachen Bereich 32 um das Minimum 6 befinden. Vielmehr kann sich die Intensität des Anregungslichts 23 auf einen Bereich um das Minimum 6 herum konzentrieren. Dabei kann dieser Bereich mit einem weiteren Minimum enden, hinter der die Intensität des Anregungslichts 23 erneut ansteigt, oder auslaufen. Während im ersten Fall auch das weitere Minimum zur Ermittlung des Orts der einzelnen Moleküle 5 verwendet werden kann, wird im zweiten Fall die Variation der Intensität IF des Fluoreszenzlichts von einem fluoreszenten Molekül 5 über eine größere Anzahl von Positionen xN des Minimums 6 in der Probe 2 erkannt und kann so bei der Bestimmung des Ortes xM des jeweiligen fluoreszenten Moleküls 5 unberücksichtigt bleiben.
  • 8 illustriert, wie mit einem Gitter aus punktförmigen lokalen Minima 6 der interessierende Bereich 1 der Probe 2 mit viel weniger Schritten abgescannt werden kann als mit nur einem Minimum 6 gemäß 2. Dabei sind für das Abtasten fast des ganzen dargestellten interessierenden Bereichs 1 auch nur vier Minima ausreichend, mit denen jeweils 20 Positionen in der Ebene angefahren werden. Ein solches Muster von Minima, wie in 8 gezeigt, kann grundsätzlich durch Überlagerung von orthogonal zueinander ausgerichteten linienförmigen Gittern realisiert werden, die durch Überlagerung von kohärenten Teilstrahlen erzeugt werden (siehe Chmyrov, A. et al: Nanoscopy with more than 100,000 'doughnuts', Nature methods 10 737–740 (2013)).
  • 9 illustriert den grundsätzlichen Ablauf eines erfindungsgemäßen Verfahrens. In einem Schritt 16 wird der Anteil der insgesamt vorhandenen Moleküle 4 der Substanz eingestellt, die sich als einzelne Moleküle 5 in dem fluoreszenten Zustand befinden. In einem Schritt 17 werden die in dem fluoreszenten Zustand befindlichen Moleküle 5 mit der Intensitätsverteilung des Anregungslichts 23, die das mindestens eine lokale Minimum 6 aufweist, zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt. Dieses Fluoreszenzlicht wird in einem Schritt 18 unter Zuordnung zu der aktuellen Position des Minimums 6 in der Probe 2 registriert. Dann wird das Minimum 6 in einem Schritt 19 um einen kleinen Abstand zu seiner letzten Position von nicht mehr als d/2 verschoben. Anschließend wird erneut angeregt 17 und registriert 18, bis die gesamte Probe abgescannt ist. Dann wird ein neuer Anteil der Moleküle 4 der Substanz in den fluoreszenten Zustand überführt, d. h. bei Wiederholung des Schrittes 16 andere einzelne Moleküle 5 zufällig ausgewählt, woran sich dann Wiederholungen der Schleife aus den Schritten 17 bis 19 anschließen. Die in 9 skizzierten Schritte 16 bis 19 werden solange durchgeführt, bis mit ihrer Hilfe die Orte so vieler einzelner Moleküle 5 in der Probe 2 bestimmt wurden, dass sie die Verteilung der Gesamtheit der Moleküle 4 in der Probe 2 mit der gewünschten Genauigkeit wiedergeben. Dazu müssen nicht die Positionen aller Moleküle 4 in der Probe 2 bestimmt werden. Vielmehr reicht es aus, den Ort einer ausreichenden Anzahl von Repräsentanten der Moleküle 4 in Form der einzelnen Moleküle 5 zu bestimmen.
  • Wenn das Fluoreszenzlicht bei dem in 9 skizzierten Verfahren im Schritt 18 mit einem Lichtsensorarray registriert wird, auf das die Probe 2 abgebildet wird, kann die zu jedem einzelnen fluoreszenten Molekül 5 registrierte Verteilung 13 des gesamten Fluoreszenzlichts über dem Lichtsensorarray auch dazu genutzt werden, seine Position durch Lokalisierung zu bestimmen (siehe 6).
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die in 9 separat gezeigten Schritte 16 bis 19 auch stark zusammengefasst werden. Dies ist in 10 skizziert. Hier wird in einem Schritt 20 mit Anregungslicht, das zugleich als Einstelllicht dient, dafür gesorgt, dass die einzelnen Moleküle 5, die in dem fluoreszenten Zustand verbleiben, einen ausreichend großen Abstand untereinander aufweisen, um das Fluoreszenzlicht von ihnen separat zu registrieren, und diese einzelnen Moleküle 5 werden zumindest außerhalb des mindestens einen Minimums 6 der Verteilung des Anregungslichts 23 zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt.
  • Parallel dazu läuft eine Schleife aus den Schritten des Registrierens 18 des Fluoreszenzlichts von den einzelnen fluoreszenten Molekülen 5 in der Probe 2 und des Verschiebens 19 des Minimums 6 ab. Dabei kann das Verschieben sogar kontinuierlich erfolgen, wenn die daraus resultierende Bewegung des Minimums 6 in der Probe 2 innerhalb jedes Zeitintervalls, für das die Intensität IF des Fluoreszenzlichts registriert wird, verglichen mit der angestrebten Genauigkeit bei der Bestimmung der Orte der Moleküle 5 klein bleibt.
  • Dass dieses Verfahren durchführbar ist, war auch angesichts dessen, was zur GSD-Mikroskopie mit nur einer Wellenlänge, siehe DE 10 2005 034 443 A1 , und zur GSDIM bekannt war, überraschend. Das erfindungsgemäße Verfahren setzt nämlich voraus, dass die in den Bereich des Minimums 6 des Anregungslichts 23 gelangenden Moleküle 4 aufgrund der dort abnehmenden Intensität des Anregungslichts 23 nicht sofort in ihren fluoreszenten Zustand zurückgelangen, sondern dass die mit der Intensität des Anregungslichts 23 eingestellte Verteilung der einzelnen Moleküle 5, die in ihrem fluoreszenten Zustand verbleiben, für ausreichend lange Zeit erhalten bleibt, um den interessierenden Bereich 1 der Probe 2 mit dem Minimum 6 abzutasten. Zumindest für lokale Minima 6 mit kleinem Bereich 8 und entsprechend noch kleinerer Halbwertbreite d und bei verglichen mit der Verweildauer eines einzelnen Moleküls 5 in seinem fluoreszenten Zustand rascher Bewegung der Minima 6 in der Probe 2 hat aber die reduzierte Intensität des Anregungslichts 23 in den Minima 6 auf die Verteilung der Moleküle 4 der Substanz auf ihren fluoreszenten Zustand und ihren nichtfluoreszenten Zustand keinen starken Einfluss. So können die Orte der einzelnen Moleküle 5 während deren Verweildauer in dem fluoreszenten Zustand bestimmt werden und diese Bestimmung wird nicht durch im Bereich der Minima in den fluoreszenten Zustand zurückdrängende Moleküle 4 verhindert. Ggf. sind die Übergangswahrscheinlichkeiten zwischen dem fluoreszenten und dem nichtfluoreszenten Zustand der Moleküle 4, wie sie insbesondere durch die Intensität des Anregungslichts 23 festgelegt werden, für das erfindungsgemäße Verfahren passend einzustellen. Zu diesem Zweck können/kann zum Beispiel geeignete Chemikalien der Probe 2 zugesetzt und/oder die Sauerstoffkonzentration in der Probe 2 geeignet eingestellt werden. Hilfreich können auch Minima 6 mit nur kleinem anregungsschwachem Bereichen 32 sein, die vergleichsweise schnell zwischen ihren einzelnen Positionen in der Probe 2 verfahren werden.
  • 11 skizziert eine Vorrichtung 21 zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Sie weist eine Anregungslichtquelle 22 auf, die das Anregungslicht 23 abgibt. Von einer Lichtformungsoptik 24 wird das Anregungslicht 23 so geformt, dass es nach Fokussieren mit einem Objektiv 25 in die Probe 2 die gewünschte Intensitätsverteilung mit dem mindestens einen Minimum 6 aufweist. Um das Minimum 6 in Schrittweiten von maximal d/2 innerhalb der Probe 2 zu verschieben, ist eine Abtasteinrichtung 26 vorgesehen. Das von der Probe 2 kommende Fluoreszenzlicht 27 wird mit einem Strahlteiler 28 zu einem Lichtsensorarray 29 hin ausgekoppelt, auf das die Probe 2 von dem Objektiv 25 abgebildet wird. Das Lichtsensorarray 29 ermöglicht es, die von der Probe 2 registrierte Intensität des Fluoreszenzlichts 27 auch im Sinne einer Lokalisierung der einzelnen Moleküle 5 in der Probe 2 auszuwerten. Für die Bestimmung des Ortes der einzelnen Moleküle 5 in der Probe 2 gemäß der vorliegenden Erfindung reicht hingegen auch ein hier mit gestrichelter Linie dargestellter Punktdetektor 30 aus, zu dem hin das Fluoreszenzlicht 27 – von der Probe 2 aus gesehen hinter der Abtasteinrichtung 26 – mit einem weiteren Strahlteiler 31 ausgekoppelt wird und der das Fluoreszenzlicht aus einem das Minimum 6 umschließenden Registrierungsbereich registriert. Die Abtasteinrichtung 26 ist so ausgebildet, dass sie die Positionen des Minimums 6 des Anregungslichts 2, zu denen das Fluoreszenzlicht 27 von der Probe 2 registriert wird, mindestens so dicht setzt, dass ihre Abstände 7 nicht größer als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Anregungslichts 23 und des Fluoreszenzlichts 27 sind.
  • Bezugszeichenliste
    • 1
    interessierender Bereich
    2
    Probe
    3
    interessierende Struktur
    4
    Molekül
    5
    einzelnes Molekül im fluoreszenten Zustand
    6
    Minimum
    7
    Abstand
    8
    Bereich
    9
    Verlauf
    10
    Verlauf
    11
    Verlauf
    12
    Verlauf
    13
    Verteilung
    14
    Abtastrichtung
    15
    Abtastrichtung
    16
    Schritt
    17
    Schritt
    18
    Schritt
    19
    Schritt
    20
    Schritt
    21
    Vorrichtung
    22
    Anregungslichtquelle
    23
    Anregungslicht
    24
    Lichtformungsoptik
    25
    Objektiv
    26
    Abtasteinrichtung
    27
    Fluoreszenzlicht
    28
    Strahlteiler
    29
    Lichtsensorarray
    30
    Punktsensor
    31
    Strahlteiler
    32
    Anregungsschwacher Bereich
    xN
    Position des Minimums in x-Richtung
    xM
    Ort eines einzelnen Moleküls in x-Richtung
    IF
    Intensität des Fluoreszenzlichts von einem einzelnen Molekül
    ΣI
    Summe der Intensitäten des Fluoreszenzlichts von einem einzelnen Molekül

Claims (25)

  1. Verfahren zur Bestimmung der Orte (xM) einzelner Moleküle (5) einer Substanz in einer Probe (2), – wobei sich die einzelnen Moleküle (5) der Substanz in einem fluoreszenten Zustand befinden, in dem sie mit Anregungslicht (23) zur Emission von Fluoreszenzlicht (27) anregbar sind, – wobei Abstände der einzelnen Moleküle (5) der Substanz in einem interessierenden Bereich (1) der Probe (2) einen Mindestwert einhalten, und – wobei das Verfahren die Schritte aufweist: – Anregen der einzelnen Moleküle (5) der Substanz mit dem Anregungslicht (23) zur Emission von Fluoreszenzlicht (27), wobei eine Intensitätsverteilung des Anregungslichts (23) mindestens ein lokales Minimum (6) aufweist, und – Registrieren des Fluoreszenzlichts (27) von den angeregten einzelnen Molekülen (5) der Substanz für verschiedene Positionen (xN) des mindestens einen Minimums (6) in dem interessierenden Bereich (1) der Probe (2), dadurch gekennzeichnet, – dass der Mindestwert der Abstände der einzelnen Moleküle (5) der Substanz in dem interessierenden Bereich (1) der Probe (2) d = λ/(2nsinα √(1 + I/IS)), wobei – λ die Wellenlänge des Anregungslichts ist, – n der Brechungsindex des optischen Materials ist, in dem das mindestens eine Minimum ausgebildet wird, – α der halbe Öffnungswinkel einer optischen Anordnung ist, mit der das Anregungslicht auf die Probe gerichtet wird, – I die maximale Intensität des Anregungslichts (23) in der Probe (2) ist und – IS eine von der Substanz abhängige Fluoreszenzanregungssättigungsintensität des Anregungslichts ist, – dass die Intensität des Fluoreszenzlichts (27) von einem einzelnen Molekül (5) am Ort des lokalen Minimums (6) der Intensitätsverteilung des Anregungslichts (23) maximal halb so groß ist wie an einem Ort der maximalen Intensität des Anregungslichts (23) in der Probe (2), – dass Abstände (7) zwischen nächst benachbarten Positionen (xN) des mindestens einen Minimums (6), in denen das Fluoreszenzlicht (27) von den angeregten einzelnen Molekülen (5) der Substanz registriert wird, nicht größer als der halbe Mindestwert d sind, und – dass die Orte (xM) der einzelnen Moleküle (5) der Substanz aus dem Verlauf der Intensität (I) des Fluoreszenzlichts (27) von dem jeweiligen Molekül (5) über den Positionen (xN) des mindestens einen Minimums (6) in dem interessierenden Bereich (1) der Probe (2) abgeleitet werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Funktion (9) mit lokalem Minimum an den Verlauf der Intensität (I) des Fluoreszenzlichts (27) von dem jeweiligen Molekül (5) über den Positionen (xN) des mindestens einen Minimums (6) angefittet wird und dass der Ort (xM) des jeweiligen Moleküls (5) der Position des lokalen Minimums der angefitteten Funktion (9) gleichgesetzt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktion (9) eine quadratische Funktion ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ort (xM) des jeweiligen Moleküls (5) einer Position (xN) des mindestens einen Minimums (6) gleichgesetzt wird, die sich dadurch auszeichnet, dass von dem jeweiligen Molekül (5) weniger Fluoreszenzlicht (27) registriert wird als in in verschiedenen Richtungen nächst benachbarten Positionen (xN) des Minimums (6).
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand (7) zwischen nächst benachbarten Positionen (xN) des mindestens einen Minimums (6), in denen das Fluoreszenzlichts (27) von den angeregten einzelnen Molekülen (5) der Substanz registriert wird, nicht größer als ein anregungsschwacher Bereich (32) um das Minimum (6) ist, in dem das jeweilige Molekül (5) nur zur Emission von Fluoreszenzlicht (27) mit einer Minimalintensität angeregt wird.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität des Anregungslichts (23) angrenzend an das mindestens eine Minimum (6) so hoch eingestellt wird, dass eine Sättigung bei der Intensität (I) des Fluoreszenzlichts (27) erreicht wird, das von den mit dem Anregungslicht (23) angeregten einzelnen Molekülen (5) emittiert wird.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, – dass die Moleküle (4) der Substanz mit einem Einstellsignal mit einer mit der Intensität des Einstellsignals ansteigenden Übergangswahrscheinlichkeit – aus ihrem fluoreszenten Zustand in einen nicht fluoreszenten Zustand oder – aus einem nicht fluoreszenten Zustand in ihren fluoreszenten Zustand überführbar sind, – dass bei Betrachtung aller Moleküle (4) unabhängig von ihrem Zustand Abstände zwischen nächst benachbarten Molekülen (4) der Substanz in dem interessierenden Bereich (1) der Probe (2) kleiner als der Mindestwert d sind und – dass die Abstände zwischen den einzelnen Molekülen (5) der Substanz in dem fluoreszenten Zustand mit dem Einstellsignal eingestellt werden.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, – dass die Moleküle (4) der Substanz entgegen der Richtung ihrer Überführung mit dem Einstellsignal – unter Einwirkung eines Rückführsignals und/oder – spontan mit einer weiteren Übergangswahrscheinlichkeit in ihren ursprünglichen Zustand zurückkehren, – dass wiederholt oder fortlaufend für jeweils andere einzelne Moleküle (5) in dem fluoreszenten Zustand die Abstände mit dem Mindestwert d mit dem Einstellsignal und ggf. dem Rückführsignal eingestellt werden und – dass jeweils die Positionen der einzelnen Moleküle (5) in dem fluoreszenten Zustand bestimmt werden, um ein Abbild der Verteilung der Moleküle (4) der Substanz in der Probe (2) zu erhalten.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (2) kontinuierlich oder intermittierend mit dem Einstellsignal und ggf. mit dem Rückführsignal beaufschlagt wird.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Einstellsignal Einstelllicht ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Moleküle (4) der Substanz mit dem Einstelllicht aus ihrem fluoreszenten Zustand in ihren nicht fluoreszenten Zustand überführt werden.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der nicht fluoreszente Zustand der Moleküle (4) der Substanz ein elektronischer Energiezustand ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Einstelllicht dieselbe Wellenlänge aufweist wie das Anregungslicht (23).
  14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Minimum (6) ein punktförmiges Minimum ist, dessen Position in dem interessierenden Bereich (1) der Probe (2) in allen Ausdehnungsrichtungen der Probe (2) verändert wird, und dass die Orte (xM) der einzelnen Moleküle (5) der Substanz in allen Ausdehnungsrichtungen der Probe (2) aus dem Verlauf der Intensität (I) des Fluoreszenzlichts (27) von dem jeweiligen Molekül (5) über den Positionen (xN) des mindestens einen Minimums (6) in dem interessierenden Bereich (1) der Probe (2) abgeleitet werden.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzlicht (27) aus einem das mindestens eine Minimum (6) umschließenden Registrierungsbereich mit einem konfokal zu dem Minimum (6) angeordneten Punktdetektor (30) registriert wird.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass sich das mindestens eine Minimum (6) längs einer Linie oder Ebene erstreckt, dass ihre Position (xN) in dem interessierenden Bereich (1) der Probe (2) in einer Abtastrichtung (14, 15) quer zu der Linie oder Ebene verändert wird und dass die Orte (xM) der einzelnen Moleküle (5) der Substanz in der Abtastrichtung (14, 15) aus dem Verlauf der Intensität (I) des Fluoreszenzlichts (27) von dem jeweiligen Molekül (5) über den Positionen (xN) des mindestens einen Minimums (6) in dem interessierenden Bereich (1) der Probe (2) abgeleitet werden.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Linie oder Ebene unterschiedlich gegenüber der Probe (2) ausgerichtet wird, um die Orte (xM) der einzelnen Moleküle (5) der Substanz in unterschiedlichen Raumrichtungen zu bestimmen.
  18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsverteilung des Anregungslichts mehrere Minima (6) aufweist, deren Positionen in dem interessierenden Bereich (1) der Probe (2) gemeinsam verändert werden, wobei das Fluoreszenzlicht (27) von den angeregten einzelnen Molekülen (5) der Substanz für jedes der Minima (6) separat registriert wird.
  19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzlicht (27) mit einem gegenüber der Probe (2) ruhenden Lichtsensorarray (29) registriert wird.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass fortlaufend Frames aus dem Lichtsensorarray (29) ausgelesen und den jeweiligen Positionen des mindestens einen Minimums (6) in der Probe (2) zugeordnet werden.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Minimum (6) kontinuierlich in der Probe (2) verschoben wird.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Abstände der einzelnen Molekülen (5) der Substanz in dem interessierenden Bereich (1) der Probe (2) größer als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts (27) sind und dass die Orte (xM) der einzelnen Moleküle (5) der Substanz in dem fluoreszenten Zustand zusätzlich aus der Verteilung (13) des von dem jeweiligen Molekül (5) insgesamt registrierten Fluoreszenzlichts (27) über dem Lichtsensorarray (29) bestimmt werden.
  23. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, – mit einer Anregungslichtquelle (22), die Anregungslicht (23) abgibt, – mit dem Moleküle (4) einer Substanz, die sich in einem fluoreszenten Zustand befinden, zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sind und – mit dem die Moleküle (4) der Substanz aus ihrem fluoreszenten Zustand in einen nicht fluoreszenten Dunkelzustand überführbar sind, – mit einer optischen Anordnung, die das Anregungslicht mit einer Intensitätsverteilung auf die Probe (2) richtet, und – mit einer Detektoreinrichtung, die das von den mit dem Anregungslicht angeregten Molekülen (5) der Substanz in dem fluoreszenten Zustand emittierte Fluoreszenzlicht (27) registriert, dadurch gekennzeichnet, – dass eine Lichtformungsoptik (24) eine Intensitätsverteilung des Anregungslichts (23) in der Probe (2) formt, die mindestens ein lokales Minimum (6) aufweist, wobei die Intensität des Fluoreszenzlichts (27) von einem einzelnen Molekül (5) am Ort des lokalen Minimums (6) der Intensitätsverteilung des Anregungslichts (23) maximal halb so groß ist wie an einem Ort der maximalen Intensität des Anregungslichts (23) in der Probe (2), – dass eine Abtasteinrichtung (26) vorhanden ist, mit der das mindestens eine Minimum (6) in verschiedene Positionen (xN) in der Probe (2) positionierbar ist, – dass die Detektoreinrichtung das aus einem das mindestens eine Minimum umschließenden Registrierungsbereich emittierte Fluoreszenzlicht (27) trennbar von aus anderen Bereichen der Probe (2) emittiertem Fluoreszenzlicht registriert, – dass Abstände (7) zwischen nächst benachbarten Positionen (xN) des mindestens einen Minimums (6), in denen die Detektoreinrichtung das Fluoreszenzlichts (27) aus dem Registrierungsbereich registriert, nicht größer als λ/(4nsinα √(1 + I/IS)) sind, wobei – λ die Wellenlänge des Anregungslichts ist, – n der Brechungsindex des optischen Materials ist, in dem das mindestens eine Minimum ausgebildet wird, – α der halbe Öffnungswinkel der optischen Anordnung ist, die das Anregungslicht auf die Probe richtet, – I die maximale Intensität des Anregungslichts (23) in der Probe (2) ist und – IS eine von der Substanz abhängige Fluoreszenzanregungssättigungsintensität des Anregungslichts ist.
  24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtformungsoptik (24) die Intensitätsverteilung des Anregungslichts (23) in der Probe mit einem Gitter von Minima (6) ausbildet und dass die Abtasteinrichtung (26) die Intensitätsverteilung so gegenüber der Probe (2) verschiebt, dass ein interessierender Bereich (1) der Probe (2) vollständig mit anregungsschwachen Bereichen (32) um die Minima (6) abgetastet wird, innerhalb derer die Moleküle (4) der Substanz in dem fluoreszenzten Zustand nur zur Emission von Fluoreszenzlicht (27) mit einer Minimalintensität angeregt werden.
  25. Vorrichtung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektoreinrichtung ein gegenüber der Probe ruhendes Bildsensorarray (29) aufweist.
DE102013114860.3A 2013-12-23 2013-12-23 Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Orte einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe Active DE102013114860B3 (de)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102013114860.3A DE102013114860B3 (de) 2013-12-23 2013-12-23 Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Orte einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe
CN201480076127.XA CN106030287B (zh) 2013-12-23 2014-12-12 用于确定物质的单个分子在试样中的地点的方法和设备
JP2016539105A JP6452005B2 (ja) 2013-12-23 2014-12-12 構造化された励起光線により分子の位置を決定する方法および装置
EP14816202.7A EP3087372B1 (de) 2013-12-23 2014-12-12 Hochauflösende fluoreszenz-mikroskopie mit einem strukturierten anregungsstrahl
RU2016130016A RU2660301C2 (ru) 2013-12-23 2014-12-12 Флуоресцентная микроскопия высокого разрешения со структурированным пучком возбуждения
PCT/EP2014/077527 WO2015097000A1 (de) 2013-12-23 2014-12-12 Hochauflösende fluoreszenz-mikroskopie mit einem strukturierten anregungsstrahl
US15/189,300 US9719928B2 (en) 2013-12-23 2016-06-22 High-resolution fluorescence microscopy using a structured beam of excitation light
HK16114563A HK1226479A1 (zh) 2013-12-23 2016-12-22 用於確定物質的單個分子在試樣中的地點的方法和設備

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102013114860.3A DE102013114860B3 (de) 2013-12-23 2013-12-23 Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Orte einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102013114860B3 true DE102013114860B3 (de) 2015-05-28

Family

ID=52144670

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102013114860.3A Active DE102013114860B3 (de) 2013-12-23 2013-12-23 Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Orte einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9719928B2 (de)
EP (1) EP3087372B1 (de)
JP (1) JP6452005B2 (de)
CN (1) CN106030287B (de)
DE (1) DE102013114860B3 (de)
HK (1) HK1226479A1 (de)
RU (1) RU2660301C2 (de)
WO (1) WO2015097000A1 (de)

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102016117096A1 (de) 2015-09-22 2017-03-23 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum hochaufgelösten lokalen Abbilden einer Struktur in einer Probe
DE102017131249A1 (de) * 2017-12-22 2019-06-27 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren zum Abbilden einer Probe unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit stimulierter Emissionsdepletion
US10955348B2 (en) 2016-03-07 2021-03-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Method of locally imaging a structure in a sample at high spatial resolution in order to detect reactions of an object of interest to altered environmental conditions
WO2021239679A1 (de) 2020-05-26 2021-12-02 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, computerprogramm und vorrichtung zum bestimmen von positionen von molekülen in einer probe
WO2021239675A1 (de) 2020-05-26 2021-12-02 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zum bestimmen von positionen von molekülen in einer probe
WO2022029280A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Abberior Instruments Gmbh Method, apparatus and computer program for localizing an emitter in a sample
DE102020127385B3 (de) 2020-10-16 2022-03-10 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur lichtmikroskopischen Multiskalen-Aufnahme biologischer Proben
WO2022112155A1 (de) 2020-11-24 2022-06-02 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zur aufnahme nanoskopischer bilder mehrfach gefärbter proben
WO2022152785A1 (de) 2021-01-13 2022-07-21 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zur hochaufgelösten ortsbestimmung eines einzelnen farbstoffmoleküls in mehreren raumrichtungen
EP4067878A1 (de) 2021-04-01 2022-10-05 Abberior Instruments GmbH Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung eines emitters in einer probe
EP4075180A1 (de) 2021-04-13 2022-10-19 Abberior Instruments GmbH Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur bestimmung einer position von mindestens einem sender in einer probe
DE102022119589B3 (de) 2022-08-04 2023-11-23 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, Lichtmikroskop und Computerprogramm zur Lokalisierung einzelner Emitter in einer Probe
DE102022119332B3 (de) 2022-08-02 2023-12-28 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, lichtmikroskop und computerprogramm zum lokalisieren oder verfolgen von emittern in einer probe
DE102022119304A1 (de) 2022-08-02 2024-02-08 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung vereinzelter emitter in einer probe
DE102022119327A1 (de) 2022-08-02 2024-02-08 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung vereinzelter emitter in einer probe
DE102022123632A1 (de) 2022-09-15 2024-03-21 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, lichtmikroskop und computerprogramm zur lokalisierung oder zum verfolgen von emittern in einer probe

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10788403B2 (en) 2015-03-11 2020-09-29 Tissuevision, Inc. Systems and methods for serial staining and imaging
DE102015109305B9 (de) * 2015-06-11 2016-10-20 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rasterlumineszenzlichtmikroskop mit Gittern aus Lumineszenzverhinderungslicht und weiterem Licht
KR101766064B1 (ko) * 2015-11-30 2017-08-08 연세대학교 산학협력단 내부 전반사 형광 현미경
DE102016119264B4 (de) 2016-10-10 2018-05-30 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe
DE102016119262B4 (de) 2016-10-10 2018-06-07 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe
CN109844503B (zh) 2016-10-10 2022-01-14 马克斯-普朗克科学促进学会 用于高空间分辨率地确定样品中的分离的、以激励光可激励以发射发光的分子的位置的方法
DE102016119263B4 (de) 2016-10-10 2018-06-07 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe
EP3857284B1 (de) 2018-09-27 2023-12-27 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und vorrichtung zur erzeugung und verschiebung einer lichtintensitätsverteilung in einem fokusbereich einer objektivlinse
DE102019008989B3 (de) 2019-12-21 2021-06-24 Abberior Instruments Gmbh Verfahren zur Störungskorrektur und Laserscanningmikroskop mit Störungskorrektur
CN111145344B (zh) * 2019-12-30 2023-03-28 哈尔滨工业大学 一种用于雪雕3d重建的结构光测量方法
DE102020116547A1 (de) 2020-06-23 2021-12-23 Abberior Instruments Gmbh Verfahren zur Lokalisation einzelner Moleküle eines Farbstoffs in einer Probe und zum Erzeugen hochaufgelöster Bilder einer Struktur in einer Probe
DE102020127320B3 (de) 2020-10-16 2022-01-27 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Fluoreszenzmikroskop zur Ortsbestimmung einzelner fluoreszierender Farbstoffmoleküle durch adaptive Abtastung
DE102021107704B4 (de) 2021-03-26 2023-03-09 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Lichtmikroskop zum hochaufgelösten Untersuchen einer Probe
EP4215970A1 (de) 2022-01-21 2023-07-26 Leica Microsystems CMS GmbH Mikroskop zur lokalisierung von einzelpartikeln

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10105391A1 (de) * 2001-02-06 2002-08-29 Leica Microsystems Scanmikroskop und Modul für ein Scanmikroskop
DE10325459A1 (de) * 2003-04-13 2004-11-18 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Räumlich hochaufgelöstes Erzeugen einer dauerhaften Struktur
WO2006127692A2 (en) * 2005-05-23 2006-11-30 Hess Harald F Optical microscopy with phototransformable optical labels
DE102005034443A1 (de) * 2005-07-22 2007-02-22 Carl Zeiss Jena Gmbh Auflösungsgesteigerte Lumineszenz-Mikroskopie
US20070206278A1 (en) * 2006-03-01 2007-09-06 Leica Microsystems Cms Gmbh Method and microscope for high spatial resolution examination of samples
DE102006009831A1 (de) * 2006-03-01 2007-09-13 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren und Mikroskop zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben
DE102006026204A1 (de) * 2006-05-31 2007-12-06 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Mikroskop mit erhöhter Auflösung
DE102006047912A1 (de) * 2006-10-06 2008-04-10 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Verfahren und Anordnung zur parallelisierten mikroskopischen Bildgebung
DE102008009216A1 (de) * 2008-02-13 2009-08-20 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer Struktur einer Probe
DE102008054317A1 (de) * 2008-11-03 2010-05-06 Carl Zeiss Microlmaging Gmbh Kombinationsmikroskopie
DE102009008646A1 (de) * 2009-02-12 2010-08-19 Dodt, Hans-Ulrich, Dr. Vorrichtung zum optischen Abbilden einer Probe
DE102010028138A1 (de) * 2010-04-22 2011-10-27 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Bestimmen der Verteilung einer Substanz durch Abtasten mit einer Messfront
US8174692B2 (en) * 2008-05-21 2012-05-08 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. High spatial resolution imaging of a structure of interest in a specimen
WO2012171999A1 (en) * 2011-06-15 2012-12-20 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method and apparatus for imaging a structure marked with a fluorescent dye
DE102011055367A1 (de) * 2011-11-15 2013-05-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9800360D0 (sv) * 1998-02-06 1998-02-06 Goeteborg University Science I Method, apparatus and flow cell for high sensitivity detection of fluorescent molecules
AT410718B (de) * 1998-10-28 2003-07-25 Schindler Hansgeorg Dr Vorrichtung zur visualisierung von molekülen
WO2003046613A2 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Overbeck James W Scanning microscopy, fluorescence detection, and laser beam positioning
US20060275182A1 (en) * 2002-05-24 2006-12-07 Hudson Gordon S Fluorescence validation microplate and method of use
US7539115B2 (en) 2003-04-13 2009-05-26 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Creating a permanent structure with high spatial resolution
US7485875B2 (en) 2005-07-22 2009-02-03 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Resolution-enhanced luminescence microscopy
DE102006062823B4 (de) 2006-03-01 2010-11-25 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren und Mikroskop zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben
US9656271B2 (en) * 2007-12-04 2017-05-23 Headway Technologies, Inc. Guided transport of magnetically labeled biological molecules and cells
DE102009055216A1 (de) * 2009-12-22 2011-06-30 Carl Zeiss Microlmaging GmbH, 07745 Lumineszenzmikroskopie
US9291562B2 (en) 2011-11-15 2016-03-22 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Method and apparatus for tracking a particle, particularly a single molecule, in a sample

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10105391A1 (de) * 2001-02-06 2002-08-29 Leica Microsystems Scanmikroskop und Modul für ein Scanmikroskop
DE10325459A1 (de) * 2003-04-13 2004-11-18 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Räumlich hochaufgelöstes Erzeugen einer dauerhaften Struktur
WO2006127692A2 (en) * 2005-05-23 2006-11-30 Hess Harald F Optical microscopy with phototransformable optical labels
DE102005034443A1 (de) * 2005-07-22 2007-02-22 Carl Zeiss Jena Gmbh Auflösungsgesteigerte Lumineszenz-Mikroskopie
US20070206278A1 (en) * 2006-03-01 2007-09-06 Leica Microsystems Cms Gmbh Method and microscope for high spatial resolution examination of samples
DE102006009831A1 (de) * 2006-03-01 2007-09-13 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren und Mikroskop zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben
DE102006026204A1 (de) * 2006-05-31 2007-12-06 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Mikroskop mit erhöhter Auflösung
DE102006047912A1 (de) * 2006-10-06 2008-04-10 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Verfahren und Anordnung zur parallelisierten mikroskopischen Bildgebung
DE102008009216A1 (de) * 2008-02-13 2009-08-20 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer Struktur einer Probe
US8174692B2 (en) * 2008-05-21 2012-05-08 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. High spatial resolution imaging of a structure of interest in a specimen
DE102008054317A1 (de) * 2008-11-03 2010-05-06 Carl Zeiss Microlmaging Gmbh Kombinationsmikroskopie
DE102009008646A1 (de) * 2009-02-12 2010-08-19 Dodt, Hans-Ulrich, Dr. Vorrichtung zum optischen Abbilden einer Probe
DE102010028138A1 (de) * 2010-04-22 2011-10-27 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Bestimmen der Verteilung einer Substanz durch Abtasten mit einer Messfront
WO2012171999A1 (en) * 2011-06-15 2012-12-20 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method and apparatus for imaging a structure marked with a fluorescent dye
DE102011055367A1 (de) * 2011-11-15 2013-05-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Aquino, D. [u.a.]: Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. In: Nature Meth., Vol. 8, No. 4, 2011, S. 353 - 359 *
Chmyrov, A. [u.a.]: Nanoscopy with more than 100,000 "doughnuts". In: Nature Meth., Vol. 10, 2013, S. 737 - 740 *
Engelhardt, J. [u.a.]: Molecular orientation affects localization accuracy in superresolution far-field fluorescence microscopy. In: Nano Lett., Vol. 11, No. 1, Jan 2011, S. 209 - 213 *
Gustafsson, M. G. L.: Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. In: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 102, 2005, S. 13081 - 13086
Gustafsson, M. G. L.: Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. In: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 102, 2005, S. 13081 - 13086 *
Schmidt, R. [u.a.]: Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells. In: Nature Meth., Vol. 5, No. 6, 2008, S. 539 - 544 *

Cited By (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102016117096A1 (de) 2015-09-22 2017-03-23 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum hochaufgelösten lokalen Abbilden einer Struktur in einer Probe
US9891417B2 (en) 2015-09-22 2018-02-13 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Locally imaging a structure in a sample at high spatial resolution
DE102016117096B4 (de) * 2015-09-22 2020-04-09 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum hochaufgelösten lokalen Abbilden einer Struktur in einer Probe
DE102016117096C5 (de) 2015-09-22 2023-11-30 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum hochaufgelösten lokalen Abbilden einer Struktur in einer Probe
US10955348B2 (en) 2016-03-07 2021-03-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Method of locally imaging a structure in a sample at high spatial resolution in order to detect reactions of an object of interest to altered environmental conditions
DE102017131249A1 (de) * 2017-12-22 2019-06-27 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren zum Abbilden einer Probe unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit stimulierter Emissionsdepletion
US11143854B2 (en) 2017-12-22 2021-10-12 Leica Microsystems Cms Gmbh Method for imaging a sample using a fluorescence microscope with stimulated emission depletion
WO2021239679A1 (de) 2020-05-26 2021-12-02 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, computerprogramm und vorrichtung zum bestimmen von positionen von molekülen in einer probe
WO2021239675A1 (de) 2020-05-26 2021-12-02 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zum bestimmen von positionen von molekülen in einer probe
DE102020113998A1 (de) 2020-05-26 2021-12-02 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, Computerprogramm und Vorrichtung zum Bestimmen von Positionen von Molekülen in einer Probe
WO2022029280A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Abberior Instruments Gmbh Method, apparatus and computer program for localizing an emitter in a sample
DE102020127385B3 (de) 2020-10-16 2022-03-10 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur lichtmikroskopischen Multiskalen-Aufnahme biologischer Proben
WO2022079265A1 (de) 2020-10-16 2022-04-21 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zur lichtmikroskopischen multiskalenaufnahme biologischer proben
WO2022112155A1 (de) 2020-11-24 2022-06-02 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zur aufnahme nanoskopischer bilder mehrfach gefärbter proben
DE102020131047A1 (de) 2020-11-24 2022-06-09 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Aufnahme nanoskopischer Bilder mehrfach gefärbter Proben
WO2022152785A1 (de) 2021-01-13 2022-07-21 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zur hochaufgelösten ortsbestimmung eines einzelnen farbstoffmoleküls in mehreren raumrichtungen
DE102021100564B4 (de) 2021-01-13 2023-12-28 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur hochaufgelösten Ortsbestimmung eines einzelnen Farbstoffmoleküls in mehreren Raumrichtungen
DE102021100564A1 (de) 2021-01-13 2022-08-04 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur hochaufgelösten Ortsbestimmung eines einzelnen Farbstoffmoleküls in mehreren Raumrichtungen
EP4067878A1 (de) 2021-04-01 2022-10-05 Abberior Instruments GmbH Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung eines emitters in einer probe
EP4075180A1 (de) 2021-04-13 2022-10-19 Abberior Instruments GmbH Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur bestimmung einer position von mindestens einem sender in einer probe
WO2022218834A1 (en) 2021-04-13 2022-10-20 Abberior Instruments Gmbh Method, device and computer program for determining a position of at least one emitter in a sample
WO2024028172A1 (de) 2022-08-02 2024-02-08 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, lichtmikroskop und computerprogramm zum lokalisieren oder verfolgen von emittern in einer probe
DE102022119332B3 (de) 2022-08-02 2023-12-28 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, lichtmikroskop und computerprogramm zum lokalisieren oder verfolgen von emittern in einer probe
DE102022119304A1 (de) 2022-08-02 2024-02-08 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung vereinzelter emitter in einer probe
DE102022119327A1 (de) 2022-08-02 2024-02-08 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung vereinzelter emitter in einer probe
DE102022119327B4 (de) 2022-08-02 2024-03-14 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung vereinzelter emitter in einer probe
EP4317949A1 (de) 2022-08-04 2024-02-07 Abberior Instruments GmbH Verfahren und lichtmikroskop zur lokalisierung einzelner emitter in einer probe
DE102022119589B3 (de) 2022-08-04 2023-11-23 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, Lichtmikroskop und Computerprogramm zur Lokalisierung einzelner Emitter in einer Probe
DE102022123632A1 (de) 2022-09-15 2024-03-21 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, lichtmikroskop und computerprogramm zur lokalisierung oder zum verfolgen von emittern in einer probe

Also Published As

Publication number Publication date
CN106030287B (zh) 2019-04-16
CN106030287A (zh) 2016-10-12
US9719928B2 (en) 2017-08-01
RU2016130016A (ru) 2018-01-30
US20160305884A1 (en) 2016-10-20
HK1226479A1 (zh) 2017-09-29
JP2017501402A (ja) 2017-01-12
EP3087372A1 (de) 2016-11-02
JP6452005B2 (ja) 2019-01-16
RU2660301C2 (ru) 2018-07-05
EP3087372B1 (de) 2021-01-06
WO2015097000A1 (de) 2015-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102013114860B3 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Orte einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe
EP2016392B1 (de) Verfahren zum räumlich hochauflösenden fluoreszenzlichtabbilden einer struktur einer probe
DE102016119263B4 (de) Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe
DE102016119264B4 (de) Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe
EP3372990B1 (de) Verfahren und vorrichtung zum räumlichen messen nanoskaliger strukturen
DE102018007455B4 (de) Verfahren zum Detektorabgleich bei der Abbildung von Objekten mittels eines Mehrstrahl-Teilchenmikroskops, System sowie Computerprogrammprodukt
EP3523631B1 (de) Verfahren zum räumlich hochauflösenden bestimmen des orts eines vereinzelten, mit anregungslicht zur emission von lumineszenzlicht anregbaren moleküls in einer probe
EP3427036B1 (de) Verfahren zum hochaufgelösten lokalen abbilden einer struktur in einer probe, um reaktionen eines interessierenden objekts auf veränderte umgebungsbedingungen zu erfassen
DE102006062823B4 (de) Verfahren und Mikroskop zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben
EP2592461B1 (de) Mikroskopische Einrichtung und Verfahren zur dreidimensionalen Lokalisierung von punktförmigen Objekten in einer Probe
DE102016117096B4 (de) Verfahren zum hochaufgelösten lokalen Abbilden einer Struktur in einer Probe
DE102016119262B4 (de) Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe
WO2017013054A1 (de) Lichtblattmikroskop zum gleichzeitigen abbilden mehrerer objektebenen
DE102008049886A1 (de) Vorrichtung, insbesondere ein Mikroskop, zur Untersuchung von Proben
EP2561336B1 (de) Bestimmen der verteilung einer substanz durch abtasten mit einer messfront
WO2016156092A1 (de) Verfahren zum lokalisieren wenigstens eines emitters mittels eines lokalisationsmikroskops
EP3159676B1 (de) Verfahren und vorrichtung zum hochauflösenden abbilden einer mit fluoreszenzmarkern markierten struktur einer probe
DE102016104651A1 (de) Verfahren und Rasterfluoreszenzlichtmikroskop zum dreidimensional hochauflösenden Abbilden einer mit Fluorophoren markierten Struktur einer Probe
DE102006038647A1 (de) Verfahren und Fluoreszenzlichtmikroskop zum räumlich hoch aufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur
DE102020130476A1 (de) Verfahren und Laserscanningmikroskop zum Abbilden einer mit verschiedenen Fluoreszenzmarkern markierten Struktur einer Probe
DE102019118446A1 (de) Verfahren und Mikroskop mit einer Korrekturvorrichtung zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern

Legal Events

Date Code Title Description
R012 Request for examination validly filed
R016 Response to examination communication
R018 Grant decision by examination section/examining division
R020 Patent grant now final