CN109844503B

CN109844503B - 用于高空间分辨率地确定样品中的分离的、以激励光可激励以发射发光的分子的位置的方法

Info

Publication number: CN109844503B
Application number: CN201780062648.3A
Authority: CN
Inventors: F·巴尔扎罗蒂; Y·艾勒斯; K·格沃施; S·W·黑尔
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2016-10-10
Filing date: 2017-10-10
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2037-10-10
Also published as: EP3523631B1; US10962479B2; US20190235220A1; JP2019534998A; JP7048582B2; CN109844503A; EP3523631A1; US10908089B2; WO2018069283A1; US20190234882A1; US10900901B2; US20190234879A1

Abstract

在一种用于高空间分辨率地确定在样品中在一个或多个空间方向(x，y)上的分离的分子(24)的位置的方法的情况下，其中，分子(24)能够以激励光激励以发射发光，使激励光以以下强度分布对准样品：所述强度分布具有零点(20)和在空间方向(x，y)中的每个上在两侧邻接零点(20)的强度上升区域。对于样品中的零点(20)的不同位置(A‑D)中的每个记录由分子(24)发射的发光；由对于零点(20)的不同位置(A‑D)记录的发光的强度推导出样品中的分子(24)的位置。在此，零点(20)布置在样品中的不超过n×3个不同位置(A‑D)处，以便由对于零点(20)的不同位置(A‑D)记录的发光的强度推导出在n个空间方向上的分子(24)的位置。

Description

用于高空间分辨率地确定样品中的分离的、以激励光可激励以发射发光的分子的位置的方法

技术领域

本发明涉及一种用于高空间分辨率地确定样品中在一个或多个空间方向上分离的分子的位置的方法，其中，可以以激励光激励分子以发射发光。

在此，“分离的、以激励光可激励以发射发光的分子”理解为如下分子：所述分子与其他同类型分子具有最小间距，可以以相同的激励光激励所述其他同类型分子以发射相同波长范围内的发光。如果分离的分子与这种同类型分子之间的间距至少等于在发光波长情况下的衍射极限，那么可靠地保持所述最小间距，因为可以分离地检测由以激励光可激励以发射发光的不同分子的发光。然而，本发明也包括以下实施方式：在所述实施方式的情况下所述最小间距小于在发光波长情况下的衍射极限。

发光——分子以激励光可激励以发射所述发光——尤其可以是荧光。然而，通过分子发射发光可以基于通过激励光激励的任何光物理过程。这些包括光致发光(Photolumineszenz)的所有过程并且例如也包括通过激励光激励地发射通过量子点的发光。

背景技术

用于确定分离的、以激励光可激励以发射发光的分子的位置的最简单方法是以激励光激励分子以发射发光以及将发光成像到摄像机上或通常成像到空间分辨探测器上。原则上，在发光波长情况下的衍射极限适用于在所述成像时可实现的空间分辨率。然而，如果借助空间分辨探测器探测到发光的多个光子，所述多个光子来自于在样品中的固定位置处的唯一的分子，那么由所述光子在探测器上的空间分布以改善了因子

的精度确定分子的位置。在此，“n”是所记录的光子的数量。因此，在这种称为“定位”的方法中明显地低于衍射极限以发光的由分离的分子发射并且记录的多个光子为前提。因此存在以下风险：分离的分子在以期望的精度确定其在样品中的位置时暗淡并且可能在以期望的精度确定其在样品中的位置前已经暗淡。因此，如跟踪在样品中运动的分子所需的那样，通常不能够实现重复地确定相同的分离的分子的位置。

当分离的分子发射具有定向的空间分布的发光时，这在由发光的光子在空间分辨探测器上的分布(例如通过定位)确定其位置的情况下以位置误差的形式产生影响。所述位置误差取决于分子在相应的样品中的取向。所发射的发光的定向分布例如示出，对于其旋转扩散时间长于其在分子的激励状态下的停留持续时间的分子，所述分子从激励状态发射发光(参见Engelhardt，J.等人的《Molecular Orientation Affects LocalizationAccuracy in Superresolution Far-Field Fluorescence Microscopy》，NanoLett 2011年1月12日；11(1)：209-13)。

由WO 2006/127692 A2已知，在样品中以可激活的分子标记令人感兴趣的结构，所述分子处于非荧光初始状态中但可以借助激活光过渡到荧光状态中，在所述荧光状态中可以以激励光激励所述分子以发射发光。因此，借助激活光可以将总体上存在的分子的一小部分置于荧光状态中，其中最相邻的分子在荧光状态中具有比衍射极限更大的间距，也就是说，所述最相邻的分子是分离的。在接下来给样品施加激励光的情况下，仅由处于荧光状态中的分子发射荧光。因此，可以分开地记录在荧光状态中的各个分离的分子的荧光；并且尽管样品中的分子的绝对密度较高，可以通过以远超衍射极限的精度的定位来确定各个分子的位置。逐步地实现样品中的分子的分布的成像并且因此逐步地实现以所述分子标记的令人感兴趣的结构，其方式是重复以下步骤并且因此对于标记令人感兴趣的结构的分子中的越来越多的分子实施以下步骤：激活分子的一小部分，激励这些激活的分子以发射荧光，并且借助空间分辨探测器记录荧光，直至相应的激活的分子暗淡。

WO 2006/127692 A2还描述仅激活总体上存在的分子的子集可以转用其他的成像方法。在此，借助通过最小值限界的最大值的激励光的强度分布，可以激励尤其在样品的确定的平面或其他空间子单元中的分离的分子以发射荧光。

由WO 2006/127692 A2已知的方法也称为PALM，即光子激活定位显微技术。非常相似的、称为STORM(stochastische optische Rekonstruktions-mikroskopie，随机光学重建显微技术)的方法具有基本相同的优点和缺点。

由US 8,174,692 B2已知，也可以使用普通染料的分子来通过定位确定各个分子的位置，其中，所述分子不是可激活的而是具有荧光初始状态，并且也不可以在两个构象状态之间切换，在所述两个构象状态中仅仅一个是荧光的。为此，给样品施加如此高强度的激励光，使得在衍射极限以上调节在当前处于荧光状态中的分子之间的间距，其中，所述激励光同时以某种过渡概率转移到相对较长时间的电子暗状态中。

分别处于荧光状态中的分子由激励光激励以发射荧光，借助作为空间分辨探测器的摄像机记录所述荧光。以这种方式，可以逐步地定位染料的不同分子，因为已经记录到光子的分子进入暗状态，其他的分子由所述暗状态以一定的过渡概率返回到荧光状态中。可以连续地实施这种已知的方法，也就是说，可以从摄像机读取连续的帧，而给样品施加高强度的激励光，其使染料基本上保持在暗状态中并且同时激励由此分离的荧光的分子以发射荧光。

由US 8,174,692 B2已知的方法也称为GSDIM(英语Ground State DepletionIndividual Molecule Return Microscopy，基态耗尽单个分子返回显微技术)。

在扫描荧光显微技术的高空间分辨率的变型方案中，使用原理上不同的方法来高空间分辨率地确定样品中的以激励光可激励以发射荧光的分子的位置。在扫描荧光显微技术中，在确定样品中的荧光分子的位置时的精度基于在任何时刻仅局部地激励样品，从而在相应时刻记录的荧光可以分配给激励的空间区域。如果以聚焦的激励光激励样品中的分子，那么在激励光波长情况下的衍射极限设置激励的区域的空间尺寸的下极限并且因此设置可对在样品中以荧光的分子标记的结构进行成像时实现的空间分辨率的下极限。

对于STED(英语Stimulated Emission Depletion，受激励射耗尽)荧光显微技术，在每个测量点附近通过定向发射来重新消除以聚焦的激励光实现的分子激励，其中，以所述分子标记了样品的令人感兴趣的结构。以STED光刺激定向发射并且防止通过分子发射荧光。然后，所记录的荧光可以仅来自于以下区域：在所述区域中未消除以STED光进行激励。未消除激励的所述区域可以保持得非常小，其方式是：所述区域通过STED光的强度分布的零点来定义，并且在与零点相邻的最大强度中的STED光的最大强度选择得高，从而完全消除激励已经非常靠近其零点的分子。

替代在样品的部分中再次去激励先前实现的分子，也可以使用具有零点的强度分布的荧光阻止光将零点以外的荧光分子切换到非荧光的暗状态中。这例如在RESOLFT(Reversible Saturable Optical(Fluorescence)Transitions，可逆饱和光(荧光)过渡)或GSD(Ground State Depletion，基态耗尽)荧光显微技术的情况下实现。

在称为STED、RESOLFT或GSD扫描荧光显微技术的方法中，在由其已经记录荧光前，除了激励光，给邻接荧光阻止光的零点的区域施加在那里高强度的荧光阻止光，所述强度与分子暗淡的明显风险相关。当在这种已知的方法中以荧光阻止光的零点追踪样品中的分离的、以激励光可激励以发射发光的分子时也存在暗淡风险，因为为此需要将由分子发射的发光的光子的速率连续地最大化。

由WO 2012/171999 A1已知一种方法，在所述方法中以激励光射束(所述激励光射束与具有最小值的STED光的光强度分布在激励光射束的焦点处重叠)如此快速地扫描样品，使得在多个彼此相继的扫描过程中的每个中仅以各个光子的形式记录荧光，所述各个光子分别仅来自于单个分子。各个不同分子(光子来自于所述分子)的位置分配给样品中的STED光的最小值的所属位置。

在这种方法中，记录每个分子的仅少量光子、在极端情况下仅一个光子，其中，所述分子被分配样品中的一个位置。然而，分子通常经历激励和受激发射的几个循环，从而不排除其暗淡。此外，以这种已知的方法不能够有意义地实现有针对性地追踪确定的分离的分子。

由DE 10 2011 055 367 A1已知一种用于追踪单个荧光分子的方法。以激励光激励分子以发射荧光，并且记录荧光。在此，使强度分布的具有局部最小值的激励光对准样品，并且最小值跟踪在样品中运动的分子。为此目的，使激励光的强度分布相对于样品逐步地移位，从而使由分子发射的荧光的光子的速率最小化。这意味着将分子保持在激励光的强度分布的最小值中，所述最小值可以涉及激励光的强度分布的零点。

由WO 2015/097000 A1已知一种用于确定样品中的分离的分子的位置的方法，其中，所述分离的分子处于荧光状态中，在所述荧光状态中可以以激励光激励所述分子以发射荧光，其中，物质的分离的分子的间距保持最小值。以激励光激励分离的分子以发射荧光，其中，激励光的强度分布具有零点。对于样品中的激励光的强度分布的零点的不同位置，记录物质的所激励的各个分子的荧光。在此，零点的最相邻位置之间的间距不大于分离的分子的间距的最小值的一半。具体地，以零点扫描样品，其中，在扫描样品时的扫描尺寸不大于最小值的一半。由相应的分离的分子的荧光的强度在激励光的强度分布的零点的位置上的变化过程推导出样品中的分离的分子的位置。在此，具有零点的函数可以拟合相应的分离的分子的荧光强度的变化过程；并且相应的分子的位置可以等于所拟合的函数的零点的位置。所述函数可以是二次函数。但是拟合函数也可以单独地匹配于相应的物质的分离的分子的发光的强度分布作为对其零点附近的激励光的强度分布的响应。

在由WO 2015/097000 A1已知的方法中，在其在扫描样品时处于激励光的强度分布的零点的附近前，相应的分离的分子经受激励光的邻接的最大强度的更高强度。这些强度超过激励光的饱和强度，在所述饱和强度以上相应的分离的分子的发光的强度不再上升，从而其变化过程在饱和值时是恒定的并且因此没有信息内容。相应地，在发射由其可以确定分子的位置的光子前，由物质的每个分离的分子发射非常多的光子。由此，在零点进一步移位前，即使当在激励光的零点的每个位置处仅记录有限数量的光子时，也存在分子暗淡的明显风险。

由DE 10 2010 028 138 A1已知一种通过以测量前沿进行扫描来确定测量区域中的物质的分布的方法。在测量前沿的深度(所述深度小于在光学信号波长情况下的衍射极限)上，光信号的强度如此上升，使得在测量状态中的物质部分首先从不存在增加然后再下降到不存在。测量前沿在与光信号强度上升的反方向上在测量区域上移位。检测可以涉及荧光的测量信号并且将其分配给测量区域中的测量前沿的相应位置。

发明内容

本发明的任务

本发明基于以下任务：提供一种用于高空间分辨率地确定样品中的分离的、以激励光可激励以发射发光的分子的位置的方法，其中，与用于空间高分辨率地确定分离的分子的位置的已知方法相比，在所实现的精度的方面需，须激励分离的分子以发射的光子的数量显著降低。

解决方案

在本发明的第一实施方式中，所述任务通过一种用于高空间分辨率地确定样品中在一个或多个空间方向上分离的分子的位置的方法解决，其中，分子可以以激励光激励以发射发光，所述方法具有以下特征：使激励光以以下强度分布对准样品：所述强度分布具有零点和强度上升区域，所述强度上升区域在所述空间方向中的每个空间方向上在两侧邻接零点。对于样品中零点的不同位置中的每个位置，记录由分子发射的发光，并且由对于零点的不同位置记录的发光的强度推导出样品中的分子的位置。在此，零点布置在样品中的不超过n×3个不同位置处，以便由对于零点的不同位置记录的发光的强度推导出在n个空间方向上分子的位置。

在本发明的第二实施方式中，所述任务通过一种用于高空间分辨率地确定在样品中在一个或多个空间方向上分离的分子的位置的方法解决，其中，所述分子可以以激励光激励以发射发光，所述方法具有以下特征：使激励光以以下强度分布对准样品：所述强度分布具有零点和强度上升区域，所述强度上升区域在所述空间方向中的每个空间方向上在两侧邻接零点。使零点在样品中在所述空间方向中的每个空间方向上移位，其中，对于在样品中零点的每个位置记录由分子发射的发光。确定样品中的初始位置区域，所述分子布置在所述初始位置区域中。在所述空间方向中的每个空间方向上如此确定零点的至少一个初始位置，使得其在相应的空间方向上处于所述初始位置区域的一侧上。对于零点的分配给所有空间方向的位置几乎同时地记录发光，其方式是：使零点重复地在所述位置之间移位。根据对于所述位置中的每个位置记录的发光的光子使零点的位置逐步地向里移位到所述初始位置区域中。

在本发明的第三实施方式中，所述任务通过一种用于高空间分辨率地确定在样品中在一个或多个空间方向上分离的分子的位置的方法解决，其中，所述分子可以以激励光激励以发射发光，所述方法具有以下特征：使激励光以以下强度分布对准样品：所述强度分布在所述空间方向中的每个空间方向上具有至少一个强度上升区域，所述至少一个强度上升区域具有激励光的强度在与所述强度分布的起始点的间距上已知的、严格单调的变化过程。强度分布的起始点在所述空间方向中的每个空间方向上布置在样品中的不同位置处。对于在样品中强度分布的起始点的每个位置，记录由分子发射的发光，并且由所记录的发光的强度推导出样品中的分子的位置。为此确定样品中的初始位置区域，所述分子布置在所述初始位置区域中。然后(i)在所述空间方向中的每个空间方向上如此确定强度分布的起始点的至少一个位置，使得所述至少一个强度上升区域在相应空间方向上在初始位置区域上延伸。此外(ii)，由发光的强度值确定样品中的另一位置区域，所述强度值对于所述空间方向中的每个空间方向包括以下两个强度值：所述两个强度值中的一个强度值说明对于强度分布的起始点的至少一个位置记录的发光的强度，其中，所述分子布置在所述另一位置区域中，并且所述另一位置区域小于所述初始位置区域。在另一位置区域用作新的初始位置区域的情况下，重复步骤(i)和(ii)至少一次。

本发明也涉及重复地实施根据本发明的用于确定多个彼此分离的分子的位置或用于追踪分离的分子的方法，以及STED扫描荧光显微镜用于实施根据本发明的方法的应用。

定义

“根据本发明的方法用于高空间分辨率地确定分离的分子的位置”意味着：如可以由10nm的可实现的精度并且容易得多地读取的那样，尤其实现在激励光波长情况下并且也在发光波长情况下明显低于衍射极限的空间分辨率。在此应注意，表述“空间分辨率”在此用作以下精度的同义词：以所述精度确定样品中的相应的分离的分子的位置。

“根据本发明的方法用于确定分离的分子的位置”意味着：如在开头已经提及的那样，分离的分子的位置包含至最相邻的同类分子的最小间距，所述同类分子可以以相同激励光激励以发射相同波长范围内的发光，从而不能基于不同的波长将最相邻的同类分子的发光分离。在所有根据本发明的方法中，所述最小间距具有在发光波长情况下衍射极限的数量级或更小。事实上，如在由WO 2015/097000 A1已知的方法中那样，最小间距也可以比在发光波长情况下衍射极限小得多，只要其不小于激励光的强度分布的强度上升区域在相应空间方向上的延展(Ausdehnung)，在所述相应空间方向上激励光的强度保持低于饱和强度并且因此分子的发光的强度保持在饱和值以下。如果分离的分子至最相邻的、以激励光可激励的分子的间距大于在发光波长情况下的衍射极限，那么借助空间分辨探测器可以在空间上与发光(所述发光由与其最相邻的分子发射)分离地记录由分离的分子发射的发光。如果分离的分子的间距至少不小于激励光的强度分布的受关于分子的发光的强度的强度上升区域影响的区域，那么发光的强度与在激励光的饱和强度的情况下的饱和值的差可以直接分配给分离的分子，因为分子仅处于受强度上升区域影响的区域中。

“分离的分子可以以激励光激励以发射发光”意味着：分离的分子是光致发光的。具体地，分离的分子可以是荧光的，也就是说，可以以激励光激励以发射荧光。在此应注意的是，表述“发光的”或“荧光的”在此仅说明分离的分子可以以激励光激励以发射发光或荧光，但并非其已经是发光的或荧光的(即受激励的)。

“在本发明的第一实施方式和第二实施方式中使激励光以以下强度分布对准样品：所述强度分布具有零点和强度上升区域，所述强度上升区域在空间方向中的每个空间方向上在两侧邻接零点”意味着：通过在至零点不同间距上不同程度的相消干涉成形具有邻接的强度上升区域的零点。在邻接零点的每个强度上升区域上，激励光的强度随着增大的至零点的间距而严格单调地(即连续地)上升。

零点可以是通过干涉形成的理想零点，在所述理想零点中激励光的强度实际上回到零。然而，在零点中激励光的小的残余强度不是有害的，因为本发明的第一和第二实施方式的方法的目的不是在样品中如此定位零点，使得其位置与样品中的分子的位置重合。出于相同的原因，由强度上升区域限界的零点原则上也可以通过在相应空间方向上间隔开的高斯强度分布(具体地通过其之间剩余的最小强度)形成。

即使以具有仅在一个空间方向上延伸的强度上升区域的面状零点也可以在两个或所有三个空间方向上高分辨率地确定样品中的分子的位置。同样地，借助具有仅在两个空间方向上延伸的强度上升区域的线状零点可以不仅在这两个空间方向上而且在所有三个空间方向上高空间分辨率地确定样品中的分离的分子的位置。为此，可以在在不同空间方向上取向所述一个或多个强度上升区域的情况下实施本发明第一和第二实施方式的方法。

本发明的实施方式的描述

本发明从由WO2015/097000 A1已知的用于高空间分辨率地确定在样品中在一个或多个空间方向上分离的分子的位置的方法出发，其中，所述分子可以以激励光激励以发射发光。

在本发明的第一实施方式中，如在初始方法中那样，使激发光以以下强度分布对准样品：所述强度分布具有零点和强度上升区域，所述强度上升区域在空间方向中的每个空间方向上在两侧邻接零点。对于在样品中零点的不同位置中的每个位置，记录由分子发射的发光；并且由对于零点的不同位置记录的发光的强度推导出样品中的分子的位置。

与已知的方法不同，在本发明的第一实施方式中，零点布置在样品中的不超过n×3个不同位置处，以便由所记录的发光强度推导出在n个空间方向上分子的位置。事实上已经发现，在有意义地选择样品中的零点的位置的情况下可以以以下精度由不超过对于n×3个不同位置记录的发光的强度推导出在样品中在n个空间方向上分子的位置：所述精度不逊色于在空间上扫描样品中的包括分子位置的位置区域时的精度。此外，当零点布置在样品中的不超过(n×2)+1个或甚至仅n+2个不同位置处时，在巧妙地选择位置的情况下——如以下进一步阐述的那样——已经可以实现这种精度。在此，通常不容易要求，相对于以有意义的方式在空间上扫描样品的情况下在零点的每个位置处记录的光子的数量提高对于样品中的零点的每个位置记录的发光的光子的数量。

因此，在本发明的第一实施方式中，在每个空间方向上非常快速地(即基于少量由分离的分子发射且记录的光子)确定样品中的分离的分子的位置。确定分离的分子的位置的精度可以无问题地低于10nm并且因此明显地低于在发光波长情况下的衍射极限。

如已经提及的那样，在本发明的第一实施方式中，在样品的限界的位置区域(在所述位置区域可能存在分子)中不在空间上扫描样品，而仅将零点定位在相对于所述位置区域的几个位置中。

在由对于零点的不同位置记录的发光的强度推导出样品中的分子的位置的情况下，可以考虑由分离的分子发射的发光的强度与分离的分子至激励光的强度分布的零点的间距的相关性。这种相关性取决于邻接零点的强度上升区域中激励光的强度的变化过程并且取决于光子物理过程，所述光子物理过程是激励分子以发射发光的基础。因此，在通过相消干涉形成的零点和分子基于单光子过程的光致发光的情况下，近似地得出由分子发射的发光与其至零点的间距的二次方相关性。在基于二分子过程的光致发光的情况下，所述相关性更明显并且遵循函数x⁴。实际上，在本发明的第一实施方式的情况下，邻接零点的强度上升区域中的激励光的强度的变化过程仅须在以下程度上是已知的：其对分子的发光的强度如何产生影响。也就是说，发光的强度与分子至零点的间距的相关性必须是已知的，以便在推导样品中的分子的位置时可以考虑所述相关性。但是可以容易地确定所述相关性，例如凭经验地通过以小步骤一次性扫描具有零点的分离的分子的周围环境。

具体地，可以由对于零点的不同的位置记录的发光的强度推导出分子的位置，其方式是：使在不同的空间方向上描述分子的发光的强度在分子至零点的间距上的变化过程并且具有零点的函数拟合这些强度。分子的位置可以等同于在样品中拟合函数的零点的位置。

“由对于零点的不同位置记录的发光的强度推导出分子的位置”不仅不仅包括考虑发光的光子的不同速率的可能性，而且包括考虑所记录的光子的时间间距的可能性。在此可以理解如下：所记录的光子的时间间距的平均值等于对于零点的位置记录的发光的光子的速率的倒数。

除了对于零点的不同位置记录的发光的强度以外，在推导分子的位置时可以考虑分离的分子的相对发光强度的度量。具体地，所述度量可以涉及在以激励光激励时分子的发光的最大强度或与其直接相关的强度值。最大强度或与其直接相关的强度值可以对于相应的分离的分子进行具体测量，或者也可以对于所有潜在的分离的分子以确定的值进行估计。

为了适应数量特别少的不同位置(在所述不同位置处布置样品中的零点)，所述不同位置可以如此布置，使得所述不同位置在每个空间方向(在所述空间方向上确定样品中的分子的位置)上在样品中在位置区域的中心(所述分子布置在其中)的两侧包括各一个位置。然而，这不意味着对于每个空间方向必须设置零点的两个分开的位置。因此，在平面中尤其布置在等腰三角形的角中的三个位置在所述平面内在每个任意空间方向上也包括布置在三角形的中点的不同侧上的至少两个位置。相应地，这同样适用于与所有可能的空间方向相关的等边四面体。

在本发明的第一实施方式的情况下进一步优选的是，除了在位置区域的中心的两侧上的两个位置以外，在确定样品中的分子的位置的每个空间方向上的不同位置(在样品中零点布置在所述位置)包括所述位置区域的中心的位置。在此，位置区域的中心的这一位置对于所有空间方向可以是相同的。

具体地，在在两个空间方向上确定分子的位置的情况下，在样品中布置零点的不同位置可以是一个中心位置和三个外围位置，即总共四个位置，其中，所述外围位置在由两个空间方向展开并且延伸通过中心位置的平面中等距地布置在绕着中心位置的圆弧上。换句话说，所述三个外围位置处于等边三角形的角中，并且中心位置处于三角形的中心点中。

当在所有三个空间方向上确定分子的位置时，在样品中布置零点的不同位置可以是一个中心位置和四个外围位置，其中，所述外围位置等距地布置在绕着中心位置的圆弧上。换句话说，所述外围位置处于等边四面体的角中，并且中心位置处于四面体的中心点中。

如已经提及的那样，样品的(分子可能所处的)整个位置区域相对于零点的每个位置处于激励光的强度分布的以下区域中：在所述区域中邻接零点的强度上升区域中的强度保持在激励光的饱和强度以下，在所述饱和强度以上进一步提高激励光的强度不再导致分离的分子的发光的更高强度。在本发明的第一实施方式的情况下优选的是，分别如此调节最大强度——即激励光的绝对强度水平，使得零点的每个位置至样品中零点的位置之间的每个点的最大间距不大于在间距的方向上每个强度上升区域的延展。更优选地，最大间距不大于每个强度上升区域在以下间距的方向上的延展：在所述间距上激励光的强度上升直至激励光的饱和强度的90％。

在本发明的第一实施方式的情况下，邻接零点的强度上升区域可以围绕零点旋转对称地构造。所述旋转对称的构造至少可以存在于与激励光朝向样品中的方向垂直的主平面中。但是也能够实现，根据零点的相应位置在激励光的波长和/或极化方面不同地构造激励光，和/或在激励光的强度在不同空间方向上的变化过程方面不同地构造邻接零点的强度区域。在此，尤其可以实现以下目的：以相同的精度在每个空间方向上在零点位置之间的每个点处确定分子的位置。可以理解，以此在确定分离的分子的位置的情况下未充分使用在确定的空间方向上最大可能的精度。反之，如果所述精度在所有空间方向上相同，那么在以所实现的精度的延展的点描绘其位置时每个分离的分子表现为小圆或球。

在本发明的第一实施方式的情况下，在样品中对于零点的不同位置几乎同时地记录发光，其方式是：使零点在样本中在所述位置之间反复地移位。为此目的，可以借助扫描仪使激励光的同一强度分布移位。但是也能够例如借助布置在激励光的射束路径中的空间光调制器(SLM)实现对于在样品中其零点的不同位置中的每个位置重新构造强度分布。然后，至少可以在这方面省去扫描仪。此外，能够实现在样品中使零点移位，其方式是：通过完全不同或部分不同的光源彼此相继地提供激励光。在本发明的第一实施方式的所有这些可能的构型的情况下，可以使零点在样品中在其位置之间反复地来回移位。可以理解，在此分开地记录分子的属于零点的各个位置的激励光。对于零点的不同位置几乎同时地记录发光具有以下优点：当对于零点的各个位置记录的发光的光子已经允许以所期望的精度由对于零点的不同位置记录的发光的强度推导出分子的位置时，可以立即中止给样品施加激励光以及记录样品的发光。

在样品中对于零点的每个位置连续地记录发光的情况下，也可以应用相应的中止标准。然而，存在以下情况：根据分子的总体上较少的光子，观察对于所有零点记录的发光的强度已经可以识别出可以以所期望的精度推导出分子的位置。

如果在本发明的第一实施方式的情况下分别仅仅一直对于激励光的强度分布的零点的位置记录发光，直至对于所述位置以足够的精度检测到所记录的发光的强度，从而可以以所期望的精度推导出分子的位置，那么所期望的精度处于20nm或更小的范围内。所期望的精度也可以小于10nm。所期望的精度也可以在1nm的数量级上并且因此能够低至0.5nm。原则上，本发明的第一实施方式对于在确定样品中的分离的分子的位置时可实现的精度没有固有限界。然而，在相应的单个情况下出现的情况——例如降低的信噪比可以限界实际可实现的精度。

以在样品中零点位置的缩小的间距重复地实施本发明的第一实施方式可以用于使以本发明的第一实施方式实现的精度迭代地上升，其中，在每次重复所述方法时在样品中零点的位置围绕着样品中分子的以下位置布置：所述位置在之前实施所述方法时已经由所记录的发光的强度推导出。随着样品中零点位置的间距缩小，可以提高激励光的最大强度。以这种方式，分子可能所处的缩小的、限界的位置区域又可以分布在强度上升区域中激励光的不同强度的整个带宽上，并且因此分布在分离的分子的发光的不同强度的整个带宽上。

在本发明的第二实施方式中，使激励光如在由WO 2015/097000 A1已知的初始方法中那样以以下强度分布对准样品：所述强度分布具有零点和强度上升区域，所述强度上升区域在空间方向中的每个空间方向上在两侧邻接零点。使所述零点在样品中在空间方向中的每个空间方向上移位，其中，对于在样品中零点的每个位置记录由分子发射的发光。

除了已知的方法以外，在本发明的第二实施方式中，首先确定样品中的初始位置区域，所述分子布置在所述初始位置区域中。然后，在空间方向中的每个空间方向上如此确定零点的至少一个初始位置，使得所述初始位置在相应的空间方向上处于所述初始位置区域的一侧。几乎同时记录对于零点的分配给所有空间方向的位置的发光，其方式是：使零点在其相应位置之间反复地来回移位；并且，根据对于所述位置中的每个位置记录的发光的光子使零点的位置逐步地向里移位到初始位置区域中。

以这种方式，零点的分配给所有空间方向的位置非常快地(即基于少量的由分离的分子发射且记录的光子)靠近样品中的分子的实际位置，并且因此限制到相对于初始位置区域强烈缩小的位置区域上。这种强烈缩小的位置区域的尺寸相应于确定分离的分子的位置的精度。所述精度可以无问题地明显低于10nm并且因此明显低于在发光波长情况下的衍射极限。

在本发明的第二实施方式中，在分子的最初位置区域中不在空间上扫描样品，而是基于对于强度分布的起始点的目前位置记录的发光的光子将强度分布的起始点的位置智能地(即在最大地充分利用所有目前由所记录的发光的强度可提供使用的关于分离的分子的实际位置的信息的情况下并且因此通常仅在一个方向上)移位至分子的实际位置。相应地，也不根据试错方法(trial-and-error-Verfahren)进行根据本发明地移位零点的位置，而是一直——即使不必要时也以最短路径——移位至样品中的分子的实际位置。

在使零点逐步地移位的情况下，可以考虑对于分离的分子的相对光强度的度量，以便例如确定使零点分别移位的距离。所述度量可以具体地涉及在以激励光进行激励时分子的发光的最大强度或涉及与其直接相关的强度值。最大强度或与其直接相关的强度值可以对于分离的分子正确地进行测量或对于所有可能的分离的分子以确定的值进行估计。

在本发明的第二实施方式中，对于在样品中零点的相应的不同位置几乎同时记录发光，其方式是：使起始点在样品中的相应位置之间重复地移位。为此目的，可以借助扫描仪使激励光的同一强度分布移位。但是也能够实现，例如借助布置在激励光的射束路径中的空间光调制器(SLM)对于样品中其零点的不同位置中的每个位置重新构造强度分布。然后，在这方面至少可以省去扫描仪。此外，能够实现在样品中使零点移位，其方式是：通过完全不同或部分不同的光源彼此相继地提供激励光。在本发明的第二实施方式的所有构型的情况下，可以使零点非常快地在样品中在其位置之间反复地来回移位。可以理解，在此分开地记录分子的属于零点的分离的位置的发光。通过对于激励光的强度分布的起始点的不同位置几乎同时地记录发光具有以下优点：当对于激励光的强度分布的起始点的各个位置记录的发光的光子已经允许使位置进一步向样品中分子的实际位置移位时，可以立即中止给样品施加激励光以及记录样品的发光。

在本发明的第二实施方式中，可以具体地根据对于位置中的每个位置记录的发光的光子的速率或时间间距使零点的位置逐步地向里移位到初始位置区域中。在此可以理解，所记录的光子的时间间距的平均值等于对于发光的强度分布的起始点的相应位置记录的发光的光子的速率的倒数值。

例如首先可以以以下条件使零点的位置有针对性地移位到初始区域中：彼此匹配对于各个位置记录的发光的光子的速率或光子的相应的时间间距。为此，使具有所记录的发光的光子的最大速率或最小时间间距的零点的位置可以在具有最小的速率或最大时间间距的零点的位置的方向上移位。并行地或接下来，可以使零点的所有位置向里移位到初始位置区域中，以便使对于所述位置记录的光子的速率最小化或使对于所述位置记录的光子的时间间距最大化。如果对于零点的所有位置记录的光子的速率或时间间距已经彼此均衡，那么可以使这些位置在其共同的中点的方向上进一步向里移位到位置区域中，以便使光子的速率最小化或使光子的时间间距最大化。

零点的位置(如其相对于初始位置区域确定并且然后根据本发明移位那样)的数量可以处于n至2n之间，其中，n是定位分子的空间方向的数量。也就是说，零点的位置的数量可以非常小。对于需确定样品中的分子的位置的空间方向中的每个空间方向至少需要零点的一个位置，以便可以基于对于所述位置记录的发光的光子使位置总体有针对性地移位。如还进一步阐述的那样，样品中的分子的实际位置可以与在任何空间方向上零点的两个位置嵌套在一起。

在本发明的第二实施方式中，样品中的分子的位置可以在空间方向中的至少一个空间方向上等同于分配给以下相应空间方向的零点位置，在所述空间方向上由分子发射的发光的光子的速率是最小的。在本发明的第二实施方式的构型的情况下，在样品中尽可能好地使相应的零点与分子匹配。

但是分子的位置也可以在空间方向中的至少一个空间方向上由发光的光子的速率或时间间距推导出，对于零点的分配给相应空间方向的位置中的至少一个位置记录所述光子。

在此，可以考虑发光的光子的速率或时间间距与分离的分子至激励光的强度分布的零点的空间间距的相关性。所述相关性取决于邻接零点的强度上升区域中激励光的强度的变化过程并且也取决于作为激励分子以发射发光的基础的光物理过程。因此，在邻接通过相消干涉形成的零点的强度上升区域和光致发光的情况下，基于单光子过程近似地得出由分子发射的发光的强度与其至零点的间距的二次方相关性。在基于双光子过程的光致发光的情况下，相关性更突出并且遵循函数x4。事实上，强度上升区域中激励光的强度的变化过程仅须在以下程度上是已知的：所述变化过程如何对分子的发光的强度产生影响。也就是说，发光的强度与分子至激励光的强度分布的零点的间距的相关性必须是已知的，以便在确定在样品中分子的实际位置时可以考虑所述相关性。但是，可以容易地确定所述相关性，例如凭经验通过以小步长扫描具有零点的分子周围环境。

在由发光的光子的速率或时间间距推导出样品中分子的实际位置的情况下，可以考虑发光的光子的其他速率或其他的时间间距，其中，在零点的至少一个分配给相应空间方向的位置记录所述光子。在此，可以涉及发光的以下光子的其他的速率或其他的时间间距：在零点的其他的分配给相应空间方向的位置记录所述光子。在此，也可以考虑在相应空间方向上零点位置的间距。替换地或附加地，在由对于零点的至少一个位置记录的发光的光子的速率或时间间距推导出样品中分子的位置的情况下也考虑用于分离的分子的相对发光强度的已经提及的度量。

在本发明的第二实施方式的一种构型中，零点的初始位置对于空间方向中的每个空间方向包括两个位置，所述两个位置在相应空间方向上处于初始位置区域的两侧。然后通过根据对于所有位置确定的发光的光子的速率或时间间距使零点的分配给所有空间方向的位置逐步地移位，使分子的保持在零点的位置之间的位置区域逐步地变窄。在此，对于空间方向中的每个空间方向不必须确定零点的两个分开的初始位置。更确切地说，零点的初始位置中的一个初始位置也可以分配给多个空间方向。因此，例如为了在两个空间方向上确定分子的位置，零点的初始位置可以在由所述两个空间方向展开的平面中处于三角形的角中，即总共仅包括三个位置。相应地，为了在三个空间方向上确定分子的位置，零点的初始位置处于四面体的角中。原则上，自然也能够对于每个空间方向实现零点的两个分开的位置，在所述空间方向上确定样品中的分子的位置。然而，在以激励光的尽可能少的光子确定样品中的分子的位置的观点下，样品中零点位置的因此更多的数量(对于所述位置记录发光)不一定是优选的。

当零点的初始位置对于空间方向中的每个空间方向包括两个位置(相应空间方向的位置处于初始位置区域的两侧)时优选的是，在空间方向中的每个空间方向上邻接零点的强度区域相对于零点对称地构造。还更优选的是，在以下所有空间方向上的强度上升区域绕着零点旋转对称地构造：在所述空间方向上确定样品中的分子的位置。

可以使分子的保持在零点位置之间的位置区域一直逐步地变窄，直至其尺寸不再大于预给定的精度。所述预给定的精度可以处于20nm或更小的范围内。其也可以小于10nm。预给定的精度当然可能在1nm的数量级并且因此也可能低至0.5nm。原则上，本发明的第二实施方式对于在确定样品中的分离的分子的位置时可达到的精度不具有固有限制。然而，在相应的单个情况下出现的情况(例如降低的信噪比)可能限制实际可达到的精度。

因此，在本发明的第二实施方式的情况下，低于预给定的信噪比也可以确定为使零点进一步移位的中止标准。可以通过缩小点探测器前的光阑改善所述信噪比，借助所述点探测器对于样品中的零点的相应位置共焦地记录由分离的分子发射的发光。光阑的缩小伴随着所记录的光子的收益相对于由分子发射的发光的光子的降低。因此，其可以限制在紧邻样品中的分子的位置的零点的最后位置：在所述位置处信噪比信号通常是重要的。

在本发明的第二实施方式的情况下，只要在当前位置处平均已经记录发光的p个光子，就可以使零点的分配给所有空间方向(在所述所有空间方向上确定样品中的分子的位置)的位置中的至少一个位置移位，其中，p相对较小或者甚至可以非常小。具体地，p可以具有不大于30、不大于20、不大于10或甚至不大于5的值。可以理解，位置中的至少一个位置以有意义的方式可以移位多远取决于p的值，因为p根据统计学的基本原理确定以下精度：以所述精度可以对于各个位置确定发光的光子的速率或时间间距。

替代地或附加地，一旦在目前位置已经记录发光的总共n×q个光子，就可以使零点的分配给所有空间方向的位置中的至少一个位置移位，其中，n是确定样品中的分子的位置的空间方向的数量。在此，q也可以相对较小。具体地，q可以等于50或更小、或等于25或更小、或甚至等于5或更小。在此也再次适用，在达到n×q个记录的光子的情况下可以使零点的至少一个位置以有意义的方式移位多远取决于q的值。

在本发明的第二实施方式的另一构型中，一旦在每个零点的目前位置已经记录发光的m个光子，就使所述零点的位置移位。在此，m又可以是小的甚至非常小。具体地，m可以是30或更小、20或更小、10或更小或甚至5或更小、直至低至仅1。

“m的值非常小”可以理解如下：在使零点的位置移位的情况下，尽可能仅考虑分子的发光的明显的光子，也就是说，不考虑虽然被记录但例如分配给噪声的光子。如果零点不是理想的零点(在理想的零点中激励光的强度返回到零)，那么在求取光子(基于此使零点的位置移位)的速率或时间间距前，分子的发光的光子的与零点中的激励光的剩余强度相关联的速率也可以看作不明显的噪声并且进行扣除。

如已经提及的那样，整个初始位置区域会处于激励光的强度分布的区域中零点的每个位置处，在所述区域中强度上升区域中的强度保持低于激励光的饱和强度，在所述饱和强度以上进一步提高激励光的强度不再导致分离的分子的发光的更高强度。在本发明的第二实施方式的情况下优选的是，分别如此调节最大强度——即激励光的绝对强度水平，使得关于激励光的强度分布的零点的每个位置的初始位置区域处于不超过激励光的饱和强度的90％的范围内。

随着使零点的位置的逐步地移位，可以逐步地提高激励光的最大强度。随着使零点的位置逐步地移位，其至样品中分子的实际位置的间距减小。通过提高激励光的最大强度，已缩小的间距再次分布在分离的分子的发光的不同强度的更大带宽上。

例如可以如此提高激励光的绝对强度，使得对于零点的所有相应位置记录的光子的速率保持相等。因此这意味着，这些光子的时间间距保持相等。可以至少暂时地、即对于使零点移位的部分时间段争取达到通过提高激励光的绝对强度使速率或时间间距保持相等。

具体地，激励光的最大强度可以越过零点的整个移位提高至少50％。所述最大强度但是也可以提高至少100％或提高到其初始值的3倍、4倍或更多倍。

在本发明的第三实施方式中，如在由WO 2015/097000 A1已知的初始方法中那样，激励光以以下强度分布对准样品：所述强度分布在所述空间方向中的每个空间方向上具有至少一个强度上升区域，所述至少一个强度上升区域具有激励光的强度在至强度分布的起始点的间距上已知的、严格单调的变化过程。强度分布的所述起始点在所述空间方向中的每个空间方向上布置在样品中的不同位置处。对于样品中的强度分布的起始点的每个位置记录由分子发射的发光；并且由所记录的发光的强度推导出样品中的分子的位置。

除了已知的方法以外，在本发明的第三实施方式的情况下，首先确定样品中的初始位置区域，分子布置在所述初始位置区域。然后(i)在所述空间方向中的每个空间方向上如此确定强度分布的起始点的至少一个位置，使得至少一个强度上升区域在相应空间方向上在整个初始位置区域上延伸，并且(ii)由发光的强度值确定样品中的另一位置区域，所述分子布置在所述另一位置区域中，并且所述另一位置区域小于初始的位置区域，其中，所述强度值对于所述空间方向中的每个空间方向包括两个强度值，所述两个强度值中的一个说明对于强度分布的起始点的至少一个位置记录的发光的强度。步骤(i)和(ii)——包括将激励光的强度分布的起始点布置在在步骤(i)中确定的位置处对于这些位置中的每个位置记录由分子发射的发光——在所述另一位置区域用作新的初始位置区域的情况下重复至少一次。

以这种方式，使样品中的分离的分子的位置在每个空间方向上非常快速地——即基于由分离的分子发射并且记录的少量光子)限制到小的位置区域。所述小的位置区域的尺寸相应于确定分离的分子的位置的精度。所述尺寸可以无问题地低于10nm并且因此明显低于在发光波长情况下的衍射极限。

在本发明的第三实施方式的情况下，在分子的初始位置区域中也不在空间上扫描样品，而是基于对于强度分布的起始点的当前位置记录的发光的强度相对于位置区域智能地(即在最大地充分利用所有目前由所记录的发光的强度可提供使用的关于分离的分子的实际位置的信息)确定强度分布的起始点的位置。在此，所确定的起始点的位置可以完全空出位置区域自身。

“在本发明的第三实施方式的情况下使激励光以以下强度分布对准样品：所述强度分布在所述空间方向中的每个空间方向上具有至少一个强度上升区域，所述至少一个强度上升区域具有激励光的强度在至强度分布的起始点的间距上已知的、严格单调的变化过程”可以意味着：通过在至起始点的不同间距上不同强度的相消干涉形成所述强度上升区域。此外，激励光的强度在至少一个强度上升区域中从零——即例如从激励光的完全相消干涉上升。然后，所述强度上升区域尤其包括激励光的小强度，其通过激励以发射发光仅少量地要求分离的分子。在此，所述强度上升区域邻接激励光的强度分布的零点，在相应空间方向上在相对置的一侧上另一强度上升区域邻接所述零点，其中，两个强度上升区域相对于零点可以彼此对称地构造。零点可以同时用作激励光的强度分布的起始点，所述起始点以以有利的方式处于激励光的最小强度附近，所述强度仅少量地要求分离的分子。通常，激励光的强度分布的起始点是在强度分布内定义的参考点，其相应位置在分子中定义并且其可以相应地定位在样品中的定义的位置处。如果激励光的强度分布的起始点是所述强度上升区域所邻接的零点，那么激励光的强度在所述强度上升区域中的每个强度上升区域上随着至起始点的间距增大而严格单调地、即连续地上升。然而，根据强度分布的起始点的类型，激励光的强度随着至起始点的间距增大也可以在强度上升区域上严格单调地下降。

与邻接激励光的强度分布的一个零点或另一起始点的两个强度上升区域是否彼此对称地构造无关，在本发明的第三实施方式的情况下可以使用两个强度上升区域，其方式是：例如在步骤(i)中在初始位置区域的不同侧确定起始点的位置。

零点可以是通过干涉形成的理想零点，在所述理想零点中激励光的强度实际上返回到零。然而，在零点中激励光的低的剩余强度是无害的，因为本发明的第三实施方式的核心不是在样品中如此定位零点(只要其存在在激励光的强度分布中)，使得其位置与样品中的分子的位置重合。出于同样的原因，原则上也可以通过在相应空间方向上间隔开的高斯强度分布——具体地通过保持在所述强度分布值之间的最小强度形成由强度上升区域限界的零点。此外，至少一个强度上升区域也可以通过仅一个高斯强度分布的侧沿提供。然而在这种情况下，聚焦成高斯强度分布的激励光的重点是强度分布的与强度上升区域中激励光的特别令人感兴趣的小的强度相对远离的起始点。

以仅在单个空间方向上延伸的强度上升区域也可以在两个或所有三个空间方向上高分辨率地确定样品中的分子的位置。同样地，借助仅在两个空间方向上延伸的强度上升区域，可以不仅在所述两个空间方向上而且在所有三个空间方向上高分辨率地确定样品中的分离的分子的位置。为此，在所述一个或多个强度上升区域在不同空间方向上取向的情况下实施本发明的第三实施方式。这对于所述一个或多个强度上升区域的不同取向可以彼此相继地或几乎同时地实现，例如当对于所述一个或多个强度上升区域的所有空间方向已经实施至少一次步骤(i)和(ii)时才重复步骤(i)和(ii)。

在本发明的第三实施方式的情况下，可以以不同方式确定初始位置区域，所述分子布置在所述初始位置区域中。在以下进一步说明其示例。

“在本发明的第三实施方式的情况下，在步骤(i)中在所述空间方向中的每个空间方向上如此确定强度分布的起始点的至少一个位置，使得至少一个强度上升区域在相应空间方向上所述初始位置区域上延伸”意味着：所述分子肯定处于激励光的强度分布的以下区域中：所述区域受到关于分子的发光的强度的强度上升区域影响。

“在步骤(ii)中分析处理发光的光强度值，所述光强度值对于所述空间方向中的每个空间方向包括两个强度值，所述两个强度值中的一个是对于强度分布的起始点的至少一个位置记录的发光的强度”不排除以下情况：对于所有空间方向，相应空间方向的相应第二强度值是同一值，从而在步骤(ii)中总共仅分析处理n+1个强度值，其中，“n”是空间方向的数量，在所述空间方向上确定分离的分子的位置。然而，原则上，对于每个空间方向也可以考虑附加的强度值，从而然后总共分析处理2n个强度值。

为了在步骤(ii)中确定样品中的另一位置区域，所述分子布置在所述另一位置区域中，并且所述另一位置区域小于所述初始位置区域，可以考虑由分离的分子发射的发光的强度与分离的分子至激励光的强度分布的起始点的间距的相关性。这种相关性取决于强度上升区域中激励光的强度的已知的、在所述间距的方向上严格单调地上升或下降的变化过程并且也取决于作为激励分子以发射发光基础的光子物理过程。因此，在邻接通过相消干涉形成的零点的强度上升区域和基于单光子过程的光致发光的情况下近似地得出由分子发射的发光的强度与其至零点的间距的二次方相关性。在基于二光子过程的光致发光的情况下，所述相关性还更明显并且遵循函数x⁴。实际上，在本发明的第三实施方式的情况下，在强度上升区域中激励光的强度的严格单调的变化过程仅在以下程度上已知：所述变化过程如何对分子的发光的强度产生影响。也就是说，发光的强度与分子至激励光的强度分布的起始点的间距必须是已知的，以便可以在确定另一位置区域时考虑所述相关性。然而，例如可以凭经验通过以小步长扫描分子的具有强度上升区域的周围环境容易地确定所述相关性。

“在步骤(ii)中由发光的强度值(所述强度值对于所述空间方向中的每个空间方向包括发光的两个强度值)确定样品中的分子的更小的另一位置区域”不仅包括考虑发光的光子的不同速率的可能性而且包括考虑所记录的光子的时间间距的可能性。在此可以理解，所记录的光子的时间间距的平均值等于对于激励光的强度分布的起始点的位置记录的发光的光子的速率的倒数值。

在本发明的第三实施方式的情况下，步骤(i)和(ii)重复至少一次。也就是说，样品中的分子所处的位置区域相对于初始位置区域缩小至少两次。这意味着，借助本发明的第三实施方式使样品中的分子的位置区域相对于其第一次估计变窄至少两次。也可以以相同的方式或以其他的方式进行位置区域的进一步变窄。然而，在初始位置区域缩小至少两次后获得的更小的位置区域也可以直接用于说明分离的分子的位置，例如作为位置区域的中心，其具有位置区域的半径作为可能的误差。

相应空间方向的第二强度值(所述第二强度值在本发明的第三实施方式的步骤(ii)中进行分析处理)可以是对于样品中的强度分布的起始点的第二位置记录的发光的强度。所述第二位置可以在相应的空间方向上处在与强度分布的起始点的至少一个位置相同一侧上的不同位置处或处在初始位置区域的与强度分布的起始点的至少一个位置相对置的一侧上。在任何情况下，在本发明的第三实施方式的所述构型的情况下，在激励光的强度分布的起始点的两个位置处检测强度上升区域中的激励光的不同强度的影响，由其已知其在相应的空间方向上相对于分子的初始位置区域处于哪里。

在考虑强度上升区域中激励光的强度的已知变化过程的情况下，可以结合相应空间方向上起始点的位置的间距由发光的所属强度推断出相应空间方向上分子的实际位置。在本发明的第三实施方式的这种构型的情况下，对于每个空间方向不需要考虑关于所记录的发光的强度的起始点的两个分开位置。更确切地说，为了在两个空间方向上确定分子的位置，起始点的位置在由所述两个空间方向上展开的平面中处于三角形的角中，即总共仅包括三个位置。相应地，为了在三个空间方向上确定位置，起始点的位置处于四面体的角中。原则上，对于确定分子的位置的每个空间方向自然也能够实现起始点的两个分开的位置。在以发光的尽可能少的光子确定样品中的分子的位置的观点下，样品中的起始点的更多位置(对于所述位置记录发光)不一定是优选的。

在另一实施方式中，在步骤(ii)中，对于相应空间方向，第二强度值是用于分离的分子的相对发光强度的度量。具体地，所述度量涉及在以激励光进行激励时分子的发光的最大强度或涉及与其直接相关联的强度值。最大强度或与其相关联的强度值可以对于分离的分子进行具体测量或对于所有潜在的分离的分子以确定的值进行估计。

在本发明的第三实施方式的情况下，对于样品中的强度分布的起始点的不同位置几乎同时地记录发光，其方式是：使出发点在样品中的位置之间重复地移位。为此目的，可以借助扫描仪使激励光的同一强度分布移位。但是也能够实现例如借助布置在激励光的射束路径中的空间光调制器(SLM)对于样品中其起始点的不同位置中的每个位置重新构造强度分布。然后，至少可以在这方面省去扫描仪。此外，能够实现使在样品中激励光的强度分布的起始点移位，其方式是：通过完全不同或部分不同的光源彼此相继地提供激励光。在本发明的第三实施方式的所有这些可能的构型的情况下，可以使激励光的强度分布的起始点在样品中的其位置之间反复地来回移位。可以理解，在此分开地记录分子的属于起始点的各个位置的激励光。对于激励光的强度分布的起始点的不同位置几乎同时地记录发光具有以下优点：当对于激励光的强度分布的起始点的各个位置记录的发光的光子已经允许使样品中的布置有分子的初始位置区域变窄预给定的度量时，可以立刻中断给样品施加激励光以及记录样品的发光。

然而，相应的中止标准也可以应用在对于样品中的激励光的强度分布的起始点的每个位置连续地记录发光的情况下。然而存在以下情况：根据分子的总共少量的光子，观察对于激励光的强度分布的起始点的所有位置记录的发光的强度已经可以识别出，可以使初始位置区域限界所期望的大小。

如果在本发明的第三实施方式的情况下分别仅一直对于激励光的强度分布的起始点的位置记录发光，直至以足够的精度检测对于所述位置所记录的发光的强度，使得可以确定另一位置区域比初始值小预给定的值，那么所述预给定的值处于5％至75％的范围内。在此，所述说明涉及相应空间方向上的位置区域的尺寸。可以理解，需要越精确地检测对于激励光的强度分布的起始点的不同位置记录的发光的强度，则会相对于初始位置区域越多地限界另一位置区域。在对于起始点的不同位置检测发光的强度的情况下，较小的限界需要较低的精度，但也更多地重复本发明的第三实施方式的步骤(i)和(ii)，以便实现相同的精度。在此，可以在在确定样品中的分子的位置的情况下达到确定的精度所需要的激励光的光子的数量的方面实施优化。

如已经提及的那样，整个初始位置区域会处于激励光的强度分布的区域中的起始点的每个位置处，在所述区域中强度上升区域的强度保持在激励光的饱和强度以下，在所述饱和强度以上进一步增大激励光的强度不再导致分离的分子的发光的更高强度。在本发明的第三实施方式的情况下优选的是，分别如此调节最大强度(即激励光的绝对强度水平)，以使初始位置区域关于在步骤(i)中确定的激励光的强度分布的起始点的位置处于不超过激励光的饱和强度的90％的区域中。

随着缩小的位置区域，可以提高激励光的最大强度。以这种方式，可以将缩小的位置区域再次分布到强度上升区域中激励光的不同强度的整个带宽上并且因此分布到分离的分子的发光的不同强度的整个带宽上。

具体地，通过步骤(i)和(ii)的所有重复可以使激励光的最大强度提高至少50％。激励光的最大强度也可以提高至少100％、或也可以提高到其初始值的3倍、4倍或更多倍。

可以一直重复本发明第三实施方式的步骤(i)和(ii)，直到在最后实施的步骤(ii)中所述另一位置区域不超过预给定的精度。所述预给定的精度可以处于20nm的范围内或更小。所述预给定的精度也可以小于10nm。也能够实现以1nm的数量级并且因此能够实现低至0.5nm的预给定的精度。原则上，本发明的第三实施方式对于在确定样品中分离的分子的位置时可实现的精度不具有固有限界。然而，在相应的单个情况下出现的情况(例如降低的信噪比)可能限界在实践中可实现的精度。因此，作为对于在本发明的第三实施方式的情况下重复步骤(i)和(ii)的中止标准，也可以确定低于预给定的信噪比或对于所实现的进一步缩小样品中分离的分子所处的位置区域的下限。

在所有根据本发明的方法的情况下，以不同的方式确定可能布置有分子的初始位置区域。以下说明其示例。

在所有根据本发明的方法的情况下，对于确定分离的分子的位置的开始，在具有零点的空间方向中的每个空间方向上扫描样品的包括分离的分子的区域，其中，由发光的强度在扫描期间的变化过程估计分离的分子的位置并且所估计的位置基于样品中的零点的位置的确定。可以以激励光的相对较低的强度并且以在空间上相对较大和在时间上相对较小的步长实施在空间上扫描样品的至少一个区域，因为由此仅需要粗地估计分子的位置(即分子可能所处的限界的位置区域)。替代以激励光的强度分布的零点，可以在确定分离的分子的位置的开始时在所述空间方向中的每个空间方向上以激励光的高斯强度分布(即以激励光的经简单聚焦的射束)扫描样品的包括分离的分子的区域。这相应于样品中分离的分子的共焦显微成像。

在根据本发明的方法的另一构型中，在确定分离的分子的位置的开始时，使激励光以高斯强度分布仅逐点地或以圆形路径或螺旋形路径对准样品的包括分离的分子的区域，其中，由发光的强度在所述点或路径上的变化过程估计分离的分子的位置并且所估计的位置作为确定样品中的零点的位置的基础。为了在此限界发光的由分离的分子发射的光子，高斯强度分布可以非常快速地运动和/或关于激励光的最大强度保持得小。在使高斯分布以圆形路径或螺旋路径运动的情况下，可以使用激励光的高斯强度分布的外围中的强度上升区域，以便给分离的分子仅施加激励光的低强度，但所述强度足够用于通过定位分子来确定分子可能所处的限界的位置区域。

在根据本发明的方法的另一构型的情况下，在确定分离的分子的位置的开始时，在空间上(即在总体上)给样品的包括分离的分子的区域施加激励光并且将其成像到以空间分辨率记录发光的探测器(例如摄像机)上。然后，可以由以探测器记录的发光的空间分布估计分离的分子的位置并且所估计的位置作为样品中的零点的位置的确定的基础。因为在所述估计的情况下不需要使分子可能所处的限界的位置区域特别地变窄，所以对此分离的分子的少量光子就足够。

在所有在此描述的、在确定分离的分子的位置的开始时可实施的步骤的情况下，为了估计分子的位置或确定分子可能所处的限界的位置区域，可以同时检测在以激励光激励的情况下分子的发光的最大强度或与其相关联的强度值，所述最大强度和/或所述强度值是用于分离的分子的相对发光度的度量。

在所有根据本发明的方法的情况下，原则上也可以以空间分辨探测器(例如摄像机、而且例如仅2×2或3×3的点传感器的更小阵列)进行记录发光。由在零点的不同位置上记录的分离的分子的发光的光子的总和可以附加地通过定位确定其位置。在此，样品中的分子的在定位时得到的其他位置指示样品中的分子的确定取向，因为虽然用于确定样品中的分子的位置的定位受其取向的影响，但根据本发明确定在样品中的分子的位置不受其取向的影响。在所有根据本发明的方法的情况下，在哪里记录相应的由分子发射的光子不重要。相应地，在根据本发明的所有方法的情况下，也可以借助点探测器记录发光。

在所有根据本发明的方法的情况下，在确定分离的分子的位置前给样品施加以下开关信号：所述开关信号使分子与相邻的同类分子分离，其方式是：将相邻的同类分子——与分离的分子相反——切换到暗状态中，在所述暗状态中不可以以激励光激励所述同类分子以发射发光。所述暗状态可以是分子的不发光的另一构象状态。但是也可以涉及电子暗状态。替代地，切换信号可以仅将待分离的分子切换到发光状态中。切换信号可以是具有与激励光不同的波长和强度的切换光。但是切换光也可以具有与激励光相同的波长并且仅具有与激励光不同的强度。原则上，切换信号也可以是激励光本身。

重复地实施根据本发明的方法可以用于确定多个彼此分离的、以激励光可激励以发射发光的分子的位置，所述分子标记样品中的令人感兴趣的结构。在另一实施方式中，重复地实施根据本发明的方法用于追踪在样品中运动的分离的分子。在此，在每次重复根据本发明的方法的情况下分子可能所处的限界的位置区域是分子的先前确定的位置加上环绕该位置的误差区域。这种误差区域的宽度与样品中分子的最大运动速度相一致。

为了实施根据本发明的方法，可以使用STED扫描荧光显微镜，其中，具有与最大强度相邻的零点的通过STED扫描荧光显微镜提供的STED光用作激励光。

本发明的有利扩展方案由权利要求、说明书和附图得出。在说明书中所提及的特征的优点和多个特征的组合的优点仅仅是示例性的并且可以替代地或累积地产生作用，而无需强制地由根据本发明的实施方式实现所述优点。在不由此改变所附的权利要求的主题的情况下，关于初始申请文件和专利的公开内容适用如下：其他的特征可从附图——尤其所示出的几何形状和多个构件彼此的相对尺寸以及其相对布置和有效连接——得出。本发明的不同实施方式的特征或不同权利要求的特征的组合同样可能不同于权利要求的选择的引用关系并且由此得到启示。这也涉及这样的特征，这些特征在分开的附图中示出或者在所述附图的说明中提及。这些特征也可以与不同权利要求的特征组合。同样，可以对于本发明的其他实施方式取消在权利要求中列举的特征。

在权利要求和说明书中所提及的特征在其数量方面可以理解如下：存在恰好这个数量或比所提及的数量更大的数量，而不必明确地使用副词“至少”。如果例如提及一个分离的分子，这可以理解如下：存在恰好一个分离的分子、两个分离的分子或更多分离的分子，其位置被确定。这些在权利要求中列举的特征可以通过其他的特征补充或者是所要求保护的主题具有的唯一特征。

在权利要求中包含的附图标记不是对通过权利要求保护的主题的范围的限制。这些附图标记仅仅用于使得权利要求更容易理解的目的。

根据本发明的可能的实施方式的其他信息可以从WO 2015/097000 A1中提取。在实现本发明的情况下也可以实现在那里公开并且与本发明不矛盾的所有内容。

附图说明

以下根据附图中示出的优选的实施例进一步阐述和描述本发明。

图1示意性地示出STED显微镜，其可以用于实施根据本发明的用于确定分离的、以激励光可激励以发射发光的分子的位置的方法；

图2示出具有与最大强度相邻的零点的激励光的强度分布的区段和发光的引起的强度，所述区段在实施根据本发明的方法的情况下借助根据图1的STED显微镜对准样品，所述发光由布置在样品中的相应位置处的发光的分子发射；

图3示出在样品中的分离的分子可能所处的限界的二维的位置区域方面实施本发明的第一实施方式；

图4示出在实施本发明的第一实施方式的情况下对于样品中的激励光的强度分布的零点的不同的位置记录的发光的不同强度之间的关系；

图5示出本发明的第一实施方式的构型的方框图；

图6示出在样品中分离的分子可能所处的限界的二维的位置区域的方面实施本发明的第二实施方式；

图7在相应于图4的图中示出在实施本发明的第二实施方式的情况下对于样品中的激励光的强度分布的零点的不同的位置记录的发光的不同强度之间的关系；

图8示出本发明的第二实施方式的实施方式的方框图；

图9阐明在样品中的分离的分子的第一初始位置区域的方面本发明的第三实施方式的步骤的第一实施；

图10阐明在样品中的分离的分子的缩小的初始位置区域的方面本发明的第三实施方式的步骤的第二实施；

图11阐明以激励光的高斯强度分布实施根据本发明的第三实施方式的替代构型；

图12阐明以激励光的强度分布的起始点的位置相对于初始位置区域的第一相对布置两次彼此相继地实施本发明的第三实施方式的步骤；

图13阐明以激励光的强度分布的起始点的位置相对于初始位置区域的另一相对布置两次彼此相继地实施本发明的第三实施方式的步骤；

图14示出本发明的用于确定样品中的分离的分子的位置的第三实施方式的构型的方框图；

图15示出重复实施本发明的用于对样品中的以可分离的分子标记的结构进行成像的第三实施方式的方框图；并且

图16示出重复实施本发明的用于追踪样品中的分离的分子的运动的第三实施方式的方框图。

具体实施方式

图1示意性地示出STED荧光显微镜1，借助该STED荧光显微镜可以实施根据本发明的方法。在实施根据本发明的方法的情况下，不一定使用STED荧光显微镜1的所有组件。然而，STED荧光显微镜1包括实施根据本发明的方法所必需的所有组件。在STED荧光光学显微镜1用于实施根据本发明的方法的情况下，光源2提供激励光3，该光源在STED荧光显微镜1的通常使用的情况下提供STED光。借助射束成形装置4使激励光如此成形，使得该激励光在镜头5的焦点具有以下强度分布：所述强度分布具有至少一个强度上升区域。在根据本发明的方法的一种构型中，激励光3在镜头5的焦点具有以下强度分布：所述强度分布具有零点，其在应确定样品6中的分离的分子的位置的所有空间方向上与最大强度相邻。然后，这些最大强度的边沿形成在所有根据本发明的方法的情况下使用的强度上升区域。射束成形装置4可以仅包括无源的部件或者也包括有源的光学器件，例如包括空间光调制器(SLM)。STED荧光显微镜1在其正常使用时提供激励光的其他光源7可以在实施根据本发明的方法的情况下提供切换光8，以便分离样品6中的分子，接下来可以确定该分子在样品中的位置。在此，将分子分离可以以以下为基础：以切换光8将其他同类的分子切换到暗状态，在该暗状态下不可以以激励光3激励所述其他同类的分子以发射发光。将切换光8耦合输入到激励光3的射束路径中，为此在此设有二向色分束器9。借助扫描仪10使样品6中的激励光3的上升区域或零点移位。通过从样品6出发布置在扫描仪10前的二向色分束器11使样品6的发光12从激励光3的射束路径耦合输出并且借助光学器件13成像到摄像机14上。摄像机14是用于发光12的在空间上进行分辨的探测器的示例。对此替代地，借助二向色分束器15使样品6的发光12输送给具有前置的光阑17的点探测器16。样品6中的发光12来自于分离的分子，以激励光3激励该分离的分子以发射发光。基于发射发光的过程是光致发光、尤其是荧光。样品6布置在样品架18上。附加地，样品例如可以借助样品架18在z方向上(即在镜头5的光学轴线的方向上)移位，以便尤其当零点在z方向上最大强度相邻时，使在样品6中激励光3的强度分布的强度上升区域或零点也在这个方向上移位。使样品6如此成像到摄像机14上，使得通过摄像机14由分子的发光12的光子的空间分布能够实现分离的分子的定位。然而，在所有根据本发明的方法的情况下，基于在样品6中激励光3的强度分布的强度上升区域或零点的不同布置的情况下发光12的强度，至少附加地确定样品6中的分子的位置。

在图2中沿着在横向于根据图1的镜头5的光学轴线的x方向上的区段示出激励光3的强度分布19。强度分布包括中心的零点20，在所述零点上激励光3的强度I_AN回到零或至少接近零。该零点20在两侧与最大强度21相邻。在零点20与最大强度21之间形成强度上升区域22。在这些强度上升区域22中，激励光3的强度I_AN从零上升到饱和强度I_S并且进一步上升。在饱和强度I_S的情况下，以激励光3激励的发光12的强度I_L达到饱和值I_SW，在该饱和值I_SW以上强度I_L不再进一步上升。激励光3的强度分布19相对于零点20对称地构造，也就是说，强度上升区域彼此对称地延伸。

图3示出样品6中分子24可能所处的限界的位置区域23。该位置区域23是x-y平面中的圆。为了在x和y方向上确定分子24的位置，激励光3的强度分布19的零点20在x-y平面中布置在相对于所述限界的位置区域的四个位置A至D处。在此，三个位置A至C(也称为外围位置)处于围绕所述限界的位置区域23的圆弧25上并且在此沿着圆弧25以相等的间距布置。零点20的第四位置D处于所述限界的位置区域23的中心，并且因此处于圆弧25的中点。换句话说，位置A至C在x-y平面中处于等边三角形的角，而位置D处于这个三角形的中点。对于样品中的零点20的位置A至D，记录由于以激励光3激励分子而由分子24发射的发光12。在强度上升区域22绕着x-y平面中的零点20旋转对称地构成的情况下，对于零点20的不同的位置A至D记录的发光12的强度仅取决于分子24至相应的位置A至D的间距a和发光在所述间距上的强度I_L的变化过程26，如在图4中绘制的那样。

在图4中也绘制了分子24与对于位置A至D的零点20的间距a_A至a_D以及由此引起的发光的强度I_A至I_D。通过在本发明的第一实施方式的情况下测量这些强度，可以根据变化过程26求取所属的间距a_A至a_D，并且由此可以确定分子24相对于已知的位置A至D的位置。因为可以分别仅以确定的精度确定强度I_A至I_D(该精度取决于对于位置A至D记录的发光12的光子的数量)，所以也可以不精确地而仅以确定的精度确定分子24的位置。然而，与发光12的光子的为此所需的总数相比，对于确定分子24的位置，在根据本发明的方法的情况下实现的精度非常高。该精度比在基于分子24的发光的光子的空间分布定位分子24的情况下尤其高得多，其借助在空间上进行分辨的探测器——例如根据图1的摄像机14进行探测。替代基于间距a_A至a_D确定分子24相对于位置A至D的位置，可以使描述变化过程26的函数拟合对于位置A至D测量的强度I_A至I_D，并且样品中的分子24的位置可以等同于变化过程26的零点27的位置。

在本发明的第一实施方式的实际测试的情况下，可以以不超过对于以相同的精度定位分子24所需的发光的光子的5％在大约1nm上精确地确定分子的位置。

在图5中以方框图的形式示出的本发明第一实施方式的构型在开始28后以分离29分子开始。接下来是确定30分子可能所处的限界的位置区域23，例如其方式是：总体上给样品6施加激励光3并且分析处理来自样品的成像到摄像机14上的发光12。然后，程序31由以下构成：将零点20布置在确定的位置A至D处以及对于所述位置A至D记录发光12。随后，由对于不同的位置A至D记录的发光12的强度推导32样品6中的分子24的位置。重新实施程序31和推导32的循环33可以在结束34前用于以更高的精度确定分子24的位置，其中，使零点20的位置A至D更邻近样品6中的分子24的在第一次推导32时确定的位置并且提高激励光的绝对强度。

但是也可以在不更密集地布置零点的位置A至D的情况下多次地遍历(durchlaufen)循环33，以便跟踪(即追踪)样品中运动的分离的分子24。在此，位置A至D可以始终围绕在先前推导32时确定的分子24的位置地布置。在此由位置A至D展开的位置区域23可以选择得如此大，使得当分子在最后记录发光12后在样品6中已经运动到最远时，该区域也仍然包括分子24。更大的循环35包括重复所有的步骤29至32，以便从标记了样品6中的令人感兴趣的结构的多个分子中始终分离出其他分子。然后，分离的分子24的确定的位置的总和以更高的精度描述样品6中的令人感兴趣的结构。

对于本发明的第二实施方式，图6阐明样品6中的一个初始的位置区域23，分子24基于先前的测量处于所述位置区域中。在此，所述位置区域是x-y平面中的圆。为了在x和y方向上确定分子24的位置，在x-y平面中相对于初始的位置区域确定激励光3的强度分布19的零点20的初始位置。在此，位置A至C布置在圆弧25上，所述圆弧以间距环绕初始的位置区域23延伸，从而初始的位置区域23在所有空间方向上位于位置A至C之间。位置A至C以相等的间距沿着圆弧25布置。换句话说，位置A至C在x-y平面中处于等边三角形的角。对于样品中的零点20的位置A至C，记录由分子24由于以激励光3激励所述分子而发射的发光12。在强度上升区域22绕着x-y平面中的零点20旋转对称地构成的情况下，对于零点20的不同位置A至C记录的发光12的强度仅取决于分子24至相应的位置A至C的间距a和发光的强度I_L在所述间距a上的变化过程26，如在图7中绘制的那样。

在图7中绘制了分子24与对于位置A至D的零点20的间距a_A-a_C以及由此引起的发光的强度I_A至I_D。如果已经准确地检测到这些强度，那么可以借助变化过程26求取所属的间距a_A至a_C，并且由此可以确定分子24相对于已知的位置A至C的位置。检测强度的精度取决于发光12的对于位置A至C记录的光子的数量。因此，精确地确定强度I_A至I_C需要对于零点20的每个位置A至C记录大量光子。

本发明的第二实施方式提出其他的路径。根据本发明，对于零点的不同位置A至C，仅记录发光的相对较少的光子，更确切地说，仅记录如此多的光子，使得可以做出以下表述：零点20的相应的位置A至C是否还离分子24相对较远，也就是说，间距a_A至a_C是否还是大的并且零点20的不同位置A至C与分子24的间距a_a至a_c是否大致相等或以确定的方式不同。根据这些确定——对于所述确定在位置A至C中的每个处仅需要记录分子24的发光的少量分子——的结果，使位置A至C向里移位到初始的位置区域23中，如以图6中的箭头228_A1至228_C1所示的那样。然后，对于零点20的如此移位的位置A至C，再次记录分子24的发光12，以便重新实施确定。因为在图6中绘制的箭头228_A1至228_C1将零点20的位置A至C以相同的间距引导至分子24，所以在零点20的如此移位的位置A至C处会检测到发光12的光子的相同的速率或时间间距。相应地，接下来会使位置A至C朝它们的共同的中点进一步移位，这在图6中通过箭头228_A2至228_C2说明。实际上，为了使位置A至C靠近分子24，实施非常多次地重复以下步骤：使位置A至C移位，并且对于不同的位置A至C记录分子24的发光。在此，对于不同的位置A至C，几乎同时地记录发光12，以便尽可能快速地确定光子的速率或光子的彼此的时间间距彼此如何变化，从而尽可能立即地(即根据总共尽可能少的光子)使位置A至C以有意义的方式进一步向里移位到初始的位置区域23中，以便使位置A至C靠近分子24。在此可以理解，以步长校正对于每个位置A至C直至接下来的移位记录的发光的光子的数量，以便接下来可以使位置A至C有意义地移位。原则上，在每次记录发光后也不需要使所有的位置A至C移位。也可以仅使光子的速率特别大或光子的时间间距特别小的位置A至C移位。这可以如下进行：当在每个位置A至C已经记录一定数量的光子时，才使每个位置A至C移位，而暂时还不使其他的位置A至C(在所述位置还不是这种情况)移位。借助本发明的第二实施方式，可以非常快速地、即具体地以比在定位样品6中的分子24时少得多的光子非常强地限界样品中的分子24的位置区域。当位置A至C已经彼此非常靠近时，由它们包围的位置区域可以作为分子的位置+/-所实现的精度输出。然而，从零点20的这些最后的位置A至C出发，也还可以实现分子24的位置的更精确的确定，其方式是：所述位置例如由对于这些位置A至C确定的发光12的强度根据根据图7的变化过程26推导出。

在图8中以方框图的形式示出的本发明的第二实施方式的构型在开始229后以分离230分子24(例如借助根据图1的切换光8)开始。然后进行确定31最初的位置区域23。在确定232时相对于初始的位置区域23确定零点20的初始的位置A至C。然后在程序233中，将零点20布置在位置A至C处，并且对于位置A至C记录由分子24发射的发光12。在此，使零点20在位置A至C之间来回移位，其中，对于不同的位置A至C分开地记录发光12，从而对于不同的位置A至C几乎同时地记录发光12。在随后的移位234的情况下，使零点20的位置A至C向里移位到初始的位置区域23中，更确切地说，取决于对于不同的位置A至C记录的发光12的光子的速率或时间间距。以循环235重复程序233和移位234，直至零点20的位置A至C已经以所期望的度量靠近样品中的分子24的位置。然后在确定236时样品中的分子24的位置，例如确定为由最后的位置A至C限界的位置区域。包括循环235在内，可以在另一循环37中重复步骤232、233、234和236，以便当分子24在样品6中移动时跟踪分子24。也表述为追踪分子24。在此，位置A至C总是可以布置在先前的确定236时确定的分子24的位置周围。接下来由确定的位置A至C展开的初始的位置区域23可以选择得如此大，使得当分子24在最后的步骤233后已经在样品6中运动得最远时所述位置区域也仍然包括分子24。

替代地，在较大的循环238中附加地可以重复步骤230和31，以便对样品6中的以多个同类分子24标记的令人感兴趣的结构逐步地进行成像。在这种情况下，当令人感兴趣的结构以所期望的完整性成像时，到达结束239。

对于本发明的第三实施方式，图9对于零点20在x_N处的位置说明所引起的发光12的强度I_L与样品中的分离的分子的位置x的相关性。强度I_L在强度上升区域22从零上升到饱和值I_SW。这在本发明的第三实施方式的情况下使用如下。在以根据图1的激励光3在空间上照亮样品6时通过摄像机14由分离的分子的发光12的分布确定初始的位置区域23，样品6中的分子的位置处于所述初始的位置区域中。通过借助根据图1的扫描仪10使零点20定位在位置x_N1处，使在此在左侧的强度区域22如此布置在样品6中，从而所述强度区域展开所述初始的位置区域23。然后，在给样品6施加激励光3期间记录由处于实际位置x₀处的分子发射的发光12并且确定所述发光的强度I₁。确定强度I₁的精度取决于在零点的所述位置x_N1处记录的发光12的光子的数量。如果强度I₁如饱和值I_SW那样是精确已知的，那么可以由强度I_L在至零点20的间距上的已知的变化过程精确地推断出分离的分子的位置x₀。然而，借助为了确定强度I₁所记录的有限数量的光子，在此仍然存在误差。在例如由分子的发光12的在开始以摄像机24记录的光子来确定饱和值I_SW时同样存在误差。反之，在右侧可以非常精确地确定发光12的强度I_L的变化过程。在零点20附近，在通过单光子过程激励分子以发射发光12时，所述变化过程通常与至零点20的间距以二次方的方式相关。因此，尽管在确定I₁和I_SW时存在不精确性，但可以基于测量I₁确定另一位置区域324，其中，分子的位置x₀处于所述另一位置区域中并且所述另一位置区域比位置区域23小得多。在图9中对于I₁和I_SW的确定的有误差的测量值绘制了所述另一位置区域324。

图10示出在本发明的第三实施方式的情况下如何使用关于所述另一位置区域324的知识来现在在位置x_N2处重新定位零点20，以便以更高的精度(即空间分辨率)在样品6中确定分子的实际位置x₀。为此，再次如此布置零点20的位置x_N2，使得左侧的强度上升区域22延伸超出位置区域324。此外，如此提高激励光3的绝对强度，使得在与零点20的更小间距上达到发光12的饱和值I_SW。然后，在零点20的所述位置x_N2确定分子的发光12的强度I₂。然后由所述强度I₂和饱和度值I_SW可以确定另一位置区域325，样品6中的分子处于所述另一位置区域中，并且所述另一位置区域又比位置区域324更小。然后，所述另一位置区域325还可以用于在样品6中的另一位置处定位零点20，以便以更高的精度确定样品中的分子的位置x₀。然而，位置区域325以比初始的位置区域23高得多的精度确定样品中的分子的位置x₀。实际上，借助本发明的第三实施方式在实践中以不超过1nm的数量级的误差确定样品6中的分子的位置x₀。

替代由发光12的强度I_L的强度I₁或I₂和饱和值I_SW确定另一位置区域324、325，零点20也可以布置在样品中的两个不同的位置x_N1a和x_N1b处，以便测量发光12的所属的强度并且然后可以由这两个强度和由强度I_L在至零点20的间距上的变化过程确定另一位置区域324、325，在此无需采用饱和值I_SW。

图11示出在激励光3的高斯强度分布的情况下的相应过程，所述强度分布在此没有达到饱和限界值导致发光12的高斯状的强度分布。在此，强度上升区域22处于高斯状的强度分布的边沿处。为了限界样品6中的分子的位置x₀的初始的位置区域23，在此将激励光3的高斯强度分布的重点326定位在两个不同的位置x_G1a和x_G1b处，从而在图11中左侧的强度上升区域22分别展开初始的位置区域23。对于这些位置x_G1a和x_G1b中的每个，记录分子的发光12的强度I_1a或I_1b。由强度I_1a和I_1b连同发光12的强度I_L在至重点326的间距上的变化过程一起确定更小的另一位置区域324，样品6中的分子的位置x₀处于所述另一位置区域中。在此需要考虑的是，图11不是以与图3和4相同的比例示出的，并且当以有利的方式在上升区域22中使用激励光3的尽可能低的强度以便尽可能少地使用分离的分子时，激励光3的强度分布I_AN的起始点的位置x_G1a、x_G1b需要布置得比零点20的位置x_N1、x_N2更远离样品中的分子的令人感兴趣的位置x₀。原因在于，对于激励光3的波长，激励光3的高斯强度分布具有衍射极限的半值宽度，并且激励光3的小的强度的区域约远离重点326的所述半值宽度，而在具有零点20的激励光3的强度分布的情况下在强度上升区域22中的激励光3的小的强度直接邻接零点20。

图12示出在垂直于根据图1的镜头5的光学轴线的xy平面中样品6中的分子的初始的位置区域23。环绕着所述位置区域，零点20的四个相等间距的位置绘制为根据图2的激励光3的强度分布的起始点。如果对于零点20的这些位置中的每个记录分子24的激励光的强度，那么可以由此确定另一位置区域324。在此，图12中所示的零点20的位置仅是可选的，这在在此在右上方示出的位置的情况下图解地说明。相应地，在本发明的第三实施方式的下一步骤中，可以通过将零点20定位在与其邻接的位置处将另一位置区域324进一步限制在另一位置区域325，其以还更小的误差说明样品6中的分子24的位置。在此，在图12中示出的零点20的位置中的一个是可选的，这再次在右上方图解地示出。

图13示出零点20相对于初始位置区域23和另一位置区域324以各三个等间隔的位置的另一种布置。这三个位置也包括每个空间方向x和y至少两个不同的位置，其中，在所述三个位置确定分子24的位置。

在图6和7中对于二维阐明的过程也可以扩展到三维。为此，对于每个位置区域23-325分别确定零点20的至少四个位置。

图14示出本发明的第三实施方式的构型的方框图。在开始328后，确定329初始的位置区域23。然后，对于确定的位置区域，确定330起始点(即零点20或重点326)的位置。在接下来的步骤331中，在将起始点布置在所述位置处的情况下使激励光3的强度分布对准样品6，并且记录由样品6中的分离的分子发射的发光。然后，必要时在附加地使用分子的发光的饱和值I_SW的情况下，基于在步骤331中检测到的发光的强度确定332另一位置区域324。接下来进行以下检查333：通过位置区域324的尺寸给定的精度是否已经满足对于所述精度的规定。如果检查333得出精度还不够高，那么重复步骤330-332，其中，在确定330时确定起始点相对于另一位置区域324的位置。如果检查333具有肯定的结果，那么达到用于确定样品6中的分子24的位置的方法的结束334。

图15是以下方法的方框图：在所述方法中在其步骤329-333方面重复实施根据图14的方法。在此，在开始328后，首先分离335分子。然后，在路线336中在使用步骤329-333的情况下对于分离的分子中的每个确定其位置。在检查337的情况下确定：是否已经以足够的详细度对以分子标记的结构进行成像。如果没有，那么从标记结构的分子重新分离几个分子。如果标记的结构在检查337时视为已经足够成像，那么达到结束334。

图16是重复地实施根据图14的步骤329-333的方框图，以便追踪样品6中的分离的分子24。为此，在开始328后，通过实施步骤329-333确定具有所期望的精度的分子24的瞬时位置。接下来，可选地进行等待338或立即重新确定样品6中的分子的当前位置。在每次以步骤329-333重复地确定分子24的位置的情况下，样品6中的分子24的最后确定的最小的位置区域可以中心地扩展到新的初始位置区域，所述初始位置区域用作用于重新实施步骤329-333的初始位置区域23。如此进行扩展最后确定的最小位置区域，使得分子24在此期间还不会已经运动出经扩展的位置区域。

附图标记列表

1 STED荧光显微镜

2 光源

3 激励光

4 射束成形装置

5 镜头

6 样品

7 光源

8 切换光

9 二向色的分束器

10 扫描仪

11 二向色的分束器

12 发光

13 光学系统

14 摄像机

15 二向色的分束器

16 点探测器

17 光阑

18 样品架

19 强度分布

20 激励光3的强度分布19的零点

21 最大值

22 强度上升区域

23 限界的位置区域

24 分子

25 圆弧

26 变化过程

27 变化过程26的零点

28 开始

29 分离

30 确定

31 程序

32 推导

33 循环

34 结束

35 循环

228 箭头

229 开始

230 分离

231 确定

232 确定

233 程序

234 移位

235 循环

236 路线

237 循环

238 循环

239 结束

324 另一位置区域

325 另一位置区域

326 激励光3的强度分布19的重点(起始点)

328 开始

329 确定

330 确定

331 步骤

332 确定

333 检查

334 结束

335 分离

336 路线

337 检查

338 等待

I_AN 激励光3的强度

I_L 发光12的强度

I_S 激励光3的饱和强度

I_SW 发光12的强度I_L的饱和值

a 间距

A 零点20的位置

B 零点20的位置

C 零点20的位置

D 零点20的位置

a_A 零点20的位置A与分子24的间距

a_B 零点20的位置B与分子24的间距

a_C 零点20的位置C与分子24的间距

a_D 零点20的位置D与分子24的间距

I_A 在零点20的位置A位置处的发光12的强度

I_B 在零点20的位置B位置处的发光12的强度

I_C 在零点20的位置C位置处的发光12的强度

I_D 在零点20的位置D位置处的发光12的强度

x₀ 样品6中的分子24的位置

x_N1 激励光3的强度分布19的零点20的位置

x_N2 激励光3的强度分布19的零点20的位置

x_G1a 激励光3的强度分布19的重点326的位置

x_G1b 激励光3的强度分布19的重点326的位置

Claims

1.一种用于高空间分辨率地确定在样品(6)中在一个或多个空间方向上分离的分子(24)的位置的方法，其中，所述分子(24)能够以激励光(3)激励以发射发光(12)，

其中，使所述激励光(3)以以下强度分布(19)对准所述样品(6)：所述强度分布具有零点(20)和强度上升区域(22)，所述强度上升区域在所述空间方向中的每个空间方向上在两侧邻接所述零点(20)，

其中，对于在所述样品(6)中所述零点(20)的不同位置中的每个位置，记录由所述分子(24)发射的发光(12)，

其中，由对于所述零点(20)的不同位置记录的发光(12)的强度推导出所述样品(6)中的所述分子(24)的位置；

其特征在于，所述零点(20)布置在所述样品(6)中的不超过n×3个不同位置处，以便由所述发光(12)的对于所述零点(20)的不同位置记录的强度推导出在所述n个空间方向上所述分子(24)的位置，其中，n是以下空间方向的数量：在所述空间方向上确定所述样品中所述分子(24)的位置，其中，所述不同位置——在所述样品(6)中所述零点(20)布置在所述不同位置处——在每个空间方向上在所述样品中的限界的位置区域(23)的中心的两侧上包括各一个位置，其中，在所述每个空间方向上确定所述样品(6)中的所述分子(24)的位置，所述分子(24)布置在所述限界的位置区域中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述零点(20)布置在所述样品中的不超过(n×2)+1个不同位置处，以便由所述发光(12)的对于所述零点(20)的不同位置记录的强度推导出在所述n个空间方向上所述分子(24)的位置。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述零点(20)布置在所述样品中的不超过n+2个不同位置处，以便由所述发光(12)的对于所述零点(20)的不同位置记录的强度推导出在所述n个空间方向上所述分子(24)的位置。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，除了所述限界的位置区域(23)的中心的两侧上的两个位置以外，所述不同位置——在所述样品(6)中所述零点(20)布置在所述不同位置处——在每个空间方向上包括在所述限界的位置区域(23)的中心上的一个位置(D)，其中，在所述每个空间方向上确定所述样品(6)中的所述分子的位置。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，当在两个空间方向上确定所述分子(24)的位置时，所述不同位置——在所述样品(6)中在所述不同位置处布置所述零点(20)——是一个中心位置(D)和三个外围位置，其中，所述外围位置在由所述两个空间方向展开的并且延伸通过所述中心位置的平面中等间距地布置在围绕所述中心位置的圆弧(25)上。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，当在三个空间方向上确定所述分子(24)的位置时，所述不同位置——在所述样品(6)中在所述不同位置处布置所述零点(20)——是一个中心位置和四个外围位置，其中，所述外围位置等间距地布置在围绕所述中心位置的球壳体上。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，如此调节所述激励光(3)的最大强度，使得所述零点(20)的每个位置至所述样品(6)中的所述零点(20)的所述位置之间的每个点的最大间距(a)不大于每个强度上升区域(22)在所述最大间距(a)的方向上的延展，在所述延展上所述激励光(3)的强度上升至所述激励光(3)的饱和强度(I_S)的90％。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，邻接所述零点(20)的所述强度上升区域(22)绕着所述零点(20)旋转对称地构造。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述激励光(3)在所述激励光的波长和/或偏振的方面和/或邻接所述零点(20)的强度上升区域(22)在所述激励光(3)的强度在不同空间方向上的变化过程方面根据所述零点(20)的相应位置不同地构造。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述激励光(3)和/或邻接所述零点(20)的强度上升区域(22)根据所述零点的相应位置如此不同地构造，使得在每个空间方向上以相同的精度在所述零点(20)的所述位置之间的每个点处确定所述分子(24)的位置。

11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，对于所述零点(20)的所述位置几乎同时地记录所述发光(12)，其方式是：使所述零点(20)在所述位置之间反复地移位。

12.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，对于所述零点的所述位置仅如此长时间地记录所述发光(12)，直至以足够的精度对于所述零点(20)的所述位置检测所记录的发光(12)的强度，从而能够以预给定的精度确定所述分离的分子(24)的位置。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述预给定的精度处于0.5nm至20nm之间的范围内。

14.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，在确定所述分离的分子(24)的位置的开始时，以所述零点(20)或所述激励光(3)的高斯强度分布在所述空间方向中的每个空间方向上扫描所述样品(6)的包括所述分离的分子(24)的区域，其中，由所述发光(12)的强度(I_L)的变化过程在所述扫描期间估计所述分离的分子(24)的位置并且将所估计的位置作为确定所述样品(6)中的所述零点(20)的位置的基础。

15.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，在确定所述分离的分子(24)的位置的开始时，所述激励光(3)以高斯强度分布(19)逐点地或以圆形路径或螺旋路径对准所述样品(6)的包括所述分离的分子(24)的区域，其中，由所述发光(12)的强度(I_L)在所述点或路径上的变化过程估计所述分离的分子(24)的位置，并且将所估计的位置作为确定所述样品(6)中的零点(20)的位置的基础。

16.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，在确定所述分离的分子(24)的位置的开始时，在空间上给所述样品(6)的包括所述分离的分子(24)的区域施加所述激励光(3)，并且将所述区域成像到空间分辨探测器上，其中，由借助所述探测器记录的发光(12)的空间分布估计所述分离的分子(24)的位置，并且将所估计的位置作为确定所述样品(6)中的所述零点(20)的位置的基础。

17.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，以所述样品(6)中的所述零点(20)的所述位置的缩小的间距重复地实施所述方法，其中，在每次重复所述方法的情况下，所述样品(6)中的所述零点(20)的所述位置环绕所述样品(6)中的所述分子(24)的以下位置地布置：所述位置在先前实施所述方法的情况下已经由所述发光(12)的所记录的强度推导出。

18.一种用于高空间分辨率地确定(31)样品(6)中的一个或多个空间方向上的分离的分子(24)的位置的方法，其中，所述分子(24)能够以激励光(3)激励以发射发光(12)，

其中，使所述零点(20)在所述样品中在所述空间方向中的每个空间方向上移位，其中，对于所述样品(6)中的所述零点(20)的每个位置记录由所述分子(24)发射的发光(12)；

其特征在于，

确定所述样品(6)中的初始位置区域(23)，所述分子(24)布置在所述位置区域中；

在所述空间方向中的每个空间方向上如此确定所述零点(20)的至少一个初始位置，使得所述初始位置在相应空间方向上处于所述初始位置区域(23)的一侧上；

对于所述零点(20)的分配给所述所有空间方向的位置几乎同时地记录所述发光(12)，其方式是：使所述零点(20)在所述位置之间反复地移位；

所述发光(12)的根据对于所述位置中的每个位置记录的光子使所述零点(20)的位置逐步地向里移位到所述初始位置区域(23)中。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，根据对于所述位置中的每个位置记录的发光(12)的光子的速率或时间间距使所述零点(20)的位置逐步地向里移位到所述初始位置区域(23)中。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述零点(20)的位置的数量处于n至2n之间，其中，n是以下空间方向的数量：在所述空间方向上定位所述分子(24)。

21.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，在所述空间方向中的至少一个空间方向上，

使所述样品(6)中的所述分子(24)的位置等同于所述零点(20)的分配给所述相应空间方向的位置：在所述相应空间方向上在所述零点(20)记录的所述发光(12)的光子的速率是最小的；或者

由所述发光(12)的以下光子的速率或时间间距推导出所述样品(6)中的所述分子(24)的位置：对于所述零点(20)的至少一个分配给相应空间方向的位置记录所述光子。

22.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，

所述零点(20)的所述初始位置对于所述空间方向中的每个空间方向包括两个位置，所述两个位置在相应空间方向上处于所述初始位置区域(23)的两侧上；并且

通过根据对于所有位置确定的所述发光(12)的光子的速率或时间间距使所述零点(20)的分配给所有空间方向的位置逐步地移位(234)使所述分子(24)的保持在所述零点(20)的所述位置之间的位置区域逐步地变窄。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，使所述分子(24)的保持在所述零点的所述位置之间的位置区域逐步地变窄，直至所述位置区域的尺寸不再大于预给定的精度。

24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述预给定的精度处于0.5nm至20nm之间的范围内或处于1nm至10nm之间的范围内。

25.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，在所述空间方向中的每个空间方向上邻接所述零点(20)的所述强度上升区域(22)相对于所述零点(20)对称地构造。

26.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，一旦在当前位置处平均已经记录所述发光(12)的p个光子，就使所述零点(20)的分配给所述所有空间方向的位置中的至少一个位置移位，其中，p不大于30、20、10或5。

27.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，一旦在目前位置处总共已经记录所述发光(12)的n×q个光子，就使所述零点(20)的分配给所有空间方向的位置中的至少一个位置移位，其中，n是以下空间方向的数量：在所述空间方向上确定所述样品(6)中的所述分子(24)的位置，其中，q不大于50、25或5。

28.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，一旦在目前位置处已经记录所述发光(12)的m个光子，就使每个零点(20)的位置移位，其中，m不大于30、20、10、5或3。

29.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，如此调节所述激励光(3)的最大强度，使得关于所述零点(20)的每个位置所述初始位置区域(23)处于不超过所述激励光(3)的饱和强度(I_S)的90％的范围内。

30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，借助所述零点(20)的所述位置的移位(234)逐步地提高所述激励光(3)的绝对强度。

31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，如此提高所述激励光(3)的绝对强度，使得对于所述零点(20)的所有相应位置记录的光子的速率至少暂时保持相等。

32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，使所述激励光(3)的绝对强度总体上提高至少50％。

33.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，在确定(31)所述分离的分子(24)的位置的开始时，以所述零点(20)或所述激励光(3)的高斯强度分布(19)在所述空间方向中的每个空间方向上扫描所述样品(6)的包括所述分离的分子(24)的区域，其中，由所述发光(12)的强度(I_L)在所述扫描期间的变化过程确定所述初始位置区域(23)。

34.一种用于高空间分辨率地确定在样品(6)中在一个或多个空间方向上分离的分子(24)的位置的方法，其中，所述分子(24)能够以激励光(3)激励以发射发光(12)，

其中，使所述激励光(3)以以下强度分布(19)对准所述样品(6)：所述强度分布在所述空间方向中的每个空间方向上具有至少一个强度上升区域(22)，所述强度上升区域具有所述激励光(3)的强度在与所述强度分布(19)的起始点的间距上已知的、严格单调的变化过程，

其中，所述强度分布(19)的起始点在所述空间方向中的每个空间方向上布置在所述样品(6)中的不同位置处，

其中，对于所述样品(6)中所述强度分布(19)的起始点的每个位置，记录由所述分子(24)发射的发光(12)，

其中，由所记录的发光(12)的强度推导出所述样品中的所述分子的位置(x₀)；

其特征在于，

确定所述样品(6)中的初始位置区域(23)，所述分子(24)布置在所述初始位置区域中；

(i)在所述空间方向中的每个空间方向上如此确定所述强度分布(19)的起始点的至少一个位置，使得所述至少一个强度上升区域(22)在相应空间方向上在所述初始位置区域(23)上延伸，

(ii)由所述发光(12)的强度值确定所述样品(6)中的另一位置区域(324，325)，所述强度值在所述空间方向中的每个空间方向上包括两个强度值，所述两个强度值中的一个说明对于所述强度分布(19)的起始点的至少一个位置记录的发光(12)的强度，在所述另一位置区域中布置有所述分子(24)并且所述另一位置区域小于所述初始位置区域(23)，

在所述另一位置区域用作新的初始位置区域(23)的情况下重复所述步骤(i)和(ii)至少一次。

35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，所述激励光(3)的强度在所述至少一个强度上升区域(22)中从零上升。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述起始点是所述强度分布(19)的零点(20)，另一强度上升区域(22)在所述空间方向中的一个空间方向上在所述至少一个强度上升区域(22)的一侧上并且在相对置的一侧上邻接所述零点。

37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述至少一个强度上升区域(22)和所述另一强度上升区域(22)相对于所述零点(20)对称地构造。

38.根据权利要求34或35所述的方法，其特征在于，对于所述相应空间方向的第二强度值是对于所述强度分布(19)的起始点的第二位置记录的发光(12)的强度(I_1b)，其在所述相应空间方向上处在与所述强度分布(19)的所述起始点的至少一个位置相同的一侧上的其他位置处或处在所述初始位置区域(23)的与所述强度分布(19)的所述起始点的至少一个位置相对置的一侧上。

39.根据权利要求34或35所述的方法，其特征在于，在每次实施所述步骤(i)时确定的位置的数量处于n+1至2n之间，其中，n是以下空间方向的数量，在所述空间方向上定位所述分子(24)。

40.根据权利要求34或35所述的方法，其特征在于，对于所述相应空间方向的第二强度值是在以所述激励光(3)进行激励时所述分子(24)的所述发光(12)的所述强度(I_L)的饱和值(I_SW)。

41.根据权利要求34或35所述的方法，其特征在于，对于所述强度分布(19)的起始点的位置几乎同时记录所述发光(12)，其方式是：使所述起始点在所述位置之间反复地移位。

42.根据权利要求34或35所述的方法，其特征在于，对于所述强度分布(19)的起始点的位置仅如此长时间地记录所述发光(12)，直至对于所述位置以足够的精度检测所记录的发光(12)的强度，从而能够确定所述另一位置区域(324，325)比所述初始位置区域(23)小预给定的值。

43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述预给定的值处于5％至75％的范围内，所述另一位置区域(324，325)在所述相应空间方向上能够确定比所述初始位置区域(23)小所述预给定的值。

44.根据权利要求34或35所述的方法，其特征在于，如此调节所述激励光(3)的最大强度，使得关于所述强度分布(19)的起始点的每个位置所述初始位置区域(23)处于不超过所述激励光(3)的饱和强度(IS)的90％的区域内。

45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，至少一次重复所述步骤(i)和(ii)提高所述激励光(3)的最大强度。

46.根据权利要求45所述的方法，其特征在于，通过所述步骤(i)和(ii)的所有重复使所述激励光(3)的最大强度提高至少50％。

47.根据权利要求34或35所述的方法，其特征在于，一直重复所述步骤(i)和(ii)，直至所述另一位置区域(324，325)不大于预给定的精度。

48.根据权利要求47所述的方法，其特征在于，所述预给定的精度处于0.5nm至20nm之间的区域内。

49.根据权利要求34或35所述的方法，其特征在于，在确定所述分离的分子(24)的位置的开始时在所述空间方向上中的每个空间方向上以所述激励光(3)的至少一个强度上升区域(22)或高斯强度分布(19)扫描所述样品(6)的包括所述分离的分子(24)的区域，其中，由所述发光(12)的所述强度(I_L)在所述扫描期间的变化过程确定所述初始位置区域(23)。

50.根据权利要求18或19或34或35所述的方法，其特征在于，在确定所述分离的分子(24)的位置的开始时使所述激励光(3)以高斯强度分布(19)逐点地或以圆形路径或螺旋路径对准所述样品(6)的包括所述分离的分子(24)的区域，其中，由所述发光(12)的所述强度(I_L)在所述点或路径上的变化过程确定所述初始位置区域(23)。

51.根据权利要求18或19或34或35所述的方法，其特征在于，在确定所述分离的分子(24)的位置的开始时在空间上给所述样品(6)的包括所述分离的分子(24)的区域施加所述激励光(3)并且将所述区域成像到空间分辨探测器上，其中，由以所述探测器记录的发光(12)的空间分布确定所述初始位置区域(23)。

52.根据权利要求1至4中任一项或18或19或34或35所述的方法，其特征在于，以空间分辨率记录所述发光(12)，其中，在所述样品(6)中的所述分子(24)的位置方面附加地分析处理在总体上记录的发光(12)的空间分布。

53.根据权利要求1至4中任一项或18或19或34或35所述的方法，其特征在于，在确定所述分离的分子(24)的位置前给所述样品(6)施加切换信号，所述切换信号使所述分子(24)与相邻的同类分子分离，其方式是：所述相邻的同类分子(24)在所述分离后——与所述分离的分子(24)相反——不能够以所述激励光(3)激励以发射发光(12)。

54.根据权利要求1至4中任一项或18或19或34或35所述的方法，重复地实施所述方法，以便确定多个彼此分离的、能够以所述激励光(3)激励以发射所述发光(12)的分子(24)的位置，所述分子标记所述样品(6)中令人感兴趣的结构。

55.根据权利要求1至4中任一项或18或19或34或35所述的方法，重复地实施所述方法，以便跟踪在所述样品(6)中运动的分离的分子(24)。

56.STED扫描荧光显微镜(1)的应用，用于实施根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中，通过所述STED扫描荧光显微镜(1)提供的STED光用作所述激励光(3)。