JP2019534998A - ルミネセンス光を放射するように励起光により励起可能な、試料中の単離分子の位置を空間的に高分解能に確定するための方法 - Google Patents
ルミネセンス光を放射するように励起光により励起可能な、試料中の単離分子の位置を空間的に高分解能に確定するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
励起光が、ゼロ箇所と強度上昇領域を有する強度分布をもって試料に指向され、前記強度上昇領域は前記空間方向の各々においてゼロ箇所に両側で隣接する。試料中のゼロ箇所の種々の位置の各々について、分子から放射されたルミネセンス光が記録され、試料中の分子の位置が、ゼロ箇所の種々の位置について記録されたルミネセンス光の強度から導出される。ここで分子の位置をn個の空間方向において、ゼロ箇所の種々の位置について記録されたルミネセンス光の強度から導出するために、ゼロ箇所は、試料中のn×3以下の異なる位置に配置される。
本発明の方法を、単離分子の位置を高い空間分解能で確定するために用いることは、10nmの達成可能な精度から理解されるように、励起光およびルミネセンス光の波長における回折限界よりも格段に下の空間分解能が格段に良好に、容易に達成されることを意味する。この関連から、文言“空間分解能”とは、ここでは、試料中のそれぞれの単離分子の位置を確定する精度に対する同義語として使用されることに注意されたい。
以下、本発明を、図面に示された好ましい実施例に基づき更に説明し記述する。
図1は、本発明の方法を実施することのできるSTED蛍光顕微鏡1を概略的に示す。本発明の方法を実施する際に、STED蛍光顕微鏡1の全ての構成部分を必ずしも使用する必要はない。しかしSTED蛍光顕微鏡1は、本発明の方法を実施するために必要な構成部分の全てを含む。STED蛍光顕微鏡1の通常の使用では、STEDビームを提供する光源2は、本発明の方法を実施するためにSTED蛍光顕微鏡1を使用する場合、励起光3を提供する。光線形成手段4により励起光3は、これが対物レンズ5の焦点において、少なくとも1つの強度上昇領域を備える強度分布を有するように形成される。本発明の方法の一構成では、励起光3は、対物レンズ5の焦点にゼロ箇所を備える強度分布を有し、このゼロ箇所には、試料6中の単離分子の位置を確定すべき全ての空間方向において両側で強度最大値が隣接している。そして、この強度最大値の側縁は、本発明の全ての方法において使用される強度上昇領域を形成する。光線形成手段4は、もっぱら受動型コンポーネントを含むが、能動型光学系、例えば空間光変調器(SLM)を含むこともできる。STED蛍光顕微鏡1のさらなる光源7は、その通常の使用では励起光を提供するが、本発明の方法の実施の際には、試料6中の分子を単離するために切替光8を提供することができ、試料中の分子の位置が引き続き確定される。ここで分子の単離は、別の同種の分子が切替光8により暗状態に切り替えられ、この暗状態ではこれら分子が励起光3によってルミネセンス光を放射するように励起できないことに基づくことできる。切替光8は、励起光3の光線路に入力結合され、そのためにここでは二色性ビームスプリッタ9が設けられている。スキャナ10により励起光3の上昇領域ないしゼロ箇所が試料6中でシフトされる。試料6からスキャナ10の前方に配置された二色性ビームスプリッタ11を介して、試料6からのルミネセンス光12は励起光3の光線路から出力結合され、光学系13によりカメラ14に結像される。カメラ14は、ルミネセンス光12のための空間分解能のある検出器の一例である。これとは択一的に、二色性ビームスプリッタ15により試料6からのルミネセンス光12は、ピンホール17が前置されたポイント検出器16に供給される。試料6からのルミネセンス光12は、励起光3によりルミネセンス光の放射が励起される単離分子から由来する。ルミネセンス光のこの放射の基礎となる過程は光ルミネセンス、とりわけ蛍光性である。試料6は、試料ホルダ18上に配置されている。試料ホルダ18により試料は、例えば付加的にz方向に、すなわち対物レンズ5の光軸の方向に移動することができ、これにより励起光3の強度上昇領域ないし強度分布のゼロ箇所を試料中でこの方向にも、とりわけゼロ箇所に、z方向でも強度最大値が隣接している場合には、移動することができる。カメラ14には試料6が、分子からのルミネセンス光12の光子の空間的分布から単離分子の局在化がカメラ14を介して可能であるように結像される。しかし本発明の全ての方法において、少なくとも付加的に、試料6中の分子の位置は、励起光の強度上昇領域ないし強度分布のゼロ箇所が試料6中に種々異なって配置される場合、ルミネセンス光12の強度に基づいて確定される。
1 STED蛍光顕微鏡
2 光源
3 励起光
4 光線形成手段
5 対物レンズ
6 試料
7 光源
8 切替光
9 二色性ビームスプリッタ
10 スキャナ
11 二色性ビームスプリッタ
12 ルミネセンス光
13 光学系
14 カメラ
15 二色性ビームスプリッタ
16 ポイント検出器
17 ピンホール
18 試料ホルダ
19 強度分布
20 励起光3の強度分布19のゼロ箇所
21 最大値
22 強度上昇領域
23 制限された位置領域
24 分子
25 円弧
26 経過
27 経過26のゼロ箇所
28 スタート
29 単離
30 確定
31 プロシージャ
32 導出
33 ループ
34 終了
35 ループ
228 矢印
229 スタート
230 単離
231 確定
232 設定
233 プロシージャ
234 シフト
235 ループ
236 ルーティン
237 ループ
238 ループ
239 終了
324 さらなる位置領域
325 さらなる位置領域
326 励起光3の強度分布19の重心(基点)
328 スタート
329 確定
330 設定
331 ステップ
332 確定
333 検査
334 終了
335 単離
336 ルーティン
337 検査
338 待機
IA 励起光3の強度
IL ルミネセンス光12の強度
IS 励起光3の飽和強度
ISW ルミネセンス光12の強度ILの飽和値
a 間隔
A ゼロ箇所20の位置
B ゼロ箇所20の位置
C ゼロ箇所20の位置
D ゼロ箇所20の位置
aA 分子24からのゼロ箇所20の位置Aの間隔
aB 分子24からのゼロ箇所20の位置Bの間隔
aC 分子24からのゼロ箇所20の位置Cの間隔
aD 分子24からのゼロ箇所20の位置Dの間隔
IA ゼロ箇所20の位置Aにおけるルミネセンス光12の強度
IB ゼロ箇所20の位置Bにおけるルミネセンス光12の強度
IC ゼロ箇所20の位置Cにおけるルミネセンス光12の強度
ID ゼロ箇所20の位置Dにおけるルミネセンス光12の強度
x0 試料6中の分子24の位置
xN1 励起光3の強度分布19のゼロ箇所の位置
xN2 励起光3の強度分布19のゼロ箇所の位置
xG1a 励起光3の強度分布19の重心326の位置
xG1b 励起光3の強度分布19の重心326の位置
Claims (57)
- 試料(6)中の1つまたは複数の空間方向において単離分子(24)の位置を高い空間分解能で確定するための方法であって、前記分子(24)は、励起光(3)によりルミネセンス光(12)を放射するように励起可能であり、
前記励起光(3)は、ゼロ箇所(20)および強度上昇領域(22)を有する強度分布(19)をもって前記試料(6)に指向され、前記強度上昇領域は前記空間方向の各々において前記ゼロ箇所(20)に両側で隣接し、
試料(6)中の前記ゼロ箇所(20)の種々の位置(A〜D)の各々について、前記分子(24)から放射されるルミネセンス光(12)が記録され、
前記試料(6)中の分子(24)の位置が、前記ゼロ箇所(20)の種々の位置(A〜D)について記録されたルミネセンス光(12)の強度(IA〜ID)から導出される、
方法において、
前記分子(24)の位置を、n個の空間方向において前記ゼロ箇所(20)の種々の位置(A〜D)について記録されたルミネセンス光(12)の強度(IA〜ID)から導出するために、前記ゼロ箇所(20)は、試料(6)中のn×3以下の異なる位置(A〜D)に配置される、ことを特徴とする方法。 - 前記分子(24)の位置を、n個の空間方向において前記ゼロ箇所(20)の種々の位置(A〜D)について記録されたルミネセンス光(12)の強度(IA〜ID)から導出するために、前記ゼロ箇所(20)は、試料(6)中の(n×2)+1以下の異なる位置(A〜D)に配置される、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記分子(24)の位置を、n個の空間方向において前記ゼロ箇所(20)の種々の位置(A〜D)について記録されたルミネセンス光(12)の強度(IA〜ID)から導出するために、前記ゼロ箇所(20)は、試料(6)中のn+2以下の異なる位置(A〜D)に配置される、ことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記ゼロ箇所(20)が試料(6)中に配置される前記種々の位置(A〜D)は、試料(6)中の分子(24)の位置が確定される各空間方向において、試料中に分子(24)が配置された制限された位置領域(23)の中心の両側に各1つの位置(A〜C)を含む、ことを特徴とする請求項2または3に記載の方法。
- 前記ゼロ箇所(20)が試料(6)中に配置される前記種々の位置(A〜D)は、試料(6)中の分子(24)の位置が確定される各空間方向において、制限された位置領域(23)の中心の両側にある2つの位置(A〜C)の他に、制限された位置領域(23)の中心にある1つの位置(D)を含む、ことを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記ゼロ箇所(20)が試料(6)中に配置される前記種々の位置(A〜D)は、分子(24)の位置が2つの空間方向で確定される場合、1つの中心位置(D)と3つの周辺位置(A〜C)であり、
前記周辺位置(A〜C)は、2つの空間方向により張架され、前記中心位置を通って延在する平面内において、前記中心位置を中心にする円弧(25)上に等間隔に配置される、ことを特徴とする請求項4および5に記載の方法。 - 前記ゼロ箇所(20)が試料(6)中に配置される前記種々の位置は、分子(24)の位置が3つの空間方向で確定される場合、1つの中心位置と4つの周辺位置であり、
前記周辺位置は、前記中心位置を中心にして配置された球殻上に等間隔に配置される、ことを特徴とする請求項4および5に記載の方法。 - 前記励起光(3)の最大強度は、ゼロ箇所(20)の各位置(A〜D)から、試料(6)中の前記ゼロ箇所(20)の(複数)位置(A〜D)の間の各点までの最大間隔が、間隔(a)の方向での各強度上昇領域(22)の広がり以下であるように調節され、前記広がりにわたって励起光(3)の強度は、励起光(3)の飽和強度(IS)の90%まで上昇する、ことを特徴とする請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゼロ箇所(20)に隣接する強度上昇領域(22)は、ゼロ箇所(20)を中心にして回転対称に構成される、ことを特徴とする請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 励起光(3)は、その波長および/または偏光に関して、および/またはゼロ箇所(20)に隣接する強度領域は、種々の空間方向における励起光(3)の強度(IA)の経過に関して、ゼロ箇所(20)のそれぞれの位置(A〜D)に依存して異なって構成される、ことを特徴とする請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記励起光(3)、および/または前記ゼロ箇所(20)に隣接する強度上昇領域(22)は、ゼロ箇所のそれぞれの位置(A〜D)に依存して、ゼロ箇所(20)の(複数)位置(A〜D)の間の各点にある分子(24)の位置が各空間方向において同じ精度で確定されるように異なって構成される、ことを特徴とする請求項10に記載の方法。
- ルミネセンス光(12)は、ゼロ箇所(20)を位置(A〜D)の間で反復してシフトすることにより、前記ゼロ箇所(20)の位置(A〜D)について疑似的に同時に記録される、ことを特徴とする請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- ルミネセンス光(12)はゼロ箇所の位置(A〜D)について、当該ゼロ箇所(20)の位置(A〜D)について記録されるルミネセンス光(12)の強度(IA〜ID)が十分な精度で検出されるまで記録され、単離分子(24)の位置は所定の精度で確定可能である、ことを特徴とする請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記所定の精度は、0.5から20nmの間の範囲にある、ことを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 単離分子(24)を含む試料(6)の領域が、単離分子(24)の位置の確定の開始時に、ゼロ箇所(20)または励起光(3)のガウス状の強度分布をもって各空間方向で走査され、
走査中のルミネセンス光(12)の強度(IL)の経過から単離分子の位置が推定され、当該推定された位置は試料(6)中のゼロ箇所(20)の位置(A〜D)の設定の基礎とされる、ことを特徴とする請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。 - 励起光(3)が、単離分子(24)の位置の確定の開始時に、ガウス状の強度分布(19)をもって点ごとに、または円軌道ないしスパイラル軌道で、単離分子(24)を含む試料(6)の領域に指向され、
単離分子(24)の位置が、ルミネセンス光(12)の強度(IL)の経過から、点ないし軌道を介して推定され、当該推定された位置は試料(6)中のゼロ箇所(20)の位置(A〜D)の設定の基礎とされる、ことを特徴とする請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。 - 単離分子(24)を含む試料(6)の領域には、単離分子(24)の位置の確定の開始時に、励起光(3)が空間的に印加され、空間分解能のある検出器に結像され、
前記検出器により記録されたルミネセンス光(12)の空間的分布から単離分子(24)の位置が推定され、当該推定された位置が試料(6)中のゼロ箇所(20)の位置(A〜D)の設定の基礎とされる、ことを特徴とする請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項1から17のいずれか一項に記載の方法を、試料(6)中のゼロ箇所(20)の位置(A〜D)の間隔を小さくしながら反復実施することであって、
試料(6)中のゼロ箇所(20)の位置(A〜D)が、本方法の各反復の際に、本方法の先行の実施の際にルミネセンス光(12)の記録された強度(IA〜ID)から導出された、試料(6)中の分子(24)の位置の周囲に配置される、反復実施。 - 試料(6)中の1つまたは複数の空間方向において単離分子(24)の位置を高い空間分解能で確定(31)するための方法であって、前記分子(24)は、励起光(3)によりルミネセンス光(12)を放射するように励起可能であり、
前記励起光(3)は、ゼロ箇所(20)および強度上昇領域(22)を有する強度分布をもって前記試料(6)に指向され、前記強度上昇領域は前記空間方向の各々において前記ゼロ箇所(20)に両側で隣接し、
前記ゼロ箇所(20)は、各空間方向において試料中でシフトされ、
試料(6)中の前記ゼロ箇所(20)の各位置(A〜D)について、前記分子(24)から放射されるルミネセンス光(12)が記録される、方法において、
前記分子(24)が配置された試料(6)中の初期位置領域が決定され、
各空間方向においてゼロ箇所(20)の少なくとも1つの初期位置(A,B,C)が、当該初期位置がそれぞれの空間方向において前記初期位置領域(23)の片側に来るように設定され、
前記ルミネセンス光(12)は、ゼロ箇所(20)を位置(A,B,C)の間で反復してシフトすることにより、全ての空間方向に割り当てられた前記ゼロ箇所(20)の位置(A,B,C)について疑似的に同時に記録され、
前記ゼロ箇所(20)の位置(A,B,C)は、各位置(A,B,C)について記録されたルミネセンス光(12)の光子に依存して、前記初期位置領域(23)に漸次入るようにシフトされる、ことを特徴とする方法。 - 前記ゼロ箇所(20)の位置(A,B,C)は、各位置(A,B,C)について記録されたルミネセンス光(12)の光子に依存して、前記初期位置領域(23)に漸次入るようにシフトされる、ことを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 前記ゼロ箇所(20)の位置(A,B,C)の数は、nから2nの間であり、nは、分子(14)が局在化される空間方向の数である、ことを特徴とする請求項19または20に記載の方法。
- 空間方向の少なくとも1つにおいて、試料(6)中の分子(24)の位置は、
それぞれの空間方向に割り当てられたゼロ箇所(20)の位置(A,B,C)であって、前記ゼロ箇所(20)について記録されるルミネセンス光(12)の光子の割合が最小化されている当該位置と同一であるとされ、または
それぞれの空間方向の少なくとも1つに割り当てられたゼロ箇所(20)の位置(A,B,C)について記録されるルミネセンス光(12)の光子の割合若しくは時間的間隔から導出される、ことを特徴とする請求項19から21のいずれか一項に記載の方法。 - ゼロ箇所(20)の初期位置(A,B,C)は、各空間方向について、それぞれの空間方向で前記初期位置領域(23)の両側にある2つの位置を含み、
全ての空間方向に割り当てられたゼロ箇所(20)の位置(A,B,C)を、ルミネセンス光(12)の光子の、全ての位置を確定するための割合または時間的間隔に依存して漸次シフトすることにより、ゼロ箇所(20)の位置(A,B,C)の間に残った分子(24)の位置領域が漸次狭められる、ことを特徴とする請求項19から22のいずれか一項に記載の方法。 - ゼロ箇所の位置(A,B,C)の間に残った分子(24)の位置領域は、その寸法が所定の精度以下になるまで漸次狭められる、ことを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 前記所定の精度は、0.5から20nmの間の範囲または1nmから10nmの範囲にある、ことを特徴とする請求項24に記載の方法。
- 各空間方向において前記ゼロ箇所(20)に隣接する強度上昇領域(22)は、前記ゼロ箇所(20)に対して回転対称に構成される、ことを特徴とする請求項19から25のいずれか一項に記載の方法。
- 全て空間方向に割り当てられたゼロ箇所(20)の位置(A,B,C)の少なくとも1つは、これまでの位置においてルミネセンス光(12)の平均でp個の光子が記録されると直ちにシフトされ、ここでpは30,20,10または5以下である、ことを特徴とする請求項19から26のいずれか一項に記載の方法。
- 全ての空間方向に割り当てられたゼロ箇所(20)の位置(A,B,C)の少なくとも1つは、これまでの位置において全部でn×q個のルミネセンス光(12)の光子が記録されると直ちにシフトされ、ここでnは、試料(6)中の分子(24)の位置が確定される空間方向の数であり、qは50,25、または5以下である、ことを特徴とする請求項19から27のいずれか一項に記載の方法。
- 各ゼロ箇所(20)の位置(A,B,C)は、これまでの位置においてルミネセンス光(12)のm個の光子が記録されると直ちにシフトされ、ここでmは30,20,10、5または3以下である、ことを特徴とする請求項19から28のいずれか一項に記載の方法。
- 励起光(3)の最大強度(IA)は、初期位置領域(23)がゼロ箇所(20)の各位置を基準にして、励起光(3)の飽和強度(IS)の90%以下の領域に存在するように調整される、ことを特徴とする請求項19から29のいずれか一項に記載の方法。
- 励起光(3)の絶対強度(IA)は、ゼロ箇所(20)の位置(A,B,C)のシフト(234)によって漸次高められる、ことを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 励起光(3)の絶対強度(IA)は、ゼロ箇所(20)のそれぞれ全ての位置(A,B,C)について記録された光子の割合が、少なくとも一次的に同じに留まるように高められる、ことを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 励起光(3)の絶対強度(IA)は、全体で少なくとも50%だけ高められる、ことを特徴とする請求項31または32に記載の方法。
- 単離分子(24)を含む試料(6)の領域が、単離分子(24)の位置の確定の開始時に、ゼロ箇所(20)または励起光(3)のガウス状の強度分布をもって各空間方向で走査され、
走査中のルミネセンス光(12)の強度(IL)の経過から、初期位置領域(23)が決定される、ことを特徴とする請求項19から33のいずれか一項に記載の方法。 - 試料(6)中の1つまたは複数の空間方向において単離分子(24)の位置を高い空間分解能で確定するための方法であって、前記分子(24)は、励起光(3)によりルミネセンス光(12)を放射するように励起可能であり、
励起光(3)が強度分布(19)をもって試料(6)に指向され、前記強度分布は、空間方向の各々において、強度分布(19)の基点(20)までの間隔にわたって励起光(3)の強度(IA)が既知の厳密に単調に経過する少なくとも1つの強度上昇領域を有し、
前記強度分布(19)の基点(20,326)は、各空間方向において前記試料(6)中の種々異なる位置に配置され、
前記試料(6)中の前記強度分布(19)の基点(20,326)の各位置について、前記分子(24)から放射されるルミネセンス光(12)が記録され、
前記試料(x0)中の分子の位置が、記録されたルミネセンス光(12)の強度から導出される、
方法において、
試料(6)中の前記分子(24)が配置された初期位置領域が決定され、
(i)空間方向の各々において強度分布(19)の基点(20,326)の少なくとも1つの位置が、少なくとも1つの強度上昇領域(22)がそれぞれの空間方向において前記初期位置領域(23)にわたって伸長するように設定され、
(ii)各空間方向について2つの強度値(I1,ISWないしI1a,I1b)を含み、これら強度値の一方(I1ないしI1a)が強度分布(19)の基点の少なくとも1つの位置について記録されたルミネセンス光(12)の強度を指示する、ルミネセンス光(12)の強度値(I1,ISW,I1a,I1b)から、分子(24)が配置されており、かつ前記初期位置領域よりも小さい、試料(6)中のさらなる位置領域(324,325)が決定され、
前記ステップ(i)と(ii)は、前記さらなる位置領域を新たな開始位置領域(23)として使用して、少なくとも一度繰り返される、ことを特徴とする方法。 - 前記励起光(3)の強度(IA)は、少なくとも1つの強度上昇領域(22)においてゼロから上昇する、ことを特徴とする請求項35に記載の方法。
- 前記基点は、強度上昇領域(19)のゼロ箇所(20)であり、前記ゼロ箇所には、空間方向の各々において片側に少なくとも1つの強度上昇領域(22)が続いており、対向する側にさらなる強度上昇領域(22)が続いている、ことを特徴とする請求項35または36に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの強度上昇領域(22)と前記さらなる強度上昇領域(22)は、前記ゼロ箇所(20)に対して対称に構成されている、ことを特徴とする請求項37に記載の方法。
- それぞれの空間方向についての第2の強度値は、強度分布(19)の基点の第2の位置について記録されたルミネセンス光(12)の強度(I1b)であり、前記第2の位置は、それぞれの空間方向において、強度分布(19)の基点の少なくとも1つの位置と同じ側の別の箇所にあるか、または強度分布(19)の基点の少なくとも1つの位置に対向する、初期位置領域(23)の側にある、ことを特徴とする請求項35から38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(i)の各実施の際に設定される位置の数は、n+1から2nの間であり、nは、分子(24)が局在化される空間方向の数である、ことを特徴とする請求項35から39のいずれか一項に記載の方法。
- それぞれの空間方向についての前記第2の強度値は、励起光(3)により励起される際の分子(24)のルミネセンス光(12)の強度(IL)の飽和値(ISW)である、ことを特徴とする請求項35から38のいずれか一項に記載の方法。
- ルミネセンス光(12)は、強度分布(19)の基点に位置について、前記基点(20,326)を(複数)位置の間で反復してシフトすることにより、疑似的に同時に記録される、ことを特徴とする請求項35から41のいずれか一項に記載の方法。
- ルミネセンス光(12)は、強度分布(19)の基点(20,326)の位置について、当該位置について記録されるルミネセンス光(12)の強度が十分な精度で検出されるまで記録され、前記さらなる位置領域(324,325)は、所定の値だけ前記初期位置領域(23)よりも小さく決定可能である、ことを特徴とする請求項35から42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記さらなる位置領域(324,325)をそれぞれの空間方向において前記初期位置領域(23)よりも小さく決定可能な前記所定の値は、5%から75%の範囲にある、ことを特徴とする請求項43に記載の方法。
- 励起光(3)の最大強度は、初期位置領域(23)が強度分布(19)の基点(20,326)の各位置を基準にして、励起光(3)の飽和強度(IS)の90%以下の領域に存在するように調整される、ことを特徴とする請求項35から44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記励起光(3)の最大強度は、前記ループ(i)と(ii)の少なくとも一回の反復で高められる、ことを特徴とする請求項45に記載の方法。
- 前記励起光(3)の最大強度は、前記ステップ(i)と(ii)の全ての反復にわたって少なくとも50%だけ高められる、ことを特徴とする請求項46に記載の方法。
- ステップ(i)と(ii)は、前記さらなる位置領域(324,325)が所定の精度よりも大きくならなくなるまで繰り返される、ことを特徴とする請求項35から47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記所定の精度は、0.5から20nmの間の範囲にある、ことを特徴とする請求項48に記載の方法。
- 単離分子(24)を含む試料(6)の領域が、単離分子(24)の位置の確定の開始時に、少なくとも11つの強度上昇領域(22)または励起光(3)のガウス状の強度分布(19)をもって各空間方向で走査され、
走査中のルミネセンス光(12)の強度(IL)の経過から、第1の初期位置領域(23)が決定される、ことを特徴とする請求項35から49のいずれか一項に記載の方法。 - 励起光(3)が、単離分子(24)の位置の確定の開始時に、ガウス状の強度分布(19)をもって点ごとに、または円軌道ないしスパイラル軌道で、前記単離分子(24)を含む試料(6)の領域に指向され、
前記第1の初期位置領域(23)は、ルミネセンス光(12)の強度(IL)の経過から点ないし軌道を介して決定される、ことを特徴とする請求項19から50のいずれか一項に記載の方法。 - 単離分子(24)を含む試料(6)の領域には、単離分子(24)の位置の確定の開始時に、励起光(3)が空間的に印加され、空間解像度のある検出器に結像され、
少なくとも1つの検出器により記録されたルミネセンス光(12)の空間的分布から前記第1の初期位置領域(23)が決定される、ことを特徴とする請求項19から51のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ルミネセンス光(12)は空間分解能により記録され、付加的に、記録されたルミネセンス光(12)全体の空間的分布が、試料(6)中の分子(24)の位置に関して評価される、ことを特徴とする請求項1から52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料(6)には単離分子(24)の位置確定の前に切替信号が印加され、該切替信号は、隣接する同種の分子が単離後には、前記単離分子(24)とは異なり、励起光(3)によりルミネセンス光(12)を放射するように励起することができないことによって、当該分子(24)を隣接する同種の分子から単離する、ことを特徴とする請求項1から52のいずれか一項に記載の方法。
- 順次単離され、励起光(3)によりルミネセンス光(12)の放射が励起可能な複数の分子(24)であって、試料(6)中の対象構造をマーキングする当該分子の位置を確定するための、請求項1から54のいずれか一項に記載の方法の反復実施。
- 試料(6)中で運動する単離分子(24)を追跡するための、請求項1から54のいずれか一項に記載の方法の反復実施。
- STEDラスタ蛍光顕微鏡(1)により提供されるSTEDビームを励起光(3)として使用する、請求項1から56のいずれか一項に記載の方法を実施するためのSTEDラスタ蛍光顕微鏡(1)の使用。
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