CN103969239B - 一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明属于显微光谱成像探测技术领域，涉及一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试方法及其装置。本发明将分光瞳激光差动共焦显微技术与激光拉曼光谱探测技术有机结合，采用分割焦斑差动探测来实现三维几何位置的精密成像，其既简化了传统差动共焦显微系统的光路结构，又继承了原有激光差动共焦系统和分光瞳共焦系统的优势，仅通过软件切换处理便可实现分光瞳激光差动共焦显微探测、激光共焦拉曼光谱探测、激光差动共焦拉曼光谱探测的多模式切换与处理。本发明为纳米级微区三维几何位置与光谱的探测提供新的技术途径，可用于生物医学、工业精密检测等领域，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于显微光谱成像技术领域，将差动共焦显微技术与光谱探测技术相结合，涉及一种“图谱合一”的高空间分辨光谱成像与探测方法及装置，可用于各类样品的微区拉曼光谱高空间分辨成像与探测。
技术背景
1990年，G.J.Puppels等学者在观测单细胞和染色体的形态与组成时首先发明了共焦拉曼光谱显微技术并成功用于实验。激光共焦拉曼光谱技术通过入射激光引起分子(或晶格)产生振动而损失(或获得)部分能量，使散射光频率发生变化，通过对散射光进行分析来探知分子的组分、结构及相对含量等，激光共焦拉曼光谱技术亦被称为分子探针技术。该技术既继承了共焦显微术的高分辨层析成像特征，又可以对样品进行光谱分析，激光共焦拉曼光谱测试技术作为一种极其重要的材料结构测量与分析的基本技术手段，广泛应用于物理、化学、生物医学、材料科学、环境科学、石油化工、地质、药物、食品、刑侦和珠宝检定等领域，可对样品进行无损伤鉴定和深度光谱分析，同时，还可以进行样品扫描和低温分析、材料的光致发光研究等。
传统共焦拉曼光谱探测仪的原理如图1所示，光源系统发出激发光束透过偏振分光镜、四分之一波片和聚焦物镜后，聚焦在被测样品上，激发出载有样品光谱特性的拉曼散射光；通过三维扫描系统移动被测样品，使对应被测样品不同区域的拉曼散射光再次通过四分之一波片并被偏振分光镜反射，第一聚光镜将偏振分光镜反射的光进行会聚，利用位于第一针孔后面的光谱探测器测得载有被测样品光谱信息的拉曼散射光谱。
传统的共焦显微技术在激光激发焦点附近的区域内，也能激发出样品的拉曼光谱，并能被针孔后的光谱探测系统探测。因而共焦拉曼光谱显微技术的实际探测位置往往处于离焦位置。随着现代科技的快速发展，人们对微区光谱探测能力及空间分辨探测能力提出了更高的要求。在光学探测系统中，当测量聚焦光斑位于焦点时其尺寸最小，激发光强最强，若要获得最佳空间分辨力和最优的光谱探测能力，必须对系统进行精确定焦。
总体而言，现有共焦显微测量方法通常有两类：一类是利用共焦强度响应的斜边直接对被测样品进行测量，另一类是利用共焦强度响应的最大值对样品进行焦点跟踪来实现测量。但现有共焦显微测量系统存在以下不足:当利用共焦强度响应斜边进行测量时，无法实现绝对位移测量，且测量精度受限于共焦强度响应曲线斜边测量区间的非线性、光源强度波动、被测表面散射和反射特性等因素；当利用焦点跟踪测量时，由于共焦显微测量系统焦点对应共焦强度响应灵敏度最差的顶点，因而制约了此类共焦传感器焦点跟踪精度的进一步提高，进而限制了传统共焦拉曼系统的焦点跟踪精度和应用范围。
同时，应用拉曼光谱进行共焦定位信噪比较低，并且由于针孔的遮挡作用会进一步降低拉曼光谱的能量，而扩大针孔尺寸提高光谱通过率则会增加共焦轴向定位曲线的半高宽，降低其定位精度，现有共焦拉曼系统中的共焦针孔尺寸通常在φ150μm～φ200μm之间，所用针孔尺寸相对较大，亦不能很好的起到定焦作用。上述原因限制了共焦拉曼光谱显微系统探测微区光谱的能力，制约了其在更精细微区光谱测试与分析场合中的应用，因而提高系统的定焦精度是提高其空间分辨力的关键。
此外，由于拉曼散射光十分微弱，为了获得精确、丰富的测量信息，拉曼光谱成像时既需较长时间的单点拉曼光谱探测，又需进行多点拉曼光谱探测，因此拉曼光谱成像需要较长的时间。但是，仪器长时间成像过程中受环境温度、振动、空气抖动等的影响较大，易使仪器系统产生漂移，从而导致样品被探测位置离焦；由于现有共焦拉曼光谱探测技术不具备实时焦点跟踪和位置矫正能力，因而在整个成像过程中，无法保证其激发光斑的位置处在物镜焦点位置，实际激发光斑远大于物镜聚焦光焦斑，其结果制约了可探测区域的微小化，限制了共焦拉曼光谱仪器的微区光谱探测能力。
为克服传统共焦拉曼系统存在的上述不足，北京理工大学的赵维谦等人曾提出了一种具有很强微区光谱探测能力的差动共焦拉曼光谱测试方法，其将共焦探测光路系统分为两部分，并将这两个探测系统的点探测器分别置于焦前和焦后位置进行差动探测，继而实现双极性绝对零点跟踪测量等。差动共焦拉曼光谱测试技术在专利ZL2008101156011(发明人：赵维谦等)中，以题为“差动共焦拉曼光谱测试方法”已公开，其原理如图2所示，该方法旨在实现样品精细微区的光谱成像检测，为样品微区三维尺度及光谱特性的测量与分析提供新手段。但是，该差动共焦拉曼光谱测试方法由于采用了双路物理针孔结构，造成差动共焦测量系统结构相对复杂，并且对离焦位置要求严格，装调困难，增加了误差源：此外，由于差动共焦显微系统受到原理限制，通常难以兼顾分辨能力、工作距离和视场。
通常样品散射的拉曼光谱强度为反射的瑞利光束强度的10-3～10-6倍，而现有的共焦拉曼光谱探测仪器均探测样品散射的微弱拉曼光谱而遗弃强于拉曼散射光103～106倍的瑞利光束，因而，利用现有光谱探测系统中遗弃的瑞利光束进行辅助探测是改善现有共焦拉曼光谱探测技术空间分辨力的新途径。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足，提出一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试方法及其装置。通过利用共焦拉曼光谱探测中遗弃的瑞利散射光构建分光瞳共焦显微成像系统来实现样品三维几何位置的高分辨成像，并利用分光瞳差动共焦显微成像装置的“过零点”与其焦点精确对应这一特性来控制光谱探测器精确捕获物镜聚焦点处激发的拉曼光谱信息，进而实现对样品微区几何位置与光谱信息的高精度探测即“图谱合一”的高空间分辨探测，并同时达到分辨能力和量程范围的有效兼顾。本发明可以探测包括荧光、布里渊散射光、康普顿散射光等的散射光谱。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的。
一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试方法，包括以下步骤：
首先，在测量物镜的光瞳面上放置照明光瞳和收集光瞳；光源系统发出激发光束，激发光束透过照明光瞳后，聚焦在被测样品上，激发出载有被测样品光谱特性的拉曼散射光，同时反射出瑞利光；拉曼散射光和瑞利光经收集光瞳后到达二向色分光系统；二向色分光系统对拉曼散射光和瑞利光进行无损分离；
经二向色分光系统反射的瑞利光进入分光瞳激光差动共焦探测系统；分光瞳激光差动共焦探测系统利用探测器横向偏移能够使分光瞳共焦显微系统的轴向响应特性曲线产生相移的特性，采用单光路、单探测器分割焦斑差动方法，实现对被测样品微区几何位置的探测，具体过程为：对接收瑞利光的分光瞳激光差动共焦探测系统所获得的探测光斑进行分割处理，得到探测区域A和探测区域B；当对A、B两个探测区域的信号进行差动相减处理时，能够进行高空间分辨的三维尺度层析成像；
与此同时，经二向色分光系统透射的拉曼散射光进入拉曼光谱探测系统，利用分光瞳激光差动共焦响应曲线的“过零点”与测量物镜焦点位置精确对应特性，将分光瞳激光差动共焦响应曲线的“过零点”精确对应测量物镜的焦点，通过“过零点”触发来精确捕获激发光斑焦点位置的光谱信息，实现高空间分辨的光谱探测。
当对接收拉曼散射光的拉曼光谱探测系统获得的光谱信号进行处理时，系统能够进行拉曼光谱探测；当对接收瑞利光的分光瞳激光差动共焦探测系统获得的差动信号和接收拉曼散射光的拉曼光谱探测系统获得的光谱信号进行处理时，系统能够进行高空间分辨的微区图谱层析成像，即实现对被测样品“图谱合一”的分光瞳激光差动共焦拉曼光谱高空间分辨成像与探测。
特别的，可以通过设置探测区域A和探测区域B的位置参数以匹配不同反射率的样品，从而扩展其应用领域。
特别的，在本发明方法中，所述照明光瞳和收集光瞳可以是圆形、D形或者其他形状。
在本发明方法中，所述激发光束可以是线偏光、圆偏光等偏振光束；还可以是由光瞳滤波技术生成的结构光束。偏振光与光瞳滤波技术结合可以压缩测量聚焦光斑尺寸，提高系统的横向分辨力。
在本发明方法中，还可以探测包括荧光、布里渊散射光、康普顿散射光的散射光谱。
在本发明方法中，仅通过计算机系统软件处理即可实现对不同NA值的测量物镜的匹配，而无需重新对系统进行任何硬件装调。
一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置，其特征在于：包括产生激发光束的光源系统、测量物镜、照明光瞳、收集光瞳、二向色分光系统、拉曼光谱探测系统、分光瞳激光差动共焦探测系统、三维扫描系统、位移传感器以及数据处理单元；
其中，在测量物镜的光瞳面上放置照明光瞳和收集光瞳，照明光瞳和测量物镜依次位于光源系统的激发光束出射方向上，照明光瞳与激发光束同轴；二向色分光系统位于收集光瞳之后；拉曼光谱探测系统位于二向色分光系统的透射方向上；分光瞳激光差动共焦探测系统位于二向分光系统的反射方向上；被测样品固定在三维扫描系统的载物台上；
数据处理单元包括分割焦斑探测模块、差动相减模块和数据融合模块；其中，分割焦斑探测模块和差动相减模块用于处理图像采集系统探测到的光斑，得到分光瞳激光差动共焦响应曲线，由此得到被测样品的位置信息；数据融合模块用于融合位置信息和光谱信息，完成被测样品的三维重构及光谱信息融合；三者关联关系为：分割焦斑探测模块将图像采集系统采集到的瑞利斑进行分割并探测，得到的信号进入差动相减模块进行差动相减后，得到分光瞳激光差动共焦响应曲线进入数据融合模块；
计算机处理系统与位移传感器、三维扫描系统、数据融合模块相连接；图像采集系统和分割焦斑探测模块相连接。数据融合模块与第一探测器相连接；
通过计算机处理系统控制三维扫描系统移动被测样品，使不同区域瑞利光及对应该区域被测样品的拉曼散射光通过测量物镜和收集光瞳。
在本发明装置中，二向色分光系统与收集光瞳轴线的夹角是可变的。可选择适当的角度以满足分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置的结构设计，从而提高结构设计的灵活性。
在本发明装置中，拉曼光谱探测系统可以是普通拉曼光谱探测系统。包括沿光路依次放置的第一聚光镜、位于第一聚光镜焦点位置的光谱探测器，以及位于光谱探测器之后的第一探测器，用于被测样品的表层光谱探测；还可以是共焦拉曼光谱探测系统，包括沿光路依次放置的第一聚光镜、位于第一聚光镜焦点位置的第一针孔、位于第一针孔后的光谱探测器，以及位于光谱探测器之后的第一探测器，可以有效滤除焦点之外的杂散光，提高光谱探测的信噪比。
在本发明装置中，可通过增加图像放大系统，放大图像采集系统探测到的瑞利斑。包括沿光路依次放置的第二聚光镜、与第二聚光镜共焦点的图像放大系统以及位于图像放大系统焦点处的图像采集系统，以提高分光瞳激光差动共焦探测系统的采集精度。
在本发明装置中，可通过在光源系统和照明光瞳之间增加光束调制系统。包括沿光路依次放置的第三聚光镜、位于第三聚光镜焦点处的第二针孔、以及焦点位于第二针孔处的第四聚光镜，用于对光源系统发出的激发光束进行调制，以得到更高空间分辨力和更好的激发效果。
有益效果
本发明方法，对比已有技术具有以下创新点：
1、本发明将分光瞳激光差动共焦显微技术与拉曼光谱探测技术有机结合，融合了分光瞳差动共焦显微技术的高精度物镜聚焦点位置跟踪捕获能力，可探测到精确对应最小激发聚焦光斑区域的样品光谱特性，在大幅提高现有共焦拉曼光谱显微镜的微区光谱探测能力的同时也大大简化了系统的光路结构，这是区别于现有拉曼光谱探测技术的创新点之一；
2、由于采用单光路分割焦斑差动探测实现几何位置的成像，其既大幅简化传统差动共焦显微系统的光路结构，又保留了激光差动共焦系统和原有分光瞳差动共焦系统的优势，仅通过软件切换处理便可实现分光瞳激光差动共焦显微探测、激光共焦拉曼光谱探测、分光瞳激光差动共焦拉曼光谱探测多模式切换与处理。这是区别于现有拉曼光谱探测技术的创新点之二；
3、由于采用分割焦斑的方法来获取差动信号，可通过改变在图像探测系统探测焦面上所设置的两个微小区域的参数以匹配不同的样品的反射率，从而可以扩展其应用领域；还可以仅通过计算机系统软件处理即可实现对不同NA值的测量物镜的匹配，而无需重新对系统进行任何硬件装调。实现了系统对分辨力和量程的有效兼顾，有利于实现仪器的通用性。这是区别于现有拉曼光谱探测技术的创新点之三；
4、利用二向色分光系统对瑞利光和拉曼散射光进行无损分离，瑞利光进入差动探测系统，拉曼散射光进入拉曼光谱探测系统，提高系统光谱探测灵敏度，二向色分光系统可以根据需要调整角度，有利于低波数拉曼光谱的探测。这是区别于现有拉曼光谱探测技术的创新点之四。
5、单光路、单探测器分割焦斑差动相减探测方式可有效抑制光源光强波动、探测器电子漂移、环境状态差异等产生的共模噪声，大幅简化探测光路系统，消除因两探测器离轴放置不对称、探测器响应特性不一致等引起的误差，改善了共焦拉曼光谱显微镜的离焦特性；
6、分光瞳激光差动共焦测具有绝对零点，可进行双极性绝对测量，且绝对零点位于特性曲线灵敏度最大处、并与测量系统“焦点位置”精确对应，极便于进行焦点跟踪测量，可实现几何尺度绝对测量；
7、可实现量程范围与分辨能力的有效兼顾，通过设置在焦斑上所取两个微小区域的参数，以匹配不同反射率的被测样品，应用范围得到扩展；
8、采用分割焦斑的横向差动共焦方式，便于系统根据需求更换不同NA值的物镜，调节方便；
9、二向色分光系统的使用增强光谱探测系统所接收到的拉曼光谱，提高光谱探测的信噪比，使共焦拉曼光谱显微镜的微区光谱探测能力显著提高，也可以降低系统对激发光源的光强要求；还可以根据需求进行调整，以提高系统低波数探测能力。
附图说明
图1为共焦拉曼光谱成像方法示意图；
图2为差动共焦拉曼光谱成像方法示意图；
图3为本发明所述分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试过程示意图；
图4为D形分光瞳激光差动共焦拉曼光瞳测试示意图；
图5为本发明所述分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置示意图；
图6为本发明所述非垂直出射的分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置示意图；
图7为本发明所述具有共焦光谱探测系统的分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置示意图；
图8为本发明所述具有光束调制系统的分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置示意图；
图9为本发明所述具有探测焦斑放大系统分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置示意图；
图10为本发明所述分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试方法与装置实施例示意图；
图11为本发明所述分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试方法的分光瞳差动共焦响应曲线及拉曼光谱响应曲线示意图。
其中，1-光源系统、2-测量物镜、3-照明光瞳、4-收集光瞳、5-被测样品、6-二向色分光系统、7-拉曼光谱探测系统、8-第一聚光镜、9-光谱探测器、10-第一探测器、11-分光瞳激光差动共焦探测系统、12-第二聚光镜、13-图像采集系统、14-探测区域A、15-探测区域B、16-三维扫描系统、17-位移传感器、18-数据处理单元、19-分割焦斑探测模块、20-差动相减模块、21-数据融合模块、22-计算机处理系统、23-第一针孔、24-光束调制系统、25-第三聚光镜、26-第二针孔、27-第四聚光镜、28-图像放大系统、29-分光瞳激光差动共焦响应曲线、30-拉曼光谱响应曲线、31-偏振分光镜、32-四分之一波片、33-聚焦物镜、34-第一保偏分光镜、35-第二保偏分光镜、36-第五聚光镜、37-第六聚光镜、38-第三针孔、39-第四针孔、40-第二探测器、41-第三探测器、42-差动共焦数据处理单元。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试方法，包括以下步骤：
如图3所示，首先，在测量物镜2的光瞳面上放置照明光瞳3和收集光瞳4；光源系统1发出激发光束，激发光束透过测量物镜2的照明光瞳3后，聚焦在被测样品5上，激发出载有被测样品5光谱特性的拉曼散射光，并反射出瑞利光；拉曼散射光和瑞利光经测量物镜2的收集光瞳4到达二向色分光系统6；二向色分光系统6对拉曼散射光和瑞利光进行无损分离；经二向色分光系统6反射的瑞利光进入分光瞳激光差动共焦探测系统11；分光瞳激光差动共焦探测系统11利用探测器横向偏移能够使分光瞳共焦显微系统的轴向响应特性曲线产生相移的特性，实现对被测样品5微区几何位置的探测；与此同时，经二向色分光系统6透射的拉曼散射光进入拉曼光谱探测系统7中进行光谱探测。被测样品5可以通过增强拉曼光谱纳米粒子等拉曼增强技术进行处理，以提高拉曼散射光的强度。
当对接收瑞利光的分光瞳激光差动共焦探测系统获得的差动信号和接收拉曼散射光的拉曼光谱探测系统获得的光谱信号进行处理时，系统能够进行高空间分辨的微区图谱层析成像，即实现对被测样品“图谱合一”的分光瞳激光差动共焦拉曼光谱高空间分辨成像与探测。
特别的，可将圆形的照明光瞳3和收集光瞳4替换为其他形状(如D形，形成D形分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试，如图4所示)。
特别的，激发光束可以是线偏光、圆偏光等偏振光束；还可以是由光瞳滤波技术生成的结构光束，偏振光与光瞳滤波技术结合可以压缩测量聚焦光斑尺寸，提高系统的横向分辨力。
特别的，可以采用计算机处理系统22控制三维扫描系统16移动被测样品5，使不同区域瑞利光及对应该区域被测样品5的拉曼散射光通过测量物镜2和收集光瞳4。
一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置，如图5所示，包括产生激发光束的光源系统1、测量物镜2、二向色分光系统6、拉曼光谱探测系统7、分光瞳激光差动共焦探测系统11、三维扫描系统16、位移传感器17、数据处理单元18和计算机处理系统22。
其中，在测量物镜2的光瞳面上放置照明光瞳3和收集光瞳4。其中，照明光瞳3和测量物镜2依次位于光源系统1的激发光束出射方向上，照明光瞳3与激发光束同轴；二向色分光系统6位于收集光瞳4之后，且二向色分光系统6与收集光瞳4的轴线的夹角β为45°。
拉曼光谱探测系统7位于二向色分光系统6的透射方向上；拉曼光谱探测系统7包括第一聚光镜8、光谱探测器9和第一探测器10。其中，光谱探测器9的探测面位于第一聚光镜8的焦点处，第一探测器10位于光谱探测器9之后。
分光瞳激光差动共焦探测系统11位于二向分光系统6的反射方向上；分光瞳激光差动共焦探测系统11包括第二聚光镜12和图像采集系统13，其中，图像采集系统13的探测面位于第二聚光镜12的焦点处。
数据处理单元18包括分割焦斑探测模块19、差动相减模块20和数据融合模块21；其中，分割焦斑探测模块19和差动相减模块20用于处理图像采集系统13探测到的光斑，得到分光瞳激光差动共焦响应曲线29，由此得到被测样品5的位置信息；数据融合模块21用于融合位置信息I(u,vM)和光谱信息I(r)，完成被测样品5的三维重构及光谱信息融合I(x,y,z,r)。三者关联关系为：分割焦斑探测模块19将图像采集系统13采集到的瑞利斑进行分割并探测，得到的信号进入差动相减模块20进行差动相减后，得到分光瞳激光差动共焦响应曲线29进入数据融合模块21。
计算机处理系统22与位移传感器17、三维扫描系统16、数据融合模块21相连接。图像采集系统13和分割焦斑探测模块19相连接。数据融合模块21与第一探测器10相连接。
通过计算机处理系统22控制三维扫描系统16移动被测样品5，使不同区域瑞利光及对应该区域被测样品5的拉曼散射光通过测量物镜2和收集光瞳4。
如图6所示，二向色分光系统6与收集光瞳4的轴线的夹角β可以不为45°，从而构成非垂直出射的分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置。
如图7所示，在第一聚光镜8的焦点位置安放第一针孔23，从而构成具有共焦光谱探测系统的分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置。
如图8所示，在光源系统1和照明光瞳3之间安放光束调制系统24；光束调制系统24包括沿光路依次放置的第三聚光镜25、位于第三聚光镜25焦点处的第二针孔26、以及焦点位于第二针孔26处的第四聚光镜27，构成具有光束调制系统的分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置。
如图9所示，在分光瞳激光差动共焦探测系统11中，增加图像放大系统28，能够放大图像采集系统13探测到的瑞利斑，从而提高分光瞳激光差动共焦探测系统的采集精度；沿光路依次放置第二聚光镜12、图像放大系统28和图像采集系统13，其中，图像放大系统28与第二聚光镜12共焦点，图像采集系统13位于图像放大系统28的焦点处。
实施例
本实施例中，二向色分光系统6为Notchfilter，光谱探测器9为拉曼光谱探测器，图像采集系统13为CCD，图像放大系统28为放大物镜。
如图10所示，分光瞳激光差动共焦拉曼光谱探测方法，其测试步骤如下：
首先，在测量物镜2的光瞳面上放置照明光瞳3和收集光瞳4。由激光器构成的光源系统1发出可激发出被测样品5拉曼光谱的激发光，激发光经第三聚光镜25会聚后进入第二针孔26成为点光源，再经第四聚光镜27准直扩束后，形成平行的激发光束。激发光束透过照明光瞳3、测量物镜2后，聚焦在被测样品5上，返回激发出的载有被测样品5光谱特性的拉曼散射光和瑞利光。
然后，通过计算机处理系统22控制三维扫描系统16移动被测样品5，使不同区域瑞利光及对应该区域被测样品5的拉曼散射光通过测量物镜2和收集光瞳4，二向色分光系统6对瑞利反射光和拉曼散射光进行无损分离。
经二向色分光系统6反射的瑞利光进入分光瞳激光差动共焦探测系统11，经第二聚光镜12会聚后进入放大物镜28，被放大后的光斑被图像采集系统13探测，图像采集系统13探测到的光斑进入分割焦斑探测模块19，在探测焦斑中的xd轴上设置两个微小区域探测区域A14和探测区域B15，两个探测区域关于yd轴对称并相对于yd轴偏移vM，测得这两个区域的响应分别为IA(u,-vM)和IB(u,vM)；差动相减模块20将得到的信号进行差动相减，得到分光瞳激光差动共焦响应曲线29：
I(u,vM)＝IA(u,-vM)-IB(u,vM)
其中，I(u,vM)为分光瞳激光差动共焦响应；u为轴向归一化光学坐标，vM为针孔轴向偏移量。分光瞳激光差动共焦响应曲线29的“过零点”与激发光束的聚焦焦点精确对应，通过响应曲线29的“过零点”获得被测样品5表面的高度信息，结合位移传感器17反馈的位置信息重构出被测样品5的表面三维形貌。
经二向色分光系统6透射的拉曼散射光进入拉曼光谱探测系统7，经第一聚光镜8及其焦点上的第一针孔23后进入拉曼光谱探测器9以及其后的第一探测器10，测得载有被测样品5光谱信息的拉曼散射光谱响应曲线I(r)30，其中r为被测样品5受激发光所激发出拉曼散射光的波长；
对接收瑞利光的分光瞳激光差动共焦探测系统11获得的探测光斑进行分割处理，得到探测区域A14和探测区域B15。
若对两个探测区域的信号进行差动相减处理，得到分光瞳激光差动共焦响应I(u,vM)，再通过其绝对零点，精确捕获激发光斑的焦点位置，系统可以进行高空间分辨的三维尺度层析成像。
若对接收拉曼散射光的拉曼光谱探测系统7获得的光谱响应曲线I(r)30进行处理时，系统可以进行光谱探测。
若对接收瑞利光的分光瞳激光差动共焦探测系统11获得的分光瞳激光差动共焦响应I(u,vM)和拉曼散射光的拉曼光谱探测系统7获得的光谱信号I(r)进行处理时，系统可以进行高空间分辨的微区图谱层析成像，即实现被测样品5几何位置信息和光谱信息的高空间分辨的“图谱合一”探测效果。
如图10所示，分光瞳激光差动共焦拉曼光谱探测系统包括产生激发光束的光源系统1、测量物镜2、照明光瞳3、收集光瞳4、二向色分光系统6、拉曼光谱探测系统7、分光瞳激光差动共焦探测系统11、三维扫描系统16、位移传感器17以及数据处理单元18；其中，在测量物镜2的光瞳面上放置照明光瞳3和收集光瞳4；测量物镜2和照明光瞳3放置在光源系统1的光束出射方向上，照明光瞳3与激发光束同轴，二向色分光系统6放置在收集光瞳4之后，拉曼光谱探测系统7放置在二向色分光系统6的透射方向上，分光瞳激光差动共焦探测系统11在的反射方向上，数据处理单元18用于融合并处理拉曼光谱探测系统7、分光瞳激光差动共焦探测系统11和位移传感器17采集到的数据；二向色分光系统6与收集光瞳轴线的夹角β是可变的，可选择适当的角度β以满足分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置的结构设计；拉曼光谱探测系统7中第一聚光镜8的焦点处放置第一针孔23对杂散光进行滤除，以提高光谱探测信噪比；光源系统1通过包括第三聚光镜25、位于第三聚光镜25焦点处的第二针孔26、以及焦点位于第二针孔26处的第四聚光镜27构成的光束调制系统24对光源系统1发出的激发光束进行调制，以保证激发光束的质量；分光瞳激光差动共焦探测系统11中第二聚光镜12焦面上的像通过放大物镜28放大后进入图像采集系统13，以便于探测器进行分割焦斑探测，提高探测精度。
以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上进行的改动都是本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试方法，其特征在于包括以下步骤：
首先，在测量物镜(2)的光瞳面上放置照明光瞳(3)和收集光瞳(4)；光源系统(1)发出激发光束，激发光束透过照明光瞳(3)后，聚焦在被测样品(5)上，激发出载有被测样品(5)光谱特性的拉曼散射光，同时反射出瑞利光；拉曼散射光和瑞利光经收集光瞳(4)后到达二向色分光系统(6)；二向色分光系统(6)对拉曼散射光和瑞利光进行无损分离；
经二向色分光系统(6)反射的瑞利光进入分光瞳激光差动共焦探测系统(11)；分光瞳激光差动共焦探测系统(11)利用探测器横向偏移能够使分光瞳共焦显微系统的轴向响应特性曲线产生相移的特性，采用单光路、单探测器分割焦斑差动方法，实现对被测样品(5)微区几何位置的探测，具体过程为：对接收瑞利光的分光瞳激光差动共焦探测系统(11)所获得的探测光斑进行分割处理，得到探测区域A和探测区域B；当对A、B两个探测区域的信号进行差动相减处理时，能够进行高空间分辨的三维尺度层析成像；
与此同时，经二向色分光系统(6)透射的拉曼散射光进入拉曼光谱探测系统(7)，利用分光瞳激光差动共焦响应曲线(29)的“过零点”与测量物镜焦点位置精确对应特性，将分光瞳激光差动共焦响应曲线的“过零点”精确对应测量物镜的焦点，通过“过零点”触发来精确捕获激发光斑焦点位置的光谱信息，实现高空间分辨的光谱探测；
当对接收拉曼散射光的拉曼光谱探测系统获得的光谱信号进行处理时，系统能够进行拉曼光谱探测；当对接收瑞利光的分光瞳激光差动共焦探测系统获得的差动信号和接收拉曼散射光的拉曼光谱探测系统获得的光谱信号进行处理时，系统能够进行高空间分辨的微区图谱层析成像，即实现对被测样品“图谱合一”的分光瞳激光差动共焦拉曼光谱高空间分辨成像与探测。
2.根据权利要求1所述的分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试方法，其特征在于：照明光瞳(3)和收集光瞳(4)可以是圆形的；还可以是D形。
3.根据权利要求1所述的分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试方法，其特征在于：激发光束可以是线偏光、圆偏光偏振光束；还可以是由光瞳滤波技术生成的结构光束，偏振光与光瞳滤波技术结合可以压缩测量聚焦光斑尺寸，提高系统的横向分辨力。
4.根据权利要求1所述的分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试方法，其特征在于：拉曼光谱探测系统还可以探测包括荧光、布里渊散射光、康普顿散射光散射光谱。
5.一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置，其特征在于：包括产生激发光束的光源系统(1)、测量物镜(2)、照明光瞳(3)、收集光瞳(4)、二向色分光系统(6)、拉曼光谱探测系统(7)、分光瞳激光差动共焦探测系统(11)、三维扫描装置(16)、位移传感器(17)以及数据处理单元(18)；
其中，在测量物镜(2)的光瞳面上放置照明光瞳(3)和收集光瞳(4)，照明光瞳(3)和测量物镜(2)依次位于光源系统(1)的激发光束出射方向上，照明光瞳(3)与激发光束同轴；二向色分光系统(6)位于收集光瞳(4)之后；拉曼光谱探测系统(7)位于二向色分光系统(6)的透射方向上；分光瞳激光差动共焦探测系统(11)位于二向色分光系统(6)的反射方向上；被测样品(5)固定在三维扫描装置(16)的载物台上；
数据处理单元(18)包括分割焦斑探测模块(19)、差动相减模块(20)和数据融合模块(21)；其中，分割焦斑探测模块(19)和差动相减模块(20)用于处理图像采集系统(13)探测到的光斑，得到分光瞳激光差动共焦响应曲线(29)，由此得到被测样品(5)的位置信息；数据融合模块(21)用于融合位置信息和光谱信息，完成被测样品(5)的三维重构及光谱信息融合；三者关联关系为：分割焦斑探测模块(19)将图像采集系统(13)采集到的瑞利斑进行分割并探测，得到的信号进入差动相减模块(20)进行差动相减后，得到分光瞳激光差动共焦响应曲线(29)进入数据融合模块(21)；
计算机处理系统(22)与位移传感器(17)、三维扫描装置(16)、数据融合模块(21)相连接；图像采集系统(13)和分割焦斑探测模块(19)相连接；数据融合模块(21)与第一探测器(10)相连接；
通过计算机处理系统(22)控制三维扫描装置(16)移动被测样品(5)，使不同区域瑞利光及对应该区域被测样品(5)的拉曼散射光通过测量物镜(2)和收集光瞳(4)。
6.如权利要求5所述的一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置，其特征在于，二向色分光系统(6)与收集光瞳(4)轴线的夹角β可变。
7.如权利要求5所述的一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置，其特征在于，拉曼光谱探测系统(7)包括第一聚光镜(8)、光谱探测器(9)和第一探测器(10)；其中，光谱探测器(9)的探测面位于第一聚光镜(8)的焦点处，第一探测器(10)位于光谱探测器(9)之后。
8.如权利要求5所述的一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置，其特征在于，在第一聚光镜(8)的焦点位置安放有第一针孔(23)，且光谱探测器(9)位于第一针孔(23)之后。
9.如权利要求5所述的一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置，其特征在于，分光瞳激光差动共焦探测系统(11)包括第二聚光镜(12)和图像采集系统(13)，其中，图像采集系统(13)的探测面位于第二聚光镜(12)的焦点处；还可以包括图像放大系统(28)，图像放大系统(28)与第二聚光镜(12)共焦点，图像采集系统(13)位于图像放大系统(28)的焦点处。
10.如权利要求5所述的一种分光瞳激光差动共焦拉曼光谱测试装置，其特征在于，在光源系统(1)和照明光瞳(3)之间安放光束调制系统(24)；光束调制系统(24)包括沿光路依次放置的第三聚光镜(25)、位于第三聚光镜(25)焦点处的第二针孔(26)以及焦点位于第二针孔(26)处的第四聚光镜(27)。
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