CN103954602B - 激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于显微光谱成像技术领域，涉及一种激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量方法与装置。本发明融合双轴差动共焦显微和光谱探测技术，采用分割焦斑差动探测的方法实现对几何位置的精密成像，同时结合拉曼光谱探测和布里渊光谱探测技术实现对系统高空间分辨图谱合一的探测,具有三维层析几何成像、光谱探测和微区图谱层析成像三种模式，同时利用共焦拉曼光谱探测技术和共焦布里渊光谱探测技术优势互补的特点，为样品形貌、属性、材质和应力等参数的综合探测提供了一种新的解决途径，在生物医学、高能制造、材料化学等领域有广泛的应用前景。

Description

激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量方法与装置

技术领域

本发明属于显微光谱成像技术领域，将双轴差动共焦显微技术与光谱探测技术相结合，涉及一种“图谱合一”的激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量方法与装置，可用于样品的微区多光谱、多性能参数综合测试与高分辨成像。

技术背景

光射现象广泛存在于光与粒子的作用过程中，即当一束光通过介质时，介质粒子受光波的作用，从一个量子态跃迁到另一个量子态，并同时辐射出散射波，不同的能级跃迁方式分别产生了瑞利、反斯托克斯和斯托克斯散射，通常根据入射光波长改变量将光散射分为：瑞利散射、拉曼散射及布里渊散射。三种散射中的瑞利散射信号最强，布里渊散射信号次之，拉曼散射信号最弱。

其中，瑞利散射是因为介质内部质点的排列存在着一定的随机起伏，从而导致物质的电性能参数产生相应的变化，于是对入射到介质中的光信号产生散射。瑞利散射的特点为：散射光强度与入射光波长的四次方成反比，散射光强随观察方向而改变，散射光的偏振度与观察方向有关，散射光频率与入射光相同，且在散射前后原子或分子内能不发生变化。

拉曼光谱是由分子内部振动而引起的散射光谱，拉曼光谱与原子的性质、空间位形及原子之间或与外界的相互作用等因素有关，因此，不同物质会有其各自的特征拉曼光谱即“指纹谱”，通过测得的拉曼散射光谱的频移、强度、线形以及偏振状态变化等信息，来获得材料的成分、微结构和内部运动信息等，继而实现材料成分、应力、温度、异物的测量。与其他光谱相比，拉曼光谱有其独特的优点：①用于拉曼散射光谱检测的样品没有任何特殊的制备要求，如对形状和大小的要求低，不需透明，也不需是研磨粉碎，并且可以在固体、液体、溶液、气体等物理状态下测量，并且拉曼散射采用光子探针，对于样品无损伤探测，因而，拉曼光谱检测在材料科学、物理科学领域应用广泛；②对样品数量的要求比较少，可以用于对毫克甚至微克的数量级的样品进行检测，使得拉曼光谱技术成为地质矿产、法庭科学及刑侦科学等领域研究的有力工具；③水对拉曼光谱信号基本上是没有影响的，因此可直接检测含水样品或水溶液样品的拉曼光谱，比较适于对生物样品的测试，甚至可以用拉曼光谱检测活体中的生物物质，优于红外光谱技术。

布里渊散射光谱是由光波与介质中的声学声子发生相互作用而产生的一种散射光谱，是由分子的弹性振动(外振动和转动)而引起的散射，布里渊散射是以光为探针测量物质中声子、自旋波等多种元激发的重要手段。①当光与物质的声学声子相互作用时，声子的湮灭和产生分别对应着引起光能增大或减小，通过测量这种光子能量的变化可以得到声子能量的信息，进一步分析便可得出物质的弹性和压电等性质，在材料性质的研究中得到了很多应用，如各种透明不透明材料、层状薄膜材料、金属材料、磁性薄膜材料等。②与拉曼散射信号的低强度，敏感物理量少不同，布里渊散射由于可感测的物理量多，信号强度较大，且具有传感灵敏度高、动态范围大、传感距离长、响应时间短、空间分辨率及测量精度高等优势，在光纤传感技术、海洋监测、激光雷达、光通信等领域中有着广泛的应用。

利用拉曼散射和布里渊散射技术提出一种新的同时探测温度和应力的方法，该方法利用拉曼散射技术探测温度，进而可以直接从混杂应力和温度信息的布里渊频移中获得应力，从而实现测量温度和应力的同步测量。

2005年M.N.Alahbabi等人利用拉曼散射和布里渊散射技术提出一种新的同时探测温度和应力的方法，该方法利用拉曼散射技术探测温度，进而可以直接从混杂应力和温度信息的布里渊频移中获得应力，从而实现温度和应力的同步测量；2009年Marcelo A.Soto等人利用多纵模激光器同时进行分布式应力和温度传感的探测，运用法布里珀罗激光器在布里渊-拉曼混合系统中进行应力及温度的测试；2010年Fuchang Chen等人利用M.N.Alahbabi等人提出的方法，设计了可以同时探测温度和应力的系统，该系统在布里渊时域反射系统的基础上又添加拉曼散射模块来测量温度，从而实现同时测量温度和应力；2010年Mohammad Belal等人利用拉曼散射技术和布里渊技术实现了温度和应力同步高分辨测试，通过布里渊光相关域分析与反斯托克斯拉曼散射技术的结合，保证了温度压力传感器的高分辨力。

目前，商用的激光共焦拉曼光谱测试仪器主要由英国RENISHAW等生产。传统共焦拉曼光谱探测仪的原理如图1所示，光源系统发出激发光束透过分光镜和聚焦物镜后，聚焦在被测样品上，激发出载有样品光谱特性的拉曼散射光；通过三维扫描系统移动被测样品，使对应被测样品不同区域的拉曼散射光通过分光镜反射被第一聚光镜会聚，利用位于第一针孔后面的光谱探测器测得载有被测样品光谱信息的拉曼散射光谱。

现有的共焦光谱显微技术存在如下不足：

(1)空间分辨能力不高，仅达1μm左右。激光激发的拉曼光谱的强度信号很弱，比遗弃的锐利光束的强度低6个量级左右，因而为了探测到极弱的拉曼信号，共焦拉曼光谱探测系统的针孔的孔径通常在左右，远大于现有共焦显微镜10μm左右针孔孔径值，其结果使现有的共焦拉曼光谱的空间分辨力仅达1μm，并且自共焦拉曼光谱探测技术发明的二十多年来一直未有根本性的改变。

(2)捕获焦点激发的拉曼光谱能力差。共焦拉曼光谱探测系统，由于在极值点处强度响应不灵敏，其很难真正捕获到焦点处激发的样品的拉曼光谱信息，因而限制了现有共焦拉曼光谱探测的空间分辨能力；

(3)探测时间长，系统漂移大。由于共焦拉曼光谱信号很弱，进行图谱成像时探测器需进行长期的积分(常达数小时)，光学系统及样品工作台的漂移，常会造成样品离焦，继而降低了共焦拉曼光谱探测的空间分辨能力；

(4)样品杂散光较强，影响了拉曼光谱探测仪器的信噪比。现有的共焦拉曼光谱探测仪器，由于采用了背向反射样品探测方式和入射激发光路与散射光探测光路完全共光路的方式，其势必存在样品杂散光干扰大的不足，限制了现有共焦显微镜对高散射样品的光谱探测能力。

为克服传统共焦拉曼系统存在的上述不足，北京理工大学的赵维谦等人曾提出了一种具有很强微区光谱探测能力的差动共焦拉曼光谱测试方法，其将共焦探测光路系统分为两部分，并将这两个探测系统的点探测器分别置于焦前和焦后位置进行差动探测，继而实现双极性绝对零点跟踪测量等。差动共焦拉曼光谱测试技术在专利ZL2008101156011(发明人：赵维谦等)中，以题为“差动共焦拉曼光谱测试方法”已公开，其原理如图2所示，该方法旨在实现样品精细微区的光谱成像检测，为样品微区三维尺度及光谱特性的测量与分析提供新的手段。但是，该差动共焦拉曼光谱测试方法由于采用了双路物理针孔结构，造成差动共焦测量系统结构相对复杂，并且对离焦位置要求严格，装调困难，增加了误差源；该方法未利用含有丰富样品信息的布里渊散射光谱，在材料的弹性和压电等性质测试方面仍然受到限制；此外，由于差动共焦显微系统受到原理限制，通常难以兼顾分辨能力、工作距离和视场。

通常样品散射的拉曼光谱强度为反射的瑞利光束强度的10^-3～10^-6倍，而现有的光谱探测仪器遗弃了强于拉曼散射光的瑞利光束。因而，利用现有光谱探测系统中遗弃的瑞利光束进行辅助探测以改善现有共焦拉曼光谱探测技术空间分辨力是光谱高分辨成像与探测的新途径。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的不足，提出激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量方法与装置。通过利用共焦拉曼光谱探测中遗弃的瑞利散射光构建双轴差动共焦显微成像系统来实现样品三维几何位置的高分辨成像，并利用双轴差动共焦显微成像装置的“过零点”与其焦点精确对应这一特性来控制光谱探测器精确捕获物镜聚焦点处激发的拉曼光谱信息，进而实现对样品微区几何位置与光谱信息的高精度探测即“图谱合一”的高空间分辨探测，同时达到分辨能力和量程范围的有效兼顾；通过探测共焦拉曼光谱探测中遗弃的布里渊散射光来获得物质基本性质(弹性、磁性、相变)及多种交叉效应(压电、磁弹、光弹等)，继而实现材料应力、弹性参数、密度等测量；利用共焦拉曼光谱探测技术和共焦布里渊光谱探测技术优势互补的特点，设计拉曼光谱和布里渊光谱同时探测的共焦光谱探测方案，实现材料多性能参数的综合测量与解耦。本发明可以探测包括荧光、康普顿散射光等散射光谱。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的。

激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量方法，采用双轴差动共焦的方式对被测样品进行图谱成像，具体步骤包括：

1)照明物镜与采集物镜对称分布在测量面法线两侧，并且照明光轴与测量面法线的夹角为θ₁，采集光轴与测量面法线的夹角为θ₂，以测量面法线方向为测量轴线，建立系统坐标系(x,y,z)，其中θ₁＝θ₂；

2)激发光经由照明物镜聚焦到被测样品上，激发出瑞利光和载有被测样品光谱特性的拉曼散射光和布里渊散射光，轴向即z向移动被测样品使瑞利光及对应被测样品不同区域的散射光被反射进入采集物镜，并被采集物镜会聚到二向色分光系统，光束经二向色分光系统分光后，拉曼散射光被分离，瑞利光和布里渊散射光被二向色分光系统反射后被分光镜分光，透射光进入差动探测系统，反射光进入布里渊光谱探测系统获得布里渊光谱信号I(λ_b)；拉曼散射光透射过二向色分光系统进入拉曼光谱探测系统获得拉曼光谱信号I(λ_r)；

3)对进入差动探测系统的光信号进行差动处理，其中，差动探测系统中两个相同的探测系统对称放置于测量光轴两侧，利用针孔横向偏移可使双轴共焦显微系统的轴向响应特性曲线产生相移的特性拟合出相应的差动共焦曲线，并获得差动信号I(x,y,z,v_xM)，其中v_xM是针孔横向偏移量，利用差动共焦曲线过零点与焦点位置精确对应的特性，通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点O位置，实现被测样品的高空间分辨的焦点定位；

4)将被测样品(3)移动至焦点O处，重新获取焦点O处的光谱信号I(λ_r)和I(λ_b)；

5)利用数据处理系统将获得的差动信号I(x,y,z,v_xM)、光谱信号I(λ_r)和I(λ_b)进行数据融合处理，以获得样品的位置信息和光谱信息的四维测量信息I(x,y,z,λ_r,λ_b)；

6)完成上述步骤后，对被测样品进行横向扫描，即x、y方向，将被测样品移动到下一个点重复步骤2)、3)、4)、5)；

7)单独处理瑞利光的信号时，获得高空间分辨的三维尺度层析图像；单独处理拉曼散射光的信号时，获得光谱图像；同时处理瑞利光和拉曼散射光的信号时，获得高空间分辨的微区图谱层析成像，即被测样品几何位置信息和光谱信息的“图谱合一”；

激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量方法，其特征在于：差动探测系统中的两个相同的探测系统是单一的探测系统即第一探测器，数据处理系统从第一探测器上获取焦斑图案后，计算出此时焦斑图案的中心，以此中心作为坐标原点，建立探测器像面上的坐标系(x_d′,y_d′)，在x_d′轴上对称设置两个具有相同半径的圆形针孔对焦斑图案进行分割探测，分别为第一虚拟针孔和第二虚拟针孔，其位置分别对应上述两个相同的探测系统，当被测样品进行扫描时，数据处理系统分别计算出第一虚拟针孔和第二虚拟针孔范围内像素灰度总和，得到强度响应。

本发明方法中为压缩测量聚焦光斑尺寸并提高系统横向分辨力，所述激发光是偏振光束，包括线偏光、圆偏光、径向偏振光；或是由光瞳滤波技术生成的结构光束。

本发明方法还可以探测荧光、康普顿散射光。

本发明涉及一种激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量装置，包括光源，照明物镜，采集物镜和三维扫描工作台，其特征在于：还包括准直扩束镜、二向色分光装置、分光镜、差动探测装置、拉曼光谱探测装置和布里渊光谱探测装置；其中，照明物镜和采集物镜对称地布局在测量面法线两侧，照明光轴与测量面法线的夹角为θ₁，采集光轴与测量面法线的夹角为θ₂，其中θ₁＝θ₂，准直扩束镜和照明物镜依次放在光源的出射光线方向，采集物镜和二向色分光装置依次放在被测样品的反射光线方向，拉曼光谱探测装置放在二向色分光装置透射方向，分光镜和差动探测装置放置在二向色分光装置的反射方向，布里渊光谱探测装置放置在光镜的反射方向。

本发明装置中为提高系统横向分辨力，激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量装置在准直扩束镜和照明物镜之间加入照明端光瞳滤波器，或者同时在准直扩束镜和照明物镜之间加入照明端光瞳滤波器以及分光镜和差动探测装置之间加入照明端光瞳滤波器采集端光瞳滤波器。

激本发明装置中为提高系统横向分辨力，在准直扩束镜和照明物镜之间加入偏振调制装置，或者在照明物镜和照明端光瞳滤波器之间加入偏振调制装置。

本发明装置中差动探测装置的探测装置是CCD探测器，或者是两个参数相同的点探测器。

本发明装置中还包括最后进行数据融合处理的数据处理系统。

本发明装置中拉曼光谱探测装置是共焦光谱探测装置，包括第一聚光镜、位于第一聚光镜焦点处的针孔、第二聚光镜、位于第二聚光镜焦点处的第一光谱仪及第一光谱仪后的第二探测器；或者拉曼光谱探测装置是普通光谱探测装置，包括第第二聚光镜、位于第二聚光镜焦点处的第一光谱仪及第一光谱仪后的第二探测器；布里渊光谱探测装置包括布里渊聚光镜，位于布里渊聚光镜焦点位置的针孔，针孔后的第二光谱仪和第三探测器。

有益效果

本发明方法，对比已有技术具有以下创新点：

1、本发明通过合理设计能够对蕴含不同信息的拉曼散射光谱和布里渊散射光谱同时进行探测，形成优势互补，实现了对材料成分与基本物理性质的高分辨探测，便于多性能参数的综合测试，这是区别于现有光谱探测技术的创新点之一；

2、本发明将激光双轴差动共焦显微技术与拉曼光谱、布里渊光谱探测技术有机结合，融合了双轴差动共焦显微技术的高精度物镜聚焦点位置跟踪捕获能力，可探测到精确对应最小激发聚焦光斑区域的样品光谱特性，在大幅提高微区光谱探测能力的同时也大大简化了系统的光路结构，这是区别于现有光谱探测技术的创新点之二；

3、由于引入了径向偏振光与光瞳滤波器相结合的紧聚焦技术，实现超分辨多光谱综合测试，这是区别于现有技术的创新点之三；

4、由于采用单光路分割焦斑差动探测实现几何位置的成像，其既大幅简化传统差动共焦显微系统的光路结构，又保留了激光差动共焦系统和原有双轴差动共焦系统的优势，仅通过软件切换处理便可实现分双轴光差动共焦显微探测、激光共焦拉曼光谱探测、激光共焦布里渊光谱探测、激光双轴差动共焦多性能参数的综合测试等多种模式自由的选与切换处理。这是区别于现有探测技术的创新点之四；

5、利用双轴结构光束斜入射探测，克服了现有共焦显微成像技术无法抑制焦面散射光干扰的缺陷，抗散射能力强。这是区别于现有探测技术的创新点之五；

本发明方法具有如下特点：

1、单光路、单探测器分割焦斑差动相减探测方式可有效抑制光源光强波动、探测器电子漂移、环境状态差异等产生的共模噪声，大幅简化探测光路系统，消除因两探测器离轴放置不对称、探测器响应特性不一致等引起的误差，改善了共焦系统的离焦特性；

2、激光双轴差动共焦测量系统具有绝对零点，可进行双极性绝对测量，且绝对零点位于特性曲线灵敏度最大处、并与测量系统“焦点位置”精确对应，极便于进行焦点跟踪测量，可实现几何尺度绝对测量；

3、可实现量程范围与分辨能力的有效兼顾，通过设置在焦斑上所取两个微小区域的参数，以匹配不同反射率的被测样品，应用范围得到扩展；

4、采用分割焦斑的横向差动共焦方式，便于系统根据需求更换不同NA值的物镜，调节方便；

5.采用双轴结构斜入射的方式照明和探测，有效抑制了焦面样品散射光的干扰，提高了光谱探测信噪比。

附图说明

图1为共焦拉曼光谱成像方法示意图；

图2为高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法示意图；

图3为高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法示意图；

图4信号探测过程示意图；

图5为高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像装置示意图；

图6为带偏振调制的高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像装置示意图；

图7为高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法与装置实施例1示意图；

图8为高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法与装置实施例2示意图；

其中，1-光源，2-照明物镜，3-被测样品，4-照明光轴，5-测量面法线，6-θ₁，7-采集物镜，8-二向色分光系统，9-测量透镜，10-显微物镜，11-第一探测系统，12-第二探测系统，13-测量光轴，14-针孔横向偏移量，15-差动探测系统，16-焦斑图案，17-第二探测系统光斑，18-第一探测系统光斑，19-拉曼光谱探测系统，20-拉曼采集光轴，21-数据处理系统，22-第一探测器，23-第二虚拟针孔，24-第一虚拟针孔，25-准直扩束系统，26-三维扫描工作台，27-差动共焦曲线，28-照明端光瞳滤波器，29-偏振调制装置，30-采集端光瞳滤波器，31-第一聚光镜，32-针孔，33-第二聚光镜，34-第一光谱仪，35-第二探测器，36-共焦拉曼曲线，37-θ₂，38-分光镜，39-布里渊光谱探测系统，40-布里渊采集光轴，41-布里渊聚光镜，42-针孔，43-第二光谱仪，44-第三探测器。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例中，光源1为激光器，偏振调制装置29为径向偏振光产生器，二向色分光系统8为Notch filter，数据处理系统21为计算机，第一探测器22为第一CCD探测器，第二探测器35为第二CCD探测器。

如图3、图4和图7所示，照明物镜2与采集物镜7对称分布在测量面法线5两侧，并且照明光轴4与测量面法线5的夹角为θ₁6，采集光轴20与测量面法线5的夹角为θ₂37，其中θ₁＝θ₂，以测量面法线5方向为测量轴线，建立系统坐标系(x,y,z)，高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法，其测量步骤是：

首先，激光器1发出的光束经准直扩束系统25后，进行扩束出射后成为与照明物镜2入瞳直径相等的平行光，经过径向偏振光产生器29后成为径向偏振光，径向偏振光经照明端光瞳滤波器28后光束被调制，经由照明物镜2形成压缩光斑聚焦到放置在三维扫描工作台26上的被测样品3表面，并激发出瑞利光和载有被测样品3光谱特性的拉曼散射光和布里渊散射光，被测样品3可通过增强光谱纳米粒子等光谱增强技术进行处理，以提高散射光的强度。

轴向(即图中的Z方向)移动三维扫描工作台26来轴向扫描被测样品3，移动时使瑞利光及对应被测样品3不同区域的拉曼散射光被反射进入采集物镜7，经过采集物镜7收集的光束被Notch filter 8进行分光：

透射过Notch filter 8的拉曼散射光进入光谱探测系统19，光谱探测系统19为共焦拉曼光谱探测系统，拉曼散射光被第一聚光镜31会聚到针孔32，经过第二聚光镜33会聚进入光谱仪34，最后入射到第二CCD探测器35，获得被测样品3的拉曼光谱I(λ_r)(λ_r为拉曼光谱)，如共焦拉曼曲线36所示。

被Notch filter 8反射的瑞利光和布里渊散射光，经过分光镜38分光，反射路进入布里渊光谱探测系统39，经过布里渊聚光镜41会聚通过针孔42进入光谱仪43并被第三探测器44探测获得被测样品3的布里渊光谱I(λ_b)(λ_b为布里渊光谱)，如共焦拉曼曲线45所示。

透过分光镜38的瑞利光和布里渊散射光经过采集端光瞳滤波器30调制后，通过测量透镜9进行汇聚到差动探测系统15，汇聚光斑经过显微物镜10放大并成像在第一CCD探测器22上。

测量过程中，计算机21从第一CCD探测器22上获取焦斑图像16，计算出此时焦斑图像16的中心，以此中心作为坐标原点，建立CCD像面上的坐标系(x_d′,y_d′)，在x_d′轴上对称设置两个具有相同半径的圆形虚拟针孔对焦斑图像16进行分割探测，分别为第一虚拟针孔24和第二虚拟针孔23，其对应的针孔横向偏移量14为M；当被测样品3进行扫描时，计算机21分别计算出第一虚拟针孔24和第二虚拟针孔23范围内像素灰度总和，分别对应为焦斑图像16中的第一探测系统光斑18和第二探测系统光斑17，得到强度响应I₁(x,y,z,-v_xM)和I₂(x,y,z,+v_xM)，其中v_xM是针孔横向偏移量，x,y,z为样品在系统坐标系下的坐标。

计算机21对I₁(x,y,z,-v_xM)和I₂(x,y,z,+v_xM)进行差动相减处理，得到带有被测样品3凸凹变化的强度响应I(x,y,z,v_xM)，

I(x,y,z,v_xM)＝I₁(x,y,z,-v_xM)-I₂(x,y,z,+v_xM) (1)

根据公式(1)的结果拟合出相应差动共焦曲线27，利用差动共焦曲线27过零点与焦点位置精确对应的特性，获系统焦点O的位置，并通过三维扫描工作台26将被测样品3移动至焦点O位置。那么此时可重新捕获被测样品3在焦点O处的拉曼光谱I(λ_r)和布里渊光谱I(λ_b)。

将I(λ_r)、I(λ_b)、I(x,y,z,v_xM)传送到计算机21进行数据处理，从而获得包含被测样品3位置信息I(x,y,z,v_xM)和光谱信息I(λ_r)和I(λ_b)的四维测量信息I(x,y,z,λ_r,λ_b)。

完成上述步骤后，利用三维扫描工作台26对被测样品3进行横向扫描(即图中的x、y方向)，移动到下一个点后，利用三维扫描工作台26对被测样品3进行轴向扫描(即图中的z方向)，获取系统焦点O的位置后，将被测样品3移动到焦点O处，并获取光谱信息。

通过上述过程，即可获得精确的光谱信息，实现焦点位置的光谱探测和三维几何位置探测，其中，通过对测量信息{I(x,y,z),I(λ_r)，I(λ_b)}的融合处理，可实现式(2)所示的三种测量模式，即：微区图谱层析成像测试、三维尺度层析成像和光谱测试。

当θ＝45°时，照明光轴4和采集光轴20相互垂直，此时被测样品3的瑞利光光强最弱，有利于系统观测高散射性生物样品。

如图6所示，高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像装置包括沿光路依次放置的激光器1、准直扩束系统25、径向偏振光产生器29、照明端光瞳滤波器28、照明物镜2、被测样品3、三维扫描工作台26，及光路反射方向的采集物镜7、Notch filter 8、位于Notch filter 8透射方向的拉曼光谱探测系统19、位于Notchfilter 8反射方向的分光镜38，位于分光镜38反射方向的布里渊探测系统39，位于分光镜38透射方向的采集端光瞳滤波器30、测量透镜9及差动探测系统15、及连接差动探测系统15与拉曼光谱探测系统19的计算机21；其中，拉曼光谱探测系统19包括沿光路依次放置的第一聚光镜31、位于第一聚光镜31焦点位置的针孔32、位于针孔32后的第二聚光镜33、位于第二聚光镜33焦点位置的光谱仪34及位于光谱仪后的第二CCD探测器35；布里渊光谱探测系统39,包括沿光路依次放置的布里渊会聚镜41、位于布里渊会聚镜41焦点位置的针孔42、位于针孔42后的光谱仪43和第三探测器44；差动探测系统15包括位于测量透镜9焦点处的显微物镜10，及位于显微物镜10焦点处的第一CCD探测器22。

实施例2

本实施例中，偏振调制系统29为径向偏振光产生器，二向色分光系统8为Notch filter，第一探测系统11第一点探测器，第二探测系统12第二点探测器，数据处理系统21为计算机，第一探测器22为第一CCD探测器，第二探测器35为第二CCD探测器。

如图2、图5、图6和图8所示，将实施例1图7中的第一CCD探测器替换为图8的两个参数相同的点探测器，分别是第一点探测器11和第二点探测器12，即可构成实施例2。第一点探测器11和第二点探测器12所在的位置分别与实施例1的第一虚拟针孔24和第二虚拟针孔23所在的位置对应。第一虚拟针孔24和第二虚拟针孔23所在的位置可根据系统参数事先计算得出。

在对样品进行轴向扫描时，设被测样品3位于系统焦平面上时为系统初始位置，此时探测面上的焦斑16中心与(x_d,y_d)坐标系原点重合，如图4(1)所示，此时第一点探测器11和第二点探测器12探测到的信号大小相同，差动相减后的信号大小为零，即该特性曲线的零点位置对应系统焦点位置。当被测样品3沿着z轴向靠近透镜方向移动时，此时探测面上的焦斑位置如图4(2)和4(3)所示，焦斑中心趋近于第二点探测器12，第二点探测器12接收到的光强比如图4(1)所示初始位置要大；另一方面，此时的焦斑中心相对于第一点探测器11是处于远离状态，因此，第一点探测器11接收到的光强比初始位置要小，则此时由第一点探测器11的信号I₁(x,y,z,-v_xM)和第二点探测器12的信号I₂(x,y,z,+v_xM)相减得到的差动信号I(x,y,z,v_xM)相对于初始位置的差动信号减小。同理，当被测样品3沿着z轴向远离物镜方向移动时，此时探测面上的焦斑位置如图4(4)和4(5)所示，焦斑中心趋近于第一点探测器11，第一点探测器11接收到的光强比初始位置大，而第二点探测器12接收到的光强比初始位置要小，则此时的差动信号I(x,y,z,v_xM)相对于初始位置的差动信号增大。驱动被测样品3沿着z轴作轴向扫描运动，将第一点探测器11和第二点探测器12探测到的信号进行差动相减，即可得到双轴差动共焦显微技术的响应函数I(x,y,z,v_xM)。图4中的曲线27是双轴差动共焦显微技术的轴向响应函数I(x,y,z,v_xM)的示意图。

其余测量方法与装置与实施例1相同。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量方法，采用双轴差动共焦的方式对被测样品进行图谱成像，其特征在于：

1)照明物镜(2)与采集物镜(7)对称分布在测量面法线(5)两侧，并且照明光轴(4)与测量面法线(5)的夹角为θ₁(6)，采集光轴(20)与测量面法线(5)的夹角为θ₂(37)，以测量面法线(5)方向为测量轴线，建立系统坐标系(x,y,z)，其中θ₁＝θ₂；

2)激发光经由照明物镜(2)聚焦到被测样品(3)上，激发出瑞利光和载有被测样品光谱特性的拉曼散射光和布里渊散射光，轴向即z向移动被测样品(3)使瑞利光及对应被测样品(3)不同区域的散射光被反射进入采集物镜(7)，并被采集物镜(7)会聚到二向色分光系统(8)，光束经二向色分光系统(8)分光后，拉曼散射光被分离，瑞利光和布里渊散射光被二向色分光系统(8)反射后被分光镜(38)分光，透射光进入差动探测系统(15)，反射光进入布里渊光谱探测系统(39)获得布里渊光谱信号I(λ_b)；拉曼散射光透射过二向色分光系统(8)进入拉曼光谱探测系统(19)获得拉曼光谱信号I(λ_r)；

3)对进入差动探测系统(15)的光信号进行差动处理，其中，差动探测系统(15)中两个相同的探测系统(11、12)对称放置于测量光轴(13)两侧，利用针孔横向偏移可使双轴共焦显微系统的轴向响应特性曲线产生相移的特性拟合出相应的差动共焦曲线(27)，并获得差动信号I(x,y,z,v_xM)，其中v_xM是针孔横向偏移量，利用差动共焦曲线过零点与焦点位置精确对应的特性，通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点O位置，实现被测样品的高空间分辨的焦点定位；

4)将被测样品(3)移动至焦点O处，重新获取焦点O处的光谱信号I(λ_r)和I(λ_b)；

5)利用数据处理系统(21)将获得的差动信号I(x,y,z,v_xM)、光谱信号I(λ_r)和I(λ_b)进行数据融合处理，以获得样品的位置信息和光谱信息的四维测量信息I(x,y,z,λ_r,λ_b)；

6)完成上述步骤后，对被测样品(3)进行横向扫描，即x、y方向，将被测样品(3)移动到下一个点重复步骤2)、3)、4)、5)；

7)单独处理瑞利光的信号时，获得高空间分辨的三维尺度层析图像；单独处理拉曼散射光的信号时，获得光谱图像；同时处理瑞利光和拉曼散射光的信号时，获得高空间分辨的微区图谱层析成像，即被测样品几何位置信息 和光谱信息的“图谱合一”。

2.根据权利要求1所述的激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量方法，其特征在于：差动探测系统(15)中的两个相同的探测系统(11、12)是单一的探测系统即第一探测器(22)，数据处理系统(21)从第一探测器(22)上获取焦斑图案(16)后，计算出此时焦斑图案(16)的中心，以此中心作为坐标原点，建立探测器像面上的坐标系(x_d′,y_d′)，在x_d′轴上对称设置两个具有相同半径的圆形针孔对(23、24)焦斑图案(16)进行分割探测，分别为第一虚拟针孔(24)和第二虚拟针孔(23)，其位置分别对应上述两个相同的探测系统(11、12)，当被测样品(3)进行扫描时，数据处理系统(21)分别计算出第一虚拟针孔(24)和第二虚拟针孔(23)范围内像素灰度总和，得到强度响应。

3.根据权利要求1所述的激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量方法，其特征在于：为压缩测量聚焦光斑尺寸并提高系统横向分辨力，所述激发光是偏振光束，包括线偏光、圆偏光、径向偏振光；或是由光瞳滤波技术生成的结构光束。

4.根据权利要求1所述的激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量方法，其特征在于：激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量方法还可以探测荧光、康普顿散射光。

5.激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量装置，包括光源(1)，照明物镜(2)，采集物镜(7)和三维扫描工作台(26)，其特征在于：还包括准直扩束镜(25)、二向色分光装置(8)、分光镜(38)、差动探测装置(15)、拉曼光谱探测装置(19)和布里渊光谱探测装置(39)；其中，照明物镜(2)和采集物镜(7)对称地布局在测量面法线(5)两侧，照明光轴(4)与测量面法线(5)的夹角为θ₁(6)，采集光轴(20)与测量面法线(5)的夹角为θ₂(37)，其中θ₁＝θ₂，准直扩束镜(25)和照明物镜(2)依次放在光源(1)的出射光线方向，采集物镜(7)和二向色分光装置(8)依次放在被测样品(3)的反射光线方向，拉曼光谱探测装置(19)放在二向色分光装置(8)透射方向，分光镜(38)和差动探测装置(15)放置在二向色分光装置(8)的反射方向，布里渊光谱探测装置(39)放置在分光镜(38)的反射方向。

6.根据权利要求5所述的激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量装置，其特征在于：为提高系统横向分辨力，激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱 测量装置在准直扩束镜(25)和照明物镜(2)之间加入照明端光瞳滤波器(28)，或者同时在准直扩束镜(25)和照明物镜(2)之间加入照明端光瞳滤波器(28)以及分光镜(38)和差动探测装置(15)之间加入照明端光瞳滤波器采集端光瞳滤波器(30)。

7.根据权利要求5或6所述的激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量装置，其特征在于：为提高系统横向分辨力，在准直扩束镜(25)和照明物镜(2)之间加入偏振调制装置(29)，或者在照明物镜(2)和照明端光瞳滤波器(28)之间加入偏振调制装置(29)。

8.根据权利要求5所述的激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量装置，其特征在于：差动探测装置(15)的探测装置是CCD探测器，或者是两个参数相同的点探测器。

9.根据权利要求5所述的激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量装置，其特征在于：还包括最后进行数据融合处理的数据处理系统(21)。

10.根据权利要求5所述的激光双轴差动共焦布里渊-拉曼光谱测量装置，其特征在于：拉曼光谱探测装置(19)是共焦光谱探测装置，包括第一聚光镜(31)、位于第一聚光镜焦点处的针孔(32)、第二聚光镜(33)、位于第二聚光镜(33)焦点处的第一光谱仪(34)及第一光谱仪(34)后的第二探测器(35)；或者拉曼光谱探测装置(19)是普通光谱探测装置，包括第二聚光镜(33)、位于第二聚光镜(33)焦点处的第一光谱仪(34)及第一光谱仪(34)后的第二探测器(35)；布里渊光谱探测装置(39)包括布里渊聚光镜(41)，位于布里渊聚光镜(41)焦点位置的针孔(42)，针孔(42)后的第二光谱仪(43)和第三探测器(44)。