CN101290293A - 差动共焦拉曼光谱测试方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于显微光谱成像技术领域，涉及一种差动共焦拉曼光谱测试方法。该方法融合差动共焦检测方法和拉曼光谱检测方法技术特点，构成一种可实现样品微区光谱检测的测试方法，通过差动共焦技术精确捕捉激发光束聚焦焦点位置，探测对应位置的拉曼光谱，同时采用设计的光瞳滤波器，锐化差动共焦拉曼光谱系统的爱里斑主瓣，改善其微区拉曼光谱探测能力，精确获取包括微区样品光谱信息和位置信息的微区空间光谱信息。本发明显著提高了共焦拉曼光谱显微镜的微区光谱探测能力；具有绝对跟踪零点和双极性跟踪特性，实现几何尺度绝对测量；可广泛应用于生物医学、生命科学、生物物理、生物化学、材料、工业精密检测等技术领域，进行微区几何位置和光谱特性的高精度检测，具有极其重要的应用前景。

Description

差动共焦拉曼光谱测试方法

技术领域

本发明属于显微光谱成像技术领域，涉及一种“图谱合一”的高空间分辨光谱测试成像方法，其可用于各类样品的微区光谱分辨测试等。

背景技术

激光共焦拉曼光谱技术通过入射激光引起分子(或晶格)产生振动而损失(或获得)部分能量，使散射光频率发生变化，通过对散射光进行分析，来探知分子的组分、结构及相对含量等，激光共焦拉曼光谱技术亦被称之为分子探针技术。

激光共焦拉曼光谱测试技术作为一种极其重要的材料结构测量与分析的基本技术手段，广泛应用于物理、化学、生物医学、材料科学、环境科学、石油化工、地质、药物、食品、刑侦和珠宝等领域，可进行未知物的无损伤鉴定和深度剖析光谱分析，同时，还可以进行样品扫描和低温分析、材料的光致发光研究等。目前，商用的激光共焦拉曼光谱测试仪器主要有英国RENISHAW等生产。

现有的共焦拉曼光谱测试仪的原理如图1所示，激发光束透过偏振分光镜(2)、四分之一波片(3)、聚焦物镜(4)后，聚焦在被测样品(7)上，激发出载有样品光谱特性的拉曼散射光；移动被测样品(7)，使对应被测样品不同区域的拉曼散射光再次通过四分之一波片(3)并被偏振分光镜(2)反射，利用位于针孔11后面的光谱检测系统16测得载有被测样品光谱信息的拉曼散射光谱。

共焦拉曼光谱系统的激发光斑位置无法保证处在物镜焦点位置，实际激发光斑远大于物镜聚焦光焦斑，其结果制约了可探测区域的微小化，限制了共焦拉曼光谱仪器的微区光谱探测能力，使共焦拉曼光谱测试技术无法用于更精细的微区光谱特性测试与分析场合。

发明内容

本发明的目的是为克服上述已有技术的不足，提供一种具有很强微区光谱探测能力的差动共焦拉曼光谱测试方法，来实现样品的精细微区光谱成像检测，其结果为样品微区三维尺度及光谱特性分析提供依据。该技术在生物医学、生命科学、生物物理、生物化学、材料、工业精密检测等技术领域具有极其重要的应用前景，是国际光谱测试领域亟待解决的难题。

差动共焦显微技术在前期的授权专利ZL 2004100063596(发明人：赵维谦等)中，以题为“具有高空间分辨能力的差动共焦扫描检测方法”已公开，本发明中该已有技术不再详述。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的。

本发明是首先通过差动共焦技术精确捕捉激发光束聚焦焦点位置，然后探测对应该位置的拉曼光谱，改善共焦拉曼光谱仪器的微区光谱探测能力。

采用特定设计的光瞳滤波器，对差动共焦拉曼光谱仪器的光瞳函数进行掩膜修正，锐化爱里斑主瓣，进一步改善差动共焦拉曼光谱系统的微区光谱探测能力。

轴向分辨力的提高可通过差动共焦光路布置及差动探测来进行，这样便可实现样品微区三维尺度及光谱特性的高信噪比检测。

实现本方法的装置包括激光器(1)、偏振分光镜(2)、1/4波片(3)、物镜(4)、聚光镜(8、10)、针孔(11、12)，探测器(13、14)、分光镜(5、6)、被测样品(7)、三维工作台(9)、聚焦信号差动相减处理单元(15)、光谱检测系统(16)、计算机处理系统(17)、光瞳滤波器(18)、滤光片(19)、扩束器(20)；所述的光瞳滤波器可以是位相型滤波器、振幅型滤波器和振幅位相混合型滤波器；其连接关系可根据本发明方法中的光路走向确定。

该方法的具体步骤如下：

1)使可激发出样品拉曼光谱的激发光束透过偏振分光镜(2)、四分之一波片(3)、聚焦物镜(4)后，聚焦在被测样品(7)上，并激发出载有样品光谱特性的拉曼散射光；

2)移动被测样品(7)，使激发光及对应被测样品不同区域的拉曼散射光再次通过四分之一波片(3)并被偏振分光镜(2)反射，利用两分光镜(5，6)分光将偏振分光镜(2)反射的激发光和拉曼光谱分别进行分光；

3)利用差动共焦显微系统的两个探测器(13、14)，分别探测分光镜(5)透射的光束，测得反映被测样品凸凹变化的强度响应I_A(v，u，-u_M)和I_B(v，u，+u_M)，并将I_A(v，u，-u_M)和I_B(v，u，+u_M)差动相减，得差动共焦强度响应I(v，u)，其中，v为横向归一化光学坐标，u为轴向归一化光学坐标，u_M为针孔轴向归一化光学偏移量；

4)利用光谱检测系统(16)检测分光镜(5)反射的光束，测得载有被测样品光谱信息的拉曼散射光谱I(λ)，其中λ为波长；

5)使被测样品沿x、y向扫描，物镜(4)沿z向扫描，利用步骤3)和步骤4)所示的方法，测得对应物镜聚焦点位置附近的一组i个包含位置信息I(v，u)和光谱信息I(λ)的序列测量信息{I_i(λ)，I_i(v，u)}；

6)利用可分辨区域σ_i对应的位置信息I_i(v，u)，找出对应σ_i区域的光谱信息I_i(λ)值，再依据v与横向位置坐标(x，y)的关系以及u与轴向位置坐标z的关系，重构反映被测物微区σ_i三维尺度和光谱特性的信息I_i(x_i，y_i，z_i，λ_i)；

7)对应最小可分辨区域σ_min的三维尺度和光谱特性可由下式确定：

$I_{{\mathrm{\σ}}_{\min }}(x,y,z,\mathrm{\λ})=I_i(x,y,z,\mathrm{\λ}){|}_{I_i(v,u)=0,I_A(v,u,-u_M)\≠0,I_B(v,u,+u_M)\≠0}$

8)优化光瞳滤波器(18)参数，压缩激发聚焦光斑的尺寸，显著提高微区光谱探测能力。

本发明检测方法具有以下特点及良好效果：

本发明由于融合了差动共焦显微术的高精度物镜聚焦点位置捕获能力，可使共焦拉曼光谱显微镜探测到精确对应最小激发聚焦光斑区域的样品光谱特性，大幅提高现有共焦拉曼光谱显微镜的微区光谱探测能力，这是区别于现有技术的创新点之一；

由于融合了光瞳滤波式差动共焦显微术的高空间分辨特性，既改善了共焦拉曼光谱显微镜的微区几何位置检测能力，又改善了环境抗干扰能力、线性和离焦特性等，显著提高了共焦拉曼光谱显微镜的微区几何尺寸探测能力，这是区别于现有技术的创新点之二；

通过选择测量信息{I_i(λ)，I_i(v，u)}中不同的I_i(v，u)值，实现不同光斑大小区域的光谱探测，既可实现较大区域的光谱平均测量，又可实现较小区域的微区单点光谱测量，这是区别于现有技术的创新点之三。

本发明检测方法具有如下特点：

1)使共焦拉曼光谱显微镜的微区光谱探测能力显著提高；

2)使共焦拉曼光谱显微镜的微区几何尺度探测能力显著提高；

3)测量系统具有绝对跟踪零点和双极性跟踪特性，可实现几何尺度绝对测量；

4)改善了共焦拉曼光谱显微镜的离焦特性。

附图说明

图1为共焦拉曼光谱成像方法示意图；

图2为差动共焦拉曼光谱成像方法示意图；

图3为差动共焦拉曼光谱成像装置。

其中，1-激光器，2-偏振分光镜(PBS)，3-1/4波片，4-物镜，8、10-聚光镜，11、12-针孔，13、14-探测器，5、6-分光镜，7-被测样品，9-三维工作台，15-聚焦信号差动相减处理单元，16-光谱检测系统，17-计算机处理系统，18-光瞳滤波器，19-滤光片，20-扩束器。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

如图3所示，激光器1发出的经扩束器20扩束后的光束，经过光瞳滤波器18(振幅型光瞳滤波器)透过偏振分光镜2后变为偏振方向平行于纸面的p光，该p光透过1/4波片3后被物镜4聚焦在被测样品7，并激发出样品的拉曼散射光。部分激光光束反回透过1/4波片3变为偏振方向垂直于纸面的s光，偏振分光镜2反射s光到分光镜5，拉曼散射光亦与激光光束一起被偏振分光镜2反射到达分光镜5。

分光镜5首先将测量光束分为两束，经分光镜5反射的测量光束，经过滤光片19滤除激光瑞利散射光，使拉曼散射光进入光谱检测系统16进行光谱探测。

经分光镜5透射的光再次被分光镜6分为两束，经分光镜6反射的测量光束被聚光镜10聚焦，进入距聚光镜10焦点后距离为M位置的针孔12，后被探测器13接收；经分光镜6透射的测量光束被聚光镜8聚焦，进入距聚光镜8焦点前距离为M的针孔11，继而被针孔11后的探测器14接收。

当工作台9对被测样品7进行轴向(轴向归一化光学坐标设为u)和横向(横向归一化光学坐标设为v)扫描时，光谱检测系统16探测到的光谱信号为I(λ)(λ为波长)，探测器13探测到的信号为I_A(v，u，-u_M)，探测器14探测到的信号为I_B(v，u，+u_M)，差动相减处理单元15将I_A(v，u，-u_M)减I_B(v，u，+u_M)，得差动信号I(v，u)。

将I(λ)、I_A(v，u，-u_M)、I_B(v，u，+u_M)和I(v，u)信号给计算机17，计算机依据下式进行处理得光学坐标表示的信号：

$I_{{\mathrm{\σ}}_{\min }}(v,u,\mathrm{\λ})=I(v,u,\mathrm{\λ}){|}_{I(v,u)=0,I_1(v,u,-u_M)\≠0,I_2(v,u,+u_M)\≠0}---\left(1\right)$

根据轴向归一化光学坐标u与轴向位移坐标z之间的关系，以及横向归一化光学坐标v与横向位移坐标(x，y)之间的关系，计算机17处理得到：

$I_{{\mathrm{\σ}}_{\min }}(x,y,z,\mathrm{\λ})=I_i(x,y,z,\mathrm{\λ})---\left(2\right)$

重构出反应被测物微区三维尺度和光谱特性的信息

即实现了微区几何尺寸(x，y，z)和光谱参数I(λ)的高精度检测。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上进行的改动都是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种差动共焦拉曼光谱测试方法，实现本方法的装置包括激光器(1)、偏振分光镜(2)、1/4波片(3)、物镜(4)、聚光镜(8、10)、针孔(11、12)，探测器(13、14)、分光镜(5、6)、被测样品(7)、三维工作台(9)、聚焦信号差动相减处理单元(15)、光谱检测系统(16)、计算机处理系统(17)、光瞳滤波器(18)、滤光片(19)、扩束器(20)，其特征在于：首先通过差动共焦技术精确捕捉激发光束聚焦焦点位置，然后探测对应该位置的拉曼光谱；采用特定设计的光瞳滤波器，对差动共焦拉曼光谱仪器的光瞳函数进行掩膜修正，锐化爱里斑主瓣，进一步改善差动共焦拉曼光谱系统的微区光谱探测能力；通过差动共焦光路布置及差动探测来提高轴向分辨力，实现样品微区三维尺度及光谱特性的高信噪比检测；该方法的具体实现步骤如下：

1)使可激发出样品拉曼光谱的激发光束透过偏振分光镜(2)、四分之一波片(3)、聚焦物镜(4)后，聚焦在被测样品(7)上，并激发出载有样品光谱特性的拉曼散射光；

2)移动被测样品(7)，使激发光及对应被测样品不同区域的拉曼散射光再次通过四分之一波片(3)并被偏振分光镜(2)反射，利用两分光镜(5、6)分光将偏振分光镜(2)反射的激发光和拉曼光谱分别进行分光；

3)利用差动共焦显微系统的两个探测器(13、14)，分别探测分光镜(5)透射的光束，测得反映被测样品凸凹变化的强度响应I_A(v，u，-u_M)和I_B(v，u，+u_M)，并将I_A(v，u，-u_M)和I_B(v，u，+u_M)差动相减，得差动共焦强度响应I(v，u)，其中，v为横向归一化光学坐标，u为轴向归一化光学坐标，u_M为针孔轴向归一化光学偏移量；

4)利用光谱检测系统(16)检测分光镜(5)反射的光束，测得载有被测样品光谱信息的拉曼散射光谱I(λ)，其中λ为波长；

5)使被测样品沿x、y向扫描，物镜(4)沿z向扫描，利用步骤3)和步骤4)所示的方法，测得对应物镜聚焦点位置附近的一组i个包含位置信息I(v，u)和光谱信息I(λ)的序列测量信息{I_i(λ)，I_i(v，u)}；

6)利用可分辨区域σ_i对应的位置信息I_i(v，u)，找出对应σ_i区域的光谱信息I_i(λ)值，再依据v与横向位置坐标(x，y)的关系以及u与轴向位置坐标z的关系，重构反映被测物微区σ_i三维尺度和光谱特性的信息I_i(x_i，y_i，z_i，λ_i)；即实现了微区几何尺寸(x，y，z)和光谱参数I(λ)的高精度检测；

7)对应最小可分辨区域σ_min的三维尺度和光谱特性可由下式确定：

$I_{{\mathrm{\σ}}_{\min }}(x,y,z,\mathrm{\λ})=I_i(x,y,z,\mathrm{\λ}){|}_{I_i(v,u)=0,I_A(v,u,-u_M)\≠0,I_B(v,u,+u_M)\≠0}$

8)优化光瞳滤波器(18)参数，压缩激发聚焦光斑的尺寸，提高微区光谱探测能力。

2.如权利要求1所述的光瞳滤波器，其特征在于：可以是位相型滤波器、振幅型滤波器或振幅位相混合型滤波器。

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