CN108844930B - 分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学物质检测技术领域，利用分光瞳设计，有效屏蔽激发光路中光学元件自发荧光对结果的干扰，提高系统的信噪比。此外，将共焦物体表面定位技术和分立荧光光谱和荧光寿命测量技术相融合；利用共焦技术实现待测样品表面三维形貌的高精度测量，同时利用分立荧光光谱及荧光寿命探测技术实现待测样品表面各点的荧光光谱及荧光寿命的高灵敏度检测，进而得到三维高分辨空间物质成分分布信息。并且在样品表面的荧光信息测量过程中，本发明使用了多种不同的分立荧光探测手段，包括荧光光谱检测和荧光寿命检测。本发明在生物学，医学，材料科学以及临床医学诊断领域具有广泛的应用前景。

Description

分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置

技术领域

本发明属于化学物质检测技术领域，不仅可以对物质的成分进行高灵敏度鉴别，还可以对物质成分的空间分布进行探测，将在生物学、医学、材料科学等研究领域及临床医学诊断方面具有重要应用。

背景技术

在生物、物理、化学和材料等学科领域，光谱检测及分析由于其具有非常高的灵敏度、分子特异性和非接触测量特性已经成为基础研究的一项基本的测量手段。其中，荧光光谱检测是利用物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。特别是对大多数有机化合物来说，其产生的荧光通常具有很强的特异性，指向性。因此荧光光谱检测尤其适合运用于对这些荧光特异性强的有机化合物的成分分析。在工业界，荧光光谱检测可用于各种污染物的成分检测、工业原料成分检测、石油原油成分检测等等。在食品安全领域，荧光光谱检测可用于对食品的霉变细菌、农药残留量等信息进行检测和监控。在医学领域，荧光光谱技术和荧光显微成像技术为肿瘤和癌症的实时成像和检测提供了新的方向，并且有望发展成为适用于临床诊断的医疗技术。由此可见，荧光光谱检测技术是一种非常实用而且有前景的光学检测手段。

通常，荧光测量技术包括荧光光谱测量和荧光寿命测量两种方式。荧光光谱测量技术是通过对从待检样品发出荧光的光谱分布检测来实现的，即固定激发波长，探测样品的发射光强与入射光波长的关系曲线。荧光光谱技术经常跟荧光探针相结合，应用在DNA测序、高分子材料科学、生物荧光成像等领域。与此相对，荧光寿命检测是脉冲光源激发后从待检样品中激发出的荧光强度降到激发时的荧光最大强度的1/e所需要的时间。荧光物质的荧光寿命与自身的结构、所处微环境的极性、粘度等条件直接相关，因此从样品所激发出来荧光的寿命值是绝对的，不受激发光强度、荧光团的浓度和光漂白等因素的影响，且不受其他限制强度测量因素的制约。通过对样品进行荧光寿命测量还可对待测样品所处的微环境的很多生化参数如pH值、离子浓度、温度等分布进行定量测量。

然而，在对待测样品的表面激发荧光进行扫描成像的过程中，当待测样品表面存在起伏不平时，无法保证激发光束在待测样品表面不同位置的光斑大小一致，进而导致检测系统在不同位置处分辨率无法保持一致。尤其对于一些起伏较大的样品，甚至存在由于系统测量物镜工作距离很小造成在样品扫描过程中物镜碰撞待测样品的可能性，最终不但得不到样品表面的荧光分布成像，而且导致系统物镜的表面受到污染。除此之外，在探测微弱荧光信号时，在激发光路上，强光不仅会激发样品的荧光，也会激发光学元件的自发荧光，对实验结果产生干扰，降低系统的信噪比。

共聚焦显微成像技术利用针孔探测器严格对应探测系统探测光束聚焦焦点的特性，使得系统具有了及其精确的纵向表面定位的能力，可用于对待测样品表面的三维轮廓信息进行高灵敏度高空间分辨率检测。分光瞳设计，可以有效屏蔽激发光路中其他光学元件激发出来的自发荧光信号，提高系统的信噪比。

因此，如果能将具有纵向表面定位能力的共焦显微成像技术和分光瞳设计运用到荧光扫描成像系统中，不仅可以保证荧光成像系统在待测样品表面每一个位置都保证相同的横向分辨率，并有效避免扫描过程中物镜碰撞表面起伏较大的待测样品，也可以有效屏蔽光学元件的自发荧光，提高系统的信噪比。在整个扫描测量过程完成以后可同时得到待测样品高分辨的物体三维形貌信息，并且测得的荧光光谱分布可以和三维形貌进行精确的对应。这将对全面精确地分析待测样品的空间成分分布具有重大的意义，可在生物学、材料学、医学等研究领域得到广泛应用。

发明内容

为了解决具有三维空间形状待测样品的表面荧光光谱及荧光寿命测量难题，以及激发光路中光学元件自发荧光对结果的干扰问题，同时得到待测样品具有高轴向分辨率的三维形貌信息及其表面各点对应的高信噪比的荧光光谱信息和荧光寿命信息，本发明提出了“分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置”。

本发明的具体思路为：利用分光瞳设计，有效屏蔽激发光路中光学元件自发荧光对结果的干扰，提高系统的信噪比。此外，将共焦物体表面定位技术和分立荧光光谱和荧光寿命测量技术相融合；利用共焦技术实现待测样品表面三维形貌的高精度测量，同时利用分立荧光光谱及荧光寿命探测技术实现待测样品表面各点的荧光光谱及荧光寿命的高灵敏度检测，进而得到三维高分辨空间物质成分分布信息。

一方面，本发明提供了分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，括脉冲激光光源和连续激光光源，第一分光镜、扩束镜、照明光瞳、物镜、收集光瞳、一号反射镜、一号二向色分光镜、共焦探测系统、分立荧光光谱及荧光寿命探测系统、三维平移台、信号采集器以及计算机；

其中，在物镜的光瞳面上放置照明光瞳和收集光瞳；第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束；扩束镜、照明光瞳和物镜依次位于所述合成光束的出射方向上，合成光束由扩束镜扩束后穿过照明光瞳，然后被物镜会聚后形成探测光束照射在待测样品上；从待测样品表面激发出来的后向散射光及荧光通过所述物镜收集后，经过收集光瞳，然后由一号反射镜反射；从一号反射镜反射后的光束由一号二向色分光镜分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，进入共焦探测系统，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束，进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

待测样品放置在三维平移台上，通过计算机控制三维平移台带动待测样品进行扫描移动；信号采集器将共焦探测系统探测得到的随待测样品高度变化的光强响应信号转化后传输给计算机，由计算机处理后得到共焦响应曲线，通过共焦响应曲线的最大值位置精确确定待测样品表面各点的高度值；当探测光束聚焦在待测样品表面的各采样点位置时，信号采集器将分立荧光光谱及荧光寿命探测系统探测得到的不同波长下随时间变化的荧光光强信息通过转化后传输给计算机，由计算机处理后得到从各采样点激发出来的不同波长下的荧光寿命及荧光光谱；进而通过扫描待测样品得到待测样品表面的三维形貌以及表面各点在不同波长下的荧光寿命及荧光光谱。

另一方面，本发明还提供了一种分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法，其步骤为：

(a)通过第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束，所述脉冲激光和连续激光波长相同；所述合成光束经过扩束镜扩束后透过经过照明光瞳、物镜，聚焦在待测样品上；定义垂直于所述探测光束光轴的两正交方向分别为x和y方向，沿探测光束光轴的方向为z方向；

(b)光束照射待测样品产生的后向散射光和从待测样品激发出来的荧光一起通过物镜、收集光瞳后、由一号反射镜反射；由一号反射镜反射的光束经过一号二向色分光镜后分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束；所述本征光束进入共焦探测系统，所述荧光光束进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

(c) 打开连续激光光源，沿x和y方向移动待测样品至横向扫描起始位置(x ₁, y ₁)，然后在该位置沿z方向扫描待测样品，利用共焦探测系统测得随扫描位置变化的共焦响应曲线I(z)，进而根据共焦响应曲线I(z)的峰值响应点精确确定探测光束聚焦在待测样品的表面位置；

(d)关闭连续激光光源，根据步骤(c)测量结果移动待测样品，使得探测光束聚焦在待测样品表面，控制脉冲激光光源发出脉冲激光，由脉冲激光在待测样品表面上激发出荧光，通过分立荧光光谱及荧光寿命探测系统，得到不同波长下随时间变化的荧光光强信息；并对所述信息进行数据分析后得到不同波长下的荧光寿命；

(e)沿x和y方向扫描待测样品，重复上述步骤，在每一个扫描点(x _i , y _i )位置处利用共焦探测系统确定待测样品在该位置处的表面信息，并利用分立荧光光谱及荧光寿命探测系统测量从该位置处激发出来的荧光在不同波长下的荧光寿命；

(f)将得到的待测样品在每一个扫描点(x _i , y _i )位置的表面位置信息和对应的荧光寿命信息进行重构，同时得到被测样品的三维形貌轮廓及其表面各点在不同波长下的荧光寿命。

本发明对比已有技术具有以下创新点：

1.将共聚焦成像技术与荧光光谱和荧光寿命成像技术结合起来，可同时得到三维待测样品的空间形貌以及其空间表面各点的荧光光谱和荧光寿命，进而得到三维高分辨空间物质成分分布信息；

2.使用多个光强传感器同时探测不同波长下荧光的寿命，并基于此鉴别待测样品化学成分，具有较高的鉴别速度及鉴别准确度；

3.本发明同时探测待测样品在不同波长下的荧光寿命及不同波长之间的相对荧光强度信息，信息量大；

4.本发明可用于自发荧光的高灵敏度测量，利用待测样品的自发荧光来检测其化学成分，在检测过程中无需使用荧光标记物，因此检测过程非常方便。

本发明对比已有技术具有以下显著优点：

1.在分立荧光光谱和荧光寿命探测过程中，利用多探测器同时测量可以消除各激光脉冲之间强度不稳定因素造成的测量精度受限问题；

2.可同时探测待测样品在不同波长下的荧光寿命及相对荧光强度谱信息，为物质成分的检测同时提供了两个不同的方法；

3.采用分光瞳设计，有效屏蔽由激发光路上光学元件激发出来的荧光对实验结果的干扰，具有较高的信噪比。

附图说明

图1为本发明分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法的示意图；

图2为本发明分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置的示意图；

图3为本发明共焦探测系统的示意图；

图4为本发明利用二向色分光镜、窄带滤光片和光强传感器组成的分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

图5 为本发明利用二向色分光镜、窄带滤光片、会聚透镜、针孔和光强传感器组成的分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

图6为本发明分立荧光光谱及荧光寿命探测系统中用多光强传感器组替代N个光强传感器的示意图；

图7为本发明利用二向色分光镜、窄带滤光片、光纤聚焦透镜、光纤延时线以及光强传感器组成的分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

图8为本发明利用滤光片转轮和光强传感器组成的分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

图9为本发明分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测实施例的示意图；

图10为本发明共焦响应曲线I(z)的示意图；

其中：1-脉冲激光光源、2-连续激光光源、3-第一分光镜、4-扩束镜、5-照明光瞳、6-收集光瞳、7-物镜、8-待测样品、9-三维平移台、10-一号反射镜、11-一号二向色分光镜、12-共焦探测系统、13-分立荧光光谱及荧光寿命探测系统、14-信号采集器、15-计算机、16-共焦会聚透镜、17-共焦针孔、18-共焦光强传感器、19-二号二向色分光镜、20-三号二向色分光镜、21-N号二向色分光镜、22-一号窄带滤光片、23-二号窄带滤光片、24-（N-1）号窄带滤光片、25-N号窄带滤光片、26-一号光强传感器、27-二号光强传感器、28-（N-1）号光强传感器、29-N号光强传感器、30-一号会聚透镜、31-二号会聚透镜、32-（N-1）号会聚透镜、33-N号会聚透镜、34-一号针孔、35-二号针孔、36-（N-1）号针孔、37-N号针孔、38-二号反射镜、39-多光强传感器组、40-第一光纤聚焦透镜、41-第二光纤聚焦透镜、42-第（N-1）光纤聚焦透镜、43-第N光纤聚焦透镜、44-第一光纤延迟线、45-第二光纤延迟线、46-第（N-1）光纤延迟线、47-第N光纤延迟线、48-（N+1）号光强传感器、49-滤光片转轮、50-（N+2）号光强传感器、51-四号二向色分光镜、52-三号窄带滤光片、53-四号窄带滤光片、54-第一光电倍增管、55-第二光电倍增管、56-第三光电倍增管、57-第四光电倍增管。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明基本思想是利用分光瞳的设计，有效屏蔽激发光路光学元件的自发荧光，提高系统的信噪比。将具有精密轴向分辨率的共焦物体表面定位技术和分立荧光光谱和荧光寿命测量技术相融合；利用共焦技术解决待测样品表面三维形貌的高精度测量，同时利用分立荧光光谱及荧光寿命探测技术解决待测样品表面各点的荧光光谱及荧光寿命的高灵敏度检测，进而得到三维高分辨空间物质成分分布信息。并且在样品表面的荧光信息测量过程中，本发明使用了多种不同的分立荧光探测手段，使用者可以根据具体的应用需求，选择不同的荧光光谱和荧光寿命探测方法。同时，使用者还可以根据待测物质的化学特性，选择使用是荧光光谱检测，还是荧光寿命检测，还是两者相结合来鉴别其物质成分。

实施例1

本实施例需要解决的问题是同时扫描待测样品的三维形貌及分析肿瘤组织在待测样品中的空间分布情况，并据此判断肿瘤组织的边界信息。本实施例使用共焦探测系统来实现三维形貌的测量，利用从样品中由355 nm波长脉冲激光激发出来的400 nm，450 nm，530 nm和580 nm这四个波长的荧光寿命来判断各扫描点是否为肿瘤细胞。由于样品的荧光信号非常微弱，因此本实施例使用了光电倍增管作为荧光探测的光强传感器来提高系统的荧光光强探测灵敏度。

图9为本发明在实现共焦分立荧光光谱和荧光寿命探测时的具体实施装置，包括脉冲激光光源1、连续激光光源2、第一分光镜3、扩束镜4、照明光瞳5、收集光瞳6、物镜7、三维平移台9、一号反射镜10、一号二向色分光镜11、共焦探测系统12、分立荧光光谱及荧光寿命探测系统13、信号采集器14、计算机15。其中，脉冲激光光源1和连续激光光源2的波长均为355 nm，脉冲激光光源1的脉冲宽度为2 ns。脉冲激光光源1和连续激光光源2发出的激光通过第一分光镜3合束后依次经过照明光瞳5、物镜7后形成探测光束照射在待测样品8。待测样品8放置于三维平移台9上，由三维平移台9对其进行扫描。光束照射待测样品8产生的后向散射光和从待测样品8中激发出来的荧光一起通过物镜7收集后，经过收集光瞳6，然后由一号反射镜10反射；由一号反射镜10反射的光束经过一号二向色分光镜11后分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，进入共焦探测系统12，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束，进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统13。

在本系统中，共焦探测系统12包括共焦会聚透镜16，共焦针孔17，和共焦光强传感器18。其中，共焦会聚透镜16将进入共焦探测系统12的光束会聚后照射在共焦针孔17上，光束由共焦针孔17将光束进行空间滤波后由共焦光强传感器18探测接收。分立荧光光谱及荧光寿命探测系统13包括二号二向色分光镜19，三号二向色分光镜20，四号二向色分光镜51，一号窄带滤光片22，二号窄带滤光片23，三号窄带滤光片52，四号窄带滤光片53，第一光电倍增管54，第二光电倍增管55，第三光电倍增管56，第四光电倍增管57。二号二向色分光镜19、三号二向色分光镜20和四号二向色分光镜51将进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统13的光束进行3次分光，得到4路不同波长带的荧光光束。这4路不同波长带的荧光光束分别经一号窄带滤光片22、二号窄带滤光片23、三号窄带滤光片52和四号窄带滤光片53后由第一光电倍增管54、第二光电倍增管55、第三光电倍增管56和第四光电倍增管57探测接收。各窄带滤光片对应的中心波长分别是400 nm，450 nm，530 nm和580 nm。信号采集器14用来采集共焦探测系统12和分立荧光光谱及荧光寿命探测系统13中各光强传感器采集得到的光强信息，并将其转化后传输给计算机13。计算机13对采集得到的光强信息进行分析后得到共焦响应曲线和各波长下随时间变化的荧光光强信息。定义垂直于所述探测光束光轴的两正交方向分别为x和y方向，沿探测光束光轴的方向为z方向。

其对待测样品成分鉴别的步骤如下。

(a) 打开连续激光光源2，沿x和y方向移动待测样品8至横向扫描起始位置(x ₁ , y ₁)，然后在该位置沿z方向扫描待测样品8。利用共焦探测系统12, 测得随扫描位置变化的如附图10所示的共焦响应曲线I(z)，进而根据共焦响应曲线I(z)的峰值响应点精确确定探测光束聚焦在待测样品的表面位置，记录该扫描位置(x ₁, y ₁)处被测样品8的表面位置高度为z ₁。

(b) 关闭连续激光光源，根据步骤(a)测量结果移动待测样品8，使得探测光束聚焦在待测样品8表面，控制脉冲激光光源1发出脉冲激光，由脉冲激光在待测样品8表面上激发出荧光，所激发出来的荧光由物镜7收集后，经过收集光瞳，经一号反射镜10反射后，透过一号二向色分光镜11进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统13。进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统13的荧光经过二号二向色分光镜19后分成两路，其中反射光束的波长范围为360 nm~430 nm，透过光束的波长范围为430 nm~700 nm；从二号二向色分光镜19透过的光束经过三号二向色分光镜20后又分成两路，其中反射光束的波长范围为430 nm~480 nm，透过光束的波长范围为480 nm~700 nm；从三号二向色分光镜20透过的光束经过四号二向色分光镜51后又分成两路，其中反射光束的波长范围为480 nm~550 nm，透过光束的波长范围为550 nm~700 nm。由二号二向色分光镜19反射的光束透过一号窄带滤光片22后照射在第一光电倍增管54上。一号窄带滤光片22的中心波长为400 nm，带通宽度为10 nm。因此由第一光电倍增管52接收的荧光的中心波长为400 nm。由三号二向色分光镜20反射的光束透过二号窄带滤光片23后照射在第二光电倍增管55上。二号窄带滤光片23的中心波长为450nm，带通宽度为10 nm。因此由第二光电倍增管55接收的荧光的中心波长为450 nm。由四号二向色分光镜51反射的光束透过三号窄带滤光片52后照射在第三光电倍增管56上；三号窄带滤光片52的中心波长为530 nm，带通宽度为10 nm。因此由第三光电倍增管56接收的荧光的中心波长为530 nm。由四号二向色分光镜51透射的光束透过四号窄带滤光片53后照射在第四光电倍增管57上；四号窄带滤光片53的中心波长为580 nm，带通宽度为10 nm；因此由第四光电倍增管57接收的荧光的中心波长为580 nm。

(c)将第一光电倍增管54探测得到的中心波长400 nm下随时间变化的荧光信息，第二光电倍增管55探测得到的中心波长450 nm下随时间变化的荧光信息，第三光电倍增管56探测得到的中心波长530 nm下随时间变化的荧光信息，以及第四光电倍增管57探测得到的中心波长580 nm下随时间变化的荧光信息同时通过信号采集器14采集后传输给计算机15。计算机15通过对这些不同中心波长下随时间变化的荧光信号进行处理，得到各波长对应的荧光寿命。其中，中心波长400 nm对应的荧光寿命为10.5 ns，中心波长450 nm对应的荧光寿命为7.3 ns，中心波长530 nm对应的荧光寿命为13.3 ns，中心波长580 nm对应的荧光寿命为6.7 ns。

(d)根据正常组织在各波长下荧光的荧光寿命：波长400 nm对应的荧光寿命为9ns~13 ns之间，波长450 nm对应的荧光寿命为10 ns~14 ns之间，波长530 nm对应的荧光寿命为12 ns~15 ns之间，波长580 nm对应的荧光寿命为11 ns~14 ns之间；肿瘤组织在各波长下荧光的荧光寿命：波长400 nm对应的荧光寿命为8 ns~11 ns之间，波长450 nm对应的荧光寿命为6 ns~8 ns之间，波长530 nm对应的荧光寿命为13 ns~16 ns之间，波长580 nm对应的荧光寿命为5 ns~7 ns之间；可以得到从待测样品8表面（x ₁ , y ₁ , z ₁）处激发出来的荧光寿命信息与肿瘤组织的荧光寿命完全匹配，因而可以判断在（x ₁ , y ₁, z ₁）处为肿瘤组织。

(e)沿x和y方向扫描待测样品，重复上述步骤，在每一个扫描点(x _i , y _i )位置处利用共焦探测系统12确定待测样品8在该位置处的表面信息z _i ，利用分立荧光光谱及荧光寿命探测系统13测量从该位置处激发出来的荧光在不同波长下的荧光寿命，并基于此判断该处为正常组织还是肿瘤组织。

(f) 将上述信息进行得到的待测样品在每一个扫描点(x _i , y _i )位置的表面位置信息z _i 和对应的荧光寿命信息进行重构，同时得到被测样品8的三维形貌轮廓及其表面各点在不同波长下的荧光寿命，并得到表面各点为肿瘤组织还是正常组织的判断结果。进而根据这些信息，可以得到肿瘤组织在待测样品8中的空间分布情况，以及肿瘤组织的边界信息。

实施例2

与实施例1不同的是，本例利用荧光的光谱强度差异来判断待测样品8表面各点是肿瘤组织还是正常组织。 所用装置及样品跟实施例1相同。为提高荧光光谱测量的稳定性，本实施例采用连续激光光源2发出的光束来激发待测样品8产生荧光，其测量步骤如下。

(a)打开连续激光光源2，沿x和y方向移动待测样品8至横向扫描起始位置(x ₁ , y ₁)，然后在该位置沿z方向扫描待测样品8。利用共焦探测系统12, 测得随扫描位置变化的如附图10所示的共焦响应曲线I(z)，进而根据共焦响应曲线I(z)的峰值响应点精确确定探测光束聚焦在待测样品的表面位置，记录该扫描位置(x ₁ , y ₁)处被测样品7的表面位置高度为z ₁。

(b) 根据步骤(a)测量结果移动待测样品8，使得探测光束聚焦在待测样品8表面，由连续激光光源2发出的连续激光照射在待测样品8表面上激发出荧光，所激发出来的荧光由物镜7收集后，经过一号反射镜10反射，然后透过一号二向色分光镜11进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统13。进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统13的荧光经过二号二向色分光镜19后分成两路，其中反射光束的波长范围为360 nm~430 nm，透过光束的波长范围为430 nm~700 nm；从二号二向色分光镜19透过的光束经过三号二向色分光镜20后又分成两路，其中反射光束的波长范围为430 nm~480 nm，透过光束的波长范围为480 nm~700 nm；从三号二向色分光镜20透过的光束经过四号二向色分光镜51后又分成两路，其中反射光束的波长范围为480 nm~550 nm，透过光束的波长范围为550 nm~700 nm。由二号二向色分光镜19反射的光束透过一号窄带滤光片22后照射在第一光电倍增管54上。一号窄带滤光片的中心波长为400 nm，带通宽度为10 nm。因此由第一光电倍增管54接收的荧光的中心波长为400 nm。由三号二向色分光镜20反射的光束透过二号窄带滤光片23后照射在第二光电倍增管55上。二号窄带滤光片23的中心波长为450 nm，带通宽度为10 nm。因此由第二光电倍增管55接收的荧光的中心波长为450 nm。由四号二向色分光镜51反射的光束透过三号窄带滤光片52后照射在第三光电倍增管56上；三号窄带滤光片52的中心波长为530 nm，带通宽度为10 nm。因此由第三光电倍增管56接收的荧光的中心波长为530 nm。由四号二向色分光镜51透射的光束透过四号窄带滤光片53后照射在第四光电倍增管57上；四号窄带滤光片53的中心波长为580 nm，带通宽度为10 nm；因此由第四光电倍增管57接收的荧光的中心波长为580 nm。计算机15通过对这些不同中心波长下的荧光信号进行处理，得到各波长对应的荧光强度信息。其中，中心波长400 nm对应的荧光强度为5.6 µW；中心波长450 nm对应的荧光强度为8.4 µW；中心波长530 nm对应的荧光强度为4.5 µW；中心波长580 nm对应的荧光强度为9.8 µW。进而可以得到该待测样品8在400 nm、450 nm、530 nm和580 nm下的相对荧光强度谱为0.57:0.86:0.46:1。

(c) 根据正常组织在这四个波长荧光信息中峰值荧光谱为530 nm，而肿瘤组织在这四个波长荧光信息中峰值荧光谱为580 nm，得到待测样品8在其表面点(x ₁, y ₁, z ₁)处为肿瘤组织。

(d) 沿x和y方向扫描待测样品，重复上述步骤，在每一个扫描点(x _i , y _i )位置处利用共焦探测系统12确定待测样品8在该位置处的表面信息z _i ，利用分立荧光光谱及荧光寿命探测系统13测量从该位置处激发出来的荧光在不同波长下的荧光强度，并基于此判断该处为正常组织还是肿瘤组织。

(e)将上述信息进行得到的待测样品在每一个扫描点(x _i , y _i )位置的表面位置信息z _i 和对应的荧光寿命信息进行重构，同时得到被测样品8的三维形貌轮廓及其表面各点的分立荧光光谱，并得到表面各点为肿瘤组织还是正常组织的判断结果。进而根据这些信息，可以得到肿瘤组织在待测样品8中的空间分布情况，以及肿瘤组织的边界信息。

实施例3

与实施例1不同的是，如附图5所示，为提高探测光束的分辨率，在所有光强传感器前都分别加上会聚透镜和针孔。针孔放置在会聚透镜的焦点位置处，会聚透镜将各不同波长的荧光光束会聚后通过针孔进行空间滤波。因此，各光强传感器探测到的荧光信号均为滤波后的荧光光强信息，这些滤波后的荧光准确对应着探测光束聚焦焦点激发出来的荧光信号，将焦点之外的荧光信号进行了有效的屏蔽。

实施例4

与实施例1不同的是，如附图6所示，为简化系统结构，降低系统成本，本实施例用阵列光电倍增管探测器作为多光强传感器组替代所述使用的四个光电倍增管探测器，用阵列光电倍增管探测器中不同的探测单元分别探测得到不同波长的荧光信息。

实施例5

与实施例1不同的是，如附图7所示，分立荧光光谱及荧光寿命探测系统包括3个二向色分光镜（该实施例中N = 4）、4个窄带滤光片、4个光纤聚焦透镜、4个具有不同延时时间的光纤延时线以及一个（N+1）号光强传感器48。由这3个二向色分光镜将从待测样品激发出来的荧光光束进行3次分光，得到4路不同波长带的荧光光束；这4路不同波长带的荧光光束分别经4个窄带滤光片滤光后由4个光纤聚焦透镜耦合进入4个具有不同延时时间的光纤延时线。经过光纤延时线延时后的4路荧光在光纤延时线末端合成输出，由（N+1）号光强传感器48探测接收。此时不同波长的荧光将在不同时刻到达（N+1）号光强传感器48，因此可以根据不同的时段将不同波长下的荧光信息分开。这种方式有利于简化系统结构，缩小系统体积，降低系统成本。

实施例6

与实施例1不同的是，如附图8所示，利用滤光片转轮49和（N+2）号光强传感器50组成分立荧光光谱及荧光寿命探测系统13。滤光片转轮49由4个具有不同中心波长的窄带滤光片组成（该实施例中N = 4），滤光片转轮49每转动一下，脉冲激光光源发出一个脉冲激光，从待测样品8激发出来的荧光光束透过对应中心波长下的窄带滤光片，（N+2）号光强传感器50测得相应波长下随时间变化的荧光光强信息。因而，滤光片转轮49转动4次后可以得到4个不同波长下随时间变化的荧光光强信息。利用转动滤光片转轮49的方法，可以减少使用的光强传感器的个数，因此显著降低了系统研制成本。

Claims (10)

1.分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，包括脉冲激光光源和连续激光光源，其特征在于：包括第一分光镜、扩束镜、照明光瞳、物镜、收集光瞳、一号反射镜、一号二向色分光镜、共焦探测系统、分立荧光光谱及荧光寿命探测系统、三维平移台、信号采集器以及计算机；

其中，在物镜的光瞳面上放置照明光瞳和收集光瞳；第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束；扩束镜、照明光瞳和物镜依次位于所述合成光束的出射方向上，合成光束由扩束镜扩束后穿过照明光瞳，然后被物镜会聚后形成探测光束照射在待测样品上；从待测样品表面激发出来的后向散射光及荧光通过所述物镜收集后，经过收集光瞳，然后由一号反射镜反射；从一号反射镜反射后的光束由一号二向色分光镜分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，进入共焦探测系统，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束，进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

待测样品放置在三维平移台上，通过计算机控制三维平移台带动待测样品进行扫描移动；信号采集器将共焦探测系统探测得到的随待测样品高度变化的光强响应信号转化后传输给计算机，由计算机处理后得到共焦响应曲线，通过共焦响应曲线的最大值位置精确确定待测样品表面各点的高度值；当探测光束聚焦在待测样品表面的各采样点位置时，信号采集器将分立荧光光谱及荧光寿命探测系统探测得到的不同波长下随时间变化的荧光光强信息通过转化后传输给计算机，由计算机处理后得到从该采样点激发出来的不同波长下的荧光寿命及荧光光谱；进而通过扫描待测样品得到待测样品表面的三维形貌以及表面各点在不同波长下的荧光寿命及荧光光谱。

2.根据权利要求1所述的分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：所述共焦探测系统包括共焦会聚透镜、共焦针孔和共焦光强传感器：共焦针孔放置于共焦会聚透镜的焦点位置处，由共焦会聚透镜将进入共焦探测系统的光束聚焦后照射在共焦针孔上，光束由共焦针孔进行空间滤波后被共焦光强传感器探测接收。

3.根据权利要求1所述的分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，所述分立荧光光谱及荧光寿命探测系统包括（N-1）个二向色分光镜、N个窄带滤光片、N个光强传感器：由所述（N-1）个二向色分光镜将从待测样品激发出来的荧光光束进行（N-1）次分光，得到N路不同波长带的荧光光束；所述N路不同波长带的荧光光束分别经N个窄带滤光片滤光后由N个光强传感器探测接收，得到N个不同波长下随时间变化的荧光光强信息；各窄带滤光片对应的中心波长为λ _n ，带通宽度为δλ _n ，其中，n=1, 2, …, N。

4.根据权利要求3所述的分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：用多光强传感器组替代所述使用的N个光强传感器：多光强传感器组由N个光强传感器组成，用多光强传感器组中的各光强传感器分别探测得到对应的荧光强度信息。

5.根据权利要求1所述的分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：所述分立荧光光谱及荧光寿命探测系统包括（N-1）个二向色分光镜、N个窄带滤光片、N个光纤聚焦透镜、N个具有不同延时时间的光纤延时线以及一个光强传感器：由所述（N-1）个二向色分光镜将从待测样品激发出来的荧光光束进行（N-1）次分光，得到N路不同波长带的荧光光束；所述N路不同波长带的荧光光束分别经N个窄带滤光片滤光后由N个光纤聚焦透镜耦合进入N个具有不同延时时间的光纤延时线；经过光纤延时线延时后的N路荧光在光纤延时线末端合成输出，由（N+1）号光强传感器探测接收；此时不同波长的荧光将在不同时刻到达（N+1）号光强传感器，根据不同的时段将不同波长下的荧光信息分开。

6.根据权利要求1所述的分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：所述分立荧光光谱及荧光寿命探测系统包括一个滤光片转轮和（N+2）号光强传感器：所述滤光片转轮上由N个具有不同中心波长的窄带滤光片组成，滤光片转轮每转动一下，脉冲激光光源每发出一个脉冲激光，从待测样品激发出来的荧光光束透过对应中心波长下的窄带滤光片，（N+2）号光强传感器测得相应波长下随时间变化的荧光光强信息；滤光片转轮转动N次后可以得到N个不同波长下随时间变化的荧光光强信息。

7.根据权利要求3或6所述的分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：在所述各光强传感器前分别加上会聚透镜和针孔：针孔放置在会聚透镜的焦点位置处，会聚透镜将各不同波长的荧光光束会聚后通过针孔进行空间滤波，所述各光强传感器探测滤波后的荧光光强信息。

8.分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法，其特征在于：

(a)通过第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束，所述脉冲激光和连续激光波长相同；所述合成光束经过扩束镜扩束后经过照明光瞳，由物镜会聚形成探测光束照射在待测样品上；定义垂直于所述物镜光轴的两正交方向分别为x和y方向，沿物镜光轴的方向为z方向；

(b)光束照射待测样品产生的后向散射光和从待测样品激发出来的荧光一起通过物镜、收集光瞳后、由一号反射镜反射；由一号反射镜反射的光束经过一号二向色分光镜后分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束；所述本征光束进入共焦探测系统，所述荧光光束进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

(c) 打开连续激光光源，沿x和y方向移动待测样品至横向扫描起始位置(x ₁, y ₁)，然后在该位置沿z方向扫描待测样品，利用共焦探测系统测得随扫描位置变化的共焦响应曲线I(z)，进而根据共焦响应曲线I(z)的峰值响应点精确确定探测光束聚焦在待测样品的表面位置；

(d)关闭连续激光光源，根据步骤(c)测量结果移动待测样品，使得探测光束聚焦在待测样品表面，控制脉冲激光光源发出脉冲激光，由脉冲激光在待测样品表面上激发出荧光，通过分立荧光光谱及荧光寿命探测系统，得到不同波长下随时间变化的荧光光强信息；并对所述信息进行数据分析后得到不同波长下的荧光寿命；

(e)沿x和y方向扫描待测样品，重复上述步骤，在每一个扫描点(x _i , y _i )位置处利用共焦探测系统确定待测样品在该位置处的表面信息，并利用分立荧光光谱及荧光寿命探测系统测量从该位置处激发出来的荧光在不同波长下的荧光寿命；

(f)将得到的待测样品在每一个扫描点(x _i , y _i )位置的表面位置信息和对应的荧光寿命信息进行重构，同时得到被测样品的三维形貌轮廓及其表面各点在不同波长下的荧光寿命。

9.根据权利要求8所述的分光瞳共焦分立光谱分立荧光光谱及荧光寿命探测方法 ，其特征在于：共焦曲线I(z)的最大值对应探测光束光斑精确聚焦在待测样品表面，此处聚焦光斑尺寸最小，探测区域最小，共焦曲线I(z)的其他位置对应探测光束聚焦在偏离表面的位置处，光斑尺寸随着共焦曲线I(z)的值减小而增大；当测量某表面位置处不同波长下的荧光寿命时，根据共焦响应曲线I(z)控制探测光束在待测样品的表面光斑大小，进而根据实际测量需求控制聚焦光斑的尺寸，实现对待测样品探测区域大小的可控。

10.分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法，其特征在于：

(a)通过第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束，所述脉冲激光和连续激光波长相同；所述合成光束经过扩束镜扩束后经过照明光瞳，由物镜会聚形成探测光束照射在待测样品上；定义垂直于所述物镜光轴的两正交方向分别为x和y方向，沿物镜光轴的方向为z方向；

(b)光束照射样品产生的后向散射光和从待测样品激发出来的荧光一起通过物镜收集后，经过收集光瞳，由一号反射镜反射；由一号反射镜反射的光束经过一号二向色分光镜后分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束；所述本征光束进入共焦探测系统，所述荧光光束进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

(c)打开连续激光光源，沿x和y方向移动待测样品至横向扫描起始位置(x ₁, y ₁)，然后在该位置沿z方向扫描待测样品，利用共焦探测系统测得随扫描位置变化的共焦响应曲线I(z)，进而根据共焦响应曲线I(z)的峰值响应点精确确定探测光束聚焦在待测样品的表面位置；

(d)根据步骤(c)测量结果移动待测样品，使得探测光束聚焦在待测样品表面，由连续激光光源发出的连续激光在待测样品表面上激发出荧光，通过分立荧光光谱及荧光寿命探测系统，得到不同波长对应的荧光光强信息，并对其进行分析得到分立荧光光谱信息；

(e)沿x和y方向扫描待测样品，重复上述步骤，在每一个扫描点(x _i , y _i )位置处利用共焦探测系统确定待测样品在该位置处的表面信息，并利用分立荧光光谱及荧光寿命探测系统测得从该位置处激发出来的分立荧光光谱信息；

(f)将得到的待测样品在每一个扫描点(x _i , y _i )位置的表面位置信息和对应的分立荧光光谱信息进行重构，同时得到被测样品的三维形貌轮廓及其表面各点的分立荧光光谱。

Images