JP2005526255A - 試料検査のための方法および装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】試料が少なくとも1つの切断面で点状または線状に走査され、走査の間試料から発せられるビームが分散および分解され、分解されたビームが少なくとも1組の検出素子DEにより波長別に検出され、これらの検出素子DIの少なくとも1つおよび/またはその他検出素子の少なくとも1つにより記録および保存された強度分布を手掛かりとして、試料から反射したビームに関し、予備保存された2次元または3次元の幾何学形状対象物に相当する、または類似する2次元または3次元の試料部分の選択が画像加工を通して行われる、およびこれら試料領域の少なくとも一部について、それらに配置された蛍光マーカーを基にスペクトル像および/または立体スペクトル配列の分析が行われる方法および/または装置。
Description
LSMは大きく分けて次の4モジュールから成っている:光源、走査モジュール、検出ユニット及び顕微鏡。これらのモジュールは以下により詳しく説明する。それに加え、DE19702753A1も参考になる。
したがって、LSMは厚いプレパラートの検査に適している。
色素の放射特性に合わせたダイクロイックフィルタにより、それぞれの色素から放出された蛍光だけを点像検出器で測定することが可能になる。
放射強度が波長別に表わされている。ナンバー1〜4の色素間には、それぞれ放射スペクトルの位置及び形態に差のあるのが認められる。
現状技術に基づく放出信号のスペクトル分離は、現状技術レベルでは次の2つのカテゴリーに分類することができる:
1)スペクトル分散素子と単色検出器との組み合せ
2)干渉分光法
3)マルチトラッキング、すなわち、異なった吸収特性を持つ色素の分離のための、画像または走査線記録に基づく励起波長の変更(当方の出願において参照指示)
1)色素副成分および放出フィルタの利用による蛍光放出のスペクトル分離
A1およびB3に記述された方法は、ツアイス社のレーザ走査型顕微鏡LSM510に適用されている。細胞およびその他粒子の分析および分類には細胞流量計が用いられる。そのためには、試料を液体で溶液化または懸濁化させ、毛管を通してポンピングする。
したがって、高感度の検出が必要になる。検出量を制限するため、現状技術では共焦点検出が行われている。
M.R.Melamed、T.Lindmo、M.L.Mendelsohn著、"Flows Cytometry and Sorting"(Wiley & Sons社刊/ニューヨーク、1990年発行、81〜107ページ)
本構造は本質的にはサーニー・ターナー構造に基づくものである。共焦点検出の場合、試料からの光Lはピンホールレンズ系POにより共焦点絞りPHを通され集束する。ノンデスキャン検出で多光子吸収の場合には、この絞りは不要である。第1の結像鏡S2は蛍光をコリメートする。
それにより、個別チャネル内の光子の計数も制限なく行える。計数された光子は、続いて加算することができる。その場合、検出器としては主にAPD(アバランシェフォトダイオード)が使用されよう。
上記方法で記録されたラムダスタックにより、隣接する非常に狭い波長領域からの蛍光強度の値を含んだx−y画像の積層が得られる。
このラムダスタックの記録とz積層又は/及び時間列とを組合せば複雑なデータが得られる。
a)ラムダ最大値の投影
ここではラムダスタックからグレー階調画像を生成する。それには、各画素のx、yポジション毎にその波長領域について、投影画像の当該画素強度を定義付けする強度最大値を求める。
この場合もa)と同様に投影されたラムダ最大値を算出し、各画素に対して、ラムダスタックの明度最高画素を生む波長領域の平均波長に相当する色素を付与する。
ここではラムダスタックの個別画像を少なくとも一部はシリーズで表示する。その場合、個々の画像毎に、強度が記録されている領域の平均波長を付記表示することもできる。
xyラムダスタックをz又は/及び時間の関数で記録する場合、画面内にそれぞれシリーズ形式でz平面又は時点を表示させるにはスライダを使用することができる。別な形式では、スペクトルの異なる画像を横列に、時間又はz平面の異なる画像を縦列に表示することにより、記録されたxy画像をすべて同時に表示することができる。次の観察画面間で選択することができる:xy−λ、xy−z、xy−t、xy−λ−z、xy−λ−t、xy−z−t
尚、挙げていない次元はスライダによって開けることができる。
ラムダ最大値又はコード化ラムダの投影と横列及び縦列の表示画面観察との組合せにより、xy−z−t−λ情報の同時表示が可能になる。
これは、自由にポジショニングできる水平標識線と垂直標識線をそれぞれ一つずつ持つラムダスタックの選択λ平面を示している。ラムダスタックがこれらの線によって切断され、生じた切断像がλ平面の横(y切断面)及びλ平面の上(x切断面)に投影される。擬似/真正色のコード化は自由選択により実施できる。この場合各波長領域に対応のスペクトル色素があてがわれる。画像内の個別色素成分の重なりによって、色に忠実な試料像が作られる。
参照スペクトルは、例えば純流動状態にある、あるいは試料条件下にある、即ち溶剤に溶かされた、または検査試料の不連続個別領域で試料構造に結合している、個々の色素の放出スペクトルである。参照スペクトル生成のための画像領域の選択は、対象領域(Regions of interest ROI)の定義付けを通して以下の方法により行うことができる。
ラムダスタックは各画素毎のスペクトル情報を補足資料として含んでいる。
様々なROIに対する第2調整法では蛍光重心(DE10033180A1)の測定が行われる。その場合、検出器内では励起レーザ光線で照射されるすべての個別チャネルのスイッチが遮断される。各ROIは、使用されるそれぞれの色素の放射特性に変化が現われるため特徴的な蛍光重心を有している。
したがって、それぞれのROIは特徴的な色素重心の位置によって区別し、明確に分離することができる。
視覚的に具象化されたスペクトル像1により、選択試料箇所に於ける蛍光放射線のスペクトル分布が解明される。
様々なROIのスペクトル像は、図9に示されているように、カラーコード化された多重チャネル画像(「チャネル別抽出」用操作素子、図8No.4)の生成に利用できる。そのような多重チャネル画像(図9b)の生成では、スペクトル像から波長領域を選択し(図9a:ROI1〜5)、例えば、当該波長領域に於ける各画像点の総和又は平均値から当該平面に於けるラムダスタックの強度レベルを求めることができる。但しここでは、各画像チャネルは1色素を表わしている(チャネル1〜チャネル5)。
分析は定量的又は定性的に行うことができる。定量分析では画像点毎に、試料から放射された総蛍光信号に対する各個別色素の割合(即ち濃度)を計算する。例えば、成分分解分析のための一次関数式(文献:Lansfordその他著“Journal of Biomedical Optics”(「バイオメディカル光学ジャーナル」)第6巻(第3号)311〜318ページ、2001年7月刊)が使用される。
選択されたROIのスペクトル像がそれぞれ、使用された試料内色素のまさに1色素の放射信号(参照信号)だけを表わしている場合では、放射信号の定量分析(例えばデジタル式成分分解、図(図5))にこの方法を使用すれば非常に有利になる(図12a)。その場合の入力データは、基礎となるラムダスタック及びn個の選択試料箇所(ROI)のスペクトル像である。尚、nは試料に使用した色素数である。定量分析(例えば、成分分解)の結果は、それぞれ1色素の放射信号情報しか含まないn個の個別チャネルからの画像である。
λスタック
検出チャネルで検出した光線を分散分割下で測定し、少なくとも1つの補助的(画像点)座標x、yおよび/またはzおよび/または測定時間tへ分類の上、記憶素子に保存した画像点毎のスペクトル分布
試料からの総信号(例えば、蛍光信号)に対する各スペクトル像の持分(割合)を画像点毎に計算する(成分分解法)。この計算は、個々のスペクトル発光体(例えば、色素)のスペクトルを特徴付け、画像を生成する(ROI)データバンクに保存されている、又は定性分析(PCA)により生成される参照スペクトルによって行われる。
試料の画像表示に於いて色をそれぞれの選択スペクトル領域に振り分ける(擬似色表示)。その場合、例えば然るべきフィルタ使用のもと複数の検出チャネルで測定した色強度は、色素/スペクトル特性の割合に一致している。
試料領域に複数のスペクトル像/色素が含まれていれば、複数色の画像表示が重なったカラーコード化画像(配合画像)が生成される。
試料からの総信号に対して最大の関与割合を持つスペクトル像/色素を各画像点に振り当てる。
異なった箇所のスペクトル像/色素を別々の色で表示する。その場合、強度はそれぞれ均等にする。
オペレータによって選択、マーキングされた領域。その場合、同一のスペクトル像/色素領域は定性分析により自動的に検索、マーキングできる。
1)試料の調製
第1ステップでは、検査対象試料をその固有特性に基づき複数の色素でマーキングする。試料は、例えば、FISH(本来の状態でのハイブリッド蛍光性)技術によって着色した染色体の場合もあり得る。細胞または組織も同様に蛍光技術により着色することができる(例えば、免疫細胞学および免疫組織化学の観点から着色)。この着色技術により、生物学上重要な試料情報がコード化される。
検出システムの観点から最も簡易な例は、1次元空間の試料である(例えば、細胞流量計)。その場合、試料内に含まれる情報は、異なった色素の配合比率だけでコード化される(図14)。図の着色では構造的特徴S1、S2およびS3が色素A、BおよびCでマーキングされている。色素間の区別は、それぞれの特徴的な吸収スペクトルまたは放出スペクトルを手掛かりに可能である。したがって、スペクトル(スペクトル像)の同定から、特定の構造的特徴の存在が推察できる。
ここでは試料を7ステップで検査および評価するのが有利である。
ステップ1:ラムダスタックの記録
試料を上記(指摘)の検出器によって検査する。
その場合、スペクトル分離された個々の測定画像点よりラムダスタック、すなわち、少なくとも1つの補助的座標(画像点の座標x、yおよび/またはZ、および/または測定時間t)への組込のもとで記憶素子に保存された試料点毎のスペクトル分布、が得られる。
使用色素参照スペクトルの検査条件下での捕捉
参照スペクトルとは、例えば検査条件下での、すなわち溶剤に溶かされた、または組織に結合した個別色素の放出スペクトルである。それはラムダスタックを手掛かりに定義付けされる。すなわちそれは、少なくとも1つの補助的座標(画像点の座標x、yおよび/またはZ、および/または測定時間t)への組込のもとで記憶素子に保存された試料点毎のスペクトル分布である。
対象物の検知(図20A)
試料の検査対象要素(例えば腫瘍細胞などの細胞、細胞構成成分、図16Aに図示されているような染色体)の選択における分析方法(バイナリ化、セグメント化)の適用
着色マーキングされた丸い腫瘍細胞は、例えばその形態を手掛かりに選択される。
ステップ4
成分分解(図SOB、C)
当ステップの目的は、多重マーキングした試料からの多重チャネル画像の生成である。その場合、当方法により、これら色素の全放出信号を擬似色チャネルに正確に振分け得ることが極めて重要である。なお、放出信号は強くオーバラップする可能性がある。多重チャネル画像の生成には2つの方法を適用することができる:
それに代わり、背景信号から試料について追加情報を得ることもできる。
線形成分分解には、ラムダスタックからの多重チャネル画像を成分分析原理(PCA)によって得ることもできる。
そのようにして得られた多重チャネル擬似色画像は、試料の上記情報をすべて有している。それに基づき、試料内の構造的特徴分布を推論することが可能である。
対象物の分析(図16および20C)
ここでは、予め定義付けされた対象物について、その構造的特徴の分布が検査される。そのため、対象物の様々な部分で擬似色チャネル(ステップ4参照)の強度が測定される。その位置は、所期通りの内容を持つ試料情報が得られるように選択される。
分類
分類の目的は、試料をその構造的特徴分布に基づいて区別し、各種種属に組み込むことである。
種属は、試料の構造的特徴における特定組み合せの存在により定義付けされる。
分類ではスペクトル情報の補足のため、少なくとも1つの追加座標(画像点[座標x、y]および/またはZおよび/または時間t)が使用される。
もちろん、試料の分類が必要ない課題もあり得る。
評価
当分類により、試料特性または試料特性の組み合せを具現する種属を求めることができる。
評価では場合により様々な課題が出される。例えば、試料が既知の種属に分類可能かどうかが問題になることがある。試料が種属分類できるのであれば、通例、1種属に組入れられる試料数はどの程度かが関心事になる。この情報は様々な方法で描くことができる。
それには、主としてヒストグラムが使用される(図20D参照)。
当ヒストグラムには、種属によって異なる組込頻度が描かれている。
図20には、そのほか、上記操作ステップの要約説明がなされている。
空間的広がりは、例えば検出チャネルからのコントラスト分析による画像加工を通じて求めることができる。
この場合、滞留時間に依存する画像点当りの強度分布は選択的に、すなわち、選択された波長または波長領域毎に求めることができる。
折れ曲がった染色体は、例えば検索および同定には有利であり、またスペクトル評価には伸ばすこともできる。
PMT5 点像検出器
EF5 ダイクロイックフィルタ
MDB ダイクロイック・ビームスプリッタ
DBS2 ダイクロイック・ビームスプリッタ
PH3 共焦点絞り
PMT4 点像検出器
EF3 ダイクロイックフィルタ
A レーザ
PO 結像レンズ系
PH 絞り
DI 角分散素子
DE ライン検出器
Claims (17)
- 画像形成顕微鏡システム、それも特にレーザ走査型顕微鏡による蛍光性試料の検査のための方法および/または装置であって;
試料が少なくとも1つの切断面で点状または線状に走査され、走査の間試料から発せられるビームが分散および分解され、分解されたビームが少なくとも1組の検出素子により波長別に検出され、これらの検出素子の少なくとも1つおよび/またはその他検出素子の少なくとも1つにより記録および保存された強度分布を手掛かりとして、試料から反射したビームに関し、予備保存された2次元または3次元の幾何学形状対象物に相当する、または類似する2次元または3次元の試料部分の選択が画像加工を通して行われる、およびこれら試料領域の少なくとも一部について、それらに配置された蛍光マーカーを基にスペクトル像および/または立体スペクトル配列の分析が行われる方法および/または装置。 - 撮影が複数の切断面で行われ、その試料内分布の3次元画像が保存され、試料点または試料領域毎に検出、保存された試料光のスペクトル分布が、試料内分布に振り分けられる、請求項1に記載の方法。
- 測定によって得られたスペクトル像および/またはスペクトル配列が予備保存されている値と比較され、その比較に基づき予備保存された値に振り分けられる、先行請求項の1つに記載の方法。
- 試料領域の幾何学特性および/またはスペクトル特性についての測定が時間別に行われる、先行請求項の1つに記載の方法。
- 3次元対象物のスペクトル分析の前にその形態が変えられる、それも特に平面的広がりの方向において変えられる、先行請求項の1つに記載の方法。
- 参照スペクトルが、試料上に存在する蛍光マーカーに基づき生成される、先行請求項の1つに記載の方法。
- 幾何学形態の計測が、複数の検出波長領域で行われる、先行請求項の1つに記載の方法。
- 検出が、受信器走査線、特に多重チャネルPMTまたはダイオード走査線を通じて行われる、先行請求項の1つに記載の方法。
- 下記のステップ、すなわち
a)試料および/または参照試料におけるラムダスタックの記録
b)使用する色素および/または色素配合の参照スペクトルの捕捉
c)試料の検査対象要素/領域の選択用としての、例えばバイナリ化またはセグメント化などの画像分析方法による対象物の検知
d)試料の擬似色チャネル表示のための試料のラムダスタックの成分分解
e)構造的特徴分布状態の測定
f)試料の構造的特徴が特定的な組み合わせで存在することによる種属の定義付け
g)測定試料の種属分類を特徴とする、特に先行請求項の1つに記載の、細胞、組織または有機体の分類方法。 - 検査対象試料が、染色体である、請求項9に記載の方法。
- 検査対象試料が、FISH技術(例えば、マルチカラーバンディング)の利用によって着色された染色体である、請求項10に記載の方法。
- 細胞、組織または有機体が、免疫細胞学または免疫組織化学の観点から着色されている、請求項9に記載の方法。
- 医療診断および/または治療のための、先行請求項の1つに記載の方法。
- 生体インジケータの利用による環境診断(例えば、水、土壌、空気)のための、先行請求項の1つに記載の方法。
- 腫瘍の診断のための、先行請求項の1つに記載の方法。
- 骨髄細胞の診断および洗浄のための、先行請求項の1つに記載の方法。
- 細胞流量計または光学近視野顕微鏡における、先行請求項の1つの適用。
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