JP5445135B2

JP5445135B2 - 蛍光顕微鏡

Info

Publication number: JP5445135B2
Application number: JP2009543835A
Authority: JP
Inventors: 豊佐々木
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2007-11-27
Filing date: 2008-11-19
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2028-11-19
Also published as: WO2009069675A1; US8451533B2; JPWO2009069675A1; US20110043907A1

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、波長特性を表示する表示装置を有する蛍光顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光顕微鏡では励起フィルタ、吸収フィルタもしくはバリアフィルタ、及びダイクロイックミラー等の波長特性を有する光学素子が光路中に配置されて所望の蛍光を検出装置で検出しモニター等の表示装置に表示し、観察者が観察していた（例えば、特開平１１−２２３７７３号公報参照）。
【０００３】
しかしながら、従来の蛍光顕微鏡では、所望の蛍光を検出するために光路中に挿入する励起フィルタ、吸収フィルタもしくはバリアフィルタ、及びダイクロイックミラー等の波長特性と所望の蛍光の波長特性とがスペック表としてカタログなどで個別に与えられるのみである。従って、ユーザは蛍光顕微鏡で観察できる蛍光像がどの波長帯域の波長特性を持つものか、すなわち前もって所望の波長領域の蛍光像が得られるか否かを視覚的に知ることができないと言う課題がある。
【発明の開示】
【０００４】
そこで本発明は、上記課題に鑑みて行われたものであり、光学系の光路に配置されるレンズ、フィルタ、あるいはビームスプリッタ等の波長特性と蛍光色素との波長特性とから、所望の波長領域の蛍光像を取得ができるか否かを前もって視覚的に知ることを可能にする蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【０００５】
上記課題を解決するため、本発明は、
励起光を標本に照射する照明光学系と、
前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、
前記蛍光検出光学系を介して前記蛍光を検出する検出部と、
前記蛍光検出光学系の光路に配置され得る複数の光学部材と、
前記複数の光学部材から選択された光学部材の組み合わせが前記蛍光検出光学系の光路に配置されたときに前記検出部が検出可能な前記蛍光の波長範囲を、前記光学部材の波長特性に基づいて演算する制御手段と、
前記演算された前記波長範囲を表示する表示手段と、を具備することを特徴とする蛍光顕微鏡を提供する。
【０００６】
本発明によれば、光学系の光路に配置されるレンズ、フィルタ、あるいはビームスプリッタ等の波長特性と蛍光色素との波長特性とから、所望の波長領域の蛍光像を取得ができるか否かを前もって視覚的に知ることを可能にする蛍光顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１は、実施の形態にかかる蛍光顕微鏡の概略構成図を示す。
図２は、励起用ダイクロイックミラーの波長透過率特性の一例を示す。
図３は、第１ダイクロイックミラーの波長透過率特性の一例を示す。
図４は、第１吸収フィルタの波長透過率特性の一例を示す。
図５は、第２ダイクロイックミラーの波長透過率特性の一例を示す。
図６は、第２吸収フィルタの波長透過率特性の一例を示す。
図７は、第３吸収フィルタの波長透過率特性の一例を示す。
図８は、光路中に配置されたダイクロイックミラー、吸収フィルタの波長透過率特性を重ねて表示した一例を示す。
図９は、ダイクロイックミラーと吸収フィルタの合成波長透過率特性の一例を示す。
図１０は、合成波長透過率特性と蛍光色素の発光特性を重ねて表示した一例を示す。
図１１は、カラーバーと共に各光学部材の合成波長透過範囲を表示した一例を示す。
図１２は、実施の形態の変形例のモニター画面例を示す。
図１３は、実施の形態にかかるコンフォーカル顕微鏡の概略構成図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の一実施の形態について図面を参照しつつ説明する。なお、以下の実施の形態は、発明の理解を容易にするためのものに過ぎず、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な付加・置換等を施すことを排除することは意図していない。
【０００９】
図１は、実施の形態にかかる蛍光顕微鏡の概略構成図を示す。図２は励起用ダイクロイックミラーの波長透過率特性の一例を示す。図３は第１ダイクロイックミラーの波長透過率特性の一例を示す。図４は第１吸収フィルタの波長透過率特性の一例を示す。図５は第２ダイクロイックミラーの波長透過率特性の一例を示す。図６は第２吸収フィルタの波長透過率特性の一例を示す。図７は第３吸収フィルタの波長透過率特性の一例を示す。図８は光路中に配置されたダイクロイックミラー、吸収フィルタの波長透過率特性を重ねて表示した一例を示す。図９は、ダイクロイックミラーと吸収フィルタの合成波長透過率特性の一例を示す。図１０は合成波長透過率特性と蛍光色素の発光特性を重ねて表示した一例を示す。
【００１０】
図１において、励起用のレーザ光源１から出射されたレーザ光（例えば、波長λ１＝４０８ｎｍ）は、ミラー２によってダイクロイックミラー３方向に反射され、ダイクロイックミラー３を透過して、ダイクロイックミラー４でエキスパンダレンズ５方向に反射される。また、励起用のレーザ光源６から射出されたレーザ光（例えば、波長λ２＝４８８ｎｍ）は、ダイクロイックミラー３でダイクロイックミラー４方向に反射され、ダイクロイックミラー４でエキスパンダレンズ５方向に反射される。また、励起用のレーザ光源７から射出されたレーザ光（例えば、λ３＝６３３ｎｍ）は、ダイクロイックミラー４を透過してエキスパンダレンズ５に入射する。３つの励起用のレーザ光源１、６、７から射出したそれぞれのレーザ光は、合成されてエキスパンダレンズ５に入射する。この様にして励起用レーザ光源装置１１０が構成されている。なお、励起用のレーザ光源は３つに限定されず適宜変更可能である。
【００１１】
エキスパンダレンズ５で拡大され略平行にされた合成レーザ光は、励起用ダイクロイックミラー８に入射し、対物レンズ９方向に反射され、対物レンズ９でステージ１０に載置された標本１１に集光される。励起用ダイクロイックミラー８は、図２に示す波長透過率特性８（部材と同じ符号を付して説明する。他も同様とする）を有し、波長λ１、波長λ２、および波長λ３のレーザ光を反射し標本１１に照射する。図２において、縦軸は透過率（単位：％）を、横軸は波長（単位：ｎｍ）を示し、これは以降の図においても同様であり、以降の図では説明を省略する。
【００１２】
標本１１に入射した励起用のレーザ光で励起された蛍光は、図１に示すように対物レンズ９で集光され励起用ダイクロイックミラー８を透過して第１ダイクロイックミラー１２に入射する。また標本１１で反射された合成レーザ光は、励起用ダイクロイックミラー８でエキスパンダレンズ５方向に反射される。エキスパンダレンズ５から対物レンズ９で照明光学系１２０が構成されている。
【００１３】
第１ダイクロイックミラー１２は、図３に示す波長透過率特性１２を有し、略４９０ｎｍ以下の波長の光を第１吸収フィルタ１３方向に反射し、これを超える波長の光を透過する。第１吸収フィルタ１３は図４に示す波長透過率特性１３を有し、略４２０ｎｍから略４７０ｎｍの光を透過し、この範囲を超える波長の光を反射する。図１に示すように第１吸収フィルタ１３を透過した光は、集光レンズ１４で集光され第１ホトマルチプライヤ１５（以後「ＰＭＴ」と略記する）で光強度が検出される。対物レンズ９からＰＭＴ１５で第１検出光学系１３０が構成されている。この様に、第１検出光学系１３０は、標本１１において波長λ１（４０８ｎｍ）の励起用レーザ光で励起されて発現した第１の蛍光を検出する。
【００１４】
また、波長特性の異なる複数の第１ダイクロイックミラー１２を光路に交換可能に不図示の電動ターレットに装着し、ターレットを回転させた際に光路に挿入されている第１ダイクロイックミラー１２を検出するフォトカプラーや電気スイッチなどの検出手段を設け、例えばパーソナルコンピュータ等から構成される制御装置２３（以後単に「ＰＣ」と記す）でターレットの回転制御や第１ダイクロイックミラーの検出をするように構成する。
【００１５】
図１に示すように第１ダイクロイックミラー１２を透過した光は、第２ダイクロイックミラー１６に入射する。第２ダイクロイックミラー１６は、図５に示す波長透過率特性１６を有し、略４５０ｎｍ以下の波長の光を第２吸収フィルタ１７方向に反射し、これを超える波長の光を透過する。第２吸収フィルタ１７は図６に示す波長透過率特性１７を有し、略４９５ｎｍから略５５０ｎｍの光を透過し、この範囲を超える波長の光を反射する。図１に示すように第２吸収フィルタ１７を透過した光は、集光レンズ１８で集光され第２ＰＭＴ１９で検出される。対物レンズ９からＰＭＴ１９で第２検出光学系１４０が構成されている。この様に、第２検出光学系１４０は、標本１１において波長λ２（４８８ｎｍ）の励起用レーザ光で励起されて発現した第２の蛍光を検出する。
【００１６】
なお、第１ダイクロイックミラー１２と同様に、波長特性の異なる複数の第２ダイクロイックミラー１６を光路に交換可能に不図示のターレットに装着し、ターレットを回転させた際に光路に挿入されている第２ダイクロイックミラー１６を検出するフォトカプラーや電気スイッチなどの検出手段を設け、ＰＣ２３でターレットの回転制御や第２ダイクロイックミラー１６の検出をするように構成する。
【００１７】
図１に示すように第２ダイクロイックミラー１６を透過した光は、第３吸収フィルタ２０に入射する。第３吸収フィルタ２０は図７に示す波長透過率特性２０を有し、略６５０ｎｍを超える光を透過し、これ以下の波長の光を反射する。図１に示すように第３吸収フィルタ２０を透過した光は、集光レンズ２１で集光され第３ＰＭＴ２２で検出される。対物レンズ９からＰＭＴ２２で第３検出光学系１５０が構成されている。この様に、第３検出光学系１５０は、標本１１において波長λ３（６３３ｎｍ）の励起用レーザ光で励起されて発現した第３の蛍光を検出する。
【００１８】
各ＰＭＴ１５、１９、２２で検出された蛍光による信号は、それぞれＰＣ２３に送られ、ＰＣ２３で画像処理され、モニター２３ａに表示される。この様にして、実施の形態にかかる蛍光顕微鏡１００が構成されている。
【００１９】
なお、上記説明において、照明光学系１２０、第１検出光学系１３０、第２検出光学系１４０、および第３検出光学系１５０は一部の光学系を共有して構成されている。
【００２０】
本実施の形態にかかる蛍光顕微鏡１００では、図２、図３、及び図５に示す各ダイクロイックミラー８，１２、及び１６や図４、図６、及び図７に示す各吸収フィルタ１３、１７、及び２０の波長透過率特性がＰＣ２３の記憶部に記憶してあり、光路に挿入されたダイクロイックミラー、及び吸収フィルタの波長透過率特性を表示手段であるＰＣ２３のモニター２３ａに表示することができるように構成されている。ここでＰＣ２３は、波長透過率特性を表示する表示装置として機能する。
【００２１】
例えば、図８に示すように、光路に挿入されている各ダイクロイックミラー８，１２、及び１６、及び各吸収フィルタ１３、１７、及び２０の波長透過率特性を重ねてモニター２３ａに表示し、透過する波長の範囲を示すことによりＰＭＴ１５、１９、２２で検出できる波長範囲を使用者が視覚的に確認することを可能にしている。
【００２２】
また、図９に示すようにＰＣ２３は、演算手段で各波長透過率特性を掛け算し合成した結果をモニター２３ａに表示することができ、透過する波長の範囲を視覚的に確認することができる。図９は、図８に示す各波長透過率特性を掛け算して合成した結果を示す。図９において、（１２×１３）は第１ダイクロイックミラー１２と第１吸収フィルタ１３の波長透過率特性を演算して得られた波長透過率特性を示し、（１６×１７）は第２ダイクロイックミラー１６と第２吸収フィルタ１７の波長透過率特性を演算して得られた波長透過率特性を示し、（１６×２０）は第２ダイクロイックミラー１６と第３吸収フィルタ２０の波長透過率特性を演算して得られる波長透過率特性をそれぞれ示している。この様に各波長透過率特性を合成することでグラフが１本となり、使用者はダイクロイックミラーと吸収フィルタが検出しようとしている蛍光色素に対応したもの否か、そして実際に蛍光画像として取得できるか否かを視覚的に判断することができる。
【００２３】
また、ＰＣ２３は各種の蛍光色素の蛍光波長特性が予め入力されたメモリに有しており、ユーザが標本１１に投入した蛍光色素の蛍光波長特性をＰＣ２３のメモリに入力することで、図１０に示すように蛍光顕微鏡１００側の各種光学部材の合成波長透過率特性（１３×１３）、（１６×１７）、（１６×２０）と共に、投入された蛍光色素のλ１蛍光、λ２蛍光、λ３蛍光をそれぞれ重ねてモニター２３ａに表示する。
【００２４】
また、ＰＣ２３の演算手段では、投入された蛍光色素の蛍光波長と、蛍光顕微鏡１００側の合成波長透過特性とを比較し、蛍光色素の蛍光波長が検出できない場合にはユーザに対して、どの蛍光色素の蛍光波長が検出できないかを報知する警告表示をモニター２３ａに表示する。モニター２３ａに表示される警告表示としては、例えば、現状、検出不可能として表示された蛍光色素を検出するのに適した光学部材種類の組み合わせおよびそれらの波長特性を具体的に報知する。
【００２５】
ここで、蛍光色素の蛍光波長特性は、最大発光強度を１００（％）として規格化することで合成波長透過率特性と重ねて表示することを可能にしている。これにより図１０の実線で示す各光学部材（１２×１３）、（１６×１７）、（１６×２０）による合成波長透過率特性と、各波長λ１、λ２、λ３による各蛍光波長特性との関係を視覚的に確認することができる。この結果、所望の蛍光を検出することができるか否かを、励起レーザ光１，６，７を標本１１に照射する前に確認することができ、蛍光検出ミスを防止することができる。
【００２６】
また、表示装置（モニター２３ａ）は図１１に示すように、カラーバーＣＢと共に各光学部材（１２×１３）、（１６×１７）、（１６×２０）による合成波長透過範囲を枠表示することで、より視覚的に認識できる。また、合成波長透過範囲を枠表示により視覚的に認識できるようにしたが、例えば、枠表示に代えて色の濃淡によりその範囲を識別できるようにしても良い。
【００２７】
なお、上述の説明では、３つのダイクロイックミラー、３つの吸収フィルタ、および３つの蛍光色素（３つの励起レーザ光）について説明したが、ダイクロイックミラー、吸収フィルタ、および蛍光色素の組合せは自由であり、光路に挿入されているダイクロイックミラー、吸収フィルタ、および蛍光色素の各波長特性を自動、または手動で指定することで、検出可能な蛍光の波長範囲を事前に確認することができる。
【００２８】
また、ＰＣ２３は、ダイクロイックミラー、吸収フィルタに限らず、蛍光顕微鏡１００が持っている光学部材、例えばエキスパンダレンズ、コンデンサレンズ、励起フィルタ、対物レンズ、集光レンズ等の波長透過率特性、受光素子の波長感度特性などをメモリに記憶しておき、上述の如く合成してモニター２３ａに表示することで、使用者はより正確に自分の使用したい蛍光色素に対応した光学部材を選択・設定すること、あるいは使用する光学系において蛍光色素からの蛍光を検出可能か否かを事前に知ることができる。
【００２９】
（変形例）
次に、本実施の形態の変形例について説明する。図１２は、実施の形態の変形例のモニター画面例を示す。
【００３０】
図１２に示す実施の形態の変形例は、ユーザがセットした各種フィルタ、ダイクロイックミラーの組合せによる蛍光検出波長範囲の候補をモニター２３ａ上に示し、その候補の中から所望のものを選択・決定することで、最終的にダイクロイックミラーと各種フィルタとのセットが顕微鏡に設定される。
【００３１】
具体的には、ユーザが図１に示す光学部材２〜４，１２，１３，１６，１７，２０等の複数の組合せを任意に設定した時々に応じて、図１２のように蛍光検出波長範囲の表示をモニター２３ａ上に選択候補として複数表示し、その組合せをＰＣ２３の記憶部に記憶する。なお、図１２では、この候補として２つの候補を表示しているが、３つ以上でもよい。モニター２３ａ上に表示される候補数は、光学部材の組合わせによって（ユーザの設定）決まる。そして、ユーザはモニター２３ａに表示された蛍光検出波長範囲の候補から、最終的に所望するフィルタの組合せを選択し、例えばモニター２３ａ上のチェック欄「□」にチェックを入れることで、候補の選択を完了する。
【００３２】
これにより、種々の蛍光検出波長範囲の候補の中から、ユーザが実験に最適な蛍光検出範囲の光学部材（バリアフィルタ、励起フィルタ、ダイクロイックミラーなど）の組合せを選択できる。
【００３３】
次に、本実施の形態にかかるコンフォーカル顕微鏡について説明する。図１３は、実施の形態にかかるコンフォーカル顕微鏡の概略構成図である。
【００３４】
図１３において、本コンフォーカル顕微鏡は、顕微鏡本体２００とレーザ光源ユニット２１０とセンサユニット２２０とから構成されている。顕微鏡本体２００は、ピンホール２０１、光学部材であるダイクロイックミラーターレット２０２（複数の異なる波長特性を有するダイクロイックミラーを含む）を備える。また、レーザ光源ユニット２１０は、レーザ光源２１３〜２１５の異なる３つの励起光源と、それぞれレーザ光源の前に設置されてレーザ光の遮断/開放を制御するシャッタ２１６〜２１８と、光学部材である励起フィルタ２１１、２１２とを備える。また、センサユニット２２０は、フィルタブロック２６１、２６２（複数の異なる波長特性を有するフィルタキューブ（ダイクロイックミラーとバリアフィルタの組合せから構成）を含む）を備える。光ファイバー２３０，２４０によって、顕微鏡本体２００とレーザ光源ユニット２１０やセンサユニット２２０が光学的に接続される。
【００３５】
これら光学部材は、ターレット上に配置され、手動もしくはモータにより駆動され、所望のものが選択できる。同様に、励起フィルタ２１１，２１２を選択するためにシャッタ２１６〜２１８の１つが開放され、他が遮断される。上述した図１と同様に、これら光学部材の波長透過率特性データは、コントローラ３００の記憶部に記憶されており、これら光学部材の選択（シャッタ２１６〜２１８の選択含む）は、コントローラ３００により制御され、光学部材の設定が電気制御される。
【００３６】
従って、上述した図１２の如く、蛍光検出波長範囲の候補がモニター２３ａ上に表示され、ユーザが所望する候補を選択すると、コントローラ３００が最適な光学部材を設定する。
【００３７】
このように、本コンフォーカル顕微鏡では、複雑に各種波長特性を有する光学部材が配置されているが、本発明の如く構成すれば、ユーザが所望する蛍光検出波長範囲を素早く設定することができる。また、ＰＭＴ（センサ）２５１は、設定された光学部材の波長特性によってはセンサに届く光がこれら光学特性の影響を受けるので、その影響された分のゲイン調整（露光時間調整など含む）がコントローラ３００により行われる。
【００３８】
なお、本実施の形態にかかる表示装置は、上述のレーザ蛍光顕微鏡のみならず、落射蛍光顕微鏡、透過蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡、共焦点走査型蛍光顕微鏡等、各種の蛍光顕微鏡の表示手段として使用することが可能である。

Claims

励起光を標本に照射する照明光学系と、
前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、
前記蛍光検出光学系を介して前記蛍光を検出する検出部と、
前記蛍光検出光学系の光路に配置され得る複数の光学部材と、
前記複数の光学部材から選択された光学部材の組み合わせが前記蛍光検出光学系の光路に配置されたときに前記検出部が検出可能な前記蛍光の波長範囲を、前記光学部材の波長特性に基づいて演算する制御手段と、
前記演算された前記波長範囲を表示する表示手段と、を具備することを特徴とする蛍光顕微鏡。
前記蛍光検出光学系および前記検出部を、それぞれ複数具備し、
前記表示手段は、前記複数の検出部が検出可能な前記蛍光の前記波長範囲を同一画面上に表示することを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
前記表示手段は、前記標本に投入された蛍光色素の蛍光波長と、前記検出部が検出可能な前記蛍光の前記波長範囲とを同一画面上に表示することを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光顕微鏡。
前記蛍光検出光学系の光路に配置され得る複数の光学部材は、前記光路に交換可能に配置され、
前記光路に配置された前記光学部材を検出する光学部材検出手段をさらに有し、
前記制御手段において、前記光学部材検出手段により検出される前記光学部材の組み合わせが選択されることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
前記光学部材は、ダイクロイックミラーを含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
前記光学部材は、吸収あるいはバリアフィルタを含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
前記表示手段は、前記検出部が検出可能な前記蛍光の前記波長範囲と、前記標本に投入された蛍光色素の蛍光波長とを比較し、前記投入された蛍光色素の蛍光波長が、前記検出部が検出可能な蛍光検出波長範囲に入らないときに前記表示手段に警告表示をする
ことを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
前記表示手段は、前記検出部が検出可能な前記蛍光の前記波長範囲の候補を、選択可能に複数表示し、
前記制御手段は、選択された候補に従って前記光学部材を、前記蛍光検出光学系の光路に配置することを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。