JP5011076B2

JP5011076B2 - レーザ顕微鏡

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Publication number: JP5011076B2
Application number: JP2007304914A
Authority: JP
Inventors: 伸吾鈴木
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2007-11-26
Filing date: 2007-11-26
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2027-11-26
Also published as: JP2009128719A

Description

本発明は、レーザ顕微鏡に関するものである。

従来、蛍光試薬の励起（吸収）、蛍光（放射）の分光特性、レーザ光の分光特性および光学系の透過率の分光特性をバイナリデータとして予めデータファイルに記憶しておき、全ての分光特性の重複の大小を判断して、使用に適した光学系の選択を可能にするレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。

特開２０００−３９５６３号公報

しかしながら、複数の波長域の蛍光を同時に観察したい場合には、蛍光のクロストーク（例えば、２種類の蛍光物質の蛍光を同時観察したい場合に、一方の蛍光物質の蛍光が、他方の蛍光物質の蛍光を検出する検出器側にも漏れ込む現象）を考慮することができず、必ずしも最適な光学系を選択することができないという不都合がある。
すなわち、最も大きな蛍光光量を受光可能な光学系を選択することはできるが、クロストークを除去することができないという不都合がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、実際に観察を行うことなく、検出器に入射する蛍光強度とクロストークの度合をシミュレートし、それによって、光源や検出器、光学部品の設定の最適化を容易にすることができるレーザ顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、励起光を出射する光源と、該光源からの励起光が照射されることにより試料内の蛍光物質において発生した蛍光を検出する検出器と、前記試料からの蛍光を前記検出器に導く設定可変の検出光学系と、該検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および蛍光物質毎の励起効率をデータとして記憶する特性記憶部と、複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、前記特性記憶部に記憶されているデータに基づいて前記検出器における蛍光物質毎の蛍光強度を算出する演算部と、該演算部により算出された特定波長における蛍光物質毎の蛍光強度を対比可能に表示する表示部とを備えるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、特性記憶部に記憶されている検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および蛍光物質毎の蛍光効率に基づいて、演算部により検出器における蛍光物質毎の蛍光強度が検出光学系の設定毎に算出され、特定波長における蛍光物質毎の蛍光強度が表示部に対比可能に表示される。これにより、複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、所望の蛍光物質の蛍光強度に対して、それ以外の蛍光物質の蛍光強度がどの程度同時に検出されるのかを簡易に判断することができ、クロストークの度合の少ない検出光学系の設定を選択する際の判断材料を提供することができる。

また、本発明は、励起光を出射する光源と、該光源からの励起光が照射されることにより試料内の蛍光物質において発生した蛍光を検出する検出器と、前記試料からの蛍光を前記検出器に導く設定可変の検出光学系と、該検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および蛍光物質毎の励起効率をデータとして記憶する特性記憶部と、複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、前記特性記憶部に記憶されているデータに基づいて前記検出器における蛍光物質毎の蛍光強度を算出する演算部と、該演算部により算出された特定波長における蛍光物質毎の蛍光強度の比率に基づいてクロストークの度合を判定するクロストーク判定部とを備えるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、特性記憶部に記憶されている検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および蛍光物質毎の蛍光効率に基づいて、演算部により検出器における蛍光物質毎の蛍光強度が検出光学系の設定毎に算出され、クロストーク判定部により特定波長における蛍光物質毎の蛍光強度の比率に基づいてクロストークの度合が判定される。これにより、複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、クロストークの度合の少ない検出光学系の設定を選択する際の判断材料を提供することができる。

上記発明においては、前記演算部により算出された蛍光強度および前記クロストーク判定部により判定されたクロストークの度合に基づいて、検出光学系の設定を評価する設定評価部を備えていてもよい。
このようにすることで、複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、設定評価部によって検出光学系の設定の優劣が評価され、設定作業に要していた時間を大幅に短縮することができる。

また、上記発明においては、前記演算部が、前記検出光学系の設定毎の分光特性および蛍光物質毎の蛍光分光特性の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、蛍光物質毎の励起効率を乗算することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記特性記憶部が、さらに、検出器の光電変換効率の分光特性をデータとして記憶し、前記演算部が、蛍光強度に代えて、前記検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および検出器の光電変換効率の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、蛍光物質毎の励起効率を乗算して光電変換後の信号レベルを算出することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記特性記憶部が、さらに、光源の出力値、各蛍光物質の励起効率および光源から試料に至る照明光学系の分光特性を励起光の波長毎にデータとして記憶し、前記演算部が、前記検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および照明光学系の分光特性の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、前記光源の出力値および蛍光物質毎の励起効率を乗算することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記特性記憶部が、さらに、光源の出力値、各蛍光物質の励起効率および光源から試料に至る照明光学系の特性を励起光の波長毎にデータとして記憶し、前記演算部が、蛍光強度に代えて、前記検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および検出器の光電変換効率の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、前記光源の出力値および蛍光物質毎の励起効率を乗算して光電変換後の信号レベルを演算する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。

また、上記発明においては、前記光源がレーザダイオードであり、前記特性記憶部が、光源への印加電圧または環境温度毎の分光特性、各蛍光物質の励起効率および光源から試料に至る照明光学系の特性を励起光の波長毎にデータとして記憶し、前記演算部が、光源の分光特性、前記検出光学系の分光特性、蛍光物質の蛍光分光特性および照明光学系の分光特性の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、蛍光物質毎の励起効率を乗算することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記照明光学系が、音響光学素子を含み、前記照明光学系の分光特性が、音響光学素子の制御波長毎の透過率特性を含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、前記設定可変の検出光学系が、挿脱可能なバリアフィルタを含むこととしてもよい。

本発明によれば、実際に観察を行うことなく、検出器に入射する蛍光強度とクロストークの度合をシミュレートし、それによって、光源や検出器、光学部品の設定の最適化を容易にすることができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡１について、図１〜図１８を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、図１に示すように、レーザ光（励起光）を出射するレーザ光源２と、該レーザ光源２から発せられたレーザ光を試料Ａに照射し、試料Ａにおいて発生する蛍光を検出する顕微鏡本体３と、各種データを記憶するメモリ（特性記憶部）４と、該メモリ４に記憶されているデータに基づいて、蛍光物質毎の強度を算出する演算部（ＰＣ）５と、算出された蛍光物質毎の強度を対比可能に表示する表示部６とを備えている。演算部５には種々の撮影条件を入力する入力部７が備えられている。

レーザ光源２は、発振波長の異なるものが複数種備えられ、それぞれの発振波長のレーザ光を照射制御可能なＡＯＴＦ（音響光学同調可能フィルタ：図示略）を備えている。
顕微鏡本体３は、図２に示されるように、レーザ光源２からのレーザ光を試料Ａに導く照明光学系８と、試料Ａからの蛍光を検出する検出器９，１０と、試料Ａからの蛍光を検出器９，１０まで導く検出光学系１１とを備えている。
照明光学系８は、レーザ光源２からのレーザ光を導光する光ファイバ１２と、コリメートレンズ１３とを備えている。

検出器９，１０は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、異なる波長の蛍光を同時に検出するために２つ備えられている。
検出光学系１１は、試料Ａからの蛍光を集光する対物レンズ１４と、対物レンズ１４により集光された蛍光を結像させる結像レンズ１５と、スキャナ１６と、結像レンズ１５により結像された蛍光を略平行光にする瞳投影レンズ１７と、略平行光にされた蛍光をレーザ光の光路から分岐する励起ダイクロイックミラー１８と、分岐された蛍光を集光する共焦点レンズ１９と、集光された蛍光のうち、対物レンズ１４の焦点位置から発生した蛍光のみを通過させる共焦点ピンホール２０と、共焦点ピンホール２０を通過した蛍光を波長毎に分光する分光ダイクロイックミラー２１と、分光された蛍光に含まれるレーザ光を除去するバリアフィルタ２２，２３とを備えている。図中符号２４はミラーである。

励起ダイクロイックミラー１８、分光ダイクロイックミラー２１およびバリアフィルタ２２，２３は、それぞれ回転可能なターレット２５〜２８に分光特性の異なるものが複数固定されている。
メモリ４には、全ての励起ダイクロイックミラー１８、分光ダイクロイックミラー２１およびバリアフィルタ２２，２３の透過率分光特性のデータおよび蛍光試薬毎の励起効率分光特性、蛍光出力分光特性のデータが、観察を行う波長範囲にわたって、例えば、所定の波長刻みで記憶されている。

演算部５は、観察を行う複数の蛍光試薬が設定されたときには、想定される励起ダイクロイックミラー１８、分光ダイクロイックミラー２１およびバリアフィルタ２２，２３の透過率分光特性のデータおよび蛍光試薬毎の励起効率分光特性、蛍光出力分光特性のデータを用いて、各蛍光試薬について、検出器９に入射する蛍光強度の分光特性を算出するようになっている。
表示部６は、算出された複数の蛍光試薬における蛍光強度の分光特性を表示し、選択される光学素子毎に切り替えて表示することができるようになっている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡１を用いて試料Ａの蛍光観察を行う場合に、観察に先立って、図３に示されるように、ユーザが入力部７から複数の蛍光試薬の種類を入力する（ステップＳ１）。演算部５は、メモリ４に記憶されているデータの中から入力された蛍光試薬の種類に従う出力波長特性を読み出す（ステップＳ２）。

次いで、ユーザが入力部７から光学素子の設定を入力する（ステップＳ３）。演算部５はメモリ４に記憶されているデータの中から入力された光学素子に対応する分光特性を読み出す（ステップＳ４）。

そして、演算部５は、読み出された分光特性および出力波長特性を用いて検出器９における蛍光の受光強度の分光特性を蛍光試薬毎に算出し（ステップＳ５）、表示部６に同時に表示する（ステップＳ６）。これにより、各蛍光試薬に対する受光強度の分光特性が対比可能に表示されるので、ユーザは、表示部６に表示されている複数の蛍光試薬毎の受光強度の分光特性を観察することにより、各蛍光試薬に対する受光強度の大きさから、実際の観察により取得される蛍光画像の明るさを推定することができる。また、分光特性の重複する波長範囲の広さ、重複部分における蛍光強度の大きさ等を考慮して、クロストークの度合を確認することができる。

そして、この設定で満足できる場合には、設定を終了し、試料Ａの観察を行う（ステップＳ７）。満足できない場合には、別の光学素子の設定を入力部７から入力するステップＳ３〜受光強度を表示するステップＳ６を繰り返し、最適な光学素子を選択することができる。

このように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、実際に観察を行うことなく、検出器９に入射する蛍光強度とクロストークの度合をシミュレートし、それによって、レーザ光源２や検出器９、ダイクロイックミラー１８，２１やバリアフィルタ２２，２３の設定の最適化を容易にすることができるという利点がある。

ここで、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１の第１の実施例について説明する。
レーザ光源２として、発振波長４８８ｎｍのアルゴンレーザと、発振波長５４３ｎｍのヘリウムイオンレーザとを備えたものを採用する。
蛍光試薬として、４８８ｎｍで励起可能な蛍光試薬ＦＩＴＣ（Fluoresceinisothiocyanate）および５４３ｎｍで励起可能な蛍光色素Ｃｙ３を採用する。

励起ダイクロイックミラー１８として、図４および図５に示されるようなダイクロイックミラー１８の透過率分光特性、バリアフィルタ２２として、図６〜図９に示されるようなバリアフィルタ２２の透過率分光特性が、観察に使用する４００〜８００ｎｍの波長範囲にわたって１ｎｍ刻みでメモリ４に記憶されている。

また、メモリ４には、図１０および図１１に示されるように、上記ＦＩＴＣおよびＣｙ３の他、５４３ｎｍで励起可能な蛍光試薬ＴｅｘａｓＲｅｄ（商標）についても、蛍光試薬毎の励起効率分光特性および蛍光出力分光特性のデータが、観察に使用する４００〜８００ｎｍの波長範囲にわたって１ｎｍ刻みで記憶されている。

ユーザが入力部７から観察対象の試料Ａを染色している蛍光試薬の種類（ＦＩＴＣ，Ｃｙ３）を入力する。演算部５は、メモリ４から、蛍光試薬ＦＩＴＣおよびＣｙ３の励起効率分光特性および蛍光出力分光特性のデータを読み出す。

また、ユーザが、入力部７から光路中に挿入する励起ダイクロイックミラー１８およびバリアフィルタ２２の種類、使用するレーザ波長を入力する。演算部５は、メモリ４から光路内に挿入する励起ダイクロイックミラー１８およびバリアフィルタ２２の透過率分光特性を読み出す。

例えば、蛍光試薬ＦＩＴＣだけを観察する場合には、４８８ｎｍのレーザ光のみを出射し、励起ダイクロイックミラー１８として図４のような透過率分光特性を有するもの、バリアフィルタ２２として図６のような透過率分光特性を有するものをそれぞれ光路内に挿入することになる。ここでは、分光ダイクロイックミラー２１としては、波長全域で反射率がほぼ１００％である全反射ミラーが挿入されるものとする。このようにすると、検出器９のみを使用する１チャネル検出となる。

このとき、試料Ａから検出器９に至る検出光学系１１全体の透過率は、蛍光が通過する光学素子の透過率および反射率の分光特性によって決定される。レンズ１３，１４，１５，１９、スキャナ１６、共焦点ピンホール２０は固定されて切り替えられないものであるうえに、透過率または反射率が波長によらずほぼ一定であるとすることができ、この実施例では考慮しないこととする。

これにより、試料Ａから検出器９へ至る検出光学系１１全体の透過率は、励起ダイクロイックミラー１８およびバリアフィルタ２２の透過率によって決定される。すなわち、波長λにおける励起ダイクロイックミラー１８およびバリアフィルタ２２の透過率をＴ_ＤＭａ（λ）、Ｔ_ＢＦａ（λ）とすると、試料Ａから検出器９へ至る検出光学系１１全体の透過率Ｔ_ＰＭＴａ（λ）は、以下の計算式により求められる。
Ｔ_ＰＭＴａ（λ）＝Ｔ_ＤＭａ（λ）・Ｔ_ＢＦａ（λ）

この計算式により得られた透過率Ｔ_ＰＭＴａ（λ）に蛍光試薬毎の蛍光出力分光特性Ｆ（λ）を乗じることにより、蛍光試薬ＦＩＴＣ、Ｃｙ３が発する蛍光の、検出器９における受光効率の分光特性が求められる。さらに、使用レーザ波長４８８ｎｍでの励起効率Ｘ_４８８を乗ずることによって、検出器９に入射する蛍光強度の分光特性Ｐ_ＰＭＴａ（λ）を求めることができる。
Ｐ_ＰＭＴａ（λ）＝Ｔ_ＰＭＴａ（λ）・Ｆ（λ）・Ｘ_４８８

このようにして算出された検出器９に入射する蛍光強度の分光特性Ｐ_ＰＭＴａ（λ）は、図１２に示されるように、表示部６にグラフ表示される。したがって、ユーザは表示部６に表示されているグラフを見ることにより、異なる蛍光試薬についての蛍光強度の分光特性の重なりを確認し、クロストークの度合を判断することができる。

さらに、正確にクロストークの度合を判断するには、蛍光出力分光特性の積分値と蛍光強度分光特性の積分値とを比較することによって波長全域での受光効率を求める。具体的には、検出器９における受光効率Ｄ_ＰＭＴａ（λ）、すなわち、励起効率１００％で励起した蛍光を全て検出器９に入射させた場合を１００％としたときの受光効率を、以下の計算式により求める。ただし、蛍光出力分光特性のデータを規格化するとき、最大値を１とせず、蛍光主力分光特性の波長全域での積分値を１として規格化する場合には、蛍光出力分光特性Ｆ（λ）の積分値で除算する必要はない。
Ｄ_ＰＭＴａ（λ）＝∫Ｐ_ＰＭＴａ（λ）／∫Ｆ（λ）

ユーザはこの計算結果を参照することにより、その設定で観察に移行するか、再度別の光学素子の設定を行うかを判断し、選択することができる。
具体的には、ユーザがバリアフィルタ２２として、図７のような透過率分光特性を有する別のバリアフィルタ２２に切り替える場合には、演算部５はメモリ４から切り替えたバリアフィルタ２２の透過率分光特性のデータを読み出し、再計算を行う。その結果、図１３に示されるような蛍光強度分光特性のデータを得る。これについても波長全域での受光効率の計算を行う。

図６のバリアフィルタ２２を用いた場合の検出器９での蛍光の受光効率は、ＦＩＴＣが６０．４％、Ｃｙ３が１９％であった。一方、図７のバリアフィルタ２２のときの検出器９での蛍光の受光効率はＦＩＴＣが２６．８％、Ｃｙ３がほぼ０％であった。

この結果から、観察対象外の蛍光の受光効率を観察対象および観察対象外の蛍光の受光効率の和で除算することによりクロストーク率を求める。例えば、図７のバリアフィルタ２２のときの検出器９でのクロストーク率は０／（２６．８＋０）＝０％である。図６のバリアフィルタ２２のときの検出器９でのクロストーク率は、１９．０／（１９．０＋６０．４）＝２３．９％である。

ユーザはこの受光効率およびクロストーク率に基づいて、どちらのバリアフィルタ２２を用いた方がよいかを決定することができる。通常は、受光効率が高い方が明るい画像を取得できるので、図６のバリアフィルタ２２を選択するが、クロストーク率として１０％以上のものをＮＧとする場合には、クロストーク率が低い図７のバリアフィルタ２２を採用することができる。

次に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１の第２の実施例について、以下に説明する。
本実施例においては、蛍光試薬として、４８８ｎｍで励起可能な蛍光試薬ＦＩＴＣおよび５４３ｎｍで励起可能な蛍光試薬ＴｅｘａｓＲｅｄ（商標）を採用する。

ユーザが入力部７から観察対象の試料Ａを染色している蛍光試薬の種類（ＦＩＴＣ，ＴｅｘａｓＲｅｄ）を入力する。演算部５は、メモリ４から、蛍光試薬ＦＩＴＣおよびＴｅｘａｓＲｅｄの励起効率分光特性および蛍光出力分光特性のデータを読み出す。

また、ユーザが、入力部７から光路中に挿入する励起ダイクロイックミラー１８、分光ダイクロイックミラー２１およびバリアフィルタ２２，２３の種類、使用するレーザ波長を入力する。演算部５は、メモリ４から光路内に挿入する励起ダイクロイックミラー１８、分光ダイクロイックミラー２１およびバリアフィルタ２２，２３の透過率分光特性を読み出す。

例えば、蛍光試薬ＦＩＴＣおよびＴｅｘａｓＲｅｄを同時観察する場合には、４８８ｎｍおよび５４３ｎｍのレーザ光を同時出射し、励起ダイクロイックミラー１８として図４のような透過率分光特性を有するもの、分光ダイクロイックミラー２１として図５のような透過率分光特性を有するものおよびバリアフィルタ２２，２３として図７および図８のような透過率分光特性を有するものをそれぞれ光路内に挿入することになる。

このとき、試料Ａから検出器９，１０に至る検出光学系１１全体の透過率は、蛍光が通過する光学素子の透過率および反射率の分光特性によって決定される。レンズ１３，１４，１５，１９、スキャナ１６、共焦点ピンホール２０およびミラーは固定されて切り替えられないものであるうえに、透過率または反射率が波長によらずほぼ一定であるとすることができ、この実施例においても考慮しないこととする。

これにより、試料Ａから検出器９，１０へ至る検出光学系１１全体の透過率は、励起ダイクロイックミラー１８の透過率、分光ダイクロイックミラー２１の反射率およびバリアフィルタ２２，２３の透過率によって決定される。分光ダイクロイックミラー２１の反射率としては、メモリ４に記憶されている分光ダイクロイックミラー２１の透過率の分光特性を透過率１から減算したものを使用する。

すなわち、波長λにおけるダイクロイックミラー１８，２１およびバリアフィルタ２２，２３の透過率をＴ_ＤＭａ（λ）、Ｔ_ＤＭｂ（λ）、Ｔ_ＢＦｂ（λ）、Ｔ_ＢＦｃ（λ）とすると、試料Ａから検出器９，１０へ至る検出光学系１１全体の透過率Ｔ_ＰＭＴａ（λ），Ｔ_ＰＭＴｂ（λ）は、それぞれ以下の計算式により求められる。
Ｔ_ＰＭＴａ（λ）＝Ｔ_ＤＭａ（λ）・｛１−Ｔ_ＤＭｂ（λ）｝・Ｔ_ＢＦｂ（λ）
Ｔ_ＰＭＴｂ（λ）＝Ｔ_ＤＭａ（λ）・Ｔ_ＤＭｂ（λ）・Ｔ_ＢＦｃ（λ）

この計算式により得られた透過率Ｔ_ＰＭＴａ（λ）に蛍光試薬毎の蛍光出力分光特性Ｆ（λ）を乗じることにより、蛍光試薬ＦＩＴＣ，ＴｅｘａｓＲｅｄが発する蛍光の、検出器９，１０における受光効率の分光特性が求められる。さらに、本実施例では波長４８８ｎｍと波長５４３ｎｍのレーザ光を同時出射するので、使用レーザ波長４８８ｎｍ，５４３ｎｍでの励起効率Ｘ_４８８，Ｘ_５４３の合計がレーザ光源２全体の励起効率となる。これを受光効率の分光特性に乗ずることによって、検出器９，１０に入射する蛍光強度の分光特性Ｐ_ＰＭＴａ（λ），Ｐ_ＰＭＴｂ（λ）を求めることができる。

具体的には、波長４８８ｎｍ，５４３ｎｍのレーザ出力をそれぞれＬ_４８８、Ｌ_５４３とすると、
Ｐ_ＰＭＴａ(λ)
＝Ｔ_ＰＭＴａ(λ)・Ｆ(λ)・{Ｘ_４８８・(１−Ｔ_ＤＭａ(４８８))・Ｌ_４８８
＋Ｘ_５４３・(１−Ｔ_ＤＭａ(５４３))・Ｌ_５４３}
Ｐ_ＰＭＴｂ(λ)
＝Ｔ_ＰＭＴｂ(λ)・Ｆ(λ)・{Ｘ_４８８・(１−Ｔ_ＤＭａ(４８８))・Ｌ_４８８
＋Ｘ_５４３・(１−Ｔ_ＤＭｂ(５４３))・Ｌ_５４３}

波長４８８ｎｍ，５４３ｎｍのレーザ出力Ｌ_４８８、Ｌ_５４３を１とすると、図１４および図１５に示される蛍光の受光効率の分光特性が得られる。
また、バリアフィルタ２３を図９に示される透過率分光特性を有するものに切り替えた場合には図１６に示されるような蛍光強度の分光特性が得られる。

このようにして得られた分光特性に基づいて、第１の実施例と同様に蛍光強度およびクロストークの度合を比較することにより、最適なバリアフィルタ２３を選択することができる。また、複数の波長のレーザ光を使用しているので、レーザ波長毎に出力の比率を変えることによって、クロストークの度合を変更することもできる。

例えば、波長４８８ｎｍよりも波長５４３ｎｍのレーザ光の出力を上げることによって、検出器１０におけるＴｅｘａｓＲｅｄの蛍光強度を相対的に高めることができる。これをシミュレートすることにより、特定の光学系においてクロストークを許容範囲内に納めるためのレーザ光の出力の比率を求めることができる。

なお、最適なレーザ光源２および光学素子を選択するために、受光効率およびクロストークの度合だけで判断するのではなく、レーザ光の遮断の程度を考慮するとさらに効果的である。具体的には、光路内に挿入しているバリアフィルタ２２，２３のレーザ波長での透過率を参照し、それが予め設定された透過率よりも低ければレーザ光遮断が可能であると判断する。

例えば、レーザ波長４８８ｎｍで、図６のような透過率の分光特性を有するバリアフィルタ２２，２３を用いた場合には、そのバリアフィルタ２２，２３の波長４８８ｎｍでの透過率が予め設定されている閾値（例えば、０．０１％）より低いので、レーザ光遮断が可能であり、このバリアフィルタ２２，２３が選択可能であると判断できる。このような場合には、予め保存しておく透過率の分光特性のデータの小数点以下の有効桁数を閾値と同等もしくは多くしておく必要がある。

また、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１においては、ユーザが表示部６に表示された蛍光試薬毎の蛍光強度の分光特性あるいはクロストーク率に基づいて、クロストークの度合を判定することとしたが、これに代えて、クロストーク率に基づいてレーザ顕微鏡１が光学素子の設定を評価し、最適な光学素子を自動的に選定することにしてもよい。

この場合の処理の流れを図１７に示されるフローチャートに従って説明する。
まず、ユーザが蛍光試薬の種類および使用するレーザ光の波長を入力部７から入力する（ステップＳ１１）。
演算部５は、入力された蛍光試薬を観察可能な光学素子のうち、いずれかの組合せを設定するとともに（ステップＳ１２）、蛍光試薬毎の励起効率の分光特性および蛍光出力の分光特性および設定された光学素子の分光特性をメモリ４から読み出す（ステップＳ１３）。

次いで、上述したレーザ光の遮断可否を判定し（ステップＳ１４）、遮断可能である場合には、蛍光色素毎の蛍光強度を算出する（ステップＳ１５）。また、単一染色か否かを判定し（ステップＳ１６）、単一染色ではない場合には、およびクロストーク率を算出し（ステップＳ１７）、クロストーク率が許容範囲か否かを判定する（ステップＳ１８）。

クロストーク率が許容範囲内である場合には、蛍光強度が最も高いか否かを判定し（ステップＳ１９）、最も高い場合にはこれを最適な光学素子の組合せとして登録する（ステップＳ２０）。単一染色の場合には、クロストークの判定を行うことなく蛍光強度の判定を行う。

レーザ光が遮断できない場合、クロストーク率が許容範囲を超えている場合および蛍光強度が最も高い組合せではない場合には、全ての光学素子の組合せについて判定されたか否かを判断し（ステップＳ２１）、まだ判定していないものが残っている場合には、光学素子の組合せを変更して（ステップＳ２２）、ステップＳ１３〜Ｓ２１を繰り返す。

全ての光学素子の組合せについて判定が行われたときには、登録されている最適な光学素子の組合せが存在するか否かを判定し（ステップＳ２３）、存在する場合には、登録されている光学素子を光路内に挿入して観察準備を終了し（ステップＳ２４）、登録されていない場合には観察不可能である旨のメッセージを報知して終了する（ステップＳ２５）。

なお、上記各実施例においては、レンズ１３，１４，１５，１９、スキャナ１６、共焦点ピンホール２０およびミラーの透過率や反射率の分光特性を考慮していないが、厳密にはこれらの光学素子も透過率および反射率の分光特性を有するので、これらの分光特性をメモリ４に記憶しておき、より正確な受光効率を算出する際に使用することにしてもよい。

また、図１８に示されるように、バリアフィルタ２２，２３に代えて、ミラー２９，３０、グレーティング３１，３２およびスリット３３，３４を用いたレーザ顕微鏡の場合には、バリアフィルタ２２，２３の透過率分光特性の代わりに、グレーティング３１，３２の角度とスリット３３，３４の幅とによって決定される透過波長範囲の透過率を１００％、それ以外の波長範囲の透過率を０％として計算に使用することとしてもよい。

また、メモリ４に記憶する特性として、レーザ光源２がレーザダイオードの場合に、レーザ光源２への印加電圧または環境温度毎の分光特性、各蛍光物質の励起効率およびレーザ光源２から試料Ａに至る光学系の特性をレーザ光の波長毎にデータとして記憶しておいてもよい。
また、照明光学系８が、音響光学素子を含む場合には、音響光学素子の制御波長毎の透過率特性をメモリ４に記憶しておいてもよい。

また、光学系の設定について、ユーザが入力部７から入力することとしたが、各光学素子に識別符号を備えておき、装着された光学素子の識別符号を読み取ることにより直接取得することとしてもよい。

本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡を示す全体構成図である。図１のレーザ顕微鏡の顕微鏡本体の構成要素を模式的に示す図である。図１のレーザ顕微鏡による光学素子の設定手順を示すフローチャートである。第１のダイクロイックミラーの透過率分光特性を示すグラフである。第２のダイクロイックミラーの透過率分光特性を示すグラフである。第１のバリアフィルタの透過率分光特性を示すグラフである。第２のバリアフィルタの透過率分光特性を示すグラフである。第３のバリアフィルタの透過率分光特性を示すグラフである。第４のバリアフィルタの透過率分光特性を示すグラフである。蛍光色素毎の励起効率分光特性を示すグラフである。蛍光色素毎の蛍光出力分光特性を示すグラフである。第１の実施例において、第１のバリアフィルタを使用した場合の検出器における蛍光強度分光特性を示すグラフである。第１の実施例において、第２のバリアフィルタを使用した場合の検出器における蛍光強度分光特性を示すグラフである。第２の実施例において、第２のバリアフィルタを使用した場合の検出器における蛍光強度分光特性を示すグラフである。第２の実施例において、第３のバリアフィルタを使用した場合の検出器における蛍光強度分光特性を示すグラフである。第２の実施例において、第４のバリアフィルタを使用した場合の検出器における蛍光強度分光特性を示すグラフである。図１のレーザ顕微鏡による光学素子の自動設定手順を示すフローチャートである。図１のレーザ顕微鏡の変形例を模式的に示す図である。

符号の説明

Ａ試料
１レーザ顕微鏡
２レーザ光源（光源）
４メモリ（特性記憶部）
５演算部（クロストーク判定部、設定評価部）
６表示部
９，１０検出器
１１検出光学系
２２，２３バリアフィルタ

Claims

励起光を出射する光源と、
該光源からの励起光が照射されることにより試料内の蛍光物質において発生した蛍光を検出する検出器と、
前記試料からの蛍光を前記検出器に導く設定可変の検出光学系と、
該検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および蛍光物質毎の励起効率をデータとして記憶する特性記憶部と、
複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、前記特性記憶部に記憶されているデータに基づいて前記検出器における蛍光物質毎の蛍光強度を算出する演算部と、
該演算部により算出された特定波長における蛍光物質毎の蛍光強度を対比可能に表示する表示部とを備えるレーザ顕微鏡。
励起光を出射する光源と、
該光源からの励起光が照射されることにより試料内の蛍光物質において発生した蛍光を検出する検出器と、
前記試料からの蛍光を前記検出器に導く設定可変の検出光学系と、
該検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および蛍光物質毎の励起効率をデータとして記憶する特性記憶部と、
複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、前記特性記憶部に記憶されているデータに基づいて前記検出器における蛍光物質毎の蛍光強度を算出する演算部と、
該演算部により算出された特定波長における蛍光物質毎の蛍光強度の比率に基づいてクロストークの度合を判定するクロストーク判定部とを備えるレーザ顕微鏡。
前記演算部により算出された蛍光強度および前記クロストーク判定部により判定されたクロストークの度合に基づいて、検出光学系の設定を評価する設定評価部を備える請求項２に記載のレーザ顕微鏡。
前記演算部が、前記検出光学系の設定毎の分光特性および蛍光物質毎の蛍光分光特性の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、蛍光物質毎の励起効率を乗算する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
前記特性記憶部が、さらに、検出器の光電変換効率の分光特性をデータとして記憶し、
前記演算部が、蛍光強度に代えて、前記検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および検出器の光電変換効率の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、蛍光物質毎の励起効率を乗算して光電変換後の信号レベルを算出する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
前記特性記憶部が、さらに、光源の出力値、各蛍光物質の励起効率および光源から試料に至る照明光学系の分光特性を励起光の波長毎にデータとして記憶し、
前記演算部が、前記検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および照明光学系の分光特性の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、前記光源の出力値および蛍光物質毎の励起効率を乗算する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
前記特性記憶部が、さらに、光源の出力値、各蛍光物質の励起効率および光源から試料に至る照明光学系の特性を励起光の波長毎にデータとして記憶し、
前記演算部が、蛍光強度に代えて、前記検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および検出器の光電変換効率の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、前記光源の出力値および蛍光物質毎の励起効率を乗算して光電変換後の信号レベルを演算する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
前記光源がレーザダイオードであり、
前記特性記憶部が、光源への印加電圧または環境温度毎の分光特性、各蛍光物質の励起効率および光源から試料に至る照明光学系の特性を励起光の波長毎にデータとして記憶し、
前記演算部が、光源の分光特性、前記検出光学系の分光特性、蛍光物質の蛍光分光特性および照明光学系の分光特性の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、蛍光物質毎の励起効率を乗算する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
前記照明光学系が、音響光学素子を含み、
前記照明光学系の分光特性が、音響光学素子の制御波長毎の透過率特性を含む請求項６から請求項８のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
前記設定可変の検出光学系が、挿脱可能なバリアフィルタを含む請求項１から請求項９のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。