JP2001356272A - 画像取得方法及び走査型光学顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】複数の蛍光を検出するときに、全ての蛍光にお
いてクロストークがなく、かつ検出する蛍光毎に最適な
共焦点効果を得ること。 【解決手段】Ｘガルバノミラー１４ａの往路においてレ
ーザ波長４８８ｎｍを選択すると共に、蛍光色素ＦＩＴ
Ｃによる蛍光に最適な共焦点ピンホール径１０５μｍに
開閉制御し、復路においてレーザ波長６３３ｎｍを選択
すると共に、蛍光色素Ｃｙ５による蛍光に最適な共焦点
ピンホール径１３５μｍに開閉制御する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、２種類以上の蛍光
を発する標本すなわち多重染色蛍光標本に対して励起光
を対物レンズにより集光して光スポットとして照射し、
この標本から発せられた各蛍光をピンホールを通して光
検出器で検出して標本の画像を取得する画像取得方法及
び走査型光学顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】このような走査型光学顕微鏡は、例えば
特開平８−４３７３９号公報にその技術が記載されてい
る。この走査型光学顕微鏡は、標本と共役な位置に１つ
の共焦点ピンホールを配置し、標本に光スポットを走査
したときの標本から発した複数の蛍光を共焦点ピンホー
ルに導き、この後に、これら蛍光をダイクロイックミラ
ーやグレーティング等によりそれぞれ光路分割し、それ
ぞれの光路に配置された各光検出器により各蛍光を検出
するようにしたものである。

【０００３】ところが、複数の蛍光を同時に取得しよう
とすると、短波長側の蛍光色素から発せられる蛍光波長
と長波長側の蛍光色素から発せられる蛍光波長とがオー
バーラップするため、２種類以上の蛍光色素で染色され
た標本において、例えば図７に示すように蛍光色素ＦＩ
ＴＣでは励起波長４８８ｎｍで励起して中心波長５２０
ｎｍの蛍光が発せられ、蛍光色素Ｃｙ５では励起波長６
３３ｎｍで励起して中心波長６７０ｎｍの蛍光が発せら
れ、これら蛍光波長はオーバーラップし、長波長側の蛍
光（Ｃｙ５）を検出する検出器に、短波長側の蛍光（Ｆ
ＩＴＣ）が混入するという蛍光クロストークと呼ばれる
現象が起こる。

【０００４】この蛍光クロストークを回避する技術とし
ては、例えば特開平１０−２０６７４５号公報に記載さ
れたものがある。この技術では、２種類以上の蛍光色素
で染色された標本を励起するための各励起波長の切り替
えと、これら蛍光を検出するときに使用する各検出器へ
の光路の切り替え、言い換えれば、各検出器の切り替え
を、光走査に同期して行うことによりそれぞれの蛍光を
時分割で検出して蛍光クロストークを回避するようにし
ている。

【０００５】このときの標本の画像取得方法としては、
コンピュータによる画像取得の指令に対して励起波長と
検出光路との切り替えを、１フレーム走査毎、１ライン
毎、又は１画素受光中に行い、それぞれの蛍光を時分割
で検出して画像取得するようにしている。又、例えばＺ
ＥＩＳＳ社の製品カタログには、光走査手段である高速
走査側のガルバノミラーを往復走査して、波長選択用の
音響光学素子（ＡＯＴＦ）により、往路と復路で励起波
長を切り替え、往路と復路とで別々の蛍光を検出するこ
とで蛍光クロストークを回避するようなものが開示され
ている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記走
査型光学顕微鏡では、共焦点ピンホール径と、この共焦
点ピンホール上に結像する各蛍光波長毎の光スポットの
径（回折光）の大きさとの違いにより共焦点の効果が異
なる。

【０００７】共焦点効果としての解像を追求すれば、共
焦点ピンホール径は無限小が最適であるが、蛍光量は非
常に少ないので、その共焦点ピンホールを通過する検出
光が微弱となりＳＮの良い画像の取得は望めない。そこ
で、明るさと光軸方向の共焦点効果を最適化するため
に、共焦点ピンホール径の大きさを回折径の大きさに合
わせるようにしている。回折径ｄの大きさは下記の式で
求められる。

【０００８】 ｄ＝１．２２Ｘ・λ／ＮＡ …(1) ここで、λは検出する蛍光の中心波長、ＮＡは共焦点ピ
ンホールに入射する蛍光光束のＮＡである。

【０００９】この式(1)に、検出する蛍光波長λ、対物
レンズにより決まる共焦点ピンホールに入射する蛍光光
束のＮＡを代入して求めた回折径ｄに共焦点ピンホール
径を合わせればよい。

【００１０】しかし、上記技術では、標本から発せられ
る複数の蛍光は、１つの共焦点ピンホールを通過する構
成なので、１つの励起波長に対する蛍光にしか共焦点ピ
ンホール径を合わせることができない。例えば、ＦＩＴ
Ｃは励起波長４８８ｎｍで励起すると中心波長５２０ｎ
ｍの蛍光が発せられ、Ｃｙ５は励起波長６３３ｎｍで励
起すると中心波長６７０ｎｍの蛍光が発せられるので、
共焦点ピンホールに入射する蛍光のＮＡを０．００６と
すると、ＦＩＴＣの蛍光に対して最適な共焦点ピンホー
ル径は下記のようになる。

【００１１】 共焦点ピンホール径＝１．２２Ｘ・λ／ＮＡ ＝１．２２Ｘ・０．５２／０．００６ ＝１０５μｍ …(2) 又、Ｃｙ５の蛍光に対して最適な共焦点ピンホール径は
下記のようになる。

【００１２】 共焦点ピンホール径＝１．２２Ｘ・λ／ＮＡ ＝１．２２Ｘ・０．６７／０．００６ ＝１３５μｍ …(3) このため、共焦点ピンホール径を１０５μｍに設定する
と、ＦＩＴＣの蛍光にとっては最適な共焦点ピンホール
径になるが、Ｃｙ５の蛍光にとっては、共焦点ピンホー
ル径が小さ過ぎて明るい蛍光画像の取得ができない。

【００１３】又、共焦点ピンホール径を１３５μｍに設
定すると、Ｃｙ５の蛍光にとっては最適な共焦点ピンホ
ール径になるが、ＦＩＴＣの蛍光にとっては、焦点ピン
ホール径が大きすぎ、共焦点効果が少なくなってしま
う。

【００１４】そこで本発明は、複数の蛍光を検出すると
きに、全ての蛍光においてクロストークがなく、かつ検
出する蛍光毎に最適な共焦点効果を得ることができる画
像取得方法及び走査型光学顕微鏡を提供することを目的
とする。

【００１５】

【課題を解決するための手段】請求項１記載による本発
明は、２種類以上の蛍光色素で染色された標本に対して
前記各蛍光色素に対応する励起波長の励起光を光走査手
段に同期して切り換えて照射し、前記各励起光に対応す
る各々の蛍光を時分割で１つの共焦点ピンホールを介し
て検出して１つの画像を取得する画像取得方法におい
て、前記励起光の切換に同期して前記共焦点ピンホール
のピンホール径を前記励起光により前記標本から発せら
れる蛍光に適した径に調整することを特徴とする画像取
得方法である。

【００１６】請求項２記載による本発明は、２種類以上
の蛍光色素で染色された標本に対して前記各蛍光色素に
対応する励起波長の励起光を選択的に出力できる光源
と、この光源から出力された前記励起光を走査する走査
手段と、この走査手段で走査された前記励起光を標本上
に集光する対物レンズと、この対物レンズにより集光さ
れた励起光により該励起光に対応する前記蛍光色素の蛍
光を検出する検出器と、この検出器の前に配置されるピ
ンホール径が調整可能な１つの共焦点ピンホールと、前
記走査手段の走査に同期して前記標本に対して照射する
前記励起光を切り換えることにより、前記各励起光に対
応する各々の蛍光を時分割で前記共焦点ピンホールを介
して検出して１つの画像を取得する場合に、前記光源か
らの前記励起光の切り換えに同期して、前記共焦点ピン
ホールのピンホール径を前記励起光により前記標本から
発せられる前記蛍光に適した径に調整する制御手段と、
を具備したことを特徴とする走査型光学顕微鏡である。

【００１７】請求項３記載による本発明は、請求項２記
載の走査型光学顕微鏡において、前記制御手段による前
記励起光の切り換えは、前記光走査手段による往復走査
の往路と復路との走査に各々同期することを特徴とす
る。

【００１８】請求項４記載による本発明は、請求項２記
載の走査型光学顕微鏡において、前記制御手段による前
記励起光の切り換えは、前記光走査手段による１フレー
ム毎の走査に同期することを特徴とする。

【００１９】請求項５記載による本発明は、請求項２記
載の走査型光学顕微鏡において、前記制御手段による前
記励起光の切り換えは、前記光走査手段による１画素毎
の走査に同期することを特徴とする。

【００２０】

【発明の実施の形態】(1)以下、本発明の第１の実施の
形態について図面を参照して説明する。

【００２１】図１は走査型光学顕微鏡の構成図である。
レーザユニット１は、２種類以上の蛍光色素で染色され
た標本（多重染色蛍光標本）２に対し、その励起波長の
各励起レーザ光を出力するものである。このレーザユニ
ット１は、励起波長４８８ｎｍの励起レーザ光を発振す
るＡｒレーザ装置３と、励起波長５４３ｎｍの励起レー
ザ光を発振するＨｅＮｅ−Ｇレーザ装置４と、励起波長
６３３ｎｍの励起レーザ光を発振するＨｅＮｅ−Ｒレー
ザ装置５と、ミラー６と、波長４８８ｎｍと波長５４３
ｎｍの二つの波長の励起レーザ光を合成するダイクロイ
ックミラー７と、波長４８８ｎｍと波長５４３ｎｍと波
長６３３ｎｍの励起レーザ光を合成するダイクロイック
ミラー８と、各波長４８８ｎｍ、５４３ｎｍ、６３３ｎ
ｍのうち任意の波長の励起レーザ光を選択するための音
響光学素子（ＡＯＴＦ）９とから構成されている。

【００２２】このレーザユニット１から出力される励起
レーザ光、すなわちＡＯＴＦ９により選択された励起波
長の励起レーザ光は、シングルモードファイバ１０を通
してスキャンユニット１１に導かれている。このシング
ルモードファイバ１０の出射端にはコリメートレンズ１
２が配置され、シングルモードファイバ１０より出射さ
れた励起レーザ光が平行光に整形されるようになってい
る。

【００２３】励起ダイクロイックミラー１３は、コリメ
ートレンズ１２により平行光に整形された励起レーザ光
の光路上に配置され、各励起波長４８８ｎｍ、５４３ｎ
ｍ、６３３ｎｍの各励起レーザ光を反射し、かつ標本２
から発せられた蛍光の波長を透過する特性を有するもの
である。

【００２４】Ｘ・Ｙガルバノミラー１４ａ，１４ｂは、
励起ダイクロイックミラー１３の反射光路上に配置さ
れ、各励起波長４８８ｎｍ、５４３ｎｍ、６３３ｎｍの
各励起レーザ光を標本２上を２次元方向（ＸＹ方向）に
走査するためのものである。

【００２５】これらＸ・Ｙガルバノミラー１４ａ，１４
ｂから標本２までの走査光路上には、瞳投影レンズ１
５、ミラー１６、さらに結像レンズ１７、標本２上に光
スポットを結ぶ対物レンズ１８が配置されている。

【００２６】標本２から発せられた蛍光は、上記照明光
路とは逆方向、すなわち対物レンズ１８から結像レンズ
１７、ミラー１６、瞳投影レンズ１５、Ｘ・Ｙガルバノ
ミラー１４ａ，１４ｂに進み、励起ダイクロイックミラ
ー１３を透過して共焦点レンズ１９に入射するものとな
っている。

【００２７】この共焦点レンズ１９の結像位置には、共
焦点ピンホール２０が配置されている。この共焦点ピン
ホール２０は、その内径の大きさが調整自在（開閉自
在）な構成となっている。この共焦点ピンホール２０
は、例えば電動機構からなる径駆動機構２１により、例
えば各励起波長４８８ｎｍ、５４３ｎｍ、６３３ｎｍの
各励起レーザ光を標本２に照射したときに、この標本２
から発せられる各蛍光波長に応じた最適なピンホール径
に調整する制御を行うもの（開閉制御）となっている。

【００２８】この共焦点ピンホール２０を通過した蛍光
（検出光）の光路上には、分光ダイクロイックミラー２
２が配置されている。この分光ダイクロイックミラー２
２は、例えば波長５７０ｎｍより短い波長の蛍光（励起
波長４８８ｎｍの励起で取得される蛍光）と、波長５７
０ｎｍより長い波長の蛍光（励起波長５４３ｎｍ又は６
３３ｎｍの励起で取得される蛍光）とに分ける特性を有
している。

【００２９】この分光ダイクロイックミラー２２の反射
光路（波長５７０ｎｍより短い波長の蛍光）上には、レ
ーザ光の反射光をカットして取得したい波長の蛍光の領
域を設定するバリアフィルタ２３を介して１ＣＨ側光検
出器２４が配置され、かつ透過光路（波長５７０ｎｍよ
り長い波長の蛍光）上には、レーザ光の反射光をカット
して取得したい波長の蛍光の領域を設定するバリアフィ
ルタ２５を介して２ＣＨ側光検出器２６が配置されてい
る。

【００３０】制御部２７は、コンピュータ２８から実行
の指令が入力されると、図２に示す画像取得制御フロー
チャートに従って、レーザユニット１からＡｒレーザ装
置３、ＨｅＮｅ−Ｇレーザ装置４又はＨｅＮｅ−Ｒレー
ザ装置５を選択し、Ｘ・Ｙガルバノミラー１４ａ，１４
ｂを走査駆動し、かつ共焦点ピンホール２０のピンホー
ル径を開閉制御し、１ＣＨ側光検出器２４から取り込ん
だ蛍光色素ＦＩＴＣによる信号と２ＣＨ側光検出器２６
から取り込んだ蛍光色素Ｃｙ５による信号とを色分け
し、例えばモニターに１つの多重染色蛍光画像として表
示する機能を有している。

【００３１】コンピュータ２８は、観察者が制御部２７
に対して観察開始の指令を与えるためのものである。

【００３２】次に、上記の如く構成された走査型光学顕
微鏡での画像取得方法について図２に示す画像取得制御
フローチャートに従って説明する。

【００３３】ここでは、蛍光色素ＦＩＴＣとＣｙ５とで
２重蛍光染色された標本２を、往復走査する高速走査側
のＸガルバノミラー１４ａによる往路で蛍光色素ＦＩＴ
Ｃに対応する蛍光を検出し、復路で蛍光色素Ｃｙ５に対
応する蛍光を検出するという時分割で２種類の蛍光を観
察する方法について説明する。

【００３４】この観察の概略を説明すると、Ｘガルバノ
ミラー１４ａにより水平方向の走査を行い、Ｙガルバノ
ミラー１４ｂにより垂直方向の走査を行うものとする。
このうちのＸガルバノミラー１４ａによる水平方向での
往復走査を行うときのその往路で１ライン上の各画素位
置での蛍光色素ＦＩＴＣに対応する蛍光を１ＣＨ側光検
出器２４で検出し、復路で往路の１ラインと同一ライン
上の各画素位置での蛍光色素Ｃｙ５に対応する蛍光を２
ＣＨ側光検出器２６で検出する。次に、Ｙガルバノミラ
ー１４ｂにより標本２上に光スポットを垂直方向に１画
素分走査する。次に、上記同様にＸガルバノミラー１４
ａの住復走査においてその往路で蛍光色素ＦＩＴＣに対
応する蛍光を１ＣＨ側光検出器２４で検出し、復路で蛍
光色素Ｃｙ５に対応する蛍光を２ＣＨ側光検出器２６で
検出する。これらの走査と検出とを垂直方向に走査しな
がら繰り返すものとなる。

【００３５】次に、観察者が、この観察方法をコンピュ
ータ２８から実行したときの動作について説明する。

【００３６】先ず、コンピュータ２８から実行の指令が
制御部２７に発せられると、この制御部２７は、ステッ
プ＃１において、コンピュータ２８からの実行指令を受
け、次のステップ＃２においてＸ・Ｙガルバノミラー１
４ａ，１４ｂによる走査が往路か復路かを判断し、先ず
往路であることからステップ＃３に移ってレーザユニッ
ト１の音響光学素子９にＡｒレーザ装置３の励起レーザ
光の選択指令を発する。

【００３７】この音響光学素子９は、Ａｒレーザ装置
３、ＨｅＮｅ−Ｇレーザ装置４又はＨｅＮｅ−Ｒレーザ
装置５のうちＡｒレーザ装置３から出力される励起波長
４８８ｎｍの励起レーザ光を選択し、シングルモードフ
ァイバ１０に導く。

【００３８】これと同時に、制御部２７は、ステップ＃
４において、共焦点ピンホール２０のピンホール径を、
励起波長４８８ｎｍを標本２に照射したときの蛍光色素
ＦＩＴＣから発せられる中心波長５２０ｎｍの蛍光の最
適径である１０５μｍに制御する指令を径駆動機構２１
に発する。これにより、共焦点ピンホール２０のピンホ
ール径は、蛍光色素ＦＩＴＣの蛍光の中心波長５２０ｎ
ｍに最適な１０５μｍ径に開閉制御される。

【００３９】上記励起波長４８８ｎｍの励起レーザ光
は、シングルモードファイバー１０を介してスキャンユ
ニット１１に導かれる。そして、この励起レーザ光は、
コリメートレンズ１２により平行光に整形され、励起ダ
イクロイックミラー１３により反射され、Ｘ・Ｙガルバ
ノミラー１４ａ，１４ｂにより走査され、さらに瞳投影
レンズ１５を透過し、ミラー１６で下方に反射され、結
像レンズ１７、対物レンズ１８などを通して標本２上に
光スポットとして結像される。このとき光スポットは、
標本２上の水平方向の往路方向に走査される。

【００４０】このように標本２上に走査されたときに発
生する蛍光色素ＦＩＴＣによる中心波長５２０ｎｍの蛍
光は、上記照明光路とは逆方向、すなわち対物レンズ１
８から結像レンズ１７、ミラー１６、瞳投影レンズ１
５、Ｘ・Ｙガルバノミラー１４ａ，１４ｂに進み、励起
ダイクロイックミラー１３を透過して共焦点レンズ１９
に入射する。そして、蛍光は、共焦点レンズ１９により
集光されて共焦点ピンホール２０上に結像する。

【００４１】このとき、共焦点ピンホール２０は、蛍光
色素ＦＩＴＣの蛍光の中心波長５２０ｎｍに最適な１０
５μｍ径に開閉制御されており、この共焦点ピンホール
２０を透過した蛍光色素ＦＩＴＣの蛍光は、分光ダイク
ロイックミラー２２により反射され、バリアフィルタ２
３により不要なレーザ反射光がカットされ、ＦＩＴＣの
蛍光のみが１ＣＨ側光検出器２４に入射する。

【００４２】制御部２７は、ステップ＃５において、１
ＣＨ側光検出器２４からの信号を取り込む。このとき制
御部２７は、分光ダイクロイックミラー２２を透過する
漏れ光を検出しないように２ＣＨ側光検出器２６を電気
的に検出光を測定できない状態にする。

【００４３】そして、制御部２７は、１ＣＨ側光検出器
２４からの信号の取り込みを、Ｘガルバノミラー１４ａ
による水平方向の往路の走査の間の各画素毎に行う。

【００４４】次に、Ｘガルバノミラー１４ａによる水平
方向の往路の走査が終了し、復路に移ると、制御部２７
は、ステップ＃６に移って、レーザユニット１の音響光
学素子９にＨｅＮｅ−Ｒレーザ装置５の励起レーザ光の
選択指令を発し、このＨｅＮｅ−Ｒレーザ装置５から励
起波長６３３ｎｍの励起レーザ光を選択出力してシング
ルモードファイバ１０に導く。

【００４５】これと同時に、制御部２７は、ステップ＃
７において、共焦点ピンホール２０のピンホール径を、
励起波長６３３ｎｍを標本２に照射したときの蛍光色素
Ｃｙ５かせ発せられる中心波長６７０ｎｍの蛍光の最適
径である１３５μｍに制御する指令を径駆動機構２１に
発する。これにより、共焦点ピンホール２０のピンホー
ル径は、蛍光色素Ｃｙ５の蛍光の中心波長６７０ｎｍに
最適な１３５μｍ径に開閉制御される。

【００４６】上記励起波長６３３ｎｍの励起レーザ光
は、シングルモードファイバー１０を介してスキャンユ
ニット１１に導かれる。そして、この励起レーザ光は、
コリメートレンズ１２により平行光に整形され、励起ダ
イクロイックミラー１３により反射され、Ｘ・Ｙガルバ
ノミラー１４ａ，１４ｂにより走査され、さらに瞳投影
レンズ１５を透過し、ミラー１６で下方に反射され、結
像レンズ１７、対物レンズ１８などを通して標本２上に
光スポットとして結像される。このとき光スポットは、
標本２上の水平方向の復路方向に走査される。

【００４７】このように標本２上に走査されたときに発
生する蛍光色素Ｃｙ５による中心波長６７０ｎｍの蛍光
は、上記照明光路とは逆方向、すなわち対物レンズ１８
から結像レンズ１７、ミラー１６、瞳投影レンズ１５、
Ｘ・Ｙガルバノミラー１４ａ，１４ｂに進み、励起ダイ
クロイックミラー１３を透過して共焦点レンズ１９に入
射する。そして、蛍光は、共焦点レンズ１９により集光
されて共焦点ピンホール２０上に結像する。

【００４８】このとき、共焦点ピンホール２０は、蛍光
色素Ｃｙ５の蛍光の中心波長６７０ｎｍに最適な１３５
μｍ径に開閉制御されており、この共焦点ピンホール２
０を透過した蛍光色素Ｃｙ５の蛍光は、分光ダイクロイ
ックミラー２２を透過し、バリアフィルタ２５により不
要なレーザ反射光がカットされ、Ｃｙ５の蛍光のみが２
ＣＨ側光検出器２６に入射する。

【００４９】制御部２７は、ステップ＃８において、２
ＣＨ側光検出器２６からの信号を取り込む。このとき制
御部２７は、分光ダイクロイックミラー２２で反射する
漏れ光を検出しないように１ＣＨ側光検出器２４を電気
的に検出光を測定できない状態にする。

【００５０】この制御部２７は、２ＣＨ側光検出器２６
からの信号の取り込みを、Ｘガルバノミラー１４ａによ
る水平方向の復路走査中の各画素毎に行う。

【００５１】そして、Ｘガルバノミラー１４ａによる往
復の走査が終了すると、制御部２７は、ステップ＃９に
おいて、Ｘガルバノミラー１４ａによる水平走査ライン
が最終ラインに達したか判断される。

【００５２】ステップ＃９で水平走査ラインが最終ライ
ンに達していれば処理は終了するが、ステップ＃９で水
平走査ラインが最終ラインに達していないと判断される
と、ステップ＃１０において、Ｙガルバノミラー１４ｂ
により標本２上の光スポットを垂直方向に１画素分走査
する。

【００５３】これ以降、以上説明したのと同様に、Ｘガ
ルバノミラー１４ａの走査による往路においてレーザ波
長４８８ｎｍを選択し、共焦点ピンホール径を１０５μ
ｍに開閉制御し、１ＣＨ側光検出器２４により蛍光色素
ＦＩＴＣに対応した蛍光を検出し、復路においてレーザ
波長６３３ｎｍを選択し、共焦点ピンホール径を１３５
μｍに開閉制御し、２ＣＨ側光検出器２６により蛍光色
素Ｃｙ５に対応した蛍光を検出する。これらのレーザ波
長選択と、共焦点ピンホール２０のピンホール径の制御
と、１ＣＨ側又は２ＣＨ側検出器２４，２６の選択と
を、Ｙガルバノミラー１４ｂを走査しながら垂直方向の
１画素毎に繰り返し行う。

【００５４】そうして、制御部２７は、１ＣＨ側光検出
器２４から取り込んだ蛍光色素ＦＩＴＣに対応した信号
と２ＣＨ側光検出器２６から取り込んだ蛍光色素Ｃｙ５
に対応した信号とを色分けし、例えばモニターに１つの
多重染色蛍光画像として表示する。

【００５５】このように上記第１の実施の形態において
は、Ｘガルバノミラー１４ａの往路においてレーザ波長
４８８ｎｍを選択すると共に、蛍光色素ＦＩＴＣに対応
した蛍光に最適な共焦点ピンホール径１０５μｍに開閉
制御し、復路においてレーザ波長６３３ｎｍを選択する
と共に、蛍光色素Ｃｙ５に対応した蛍光に最適な共焦点
ピンホール径１３５μｍに開閉制御するので、１つの画
像を時分割で２種類の蛍光色素ＦＩＴＣとＣｙ５とに対
応した各蛍光を検出するときに、蛍光波長毎に最適な共
焦点ピンホール２０のピンホール径に開閉制御でき、２
種類の蛍光においてクロストークがなく、かつ検出する
蛍光毎に最適な共焦点効果を得ることができる。

【００５６】なお、上記第１の実施の形態は、次の通り
変形してもよい。

【００５７】例えば、上記第１の実施の形態では、蛍光
色素ＦＩＴＣとＣｙ５の各蛍光を取得する時分割の単位
を往復走査によるライン単位で行っているが、これを例
えば１回の画像取得で２フレーム分走査するようにし
て、フレーム毎に時分割してもよい。この場合、最初の
フレーム走査で、レーザ波長、共焦点ピンホール径、光
検出器の設定をＦＩＴＣの蛍光を取得するように切り替
えて制御して１ＣＨ側光検出器２４によりＦＩＴＣの蛍
光を取得し、次のフレーム走査でレーザー波長、共焦点
ピンホール径、光検出器の設定をＣｙ５の蛍光を取得す
るように制御して２ＣＨ側光検出器２６によりＣｙ５の
蛍光を取得することになる。

【００５８】又、１画素走査中に、２つの蛍光を時分割
して検出してもよい。この場合、１つの画素を検出する
ときに、最初に、レーザ波長、共焦点ピンホール径、光
検出器の設定を蛍光色素ＦＩＴＣの蛍光を取得するよう
に制御して１ＣＨ側光検出器２４によりＦＩＴＣの蛍光
を取得し、次に同一画素上でレーザ波長、共焦点ピンホ
ール径、光検出器の設定をＣｙ５の蛍光を取得するよう
に切り替えて制御して２ＣＨ側光検出器２６によりＣｙ
５の蛍光を取得する。そして、全ての画素において、上
記蛍光色素ＦＩＴＣ及びＣｙ５の蛍光検出を行う。１画
素中に２つの蛍光を切換えて取得する本変形例では、フ
レーム走査毎の時分割検出やＸガルバノミー１４ａの往
路と復路での時分割検出に比べ、２つの蛍光を取得する
時間的な遅れをかなり少なくできる。

【００５９】(2)次に、本発明の第２の実施の形態につ
いて図面を参照して説明する。なお、図１と同一部分に
は同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

【００６０】図３は走査型光学顕微鏡の構成図である。
この走査型光学顕微鏡は、上記第１の実施の形態におけ
る分光ダイクロイックミラー２２、バリアフィルタ２３
及び１ＣＨ側光検出器２４をなくして１つの光検出器
（上記第１の実施の形態における２ＣＨ側光検出器）２
６のみを用いて２つの蛍光を取得するものである。

【００６１】制御部３０は、コンピュータ２８から実行
の指令が入力されると、図４に示す画像取得制御フロー
チャートに従って、蛍光色素ＦＩＴＣ及びＣｙ５に２重
染色された標本２の画像取得が実行される。制御部３０
は、Ｘガルバノミラー１４ａの駆動による往路走査にお
いてレーザユニット１からＡｒレーザ装置３を選択する
と共に共焦点ピンホール２０のピンール径を蛍光色素Ｆ
ＩＴＣの蛍光波長に最適なピンホール径１０５μｍに開
閉制御し、検出器２４からの信号を蛍光色素ＦＩＴＣに
よる信号として取り込んで蛍光色素ＦＩＴＣに対応した
不図示のメモリ部に蓄積し、かつＸガルバノミラー１４
ａの駆動による復路走査においてレーザユニット１から
ＨｅＮｅ−Ｒレーザ装置５を選択すると共に共焦点ピン
ホール２０のピンホール径を蛍光色素Ｃｙ５の蛍光波長
に最適なピンホール径１３５μｍに開閉制御し、検出器
２６からの信号を蛍光色素Ｃｙ５による信号として取り
込んで蛍光色素Ｃｙ５に対応した不図示のメモリ部に蓄
積し、これら蛍光色素ＦＩＴＣに対応した信号と蛍光色
素Ｃｙ５に対応した信号とを色分けし、例えばモニター
に１つの多重染色蛍光画像として表示する機能を有して
いる。

【００６２】又、光検出器２６の前方に配置するバリア
フィルタ３１は、２つの励起波長４８８ｎｍ，６３３ｎ
ｍの両方をカットすると共に、蛍光色素ＦＩＴＣとＣｙ
５とに対応した２つの蛍光の蛍光波長領域を透過させる
特性を持たせるか、又は励起波長４８８ｎｍをカットし
て蛍光色素ＦＩＴＣの蛍光波長を透過させる特性を持つ
ＦＩＴＣ用バリアフィルタと、励起波長６３３ｎｍをカ
ットして蛍光色素Ｃｙ５の蛍光波長を透過させる特性を
持つＣｙ５用バリアフィルタとの２種類のバリアフィル
タを、各蛍光の検出時間に同期させて電動式の機構によ
り切り替えるようにする。

【００６３】次に、上記の如く構成された走査型光学顕
微鏡での画像取得方法について図４に示す画像取得制御
フローチャートに従って説明する。

【００６４】先ず、コンピュータ２８から実行の指令が
制御部３０に発せられると、この制御部３０は、ステッ
プ＃１０において、コンピュータ２８からの実行指令を
受け、次のステップ＃１１においてＸガルバノミラー１
４ａによる走査が往路か復路かを判断し、先ず往路であ
ることからステップ＃１２に移ってレーザユニット１の
音響光学素子９に選択指令を発してＡｒレーザ装置３を
選択させ、このＡｒレーザ装置３から励起波長４８８ｎ
ｍの励起レーザ光を出力させる。

【００６５】これと同時に、制御部３０は、ステップ＃
１３において、共焦点ピンホール２０のピンホール径
を、励起波長４８８ｎｍの励起レーザ光を標本２に照射
したときの蛍光色素ＦＩＴＣの蛍光の中心波長５２０ｎ
ｍにより算出される最適径である１０５μｍに制御する
指令を径駆動機構２１に発する。これにより、共焦点ピ
ンホール２０のピンホール径は、蛍光色素ＦＩＴＣに対
応した中心波長５２０ｎｍの蛍光に最適な１０５μｍ径
に開閉制御される。

【００６６】上記励起波長４８８ｎｍの励起レーザ光
は、シングルモードファイバー１０を介してスキャンユ
ニット１１に導かれ、コリメートレンズ１２、励起ダイ
クロイックミラー１３、Ｘ・Ｙガルバノミラー１４ａ，
１４ｂ、さらに瞳投影レンズ１５、ミラー１６、結像レ
ンズ１７、対物レンズ１８などを通して標本２上に光ス
ポットとして結像される。

【００６７】この標本２からの蛍光色素ＦＩＴＣに対応
する中心波長５２０ｎｍの蛍光は、上記照明光路とは逆
方向を進行して共焦点レンズ１９に入射し、共焦点ピン
ホール２０上に結像する。

【００６８】このとき、共焦点ピンホール２０は、蛍光
色素ＦＩＴＣに対応した中心波長５２０ｎｍの蛍光に最
適な１０５μｍ径に開閉制御されているので、この共焦
点ピンホール２０を通過し、バリアフィルタ３１を透過
して光検出器２６に入射する。

【００６９】制御部３０は、ステップ＃１４において、
光検出器２６からの信号を蛍光色素ＦＩＴＣの蛍光の信
号として取り込んで不図示のメモリ部に蓄積する。この
制御部３０は、Ｘガルバノミラー１４ａによる水平方向
の往路の走査の間の各画素毎に光検出器２６からの信号
を取り込む。

【００７０】次に、Ｘガルバノミラー１４ａによる水平
方向の往路の走査が終了し、ステップ＃１１に戻り、復
路に移ると、制御部３０は、ステップ＃１５に移って、
レーザユニット１の音響光学素子９に選択指令を発して
ＨｅＮｅ−Ｒレーザ装置５を選択させ、このＨｅＮｅ−
Ｒレーザ装置５から励起波長６３３ｎｍの励起レーザ光
を出力させる。

【００７１】これと同時に、制御部３０は、ステップ＃
１６において、共焦点ピンホール２０のピンホール径
を、励起波長６３３ｎｍの励起レーザ光を標本２に照射
したときの蛍光色素Ｃｙ５に対応した中心波長６７０ｎ
ｍの蛍光に最適径である１３５μｍに制御する指令を径
駆動機構２１に発する。これにより、共焦点ピンホール
２０のピンホール径は、蛍光色素Ｃｙ５に対応した中心
波長６７０ｎｍの蛍光に最適な１３５μｍ径に開閉制御
される。

【００７２】上記励起波長６３３ｎｍの励起レーザ光
は、シングルモードファイバー１０を介してスキャンユ
ニット１１に導かれ、コリメートレンズ１２、励起ダイ
クロイックミラー１３、Ｘ・Ｙガルバノミラー１４ａ，
１４ｂ、さらに瞳投影レンズ１５、ミラー１６、結像レ
ンズ１７、対物レンズ１８などを通して標本２上に光ス
ポットとして結像される。

【００７３】この標本２からの蛍光色素ＦＩＴＣに対応
した中心波長６７０ｎｍの蛍光は、上記照明光路とは逆
方向を進行して共焦点レンズ１９に入射し、共焦点ピン
ホール２０上に結像する。

【００７４】このとき、共焦点ピンホール２０は、蛍光
色素Ｃｙ５に対応した中心波長６７０ｎｍの蛍光に最適
な１３５μｍ径に開閉制御されているので、この共焦点
ピンホール２０を通過し、バリアフィルタ３１を透過し
て光検出器２６に入射する。

【００７５】制御部３０は、ステップ＃１７において、
光検出器２６からの信号を蛍光色素Ｃｙ５の蛍光の信号
として取り込んで不図示のメモリ部に蓄積する。この制
御部３０は、Ｘガルバノミラー１４ａによる水平方向の
復路走査中の各画素毎に光検出器２６からの信号を取り
込む。

【００７６】そして、Ｘガルバノミラー１４ａによる往
復の走査が終了すると、制御部３０は、ステップ＃１８
において、Ｘガルバノミラー１４ａによる水平走査ライ
ンが最終ラインに達したか判断される。

【００７７】ステップ＃１８で水平走査ラインが最終ラ
インに達していれば処理は終了するが、ステップ＃１８
で水平走査ラインが最終ラインに達していないと判断さ
れると、ステップ＃１９において、Ｙガルバノミラー１
４ｂにより標本２上の光スポットを垂直方向に１画素分
走査する。

【００７８】これ以降、以上説明したのと同様に、Ｘガ
ルバノミラー１４ａの往路においてレーザ波長４８８ｎ
ｍを選択し、共焦点ピンホール径を１０５μｍに開閉制
御し、光検出器２６により蛍光色素ＦＩＴＣによる蛍光
を検出し、復路においてレーザ波長６３３ｎｍを選択
し、共焦点ピンホール径を１３５μｍに開閉制御し、光
検出器２６により蛍光色素Ｃｙ５による蛍光を検出す
る。そうして、制御部３０は、蛍光色素ＦＩＴＣによる
信号と蛍光色素Ｃｙ５による信号とを色分けし、例えば
モニターに１つの多重染色蛍光画像として表示する。

【００７９】このように上記第２の実施の形態によれ
ば、上記第１の実施の形態の効果に加えて光検出器１個
を節約できる。

【００８０】(3)次に、本発明の第３の実施の形態につ
いて図面を参照して説明する。なお、図３と同一部分に
は同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

【００８１】図５は走査型光学顕微鏡の構成図である。
この走査型光学顕微鏡は、１つの光検出器２６で蛍光色
素ＦＩＴＣとＰＩとＣｙ５に対応する３つの蛍光を時分
割で取得する。ここでは、上記第１の実施の形態の変形
例として記載した１画素走査中に３つの蛍光を時分割で
取得する方法について説明する。

【００８２】蛍光色素ＰＩを染色した標本２に対して励
起波長５４３ｎｍの励起レーザ光で励起すると、中心波
長５９０ｎｍの蛍光が発せられる。このとき、蛍光色素
ＰＩに対する蛍光の最適な共焦点ピンホール２０のピン
ホール径は、 共焦点ピンホール径＝１．２２Ｘ・λ／ＮＡ ＝１．２２Ｘ・０．５９／０．００６ ＝１２０μｍ …(4) となる。なお、共焦点ピンホール２０に入射する蛍光の
ＮＡは、蛍光色素ＦＩＴＣとＣｙ５との場合と同様に、
ＮＡ＝０．００６としている。

【００８３】従って、制御部４０は、コンピュータ２８
から実行の指令が入力されると、図６に示す画像取得制
御フローチャートに従って、蛍光色素ＦＩＴＣ、ＰＩ、
Ｃｙ５に３重染色された標本２の画像を取得する場合、
１画素上で、レーザユニット１から先ずはＡｒレーザ装
置３の励起レーザ光を選択すると共に共焦点ピンホール
２０のピンホール径を蛍光色素ＦＩＴＣに対応する蛍光
波長に最適なピンホール径１０５μｍに開閉制御し、次
にＨｅＮｅ−Ｇレーザ装置４の励起レーザ光を選択する
と共に共焦点ピンホール２０のピンホール径を蛍光色素
ＰＩに対応する蛍光波長に最適なピンホール径１２０μ
ｍに開閉制御し、次にＨｅＮｅ−Ｒレーザ装置５のレー
ザ光を選択すると共に共焦点ピンホール２０のピンホー
ル径を蛍光色素Ｃｙ５に対応する蛍光波長に最適なピン
ホール径１３５μｍに開閉制御し、これら選択に同期し
て検出器２６からの信号を蛍光色素ＦＩＴＣによる信号
として取り込んで蛍光色素ＦＩＴＣに対応する不図示の
メモリ部に蓄積し、次に検出器２６からの信号を蛍光色
素ＰＩによる信号として取り込んで蛍光色素ＰＩに対応
する不図示のメモリ部に蓄積し、次に検出器２６からの
信号を蛍光色素Ｃｙ５による信号として取り込んで蛍光
色素Ｃｙ５に対応する不図示のメモリ部に蓄積する。こ
れらの動作をＸ・Ｙガルバノミラー１４ａ，１４ｂによ
り走査しながら全ての画素について行う。そして、各画
素毎に蓄積された蛍光色素ＦＩＴＣ、ＰＩ、Ｃｙ５によ
る各信号を色分けし、例えばモニターに１つの多重染色
蛍光画像として表示する機能を有している。

【００８４】又、光検出器２６の前方に配置するバリア
フィルタ４１は、３つの励起波長４８８ｎｍ，５４３ｎ
ｍ、６３３ｎｍを全てカットすると共に、蛍光色素ＦＩ
ＴＣ、ＰＩ、Ｃｙ５に対応する３つの蛍光の蛍光波長領
域を透過させる特性を持たせるか、又は励起波長４８８
ｎｍをカットして蛍光色素ＦＩＴＣの蛍光波長を透過さ
せる特性を持つＦＩＴＣ用バリアフィルタと、励起波長
５４３ｎｍをカットして蛍光色素ＰＩの蛍光波長を透過
させる特性を持つＰＩ用バリアフィルタと、励起波長６
３３ｎｍをカットして蛍光色素Ｃｙ５の蛍光波長を透過
させる特性を持つＣｙ５用バリアフィルタとの３種類の
バリアフィルタを、各蛍光の検出時間に同期させて電動
式の機構により切り替えるようにする。

【００８５】次に、上記の如く構成された走査型光学顕
微鏡での画像取得方法について図６に示す画像取得制御
フローチャートに従って説明する。

【００８６】先ず、コンピュータ２８から実行の指令が
制御部４０に発せられると、この制御部４０は、ステッ
プ＃２０において、Ｘ・Ｙガルバノミラー１４ａ、１４
ｂを駆動して最初の１画素に対応する標本２上の１点に
スポット光が結像するように移動し、その後にＸ・Ｙガ
ルバノミラー１４ａ、１４ｂを固定する。

【００８７】制御部４０は、ステップ＃２１において、
３種類の蛍光色素ＦＩＴＣ、ＰＩ、Ｃｙ５のうちＦＩＴ
Ｃ→ＰＩ→Ｃｙ５の順序で測定することから、次のステ
ップ＃２２に移り、レーザユニット１の音響光学素子９
に選択指令を発してＡｒレーザ装置３の暦レーザ光を選
択させ、このＡｒレーザ装置３から励起波長４８８ｎｍ
の励起レーザ光を出力させる。

【００８８】これと同時に、制御部４０は、ステップ＃
２３において、共焦点ピンホール２０のピンホール径
を、励起波長４８８ｎｍの励起レーザ光を標本２に照射
したときの蛍光色素ＦＩＴＣの蛍光の中心波長５２０ｎ
ｍにより算出される最適径である１０５μｍに制御する
指令を径駆動機構２１に発する。これにより、共焦点ピ
ンホール２０のピンホール径は、蛍光色素ＦＩＴＣの蛍
光の中心波長５２０ｎｍに最適な１０５μｍ径に開閉制
御される。

【００８９】上記励起波長４８８ｎｍの励起レーザ光
は、シングルモードファイバー１０を介してスキャンユ
ニット１１に導かれ、コリメートレンズ１２、励起ダイ
クロイックミラー１３、Ｘ・Ｙガルバノミラー１４ａ，
１４ｂ、さらに瞳投影レンズ１５、ミラー１６、結像レ
ンズ１７、対物レンズ１８などを通して標本２上に光ス
ポットとして結像される。

【００９０】この標本２からの蛍光色素ＦＩＴＣに対応
する中心波長５２０ｎｍの蛍光は、上記照明光路とは逆
方向を進行して共焦点レンズ１９に入射し、共焦点ピン
ホール２０上に結像する。

【００９１】このとき、共焦点ピンホール２０は、蛍光
色素ＦＩＴＣに対応した中心波長５２０ｎｍの蛍光に最
適な１０５μｍ径に開閉制御されているので、この共焦
点ピンホール２０を通過し、バリアフィルタ４１を透過
して光検出器２６に入射する。

【００９２】制御部４０は、ステップ＃２４において、
光検出器２６からの信号を蛍光色素ＦＩＴＣの蛍光の信
号として取り込んで蛍光色素ＦＩＴＣに対応する不図示
のメモリ部に蓄積する。

【００９３】次に、制御部４０は、ステップ＃２５にお
いて、１画素に対して３種類の蛍光色素ＦＩＴＣ、Ｐ
Ｉ、Ｃｙ５の各蛍光の検出が終了したかを判断し、３種
類全ての蛍光検出が終了していなければ、再びステップ
＃２１に戻って次に蛍光測定する蛍光色素、ここではＰ
Ｉ又はＣｙ５を判断する。

【００９４】この判断の結果、制御部４０は、ステップ
＃２１から＃２７に移り、同一画素上において、レーザ
ユニット１の音響光学素子９に選択指令を発してＨｅＮ
ｅ−Ｇレーザ装置４の励起レーザ光を選択させ、このＨ
ｅＮｅ−Ｇレーザ装置４から励起波長５４３ｎｍの励起
レーザ光を出力させる。

【００９５】これと同時に、制御部４０は、ステップ＃
２８において、共焦点ピンホール２０のピンホール径
を、励起波長５４３ｎｍの励起レーザ光を標本２に照射
したときの蛍光色素ＰＩに対応する中心波長５９０ｎｍ
の波長に最適径である１２０μｍに制御する指令を径駆
動機構２１に発する。これにより、共焦点ピンホール２
０のピンホール径は、蛍光色素ＰＩの蛍光の中心波長５
９０ｎｍに最適な１２０μｍ径に開閉制御される。

【００９６】上記励起波長５４３ｎｍの励起レーザ光
は、シングルモードファイバー１０を介してスキャンユ
ニット１１に導かれ、コリメートレンズ１２、励起ダイ
クロイックミラー１３、Ｘ・Ｙガルバノミラー１４ａ，
１４ｂ、さらに瞳投影レンズ１５、ミラー１６、結像レ
ンズ１７、対物レンズ１８などを通して標本２上に光ス
ポットとして結像される。

【００９７】この標本２からの蛍光色素ＰＩに対応する
中心波長５９０ｎｍの蛍光は、上記照明光路とは逆方向
を進行して共焦点レンズ１９に入射し、共焦点ピンホー
ル２０上に結像する。

【００９８】このとき、共焦点ピンホール２０は、蛍光
色素ＰＩに対応した中心波長５９０ｎｍの蛍光に最適な
１２０μｍ径に開閉制御されているので、この共焦点ピ
ンホール２０を通過し、バリアフィルタ４１を透過して
光検出器２６に入射する。

【００９９】制御部４０は、ステップ＃２４に移って光
検出器２６からの信号を蛍光色素ＰＩの蛍光の信号とし
て取り込んで蛍光色素ＰＩに対応する不図示のメモリ部
に蓄積する。

【０１００】次に、制御部４０は、再びステップ＃２５
において、１画素に対して３種類の蛍光色素ＦＩＴＣ、
ＰＩ、Ｃｙ５の各蛍光の検出が終了したかを判断し、３
種類全ての蛍光検出が終了していなければ、再びステッ
プ＃２１に戻って次に蛍光測定する蛍光色素、ここでは
Ｃｙ５を判断する。

【０１０１】この判断の結果、制御部４０は、ステップ
＃２１から＃２９に移り、同一画素上において、レーザ
ユニット１の音響光学素子９に選択指令を発してＨｅＮ
ｅ−Ｒレーザ装置５の励起レーザ光を選択させ、このＨ
ｅＮｅ−Ｒレーザ装置５から励起波長６３３ｎｍの励起
レーザ光を出力させる。

【０１０２】これと同時に、制御部４０は、ステップ＃
３０において、共焦点ピンホール２０のピンホール径
を、励起波長６３３ｎｍの励起レーザ光を標本２に照射
したときの蛍光色素Ｃｙ５に対応する中心波長６７０ｎ
ｍの蛍光に最適径である１３５μｍに制御する指令を径
駆動機構２１に発する。これにより、共焦点ピンホール
２０のピンホール径は、蛍光色素Ｃｙ５の蛍光の中心波
長６７０ｎｍに最適な１３５μｍ径に開閉制御される。

【０１０３】上記励起波長６３３ｎｍの励起レーザ光
は、シングルモードファイバー１０を介してスキャンユ
ニット１１に導かれ、コリメータレンズ１２、励起ダイ
クロイックミラー１３、Ｘ・Ｙガルバノミラー１４ａ，
１４ｂ、さらに瞳投影レンズ１５、ミラー１６、結像レ
ンズ１７、対物レンズ１８などを通して標本２上に光ス
ポットとして結像される。

【０１０４】この標本２からの蛍光色素ＦＩＴＣに対応
した中心波長６７０ｎｍの蛍光は、上記照明光路とは逆
方向を進行して共焦点レンズ１９に入射し、共焦点ピン
ホール２０上に結像する。

【０１０５】このとき、共焦点ピンホール２０は、蛍光
色素Ｃｙ５に対応する中心波長６７０ｎｍの蛍光に最適
な１３５μｍ径に開閉制御されているので、この共焦点
ピンホール２０を通過し、バリアフィルタ３１を透過し
て光検出器２６に入射する。

【０１０６】制御部４０は、ステップ＃２４において、
光検出器２６からの信号を蛍光色素Ｃｙ５の蛍光の信号
として取り込んで蛍光色素Ｃｙ５に対応する不図示のメ
モリ部に蓄積する。

【０１０７】次に、制御部４０は、再びステップ＃２５
において、１画素に対して３種類の蛍光色素ＦＩＴＣ、
ＰＩ、Ｃｙ５の各蛍光の検出が終了したかを判断し、３
種類全ての蛍光検出が終了すれば、次のステップ＃２６
に移り、Ｘガルバノミラー１４ａ又はＸ・Ｙガルバノミ
ラー１４ａ，１４ｂにより走査された画素が最終ライン
の最終画素に達したか判断される。

【０１０８】ステップ＃２６で最終ラインの最終画素に
走査された画素が達していれば、処理は終了するが、ス
テップ＃２６で最終ラインの最終画素に走査された画素
が達していなければ、次のステップ＃２７に移り、Ｘガ
ルバノミラー１４ａ又はＸ・Ｙガルバノミラー１４ａ，
１４ｂにより次の１画素毎にスポット光を固定照射す
る。

【０１０９】これ以降、以上説明したものと同様に、Ｘ
・Ｙガルバノミラー１４ａ，１４ｂにより１画素毎にス
ポット光を固定照射し、蛍光色素ＦＩＴＣに対応する蛍
光を検出するために共焦点ピンホール径を１０５μｍに
開閉制御し、次に蛍光色素ＰＩに対応する蛍光を検出す
るために共焦点ピンホール径を１２０μｍに開閉制御
し、次に蛍光色素Ｃｙ５に対応する蛍光を検出するため
に共焦点ピンホール径を１３５μｍに開閉制御し、これ
ら蛍光色素ＦＩＴＣ、ＰＩ、Ｃｙ５による信号を不図示
の各メモリ部に蓄積する動作を全ての画素に対して行
う。

【０１１０】そして、制御部４０は、蛍光色素ＦＩＴＣ
による信号と蛍光色素ＰＩによる信号と蛍光色素Ｃｙ５
による信号とを色分けし、例えばモニターに１つの多重
染色蛍光画像として表示する。

【０１１１】このように上記第３の実施の形態によれ
ば、１個の光検出器２６を用いて３種類の蛍光色素ＦＩ
ＴＣ、ＰＩ、Ｃｙ５の各蛍光波長毎に最適な共焦点ピン
ホール２０のピンホール径を設定して、これら３種類の
蛍光波長毎の信号を時分割で取得でき、３種類全ての蛍
光に対してクロストークがなく、かつ最適な共焦点効果
を得ることができる。

【０１１２】なお、本発明は、上記第１乃至第３の実施
の形態に限定されるものでなく、実施段階ではその要旨
を逸脱しない範囲で種々に変形することが可能である。

【０１１３】さらに、上記実施形態には、種々の段階の
発明が含まれており、開示されている複数の構成要件に
おける適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出でき
る。例えば、実施形態に示されている全構成要件から幾
つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとす
る課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果の欄で
述べられている効果が得られる場合には、この構成要件
が削除された構成が発明として抽出できる。

【０１１４】例えば、３種類の蛍光色素ＦＩＴＣ、Ｐ
Ｉ、Ｃｙ５を順次切り替えてその蛍光を得るようにして
いるが、これら蛍光色素ＦＩＴＣ、ＰＩ、Ｃｙ５の切り
替え順序は限定されるものでなく、ランダムに切替えて
もよい。

【０１１５】又、３種類の蛍光色素ＦＩＴＣ、ＰＩ、Ｃ
ｙ５に限らず、他の蛍光色素を用いてもよい。

【０１１６】又、上記第１乃至第３の実施の形態では、
各励起波長の切り替えを励起レーザ光の往復走査（ライ
ン単位）、フレーム単位又は１画素単位で行っている
が、これに限らず、励起レーザ光の走査に同期してさえ
いれば励起波長を切り替えることが可能である。

【０１１７】

【発明の効果】以上詳記したように本発明によれば、複
数の蛍光を検出するときに、全ての蛍光においてクロス
トークがなく、かつ検出する蛍光毎に最適な共焦点効果
を得ることができる画像取得方法及び走査型光学顕微鏡
を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係わる走査型光学顕微鏡の第１の実施
の形態を示す構成図。

【図２】本発明に係わる走査型光学顕微鏡の第１の実施
の形態における画像取得制御フローチャート。

【図３】本発明に係わる走査型光学顕微鏡の第２の実施
の形態を示す構成図。

【図４】本発明に係わる走査型光学顕微鏡の第２の実施
の形態における画像取得制御フローチャート。

【図５】本発明に係わる走査型光学顕微鏡の第３の実施
の形態を示す構成図。

【図６】本発明に係わる走査型光学顕微鏡の第３の実施
の形態における画像取得制御フローチャート。

【図７】各蛍光試薬の染色された標本からの蛍光のクロ
ストークを示す図。

【符号の説明】

１：レーザユニット ２：標本（多重染色蛍光標本） ３：Ａｒレーザ装置 ４：ＨｅＮｅ−Ｇレーザ装置 ５：ＨｅＮｅ−Ｒレーザ装置 ６：ミラー ７，８：ダイクロイックミラー ９：音響光学素子（ＡＯＴＦ） １０：シングルモードファイバ １１：スキャンユニット １２：コリメートレンズ １３：励起ダイクロイックミラー １４ａ，１４ｂ：Ｘ・Ｙガルバノミラー １５：瞳投影レンズ １６：ミラー １７：結像レンズ １８：対物レンズ １９：共焦点レンズ ２０：共焦点ピンホール ２１：径駆動機構 ２２：分光ダイクロイックミラー ２３：バリアフィルタ ２４：１ＣＨ側光検出器 ２５：バリアフィルタ ２６：２ＣＨ側光検出器 ２７，３０，４０：制御部 ２８：コンピュータ

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Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２種類以上の蛍光色素で染色された標本
   に対して前記各蛍光色素に対応する励起波長の励起光を
   光走査手段に同期して切り換えて照射し、前記各励起光
   に対応する各々の蛍光を時分割で１つの共焦点ピンホー
   ルを介して検出して１つの画像を取得する画像取得方法
   において、 前記励起光の切換に同期して前記共焦点ピンホールのピ
   ンホール径を前記励起光により前記標本から発せられる
   蛍光に適した径に調整することを特徴とする画像取得方
   法。
2. 【請求項２】 ２種類以上の蛍光色素で染色された標本
   に対して前記各蛍光色素に対応する励起波長の励起光を
   選択的に出力できる光源と、 この光源から出力された前記励起光を走査する走査手段
   と、 この走査手段で走査された前記励起光を標本上に集光す
   る対物レンズと、 この対物レンズにより集光された励起光により該励起光
   に対応する前記蛍光色素の蛍光を検出する検出器と、 この検出器の前に配置されるピンホール径が調整可能な
   １つの共焦点ピンホールと、 前記走査手段の走査に同期して前記標本に対して照射す
   る前記励起光を切り換えることにより、前記各励起光に
   対応する各々の蛍光を時分割で前記共焦点ピンホールを
   介して検出して１つの画像を取得する場合に、前記光源
   からの前記励起光の切り換えに同期して、前記共焦点ピ
   ンホールのピンホール径を前記励起光により前記標本か
   ら発せられる前記蛍光に適した径に調整する制御手段
   と、を具備したことを特徴とする走査型光学顕微鏡。
3. 【請求項３】 前記制御手段による前記励起光の切り換
   えは、前記光走査手段による往復走査の往路と復路との
   走査に各々同期することを特徴とする請求項２記載の走
   査型光学顕微鏡。
4. 【請求項４】 前記制御手段による前記励起光の切り換
   えは、前記光走査手段による１フレーム毎の走査に同期
   することを特徴とする請求項２記載の走査型光学顕微
   鏡。
5. 【請求項５】 前記制御手段による前記励起光の切り換
   えは、前記光走査手段による１画素毎の走査に同期する
   ことを特徴とする請求項２記載の走査型光学顕微鏡。