JP4262319B2 - 走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザ光源から発したレーザ光を走査して標本に照射し、このレーザ光の照射により励起された標本が発した蛍光を、共焦点光学系を通して結像させ、これを各蛍光波長毎に分光して検出するようにした走査型レーザ顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
図２は従来の走査型レーザ顕微鏡の光学系の構成を示す図である。図２において、１はレーザ光源、２はレーザ光の光束径を拡大するためのビームエクスパンダ、３はレーザ波長を選択するためのレーザラインフィルタ、４はダイクロイックミラーである。また、５はガルバノミラー等のＸ−Ｙレーザ走査光学系、６は瞳リレーレンズ、７は観察光学系、８は対物レンズ、９は標本である。
【０００３】
１１は結像レンズ、１２は前記結像レンズ１１の結像位置に配置された共焦点ピンホール、１３は前記共焦点ピンホール１２を通過する発散光（広がり角を持つ光）を平行光線にするコリメート光学系であり、これら１１〜１３によって共焦点光学系を構成している。１４および１５は分光用のダイクロイックミラー、１６はミラー、２４，２５，２６は光検出器である。
【０００４】
この走査型レーザ顕微鏡においては、レーザ光源１からレーザ光が発せられると、このレーザ光はビームエクスパンダ２で対物レンズ８のＮＡに応じた光束径に拡大され、レーザラインフィルタ３により所望のレーザ波長が選択された後、ダイクロイックミラー４で反射され、Ｘ−Ｙレーザ走査光学系５でＸＹ偏向されたのち、瞳リレーレンズ６，観察光学系７，対物レンズ８を介して標本９に照射される。
【０００５】
この照射により励起された標本９が発した所定波長の蛍光は、対物レンズ８からダイクロイックミラー４までの経路を戻り、ダイクロイックミラー４を透過する。ダイクロイックミラー４を透過した蛍光は、結像レンズ１１で集光されて共焦点ピンホール１２を通過する。共焦点ピンホール１２を通過した発散光（広がり角を持つビーム）は、コリメート光学系１３を透過することにより平行光線となる。この平行光線は、蛍光の波長域毎に分光されて検出される。即ち第１レベル以下の波長の光はダイクロイックミラー１４で反射されて光検出器２４により検出される。第２レベル以下の波長の光はダイクロイックミラー１５で反射されて光検出器２５により検出される。そして第２レベルを越えた波長の光はミラー１６で反射されて光検出器２６により検出される。
【０００６】
かくしてこの走査型レーザ顕微鏡によれば、共焦点ピンホール１２を通過した後の蛍光が所定波長毎に分光され、複数の異なる波長の光として光検出器２４、２５、２６でそれぞれ検出され、測光される。その輝度情報をそれぞれの走査ポイントに対応させて、モニタ上に二次元表示した画像が得られていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述した従来の走査型レーザ顕微鏡には次のような問題点がある。上記構成の走査型レーザ顕微鏡では、標本９を多重染色により蛍光観察する場合、複数種の波長の蛍光が一つの共焦点ピンホール１２を通過することになる。一つの共焦点ピンホール１２を回折径の異なる複数の蛍光が通るということは、下記の（１）式を満たす回折径Ｄのうち、一つの蛍光波長λの回折径Ｄのみが上記共焦点ピンホール径に適合するだけである。つまりその他の蛍光波長にとっては、最適なピンホール径ｄではないために、共焦点効果の弱い像あるいは明るさをロスした像になってしまう。
【０００８】
Ｄ＝１．２２（λ／ＮＡ） …（１）
ただし、Ｄ…回折径
λ…蛍光波長
ＮＡ…共焦点ピンホールへ入射する光の開口数
ここでピンホール径ｄと回折径Ｄとが、ｄ≦Ｄの場合は、共焦点効果は変わらないが明るさが減少する。またｄ＞Ｄの場合は、明るくはなるが共焦点効果は低下する。従って短波長でｄ＝Ｄにすると、長波長では明るさが失われてしまう。逆に長波長でｄ＝Ｄにすると、短波長では明るくはなるが共焦点効果が低下してしまう。
【０００９】
本発明の目的は、観察したい標本から発する全ての蛍光波長に対し、共焦点効果が高く且つ明るさ損失の少ない像を、得ることのできる走査型レーザ顕微鏡を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決し目的を達成するために、本発明の走査型レーザ顕微鏡は以下に示す如く構成されている。
（１）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、異なる波長を有する複数のレーザ光を発するレーザ光源と、このレーザ光源から発せられる各波長のレーザ光から特定波長のレーザ光を選択するレーザ光選択手段と、このレーザ光選択手段により選択されたレーザ光を走査して標本に照射する手段と、この照射手段により照射されたレーザ光により励起された前記標本が発した蛍光を通過させる如く前記標本の面と共役な位置に設置され前記蛍光の波長に対応した開口径に切換え可能な共焦点ピンホールと、この共焦点ピンホールの開口径を前記蛍光の波長にあわせて切換え制御する制御装置とを備え、上記制御装置は、レーザ光源から発せられるレーザ光の波長情報または標本の蛍光色素情報に基づいて、標本が発する蛍光波長の回折径を算出し、この算出結果に基づいて共焦点ピンホールの開口径を切換え制御するものであることを特徴としている。
（２）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）に記載した顕微鏡であって、前記レーザ光選択手段によってレーザ光の波長を切り換えるたびに、前記制御装置により前記共焦点ピンホールの開口径を切換え制御するものであることを特徴としている。
（３）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）〜（２）に記載した顕微鏡であって、前記レーザ光選択手段によってレーザ光の波長を切り換えるたびに、前記制御装置により前記共焦点ピンホールの開口径を切換え制御して画像を取得し、前記各レーザ波長ごとに取得された画像を重ね合わせることを特徴としている。
（４）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）〜（３）に記載した顕微鏡であって、前記共焦点ピンホール径と前記各蛍光の回折径との大小関係を、観察標本の条件に応じて可変設定する手段を備えたことを特徴としている。この可変設定する手段は、蛍光波長に対して算出される回折径に対して、前記蛍光波長に拘らず同じであって、前記標本の条件に応じて設定される係数を乗じた値に前記共焦点ピンホールの開口径を制御する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
（第１実施形態）
図１は本発明の第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の光学系の構成を示す図である。なお図２と同一機能を有する部分には同一符号を付し、詳しい説明は省く。図１に示す光学系の特徴点の一つは、ビームエクスパンダ２とダイクロイックミラー４との間に、４８８ｎｍ用レーザラインフィルタ３１、５３０ｎｍ用レーザラインフィルタ３２、６４８ｎｍ用レーザラインフィルタ３３、を光路に対し選択的に挿脱可能なレーザ光選択手段３０を設けた点である。他の特徴点はレーザ光選択手段３０のフィルタの種類に応じて制御装置４１が、結像レンズ１１の結像位置に配置された共焦点ピンホール４２の開口径を蛍光の波長に応じた径に切換え制御すると共に、これに連動して光検出器２４，２５，２６の各受光部にそれぞれ配置されたシャッター４４，４５，４６を開閉制御する共焦点制御系４０を設けた点である。なお、共焦点ピンホール４２としては単一のピンホールの径が拡大または縮小するものや、回転円板上に配設された径の異なる複数のピンホールが選択的に光路に挿入されるもの等を用いることができる。
【００１２】
また本実施形態におけるレーザ光源１０は、例えば４８８ｎｍ、５３０ｎｍ、６４８ｎｍ、の各波長のレーザ光を同時発振可能なＫｒ−Ａｒ多波長発振レーザ光源である。また標本９は蛍光色素ＦＩＴＣ，ＰＩ，ＣＹ５で染色されているものとする。
【００１３】
なお、本実施形態では共焦点ピンホール４２の開口径の切換え制御をレーザ光選択手段３０に連動させていたが、これに限られるものではなく、例えばレーザ光選択手段３０とは独立して、共焦点ピンホール４２の開口径の切換え制御を制御装置４１に行なわせるようにしてもよい。
【００１４】
制御装置４１は、レーザ光源１０から出力されるレーザ光の波長情報（例えば４８８ｎｍ、５３０ｎｍ、６４８ｎｍ）あるいは標本９の蛍光色素情報（ＦＩＴＣ、ＰＩ、ＣＹ５）を、例えば内蔵のメモリに記憶し、かつ記憶されたこれらの情報に基づいて標本９が発する蛍光波長の回折径を演算して求め、求めた回折径に応じて共焦点ピンホール４２の大きさを可変制御する如く構成されている。
【００１５】
このように構成された本実施形態によれば、レーザ光源１０から出力されたレーザ光はビームエクスパンダ２を通ることにより、対物レンズ８のＮＡに応じた光束径に拡大された後、レーザ光選択手段３０により下記の如く所定のレーザ波長を持つレーザ光のみが選択される。
【００１６】
まず、例えばレーザラインフィルタ３１が光路に挿入されると、４８８ｎｍの波長のレーザ光が選択される。この選択されたレーザ光はダイクロイックミラー４で反射され、ガルバノミラー等のＸ−Ｙレーザ走査光学系５でＸＹ偏向されたのち、瞳リレーレンズ６、観察光学系７、対物レンズ８を介して標本９上に照射される。つまり波長４８８ｎｍのレーザ光のみが標本９へ照射され、二次元走査が行なわれる。
【００１７】
波長４８８ｎｍのレーザ光の照射により、標本９の蛍光色素が励起されると、主として約５２０ｎｍの波長のＦＩＴＣ蛍光色素（以下、ＦＩＴＣと称す）が発せられる。このＦＩＴＣの蛍光は、対物レンズ８からダイクロイックミラー４に至る経路を戻り、ダイクロイックミラー４を透過する。ダイクロイックミラー４を透過した上記蛍光は、結像レンズ１１で集光され、当該結像レンズの結像位置に配置された共焦点ピンホール４２を通過する。
【００１８】
制御装置４１はレーザ光選択手段３０のフィルタがレーザラインフィルタ３１であることに基づいて、標本９から発せられるＦＩＴＣの蛍光波長（約５２０ｎｍ）の回折径を算出し、その回折径に応じて共焦点ピンホール４２の大きさ（ピンホール径ｄ）を可変設定している。したがってこの共焦点ピンホール４２を通過した約５２０ｎｍの波長の蛍光は、フレアの少ない即ち共焦点効果の高い、しかも光量ロスの少ないものとなる。このため良好な像が得られる。
【００１９】
共焦点ピンホール４２を通過した発散光（広がり角を持つビーム）は、コリメート光学系１３を透過することにより平行光線となる。
この平行光線は、波長５７５ｎｍ以下の光を反射するダイクロイックミラー１４で反射され、制御装置４１により開状態とされているシャッタ４４を通過し光検出器２４で検出される。なおこのとき標本９は、５７５ｎｍを越えた波長の蛍光も発するが、この蛍光はダイクロイックミラー１４を透過し、ダイクロイックミラー１５，ミラー１６で分光ないし反射され、光検出器２５，２６に入射しようとする。しかるにこのときはシャッター４５，４６は制御装置４１により閉状態とされているため光検出器２５，２６に余計な光が入射するおそれはない。
【００２０】
したがって、共焦点ピンホール４２を通過した約５２０ｎｍの波長を有するＦＩＴＣの蛍光のみが、ダイクロイックミラー１４，シャッタ４４により分離抽出されて対応する光検出器２４で検出され、輝度情報を得ることになる。
【００２１】
次に、例えばレーザラインフィルタ３２が光路に挿入されると、今度は５３０ｎｍの波長のレーザ光が選択される。選択されたレーザ光は前述の場合と同様にダイクロイックミラー４で反射され、ガルバノミラー等のＸ−Ｙレーザ走査光学系５でＸＹ偏向され、瞳リレーレンズ６、観察光学系７、対物レンズ８を介して標本９上に照射される。
【００２２】
波長５３０ｎｍのレーザ光が照射されることにより、標本９の蛍光色素が励起され、主として約６１５ｎｍの波長を有するＰＩの蛍光が発せられる。このＰＩの蛍光は、対物レンズ８からダイクロイックミラー４に至る経路を戻り、ダイクロイックミラー４を透過する。ダイクロイックミラー４を透過した蛍光は、結像レンズ１１で集光され、当該結像レンズの結像位置に配置された共焦点ピンホール４２を通過する。
【００２３】
制御装置４１は、レーザ光選択手段３０のフィルタがレーザラインフィルタ３２であることに基づいて標本９から発せられるＰＩの蛍光波長（約６１５ｎｍ）の回折径を算出し、その回折径に応じて共焦点ピンホール４２の大きさを可変設定している。したがって、この共焦点ピンホール４２を通過した約６１５ｎｍの波長の蛍光は、やはりフレアの少ないすなわち共焦点効果の高い、しかも光量ロスの少ないものとなり、良好な像となる。
【００２４】
そして前述の場合と同様に、共焦点ピンホール４２を通過した６１５ｎｍの波長を有するＰＩの蛍光は、コリメート光学系１３により平行光線とされる。
この平行光線は、ダイクロイックミラー１４を透過したのち、波長６４０ｎｍ以下の光を反射するダイクロイックミラー１５で反射され、この場合は開状態となっているシャッタ４５を通過し光検出器２５で検出される。なおこのときも、前述したのと同様に、波長５７５ｎｍ以下の蛍光はダイクロイックミラー１４で反射されると共に、波長が６４０ｎｍを越えた蛍光はダイクロイックミラー１５を透過した後、ミラー１６で反射され、それぞれ光検出器２４，２６に入射しようとする。しかるにこのときシャッター４４，４６はいずれも閉じているため、光検出器２４，２６に余計な光が入射するおそれはない。
【００２５】
次いで更に、例えばレーザラインフィルタ３３が光路に挿入されると、今度は６４８ｎｍの波長のレーザ光が選択される。選択されたレーザ光は前述の場合と同様にダイクロイックミラー４で反射され、ガルバノミラー等のＸ−Ｙレーザ走査光学系５でＸＹ偏向され、瞳リレーレンズ６、観察光学系７、対物レンズ８を介して標本９上に照射される。
【００２６】
波長６４８ｎｍのレーザ光が照射されることにより、標本９の蛍光色素が励起され、主として約６７０ｎｍの波長を有するＣＹ５の蛍光が発せられる。この蛍光は、対物レンズ８からダイクロイックミラー４に至る経路を戻り、ダイクロイックミラー４を透過する。ダイクロイックミラー４を透過した蛍光は、結像レンズ１１で集光され、当該結像レンズの結像位置に配置された共焦点ピンホール４２を通過する。
【００２７】
制御装置４１は、レーザ光選択手段３０のフィルタがレーザラインフィルタ３３であることに基づいて、標本９から発せられるＣＹ５の蛍光波長（約６７０ｎｍ）の回折径を算出し、その回折径に応じて共焦点ピンホール４２の大きさを可変設定している。したがって、この共焦点ピンホール４２を通過した波長が約６７０ｎｍの蛍光は、やはりフレアの少ないすなわち共焦点効果の高い、しかも光量ロスの少ないものとなり良好な像となる。
【００２８】
そして前述の場合と同様に、共焦点ピンホール４２を通過した約６７０約ｎｍの波長を有するＣＹ５の蛍光は、コリメート光学系１３によって平行光線とされる。
【００２９】
この平行光線は、ダイクロイックミラー１４を透過し、更にダイクロイックミラー１５を透過したのち、ミラー１６で反射され、この場合は開状態となっているシャッタ４６を通過し光検出器２６で検出される。なおこのときも前述したのと同様に、波長が５７５ｎｍ以下の蛍光は、ダイクロイックミラー１４で反射され、波長６４０ｎｍ以下の蛍光はダイクロイックミラー１５で反射され、それぞれ光検出器２４，２５に入射しようとする。しかるにこのときシャッター４４，４５はいずれも閉じているため、光検出器２４，２５に余計な光が入射するおそれはない。
【００３０】
前記三つの波長の蛍光に基づく像を重ね合わせると、短波長の蛍光から長波長の蛍光まで、全て共焦点効果が高くかつ明るさロスの少ない像が得られる。この結果、良好な多重染色観察を行なうことができる。
【００３１】
また、このような方法による多重染色像の取得に際しては、一つの励起光に対応する蛍光波長の光のみが各検出器にとり込まれるので、短波長側の蛍光が長波長側の蛍光に重なることを避けることができ、所謂クロスオーバーのないＳ／Ｎの良い像を得ることができる。
【００３２】
（第２実施形態）
共焦点ピンホール４２のピンホール径ｄが回折径Ｄの面内分解能が飽和するまで、例えば、１／３に低下するまでは蛍光量が減少し暗くなるが、面内分解能を向上させ得ることが判明している。そして観察したい標本によっては、ピンホール径ｄを回折径Ｄまで絞っても充分に明るい条件の下では、さらにピンホール径ｄを絞り込んで面内分解能を上げたい場合もあるし、回折径Ｄまで絞ると暗くなりＳ／Ｎが悪くなる条件の下では、ピンホール径ｄをひろげ、共焦点効果を犠牲にしても明るさを優先させたい場合もある。
【００３３】
そこで第２実施形態においては、蛍光が充分に明るい場合に、共焦点ピンホール４２のピンホール径ｄと各蛍光の回折径Ｄとの大小関係を、観察標本の条件に応じて可変設定する手段を付加したことを特徴としている。
【００３４】
すなわち、回折径Ｄは前記（１）式に適当な係数Ｋを乗じるように変形した下記の（２）式を用いて求めるものとした。
Ｄ＝１．２２（λ／ＮＡ）Ｋ …（２）
ただし、Ｋ…条件に応じて設定される係数
上記係数Ｋを蛍光波長の如何に拘らず同じにすることで、各蛍光波長の共焦点効果と明るさとのバランスを一定化することができる。
【００３５】
（実施形態についての特徴点）
［１］実施形態に示された走査型レーザ顕微鏡は、
異なる波長（例えば４８８ｎｍ，５３０ｎｍ，６４８ｎｍ）を有する複数のレーザ光を発するレーザ光源(10)と、このレーザ光源(10)から発せられる各波長のレーザ光から特定波長のレーザ光を選択するレーザ光選択手段(30)と、このレーザ光選択手段(30)により選択されたレーザ光をレーザ走査手段(5) を介して標本(9) に照射する手段と、この手段により照射されたレーザ光により励起された前記標本(9) が発した蛍光を通過させる如く前記標本(9) の面と共役な位置に設置され記蛍光の波長に対応した開口径に切換え可能な共焦点ピンホール(42)と、この共焦点ピンホール(42)の開口径を前記蛍光の波長（例えば５２０ｎｍ，６１５ｎｍ，６７０ｎｍ）にあわせて切換え制御する制御装置(41)と、を備えたことを特徴としている。
【００３６】
上記走査型レーザ顕微鏡においては、制御装置(41)が入力された情報に基づいて標本(9) から発せられた各蛍光波長（ＦＩＴＣの蛍光は約５２０ｎｍ，ＰＩの蛍光は約６１５ｎｍ，ＣＹ５の蛍光は約６７０ｎｍ）の回折径Ｄを算出し、その回折径Ｄに応じて、共焦点ピンホール(42)の大きさを可変設定する。したがってピンホール径(d) が回折径(D) に適合したものとなり、共焦点ピンホール(42)を通過した特定波長の蛍光は、フレアの少ないすなわち共焦点効果の高い、しかも光量ロスの少ないものとなり、良好な像となる。
【００３７】
前記三つの波長の蛍光に基づく像を重ねると、短波長の蛍光から長波長の蛍光まですべて共焦点効果が高く、かつ明るさロスのない像が得られる。この結果、良好な多重染色観察が可能である。
［２］実施形態に示された走査型レーザ顕微鏡は、前記［１］と同様の顕微鏡であって、
制御装置(41)は、レーザ光源(10)から発せられるレーザ光の波長情報または標本(9) からの蛍光色素情報に基づいて、標本(9) が発する蛍光波長の回折径(D) を算出し、この算出結果に基づいて共焦点ピンホール(42)の開口径を切換え制御するものであることを特徴としている。
【００３８】
上記走査型レーザ顕微鏡においては前記［１］と同様の作用効果を奏する上、共焦点ピンホールの大きさを可変制御するための具現手段が明確に特定されていることから、実施しやすい利点がある。
［３］実施形態に示された走査型レーザ顕微鏡は、前記［１］と同様の顕微鏡であって、
光検出器(24,25,26)の各受光部にそれぞれシャッタ(44,45,46)を配置し、これらのシャッタ(44,45,46)を、共焦点ピンホール(42)の開口径の切換え制御に連動して開閉制御することにより、検出すべき蛍光のみを所定の光検出器(24,25,26 の一つ) に入射させるようにしたことを特徴としている。
【００３９】
上記走査型レーザ顕微鏡においては前記［１］と同様の作用効果を奏する上、多重染色像を得るに際し、一つの励起光に対応する蛍光波長以外の蛍光はシャットアウトされ、検出すべき蛍光のみが検出器(24,25,26)の一つにとり込まれることになる。かくして短波長側の蛍光が長波長側の蛍光に重なることを避けることができ、所謂クロスオーバーのないＳ／Ｎの良い像を得ることができる。
［４］実施形態に示された走査型レーザ顕微鏡は、前記［１］と同様の顕微鏡であって、
共焦点ピンホール(42)のピンホール径(d) と各蛍光の回折径(D) との大小関係を、観察標本の条件に応じて可変設定する手段を備えたことを特徴としている。
【００４０】
上記走査型レーザ顕微鏡においては前記［１］と同様の作用効果を奏する上、共焦点ピンホール(42)のピンホール径(d) が、観察標本の条件に適合した状況の下で可変制御されることになる。
【００４１】
【発明の効果】
本発明によれば、共焦点ピンホールの開口径が、制御装置によって、標本から発せられた蛍光の波長に応じて可変制御されるので、各蛍光波長ごとに共焦点効果及び明るさが最適な像を取得することのできる走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の光学系の構成を示す図。
【図２】従来例に係る走査型レーザ顕微鏡の光学系の構成を示す図。
【符号の説明】
１…レーザ光源
２…ビームエクスパンダ
３…レーザラインフィルタ
４…ダイクロイックミラー
５…ＸＹレーザ走査光学系
６…瞳リレーレンズ
７…観察光学系
８…対物レンズ
９…標本
１０…多波長発振レーザ光源
１１…結像レンズ
１２…共焦点ピンホール、
１３…コリメータ光学系
１４，１５…ダイクロイックミラー
１６…ミラー
２４，２５，２６…光検出器
３０……レーザ光選択手段
３１…４８８ｎｍ用レーザラインフィルタ
３２…５３０ｎｍ用レーザラインフィルタ
４０…共焦点制御系
４１…制御装置
４２…共焦点ピンホール
４４〜４６…シャッタ
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザ光源から発したレーザ光を走査して標本に照射し、このレーザ光の照射により励起された標本が発した蛍光を、共焦点光学系を通して結像させ、これを各蛍光波長毎に分光して検出するようにした走査型レーザ顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
図２は従来の走査型レーザ顕微鏡の光学系の構成を示す図である。図２において、１はレーザ光源、２はレーザ光の光束径を拡大するためのビームエクスパンダ、３はレーザ波長を選択するためのレーザラインフィルタ、４はダイクロイックミラーである。また、５はガルバノミラー等のＸ−Ｙレーザ走査光学系、６は瞳リレーレンズ、７は観察光学系、８は対物レンズ、９は標本である。
【０００３】
１１は結像レンズ、１２は前記結像レンズ１１の結像位置に配置された共焦点ピンホール、１３は前記共焦点ピンホール１２を通過する発散光（広がり角を持つ光）を平行光線にするコリメート光学系であり、これら１１〜１３によって共焦点光学系を構成している。１４および１５は分光用のダイクロイックミラー、１６はミラー、２４，２５，２６は光検出器である。
【０００４】
この走査型レーザ顕微鏡においては、レーザ光源１からレーザ光が発せられると、このレーザ光はビームエクスパンダ２で対物レンズ８のＮＡに応じた光束径に拡大され、レーザラインフィルタ３により所望のレーザ波長が選択された後、ダイクロイックミラー４で反射され、Ｘ−Ｙレーザ走査光学系５でＸＹ偏向されたのち、瞳リレーレンズ６，観察光学系７，対物レンズ８を介して標本９に照射される。
【０００５】
この照射により励起された標本９が発した所定波長の蛍光は、対物レンズ８からダイクロイックミラー４までの経路を戻り、ダイクロイックミラー４を透過する。ダイクロイックミラー４を透過した蛍光は、結像レンズ１１で集光されて共焦点ピンホール１２を通過する。共焦点ピンホール１２を通過した発散光（広がり角を持つビーム）は、コリメート光学系１３を透過することにより平行光線となる。この平行光線は、蛍光の波長域毎に分光されて検出される。即ち第１レベル以下の波長の光はダイクロイックミラー１４で反射されて光検出器２４により検出される。第２レベル以下の波長の光はダイクロイックミラー１５で反射されて光検出器２５により検出される。そして第２レベルを越えた波長の光はミラー１６で反射されて光検出器２６により検出される。
【０００６】
かくしてこの走査型レーザ顕微鏡によれば、共焦点ピンホール１２を通過した後の蛍光が所定波長毎に分光され、複数の異なる波長の光として光検出器２４、２５、２６でそれぞれ検出され、測光される。その輝度情報をそれぞれの走査ポイントに対応させて、モニタ上に二次元表示した画像が得られていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述した従来の走査型レーザ顕微鏡には次のような問題点がある。上記構成の走査型レーザ顕微鏡では、標本９を多重染色により蛍光観察する場合、複数種の波長の蛍光が一つの共焦点ピンホール１２を通過することになる。一つの共焦点ピンホール１２を回折径の異なる複数の蛍光が通るということは、下記の（１）式を満たす回折径Ｄのうち、一つの蛍光波長λの回折径Ｄのみが上記共焦点ピンホール径に適合するだけである。つまりその他の蛍光波長にとっては、最適なピンホール径ｄではないために、共焦点効果の弱い像あるいは明るさをロスした像になってしまう。
【０００８】
Ｄ＝１．２２（λ／ＮＡ） …（１）
ただし、Ｄ…回折径
λ…蛍光波長
ＮＡ…共焦点ピンホールへ入射する光の開口数
ここでピンホール径ｄと回折径Ｄとが、ｄ≦Ｄの場合は、共焦点効果は変わらないが明るさが減少する。またｄ＞Ｄの場合は、明るくはなるが共焦点効果は低下する。従って短波長でｄ＝Ｄにすると、長波長では明るさが失われてしまう。逆に長波長でｄ＝Ｄにすると、短波長では明るくはなるが共焦点効果が低下してしまう。
【０００９】
本発明の目的は、観察したい標本から発する全ての蛍光波長に対し、共焦点効果が高く且つ明るさ損失の少ない像を、得ることのできる走査型レーザ顕微鏡を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決し目的を達成するために、本発明の走査型レーザ顕微鏡は以下に示す如く構成されている。
（１）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、異なる波長を有する複数のレーザ光を発するレーザ光源と、このレーザ光源から発せられる各波長のレーザ光から特定波長のレーザ光を選択するレーザ光選択手段と、このレーザ光選択手段により選択されたレーザ光を走査して標本に照射する手段と、この照射手段により照射されたレーザ光により励起された前記標本が発した蛍光を通過させる如く前記標本の面と共役な位置に設置され前記蛍光の波長に対応した開口径に切換え可能な共焦点ピンホールと、この共焦点ピンホールの開口径を前記蛍光の波長にあわせて切換え制御する制御装置とを備え、上記制御装置は、レーザ光源から発せられるレーザ光の波長情報または標本の蛍光色素情報に基づいて、標本が発する蛍光波長の回折径を算出し、この算出結果に基づいて共焦点ピンホールの開口径を切換え制御するものであることを特徴としている。
（２）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）に記載した顕微鏡であって、前記レーザ光選択手段によってレーザ光の波長を切り換えるたびに、前記制御装置により前記共焦点ピンホールの開口径を切換え制御するものであることを特徴としている。
（３）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）〜（２）に記載した顕微鏡であって、前記レーザ光選択手段によってレーザ光の波長を切り換えるたびに、前記制御装置により前記共焦点ピンホールの開口径を切換え制御して画像を取得し、前記各レーザ波長ごとに取得された画像を重ね合わせることを特徴としている。
（４）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）〜（３）に記載した顕微鏡であって、前記共焦点ピンホール径と前記各蛍光の回折径との大小関係を、観察標本の条件に応じて可変設定する手段を備えたことを特徴としている。この可変設定する手段は、蛍光波長に対して算出される回折径に対して、前記蛍光波長に拘らず同じであって、前記標本の条件に応じて設定される係数を乗じた値に前記共焦点ピンホールの開口径を制御する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
（第１実施形態）
図１は本発明の第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の光学系の構成を示す図である。なお図２と同一機能を有する部分には同一符号を付し、詳しい説明は省く。図１に示す光学系の特徴点の一つは、ビームエクスパンダ２とダイクロイックミラー４との間に、４８８ｎｍ用レーザラインフィルタ３１、５３０ｎｍ用レーザラインフィルタ３２、６４８ｎｍ用レーザラインフィルタ３３、を光路に対し選択的に挿脱可能なレーザ光選択手段３０を設けた点である。他の特徴点はレーザ光選択手段３０のフィルタの種類に応じて制御装置４１が、結像レンズ１１の結像位置に配置された共焦点ピンホール４２の開口径を蛍光の波長に応じた径に切換え制御すると共に、これに連動して光検出器２４，２５，２６の各受光部にそれぞれ配置されたシャッター４４，４５，４６を開閉制御する共焦点制御系４０を設けた点である。なお、共焦点ピンホール４２としては単一のピンホールの径が拡大または縮小するものや、回転円板上に配設された径の異なる複数のピンホールが選択的に光路に挿入されるもの等を用いることができる。
【００１２】
また本実施形態におけるレーザ光源１０は、例えば４８８ｎｍ、５３０ｎｍ、６４８ｎｍ、の各波長のレーザ光を同時発振可能なＫｒ−Ａｒ多波長発振レーザ光源である。また標本９は蛍光色素ＦＩＴＣ，ＰＩ，ＣＹ５で染色されているものとする。
【００１３】
なお、本実施形態では共焦点ピンホール４２の開口径の切換え制御をレーザ光選択手段３０に連動させていたが、これに限られるものではなく、例えばレーザ光選択手段３０とは独立して、共焦点ピンホール４２の開口径の切換え制御を制御装置４１に行なわせるようにしてもよい。
【００１４】
制御装置４１は、レーザ光源１０から出力されるレーザ光の波長情報（例えば４８８ｎｍ、５３０ｎｍ、６４８ｎｍ）あるいは標本９の蛍光色素情報（ＦＩＴＣ、ＰＩ、ＣＹ５）を、例えば内蔵のメモリに記憶し、かつ記憶されたこれらの情報に基づいて標本９が発する蛍光波長の回折径を演算して求め、求めた回折径に応じて共焦点ピンホール４２の大きさを可変制御する如く構成されている。
【００１５】
このように構成された本実施形態によれば、レーザ光源１０から出力されたレーザ光はビームエクスパンダ２を通ることにより、対物レンズ８のＮＡに応じた光束径に拡大された後、レーザ光選択手段３０により下記の如く所定のレーザ波長を持つレーザ光のみが選択される。
【００１６】
まず、例えばレーザラインフィルタ３１が光路に挿入されると、４８８ｎｍの波長のレーザ光が選択される。この選択されたレーザ光はダイクロイックミラー４で反射され、ガルバノミラー等のＸ−Ｙレーザ走査光学系５でＸＹ偏向されたのち、瞳リレーレンズ６、観察光学系７、対物レンズ８を介して標本９上に照射される。つまり波長４８８ｎｍのレーザ光のみが標本９へ照射され、二次元走査が行なわれる。
【００１７】
波長４８８ｎｍのレーザ光の照射により、標本９の蛍光色素が励起されると、主として約５２０ｎｍの波長のＦＩＴＣ蛍光色素（以下、ＦＩＴＣと称す）が発せられる。このＦＩＴＣの蛍光は、対物レンズ８からダイクロイックミラー４に至る経路を戻り、ダイクロイックミラー４を透過する。ダイクロイックミラー４を透過した上記蛍光は、結像レンズ１１で集光され、当該結像レンズの結像位置に配置された共焦点ピンホール４２を通過する。
【００１８】
制御装置４１はレーザ光選択手段３０のフィルタがレーザラインフィルタ３１であることに基づいて、標本９から発せられるＦＩＴＣの蛍光波長（約５２０ｎｍ）の回折径を算出し、その回折径に応じて共焦点ピンホール４２の大きさ（ピンホール径ｄ）を可変設定している。したがってこの共焦点ピンホール４２を通過した約５２０ｎｍの波長の蛍光は、フレアの少ない即ち共焦点効果の高い、しかも光量ロスの少ないものとなる。このため良好な像が得られる。
【００１９】
共焦点ピンホール４２を通過した発散光（広がり角を持つビーム）は、コリメート光学系１３を透過することにより平行光線となる。
この平行光線は、波長５７５ｎｍ以下の光を反射するダイクロイックミラー１４で反射され、制御装置４１により開状態とされているシャッタ４４を通過し光検出器２４で検出される。なおこのとき標本９は、５７５ｎｍを越えた波長の蛍光も発するが、この蛍光はダイクロイックミラー１４を透過し、ダイクロイックミラー１５，ミラー１６で分光ないし反射され、光検出器２５，２６に入射しようとする。しかるにこのときはシャッター４５，４６は制御装置４１により閉状態とされているため光検出器２５，２６に余計な光が入射するおそれはない。
【００２０】
したがって、共焦点ピンホール４２を通過した約５２０ｎｍの波長を有するＦＩＴＣの蛍光のみが、ダイクロイックミラー１４，シャッタ４４により分離抽出されて対応する光検出器２４で検出され、輝度情報を得ることになる。
【００２１】
次に、例えばレーザラインフィルタ３２が光路に挿入されると、今度は５３０ｎｍの波長のレーザ光が選択される。選択されたレーザ光は前述の場合と同様にダイクロイックミラー４で反射され、ガルバノミラー等のＸ−Ｙレーザ走査光学系５でＸＹ偏向され、瞳リレーレンズ６、観察光学系７、対物レンズ８を介して標本９上に照射される。
【００２２】
波長５３０ｎｍのレーザ光が照射されることにより、標本９の蛍光色素が励起され、主として約６１５ｎｍの波長を有するＰＩの蛍光が発せられる。このＰＩの蛍光は、対物レンズ８からダイクロイックミラー４に至る経路を戻り、ダイクロイックミラー４を透過する。ダイクロイックミラー４を透過した蛍光は、結像レンズ１１で集光され、当該結像レンズの結像位置に配置された共焦点ピンホール４２を通過する。
【００２３】
制御装置４１は、レーザ光選択手段３０のフィルタがレーザラインフィルタ３２であることに基づいて標本９から発せられるＰＩの蛍光波長（約６１５ｎｍ）の回折径を算出し、その回折径に応じて共焦点ピンホール４２の大きさを可変設定している。したがって、この共焦点ピンホール４２を通過した約６１５ｎｍの波長の蛍光は、やはりフレアの少ないすなわち共焦点効果の高い、しかも光量ロスの少ないものとなり、良好な像となる。
【００２４】
そして前述の場合と同様に、共焦点ピンホール４２を通過した６１５ｎｍの波長を有するＰＩの蛍光は、コリメート光学系１３により平行光線とされる。
この平行光線は、ダイクロイックミラー１４を透過したのち、波長６４０ｎｍ以下の光を反射するダイクロイックミラー１５で反射され、この場合は開状態となっているシャッタ４５を通過し光検出器２５で検出される。なおこのときも、前述したのと同様に、波長５７５ｎｍ以下の蛍光はダイクロイックミラー１４で反射されると共に、波長が６４０ｎｍを越えた蛍光はダイクロイックミラー１５を透過した後、ミラー１６で反射され、それぞれ光検出器２４，２６に入射しようとする。しかるにこのときシャッター４４，４６はいずれも閉じているため、光検出器２４，２６に余計な光が入射するおそれはない。
【００２５】
次いで更に、例えばレーザラインフィルタ３３が光路に挿入されると、今度は６４８ｎｍの波長のレーザ光が選択される。選択されたレーザ光は前述の場合と同様にダイクロイックミラー４で反射され、ガルバノミラー等のＸ−Ｙレーザ走査光学系５でＸＹ偏向され、瞳リレーレンズ６、観察光学系７、対物レンズ８を介して標本９上に照射される。
【００２６】
波長６４８ｎｍのレーザ光が照射されることにより、標本９の蛍光色素が励起され、主として約６７０ｎｍの波長を有するＣＹ５の蛍光が発せられる。この蛍光は、対物レンズ８からダイクロイックミラー４に至る経路を戻り、ダイクロイックミラー４を透過する。ダイクロイックミラー４を透過した蛍光は、結像レンズ１１で集光され、当該結像レンズの結像位置に配置された共焦点ピンホール４２を通過する。
【００２７】
制御装置４１は、レーザ光選択手段３０のフィルタがレーザラインフィルタ３３であることに基づいて、標本９から発せられるＣＹ５の蛍光波長（約６７０ｎｍ）の回折径を算出し、その回折径に応じて共焦点ピンホール４２の大きさを可変設定している。したがって、この共焦点ピンホール４２を通過した波長が約６７０ｎｍの蛍光は、やはりフレアの少ないすなわち共焦点効果の高い、しかも光量ロスの少ないものとなり良好な像となる。
【００２８】
そして前述の場合と同様に、共焦点ピンホール４２を通過した約６７０約ｎｍの波長を有するＣＹ５の蛍光は、コリメート光学系１３によって平行光線とされる。
【００２９】
この平行光線は、ダイクロイックミラー１４を透過し、更にダイクロイックミラー１５を透過したのち、ミラー１６で反射され、この場合は開状態となっているシャッタ４６を通過し光検出器２６で検出される。なおこのときも前述したのと同様に、波長が５７５ｎｍ以下の蛍光は、ダイクロイックミラー１４で反射され、波長６４０ｎｍ以下の蛍光はダイクロイックミラー１５で反射され、それぞれ光検出器２４，２５に入射しようとする。しかるにこのときシャッター４４，４５はいずれも閉じているため、光検出器２４，２５に余計な光が入射するおそれはない。
【００３０】
前記三つの波長の蛍光に基づく像を重ね合わせると、短波長の蛍光から長波長の蛍光まで、全て共焦点効果が高くかつ明るさロスの少ない像が得られる。この結果、良好な多重染色観察を行なうことができる。
【００３１】
また、このような方法による多重染色像の取得に際しては、一つの励起光に対応する蛍光波長の光のみが各検出器にとり込まれるので、短波長側の蛍光が長波長側の蛍光に重なることを避けることができ、所謂クロスオーバーのないＳ／Ｎの良い像を得ることができる。
【００３２】
（第２実施形態）
共焦点ピンホール４２のピンホール径ｄが回折径Ｄの面内分解能が飽和するまで、例えば、１／３に低下するまでは蛍光量が減少し暗くなるが、面内分解能を向上させ得ることが判明している。そして観察したい標本によっては、ピンホール径ｄを回折径Ｄまで絞っても充分に明るい条件の下では、さらにピンホール径ｄを絞り込んで面内分解能を上げたい場合もあるし、回折径Ｄまで絞ると暗くなりＳ／Ｎが悪くなる条件の下では、ピンホール径ｄをひろげ、共焦点効果を犠牲にしても明るさを優先させたい場合もある。
【００３３】
そこで第２実施形態においては、蛍光が充分に明るい場合に、共焦点ピンホール４２のピンホール径ｄと各蛍光の回折径Ｄとの大小関係を、観察標本の条件に応じて可変設定する手段を付加したことを特徴としている。
【００３４】
すなわち、回折径Ｄは前記（１）式に適当な係数Ｋを乗じるように変形した下記の（２）式を用いて求めるものとした。
Ｄ＝１．２２（λ／ＮＡ）Ｋ …（２）
ただし、Ｋ…条件に応じて設定される係数
上記係数Ｋを蛍光波長の如何に拘らず同じにすることで、各蛍光波長の共焦点効果と明るさとのバランスを一定化することができる。
【００３５】
（実施形態についての特徴点）
［１］実施形態に示された走査型レーザ顕微鏡は、
異なる波長（例えば４８８ｎｍ，５３０ｎｍ，６４８ｎｍ）を有する複数のレーザ光を発するレーザ光源(10)と、このレーザ光源(10)から発せられる各波長のレーザ光から特定波長のレーザ光を選択するレーザ光選択手段(30)と、このレーザ光選択手段(30)により選択されたレーザ光をレーザ走査手段(5) を介して標本(9) に照射する手段と、この手段により照射されたレーザ光により励起された前記標本(9) が発した蛍光を通過させる如く前記標本(9) の面と共役な位置に設置され記蛍光の波長に対応した開口径に切換え可能な共焦点ピンホール(42)と、この共焦点ピンホール(42)の開口径を前記蛍光の波長（例えば５２０ｎｍ，６１５ｎｍ，６７０ｎｍ）にあわせて切換え制御する制御装置(41)と、を備えたことを特徴としている。
【００３６】
上記走査型レーザ顕微鏡においては、制御装置(41)が入力された情報に基づいて標本(9) から発せられた各蛍光波長（ＦＩＴＣの蛍光は約５２０ｎｍ，ＰＩの蛍光は約６１５ｎｍ，ＣＹ５の蛍光は約６７０ｎｍ）の回折径Ｄを算出し、その回折径Ｄに応じて、共焦点ピンホール(42)の大きさを可変設定する。したがってピンホール径(d) が回折径(D) に適合したものとなり、共焦点ピンホール(42)を通過した特定波長の蛍光は、フレアの少ないすなわち共焦点効果の高い、しかも光量ロスの少ないものとなり、良好な像となる。
【００３７】
前記三つの波長の蛍光に基づく像を重ねると、短波長の蛍光から長波長の蛍光まですべて共焦点効果が高く、かつ明るさロスのない像が得られる。この結果、良好な多重染色観察が可能である。
［２］実施形態に示された走査型レーザ顕微鏡は、前記［１］と同様の顕微鏡であって、
制御装置(41)は、レーザ光源(10)から発せられるレーザ光の波長情報または標本(9) からの蛍光色素情報に基づいて、標本(9) が発する蛍光波長の回折径(D) を算出し、この算出結果に基づいて共焦点ピンホール(42)の開口径を切換え制御するものであることを特徴としている。
【００３８】
上記走査型レーザ顕微鏡においては前記［１］と同様の作用効果を奏する上、共焦点ピンホールの大きさを可変制御するための具現手段が明確に特定されていることから、実施しやすい利点がある。
［３］実施形態に示された走査型レーザ顕微鏡は、前記［１］と同様の顕微鏡であって、
光検出器(24,25,26)の各受光部にそれぞれシャッタ(44,45,46)を配置し、これらのシャッタ(44,45,46)を、共焦点ピンホール(42)の開口径の切換え制御に連動して開閉制御することにより、検出すべき蛍光のみを所定の光検出器(24,25,26 の一つ) に入射させるようにしたことを特徴としている。
【００３９】
上記走査型レーザ顕微鏡においては前記［１］と同様の作用効果を奏する上、多重染色像を得るに際し、一つの励起光に対応する蛍光波長以外の蛍光はシャットアウトされ、検出すべき蛍光のみが検出器(24,25,26)の一つにとり込まれることになる。かくして短波長側の蛍光が長波長側の蛍光に重なることを避けることができ、所謂クロスオーバーのないＳ／Ｎの良い像を得ることができる。
［４］実施形態に示された走査型レーザ顕微鏡は、前記［１］と同様の顕微鏡であって、
共焦点ピンホール(42)のピンホール径(d) と各蛍光の回折径(D) との大小関係を、観察標本の条件に応じて可変設定する手段を備えたことを特徴としている。
【００４０】
上記走査型レーザ顕微鏡においては前記［１］と同様の作用効果を奏する上、共焦点ピンホール(42)のピンホール径(d) が、観察標本の条件に適合した状況の下で可変制御されることになる。
【００４１】
【発明の効果】
本発明によれば、共焦点ピンホールの開口径が、制御装置によって、標本から発せられた蛍光の波長に応じて可変制御されるので、各蛍光波長ごとに共焦点効果及び明るさが最適な像を取得することのできる走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の光学系の構成を示す図。
【図２】従来例に係る走査型レーザ顕微鏡の光学系の構成を示す図。
【符号の説明】
１…レーザ光源
２…ビームエクスパンダ
３…レーザラインフィルタ
４…ダイクロイックミラー
５…ＸＹレーザ走査光学系
６…瞳リレーレンズ
７…観察光学系
８…対物レンズ
９…標本
１０…多波長発振レーザ光源
１１…結像レンズ
１２…共焦点ピンホール、
１３…コリメータ光学系
１４，１５…ダイクロイックミラー
１６…ミラー
２４，２５，２６…光検出器
３０……レーザ光選択手段
３１…４８８ｎｍ用レーザラインフィルタ
３２…５３０ｎｍ用レーザラインフィルタ
４０…共焦点制御系
４１…制御装置
４２…共焦点ピンホール
４４〜４６…シャッタ
Claims (4)
- 異なる波長を有する複数のレーザ光を発するレーザ光源と、
このレーザ光源から発せられる各波長のレーザ光から特定波長のレーザ光を選択するレーザ光選択手段と、
このレーザ光選択手段により選択されたレーザ光を走査して標本に照射する手段と、
この照射手段により照射されたレーザ光により励起された前記標本が発した蛍光を通過させる如く前記標本の面と共役な位置に設置され前記蛍光の波長に対応した開口径に切換え可能な共焦点ピンホールと、
この共焦点ピンホールの開口径を前記蛍光の波長にあわせて切換え制御する制御装置と、を備え、
前記制御装置は、レーザ光源から発せられるレーザ光の波長情報または標本の蛍光色素情報に基づいて、標本が発する蛍光波長の回折径を算出し、この算出結果に基づいて共焦点ピンホールの開口径を切換え制御するものであることを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。 - 前記レーザ光選択手段によってレーザ光の波長を切り換えるたびに、前記制御装置により前記共焦点ピンホールの開口径を切換え制御するものであることを特徴とする請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
- 前記レーザ光選択手段によってレーザ光の波長を切り換えるたびに、前記制御装置により前記共焦点ピンホールの開口径を切換え制御して画像を取得し、
前記各レーザ波長ごとに取得された画像を重ね合わせることを特徴とする請求項１〜２に記載の走査型レーザ顕微鏡。 - 前記制御装置は、蛍光波長に対して算出される回折径に対して、前記蛍光波長に拘らず同じであって、前記標本の条件に応じて設定される係数を乗じた値に前記共焦点ピンホールの開口径を制御することを特徴とする、請求項１〜３に記載の走査型レーザ顕微鏡。
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