JP4270884B2 - 顕微鏡システム - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の異なる観察法に対応可能な顕微鏡システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、生体細胞の機能解析が行われている。これら細胞の機能解析で、特に、細胞膜の機能を観察するために、細胞膜およびその近傍からのエバネッセント蛍光画像を取得する全反射蛍光顕微鏡が注目されている。
【０００３】
特開平１０−２３１２２２号公報では、走査型レーザー顕微鏡の一例を示している。この走査型レーザー顕微鏡では、複数の蛍光色素に対応するために、複数のレーザー光源から発振されるレーザービームを一つのレーザービームに合成し、点光源として対物レンズを介して標本に対し走査しながら照射し、標本からの蛍光または反射光の観察光を再び対物レンズを介して光検出器で検出し、２次元の情報を得る。このような走査型レーザー顕微鏡は、共焦点効果を利用することで、焦点を合わせた面の情報のみが取得され、厚みのある標本のスライス観察に有効な観察法として用いられている。
【０００４】
一方、特開２００１−２７２６０６号公報では、全反射蛍光顕微鏡の一例を示している。この全反射蛍光顕微鏡では、レーザー光源から発振されたレーザービームを光ファイバの出射端面から集光光学系を介して対物レンズの後側焦点位置に集光するとともに、対物レンズからのレーザービームを光軸に対し傾かせて射出させ標本を照明することで、エバネッセント光による蛍光観察を可能にしている。このような全反射蛍光顕微鏡は、照明範囲が光源として使用するレーザーの波長程度の深さに限られるので、バックグラウンドとなる蛍光が非常に少なく、細胞膜表面の観察やカバーガラス表面付近に局在する蛍光色素一分子の観察などに有効な観察法として用いられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、これら走査型レーザー顕微鏡および全反射蛍光顕微鏡は、光ファイバを使用しているが、それぞれの顕微鏡は、一つの観察法にしか対応していない。このため、例えば、蛍光色素で標識された一つの標本の蛍光観察を共焦点走査型レーザー顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡とを用いて観察するような場合は、標本を各顕微鏡間で移動させなければならない。このため、特に、標本上の同じ位置の状態を観察するようなときは、各装置において、標本上の同じ位置を探し出すのに極めて難しい作業が強いられるという問題が生じる。
【０００６】
本発明の目的は、複数の異なる観察法の切換えまたは同時使用に簡単に対応できる顕微鏡システムを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
課題を解決し目的を達成するために、本発明の顕微鏡システムは以下の如く構成されている。
【０００８】
本発明の顕微鏡システムは、レーザー光源と、前記レーザー光源からのレーザービームの光路を少なくとも２つに分割する光路分割部と、前記光路分割部で分割された光路上の各レーザービームがそれぞれ入射される複数の光ファイバと、前記複数の光ファイバを通った各レーザービームをそれぞれ使用する複数の異なる顕微鏡光学系と、を単一の顕微鏡内に備えている。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
【００１０】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態に係る顕微鏡システムの概略構成を示す図である。レーザー光源１から発せられるレーザービームの光路上には、光路分割部材としてのビーム分割用のビームスプリッタ２が配置されている。このビームスプリッタ２は、レーザー光源１から発せられるレーザービームを、５０％を透過、５０％を反射するよう分割する。
【００１１】
ビームスプリッタ２の反射光路上には、光遮蔽部材としてのシャッター２５、集光レンズ３０１、およびシングルモードの光ファイバ３の入射端３ａが配置されている。ビームスプリッタ２で反射し集光レンズ３０１により集光されたレーザービームは、入射端３ａに入射される。シャッター２５は制御部１００の制御により開閉される。
【００１２】
また、ビームスプリッタ２の透過光路上には、光遮蔽部材としてのシャッター２６、集光レンズ３０２、およびシングルモードの光ファイバ４の入射端４ａが配置されている。ビームスプリッタ２を透過し集光レンズ３０２により集光されたレーザービームは、入射端４ａに入射される。シャッター２６は制御部１００の制御により開閉される。
【００１３】
シャッター２５，２６は、レーザー光源１から発せられるレーザービームを遮蔽する。図１の顕微鏡システムを共焦点走査型レーザー顕微鏡として使用するときは、シャッター２５は開放され、シャッター２６は閉じられる。全反射蛍光顕微鏡として使用するときは、シャッター２５は閉じられ、シャッター２６は開放される。いずれの顕微鏡としても使用しないときは、シャッター２５、２６の両方が閉じられる。
【００１４】
光ファイバ３の出射端３ｂの光路上には、第１の観察法としての共焦点走査型レーザー顕微鏡（ＬＳＭ）を構成する光学系（顕微鏡光学系）が配置されている。この光学系では、光ファイバ３の出射端３ｂから出射されるレーザービームの光路上に、コリメートレンズ５とダイクロイックミラー６が配置されている。ダイクロイックミラー６の反射光路上には、ＸＹスキャナ７、瞳投影レンズ８、およびミラー９が配置されている。さらに、ミラー９の反射光路上には、結像レンズ１０、観察光学系を構成する対物レンズ１１、および標本１２が配置されている。ミラー９は、アクチュエータを備えた挿脱機構２０１により光路に対して挿脱可能である。挿脱機構２０１は、制御部１００の制御により駆動される。
【００１５】
光ファイバ３の出射端３ｂから出射されたレーザービームは、コリメートレンズ５で平行光束に変換されダイクロイックミラー６で反射し、さらにＸＹスキャナ７から出射したレーザービームは、瞳投影レンズ８を通過してミラー９で反射し、結像レンズ１０を通過して対物レンズ１１により標本１２上に集光され、スキャンされる。この場合、ミラー９は、光路上に挿入されている。
【００１６】
標本１２上からの蛍光および反射光は、上述した光路を逆にたどり、すなわち対物レンズ１１、結像レンズ１０、ミラー９、瞳投影レンズ８、およびＸＹスキャナ７を介してダイクロイックミラー６に入射される。
【００１７】
ダイクロイックミラー６の透過光路上には、ミラー４０１，４０２、ダイクロイックミラー１３ａ、およびミラー１３ｂが配置されている。ダイクロイックミラー６は、レーザービームより長波長である蛍光を透過し、標本１２からの反射光であるレーザービームを反射する。ダイクロイックミラー６を通過した標本１２からの蛍光は、ミラー４０１，４０２を介して、波長ごとにダイクロイックミラー１３ａで分光される。
【００１８】
ダイクロイックミラー１３ａの反射光路上には、吸収フィルタ１４ａ、コンフォーカルレンズ１５ａ、標本１２と光学的に共役な位置に設けられる共焦点絞り１６ａ、および検出器１７ａが配置されている。吸収フィルタ１４ａを通過した標本１２からの蛍光は、コンフォーカルレンズ１５ａで集光され、共焦点絞り１６ａを通過して検出器１７ａで検出される。
【００１９】
同様に、ミラー１３ｂの反射光路上には、吸収フィルタ１４ｂ、コンフォーカルレンズ１５ｂ、標本１２と光学的に共役な位置に設けられる共焦点絞り１６ｂ、および検出器１７ｂが配置されている。ダイクロイックミラー１３ａを通過した標本１２からの蛍光は、吸収フィルタ１４ｂを通過し、コンフォーカルレンズ１５ｂで集光され、共焦点絞り１６ｂを通過して検出器１７ｂで検出される。
【００２０】
一方、光ファイバ４の出射端４ｂの光路上には、第２の観察法としての全反射蛍光顕微鏡を構成する光学系（顕微鏡光学系）が配置されている。この光学系では、光ファイバ４の出射端４ｂは、対物レンズ１１の後側焦点位置１８と共役になるように配置される。また、光ファイバ４の出射端４ｂから出射されるレーザービームの光路上に、落射照明投光管２１内の光学系２１ａ、およびダイクロイックミラー２２が配置されている。出射端４ｂから出射されたレーザービームは、落射照明投光管２１内の光学系２１ａを通過し、ダイクロイックミラー２２で対物レンズ１１へ向けて反射され、対物レンズ１１の後側焦点位置１８に集光される。ダイクロイックミラー２２は、アクチュエータを備えた挿脱機構２０２により光路に対して挿脱可能である。挿脱機構２０２は、制御部１００の制御により駆動される。
【００２１】
光ファイバ４の出射端４ｂは、アクチュエータを備えた移動機構２０３により光学系２１ａの光軸２０に対して垂直方向へ移動可能である。移動機構２０３は、制御部１００の制御により駆動される。この光ファイバ４の出射端４ｂの位置を光軸２０に対し垂直方向に移動させ、対物レンズ１１から出射される平行光束を標本１２に対して傾かせて入射させるとともに、この時の入射角を所定角度に調整する。これにより、標本１２もしくはカバーガラスの境界で全反射が生じ、ごく一部のレーザービームがエバネッセント光（エバネッセント場）として、標本１２側へ染み出る。
【００２２】
このエバネッセント光による標本１２の境界付近の蛍光は、対物レンズ１１、ダイクロイックミラー２２、結像レンズ１０、および吸収フィルタ２３を通過して、撮像素子２４（例えばＣＣＤカメラ）により撮像される。この場合、ミラー９は、光路上から外されている。
【００２３】
本第１の実施の形態のダイクロイックミラー２２は、標本１２が単色の蛍光色素で染色されているとき、または標本１２が多重染色されているが単色の蛍光色素のみを観察するときに、第２の観察法すなわちエバネッセント光による蛍光観察を行なうのに必要な特性を有している。すなわちダイクロイックミラー２２は、光ファイバ４の出射端４ｂから出射される励起波長のレーザービームを反射し、標本１２からの蛍光（出射端４ｂから出射された励起波長のレーザービームにより励起された蛍光）を透過する波長特性を有する。
【００２４】
以上のような構成をなす顕微鏡システムを共焦点走査型レーザー顕微鏡として使用する場合、シャッター２５は開放され、シャッター２６は閉じられる。ミラー９は挿脱機構２０１により光路中に挿入される。ダイクロイックミラー２２は挿脱機構２０２により光路から外される。この状態で、レーザー光源１から発せられたレーザービームは、ビームスプリッタ２で反射され、集光レンズ３０１を介して光ファイバ３の入射端３ａに入射される。また、光ファイバ３の出射端３ｂから出射されたレーザービームは、コリメートレンズ５で平行光束に変換され、ダイクロイックミラー６で反射され、さらにＸＹスキャナ７、瞳投影レンズ８を通過してミラー９で反射し、結像レンズ１０を通過して対物レンズ１１により標本１２上に集光され、スキャンされる。
【００２５】
標本１２上からの蛍光および反射光は、上述した光路を逆にたどり、レーザービームより長波長である蛍光のみがダイクロイックミラー６を透過し、ミラー４０１，４０２を介して、波長ごとにダイクロイックミラー１３ａで分光される。ダイクロイックミラー１３ａで反射された波長領域の蛍光は、吸収フィルタ１４ａ、コンフォーカルレンズ１５ａ、および共焦点絞り１６ａを介して検出器１７ａで検出され、２次元画像として取得される。同時に、ダイクロイックミラー１３ａを透過した波長領域の蛍光は、ミラー１３ｂ、吸収フィルタ１４ｂ、コンフォーカルレンズ１５ｂ、および共焦点絞り１６ｂを介して検出器１７ｂで検出され、２次元画像として取得される。
【００２６】
一方、顕微鏡システムを全反射蛍光顕微鏡として使用する場合、シャッター２５は閉じられ、シャッター２６は開放される。ミラー９は挿脱機構２０１により光路中から外される。ダイクロイックミラー２２は挿脱機構２０２により光路中に挿入される。この状態で、レーザー光源１から発せられたレーザービームは、ビームスプリッタ２を透過し、集光レンズ３０２を介して光ファイバ４の入射端４ａに入射される。また、光ファイバ４の出射端４ｂから出射されたレーザービームは、落射照明投光管２１内の光学系２１ａを通過し、ダイクロイックミラー２２で対物レンズ１１へ向けて反射され、対物レンズ１１の後側焦点位置１８に集光される。
【００２７】
この状態で、光ファイバ４の出射端４ｂを、移動機構２０３により光学系２１ａの光軸２０に対し垂直方向に移動させ、対物レンズ１１から標本１２に対し傾いて入射されるレーザー光の入射角を調整する。これにより、標本１２もしくはカバーガラスの境界で全反射を生じさせ、エバネッセント光を標本１２側へ染み出るように発生させる。このエバネッセント光による標本１２の境界付近の蛍光は、対物レンズ１１、ダイクロイックミラー２２、結像レンズ１０、及び吸収フィルタ２３を通過し、撮像素子２４（例えばＣＣＤカメラ）により撮像される。
【００２８】
また、顕微鏡システムを共焦点走査型レーザー顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡のいずれとしても使用しない場合、シャッター２５，２６の両方を閉じる。こうすれば、レーザービームによって標本１２が退色するのを防止することができる。
【００２９】
本第１の実施の形態によれば、顕微鏡システムを共焦点走査型レーザー顕微鏡および全反射蛍光顕微鏡のいずれとして使用する場合も、対物レンズ１１により構成される観察光学系は共通に用いられる。よって、例えば、蛍光色素で標識された一つの標本１２からの蛍光を共焦点走査型レーザー顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡の双方の観察法を用いて観察するような場合も、標本１２を別体の顕微鏡へ移動させる必要が全くなくなる。これにより、標本１２上の同じ位置の状態を異なる観察法で観察するような場合に、同一の顕微鏡システムにて観察法を切換えるだけで精度の高い観察を行なうことができる。
【００３０】
従来では、共焦点走査型レーザー顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡とは、それぞれ別体の顕微鏡として用いられていた。この場合、各顕微鏡で同じ波長のレーザービームを有するレーザー光源が必要となるが、このレーザー光源を各顕微鏡毎に１セットずつ用意しなければならず、経済的に極めて不利になってしまう。そこで、一つのレーザー光源を各顕微鏡で共有することも考えられる。この場合は、レーザー光源からの光ファイバを、使用する顕微鏡毎に接続し直すことになるが、レーザー光を照明として標本に導くためには、光軸の再調整が必要となる。しかし、これら走査型レーザー顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡に用いられる光ファイバは、通常シングルモードファイバであり、コア径が数ミクロンと極めて小さいため、ユーザーが光軸調整を行うのは極めて困難である。
【００３１】
これに対して本第１の実施の形態では、ビームスプリッタ２で分割されたレーザー光源１からのレーザービームを、それぞれ光ファイバ３，４を介して共焦点走査型レーザー顕微鏡および全反射蛍光顕微鏡を構成する光学系に導入し、それぞれの観察法の光源として用いる。これにより、前述したように各顕微鏡毎にレーザー光源を１セットずつ用意するのに比べて、レーザー光源を共有化できるため、顕微鏡システム全体を小型化できるとともに、経済的にも極めて有利になる。
【００３２】
さらに本第１の実施の形態では、レーザー光源１に対するビームスプリッタ２の位置は固定されており、観察法を切換えた時の光ファイバ３，４の入射端３ａ，４ａに対するレーザービームの位置ズレは全く無い。このため、前述したように観察法を切換えるたびに光軸の再調整を必要とするものと比べて、これらの困難な作業を省略できるとともに、常に安定した光量を各顕微鏡に供給することができる。
【００３３】
さらにまた、共焦点走査型レーザー顕微鏡および全反射蛍光顕微鏡、すなわち観察用途の異なる光学系を一つのシステムとして備えることができるので、目的に合った観察法に容易に対応できる。また、レーザー光源および観察光学系を各観察法に共通に使用できるため、システムのスペースを削減でき、レイアウトの自由度が増すとともに、コストの低減化を図ることができる。
【００３４】
（第２の実施の形態）
図２は、本発明の第２の実施の形態に係る顕微鏡システムの概略構成を示す図である。図２において図１と同一な部分には同符号を付している。
【００３５】
レーザー光源１から発せられるレーザービームの光路上には、ミラー２７が配置されている。このミラー２７は、アクチュエータを備えた挿脱機構２０４により、レーザー光源１の光軸に対して垂直な方向（図示矢印方向）へ移動可能、すなわち光路に対し挿脱可能である。挿脱機構２０４は、制御部１００の制御により駆動される。ミラー２７を光路に挿入した状態では、レーザー光源１からのレーザービームはミラー２７で反射し、集光レンズ３０１を介して光ファイバ３の入射端３ａに入射される。また、ミラー２７を光路から外した状態では、レーザー光源１からのレーザービームは直接集光レンズ３０２を介して光ファイバ４の入射端４ａに入射される。図２におけるその他の構成は図１と同じである。
【００３６】
本第２の実施の形態のダイクロイックミラー２２は、上記第１の実施の形態のものと同じ特性を有している。
【００３７】
本第２の実施の形態によれば、ミラー２７を光路に挿入すると、光ファイバ３の入射端３ａにレーザー光源１からのレーザービームが導入されるため、レーザー光源１を第１の実施の形態で述べた共焦点走査型レーザー顕微鏡の光源として用いることができる。また、ミラー２７を光路から外すと、光ファイバ４の入射端４ａに直接レーザー光源１からのレーザービームが導入されるため、レーザー光源１を第１の実施の形態で述べた全反射蛍光顕微鏡の光源として用いることができる。
【００３８】
したがって、このような移動可能なミラー２７を用いることにより、一つのレーザー光源を二つの異なる観察法の光源として切換えて使用することが可能になる。また、レーザー光源からのレーザービームを分割する光路分割部材を用いないため、レーザービームをその強度を減少させることなく、それぞれの観察法に使用することができる。
【００３９】
（第３の実施の形態）
図３は、本発明の第３の実施の形態に係る顕微鏡システムの概略構成を示す図である。図３において図１，図２と同一な部分には同符号を付している。
【００４０】
図３では、レーザー光源として、多波長の発振線を有するレーザー光源２９と単波長の発振線を有するレーザー光源３０とが用いられている。レーザー光源２９は、例えばアルゴンレーザーであり、４５７．９ｎｍ、４８８ｎｍ、５１４．５ｎｍの３本の発振線を有する。レーザー光源３０は、例えば、ヘリウムネオンレーザーであり、５４３ｎｍの発振線を有する。
【００４１】
レーザー光源２９から発せられるレーザービームの光路上には、光路合成部材としてのビーム合成用のダイクロイックミラー３１とビーム分割用のビームスプリッタ２とが配置されている。レーザー光源３０から発せられるレーザービームの光路上には、ミラー３０４が配置されている。ダイクロイックミラー３１は、レーザー光源２９，３０からのレーザービームを合成し、１つの光路を介してビームスプリッタ２に入射させる。
【００４２】
ビームスプリッタ２の反射光路上には、ビームスプリッタ２と集光レンズ３０１との間にＡＯＴＦ（音響光学可変波長フィルタ）３２が配置されている。また、ビームスプリッタ２の透過光路上には、ビームスプリッタ２と集光レンズ３０２との間にＡＯＴＦ３３が配置されている。ＡＯＴＦ３２，３３は、複数本の発振線に対する選択フィルターとして働く。ＡＯＴＦ３２，３３の動作は、制御部１００によって制御される。ＡＯＴＦ３２，３３にて、それぞれＲＦ電圧を選択的に印加することで、その周波数に対応する発振線が各光ファイバ３，４へ導入される発振線として選択される。これにより、共焦点走査型レーザー顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡でのそれぞれ異なる波長のレーザービームによる同時観察を実現できる。
【００４３】
本第３の実施の形態のダイクロイックミラー２２は、標本１２が多重染色されているときに、異なる励起波長のレーザービームを用いて、第１の観察法すなわちＬＳＭによる蛍光観察と第２の観察法すなわちエバネッセント光による蛍光観察とを同時に行なうのに必要な特性を有している。すなわちダイクロイックミラー２２は、光ファイバ４の出射端４ｂから出射される励起波長のレーザービームを反射し、標本１２からの蛍光（出射端４ｂから出射された励起波長のレーザービームにより励起された蛍光）を透過する波長特性を有するとともに、光ファイバ３の出射端３ｂから出射される励起波長のレーザービームを透過し、標本１２からの蛍光（出射端３ｂから出射された励起波長のレーザービームにより励起された蛍光）を透過する波長特性を有する。図３におけるその他の構成は図１と同じである。
【００４４】
以上のような構成をなす顕微鏡システムを共焦点走査型レーザー顕微鏡として使用する場合、ミラー９は挿脱機構２０１により光路に挿入される。ダイクロイックミラー２２は挿脱機構２０２により光路から外される。この状態で、レーザー光源２９，３０から発せられたレーザービーム（４５７．９ｎｍ、４８８ｎｍ、５１４．５ｎｍ、及び５４３ｎｍの発振線）は、ＡＯＴＦ３２により波長４８８ｎｍの発振線が選択され、光ファイバ３等を介して標本１２へ照射される。このとき、ＡＯＴＦ３３では波長４８８ｎｍの発振線は選択されない。そして、ＦＩＴＣ（蛍光波長５２０ｎｍ程度）とＴＲＩＴＣ（蛍光波長５８５ｎｍ程度）で多重染色された標本１２では、波長４８８ｎｍの発振線（励起光）に対応した蛍光が励起される。
【００４５】
標本１２からの５６０ｎｍ未満の波長であるＦＩＴＣの蛍光を含むビームは、ミラー９にて共焦点走査型レーザー顕微鏡用の光路側へ反射する。ＦＩＴＣの蛍光は、検出器１７ａ，１７ｂで検出される。
【００４６】
上記のような構成をなす顕微鏡システムを全反射蛍光顕微鏡として使用する場合、ミラー９は挿脱機構２０１により光路から外される。ダイクロイックミラー２２は挿脱機構２０２により光路に挿入される。この状態で、レーザー光源２９，３０から発せられたレーザービーム（４５７．９ｎｍ、４８８ｎｍ、５１４．５ｎｍ、及び５４３ｎｍの発振線）は、ＡＯＴＦ３３により波長５４３ｎｍの発振線が選択され、光ファイバ４等を介して標本１２へ照射される。このとき、ＡＯＴＦ３２では波長５４３ｎｍの発振線は選択されない。そして、ＦＩＴＣ（蛍光波長５２０ｎｍ程度）とＴＲＩＴＣ（蛍光波長５８５ｎｍ程度）で多重染色された標本１２では、波長６４３ｎｍの発振線（励起光）に対応した蛍光が励起される。
【００４７】
標本１２からの５６０ｎｍ以上の波長であるＴＲＩＴＣの蛍光を含むビームは、撮像素子２４により検出される。
【００４８】
上記のような構成をなす顕微鏡システムを共焦点走査型レーザー顕微鏡および全反射蛍光顕微鏡として同時に使用する場合、上述したミラー９の代わりに、ダイクロイックミラー９’を用いる。ダイクロイックミラー９’は、５６０ｎｍ未満の波長のビームを反射し、それ以上の波長のビームを透過する。ダイクロイックミラー９’は挿脱機構２０１により光路に挿入される。ダイクロイックミラー２２は挿脱機構２０２により光路に挿入される。
【００４９】
この状態で、レーザー光源２９，３０から発せられたレーザービーム（４５７．９ｎｍ、４８８ｎｍ、５１４．５ｎｍ、及び５４３ｎｍの発振線）は、ＡＯＴＦ３２により共焦点走査型レーザー顕微鏡用として波長４８８ｎｍの発振線が選択され、この発振線が光ファイバ３等を介してダイクロイックミラー９’で反射し、ダイクロイックミラー２２を透過し、標本１２へ照射されるとともに、ＡＯＴＦ３３により全反射蛍光顕微鏡用として波長５４３ｎｍの発振線が選択され、この発振線が光ファイバ４等を介してダイクロイックミラー２２で反射し、標本１２へ照射される。そして、ＦＩＴＣ（蛍光波長５２０ｎｍ程度）とＴＲＩＴＣ（蛍光波長５８５ｎｍ程度）で多重染色された標本１２では、それぞれの発振線（励起光）に対応した蛍光が励起される。
【００５０】
標本１２からのこれらの蛍光が、ダイクロイックミラー２２を透過し、ダイクロイックミラー９’で分光される。５６０ｎｍ未満の波長であるＦＩＴＣの蛍光を含むビームは、ダイクロイックミラー９’にて共焦点走査型レーザー顕微鏡用の光路側へ反射する。５６０ｎｍ以上の波長であるＴＲＩＴＣの蛍光を含むビームは、ダイクロイックミラー９’を全反射蛍光顕微鏡用の光路側へ透過する。これら分光された蛍光は、検出器１７ａ，１７ｂおよび撮像素子２４により同時に検出される。
【００５１】
本第３の実施の形態によれば、複数のレーザー光源を備えて発振線を選択的に使用でき、共焦点走査型レーザー顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡とでそれぞれ異なる波長のレーザービームを個別に、または同時に使用できる。これにより、多重染色の標本の同時観察を実現できる。
【００５２】
（第４の実施の形態）
図４は、本発明の第４の実施の形態に係る顕微鏡システムの概略構成を示す図である。図４において図１〜図３と同一な部分には同符号を付している。
【００５３】
図４でも図３と同様に、レーザー光源として、多波長の発振線を有するレーザー光源（アルゴンレーザー）２９と単波長のレーザー光源(ヘリウムネオンレーザー)３０とが用いられている。
【００５４】
レーザー光源２９から発せられるレーザービームの光路上には、ビーム合成用のダイクロイックミラー３４が配置されている。レーザー光源３０から発せられるレーザービームの光路上には、ミラー３０４が配置されている。ダイクロイックミラー３４は、レーザー光源２９，３０からのレーザービームをビーム合成し、ビームスプリッタ３５に入射させる。
【００５５】
ダイクロイックミラー３４により合成されたビームの光路上には、ビームスプリッタ３５が配置されている。このビームスプリッタ３５は、ダイクロイックミラー３４からのレーザービームを、３０％を透過、７０％を反射するよう分割する。ビームスプリッタ３５の透過光路上には、ＡＯＴＦ３２、集光レンズ３０１、およびシングルモードの光ファイバ３の入射端３ａが配置されている。ビームスプリッタ３５を透過したレーザービームはＡＯＴＦ３２に入射する。ＡＯＴＦ３２で選択された波長のレーザービームは、集光レンズ３０１を介して光ファイバ３の入射端３ａに入射する。
【００５６】
ビームスプリッタ３５の反射光路上には、ビームスプリッタ３６とミラー３６１が配置されている。このビームスプリッタ３６は、ビームスプリッタ３５からのレーザービームを、５０％を透過、５０％を反射するよう分割する。ビームスプリッタ３６の反射光路上には、ＡＯＴＦ３３、集光レンズ３０２、およびシングルモードの光ファイバ４の入射端４ａが配置されている。ビームスプリッタ３６で反射したレーザービームはＡＯＴＦ３３に入射する。ＡＯＴＦ３３で選択された波長のレーザービームは、集光レンズ３０２を介して光ファイバ４の入射端４ａに入射する。
【００５７】
ミラー３６１の反射光路上には、ＡＯＴＦ３７、集光レンズ３０３、および光ファイバ３８の入射端３８ａが配置されている。ビームスプリッタ３６１で反射したレーザービームはＡＯＴＦ３７に入射する。ＡＯＴＦ３７で選択された波長のレーザービームは、集光レンズ３０３を介して光ファイバ３８の入射端３８ａに入射する。なお、ＡＯＴＦ３２，３３，３７の動作は、制御部１００によって制御される。
【００５８】
光ファイバ３８の出射端３８ｂの光路上には、第３の観察法としての、共焦点スキャナにより共焦点ディスクスキャン顕微鏡を構成する光学系（顕微鏡光学系）が配置されている。この共焦点スキャナは、マルチピンホールによる共焦点効果を利用した光スキャナであり、リアルタイムでの標本のスライス画像の観察を可能とする。
【００５９】
光ファイバ３８の出射端３８ｂから出射されるレーザービームの光路上には、レーザービームの径を所定径に拡大し平行光束化するビームエクスパンダー３９、マイクロレンズ４０ａを有するマイクロレンズアレイディスク４０、および標本１２と光学的に共役な位置のピンホール４１ａを有するピンホールディスク４１が配置されている。なお、マイクロレンズアレイディスク４０とピンホールディスク４１には、それぞれ例えば特開平９−８０３１５号公報に示される如きマイクロレンズアレイディスクとニポウディスクを用いることができる。また、ピンホールディスク４１の代わりに、国際公開番号ＷＯ０１／６７１５５号に示される如き縞ディスク（スリットディスク）を用いることもできる。
【００６０】
光ファイバ３８の出射端３８ｂから出射されたレーザービームは、ビーム径をビームエクスパンダー３９で所定径に拡大され、平行光束化される。この平行光束に変換されたレーザービームは、マイクロレンズアレイディスク４０のマイクロレンズ４０ａを介して、マイクロレンズ４０ａに対応して配置されたピンホールディスク４１上のピンホール４１ａに集光される。なお、マイクロレンズアレイディスク４０とピンホールディスク４１とは、共通の軸４２を中心に一体化して回転する。
【００６１】
ピンホールディスク４１のピンホール４１ａを通過するレーザービームの光路上には、結像レンズ１０、対物レンズ１１、および標本１２が配置されている。なお、共焦点スキャナを使用する場合、後述するようにミラー９とミラー４６は、光路上から外されている。ピンホールディスク４１のピンホール４１ａを通過したレーザービームは、結像レンズ１０、対物レンズ１１を通過して、標本１２上に集光される。
【００６２】
標本１２からの蛍光および反射光は、対物レンズ１１と結像レンズ１０を通過してピンホールディスク４１上のピンホール４１ａに到達する。このとき、ピンホール４１ａは標本１２と光学的に共役な位置に配置されているので、ピンホール４１ａにより、共焦点効果が得られる。
【００６３】
マイクロレンズアレイディスク４０とピンホールディスク４１との間には、ダイクロイックミラー４３が配置されている。ピンホール４１ａを通過した光線は、ダイクロイックミラー４３により分光される。ダイクロイックミラー４３では、標本１２からの蛍光のみが反射される。また、ダイクロイックミラー４３の反射光路上には、集光レンズ４４と撮像素子（例えばＣＣＤカメラ）４５が配置されている。ダイクロイックミラー４３を反射した標本１２からの蛍光は、集光レンズ４４を介して撮像素子４５の撮像面に集光され、共焦点画像が撮像される。
【００６４】
さらに、結像レンズ１０とミラー９との間の光路上には、ミラー４６が配置されている。ミラー４６は、アクチュエータを備えた挿脱機構２０５により光路に対して挿脱可能である。挿脱機構２０５は、制御部１００の制御により駆動される。このミラー４６は、顕微鏡システムを全反射蛍光顕微鏡として使用する場合に、挿脱機構２０５により光路上に挿入され、エバネッセント光による標本１２の境界付近の蛍光を反射する。ミラー４６で反射した蛍光は、吸収フィルタ２３を介して撮像素子２４（例えばＣＣＤカメラ）により撮像される。
【００６５】
ミラー４６は、顕微鏡システムを共焦点走査型レーザー顕微鏡として使用する場合、または共焦点スキャナを使用する場合に、挿脱機構２０５により光路上から外される。ミラー９は、顕微鏡システムを共焦点走査型レーザー顕微鏡として使用する場合に挿脱機構２０１により光路上に挿入され、共焦点スキャナを使用する場合に挿脱機構２０１により光路上から外される。
【００６６】
このようにミラー９とミラー４６は、顕微鏡システムで用いる観察法に応じて適宜光路上に挿脱される。これにより顕微鏡システムを、共焦点走査型レーザー顕微鏡、全反射蛍光顕微鏡、または共焦点スキャナとして用いることができる。
【００６７】
本第４の実施の形態のダイクロイックミラー２２は、標本１２が多重染色されているときに、異なる励起波長のレーザービームを用いて、第１の観察法すなわちＬＳＭによる蛍光観察と第２の観察法すなわちエバネッセント光による蛍光観察と第３の観察法すなわち共焦点スキャナによる蛍光観察とを同時に行なうのに必要な特性を有している。すなわちダイクロイックミラー２２は、光ファイバ４の出射端４ｂから出射される励起波長のレーザービームを反射し、標本１２からの蛍光（出射端４ｂから出射された励起波長のレーザービームにより励起された蛍光）を透過する波長特性を有するとともに、光ファイバ３の出射端３ｂから出射される励起波長のレーザービームを透過し、標本１２からの蛍光（出射端３ｂから出射された励起波長のレーザービームにより励起された蛍光）を透過する波長特性を有し、かつ光ファイバ３８の出射端３８ｂから出射される励起波長のレーザービームを透過し、標本１２からの蛍光（出射端３８ｂから出射された励起波長のレーザービームにより励起された蛍光）を透過する波長特性を有する。よって、ダイクロイックミラー２２を光路上に常時挿入した状態で、顕微鏡システムを、共焦点走査型レーザー顕微鏡、全反射蛍光顕微鏡、または共焦点スキャナとして用いることができる。図４におけるその他の構成は図１と同じである。
【００６８】
なお、ミラー９，４６をそれぞれ図示しない所定のダイクロイックミラーに代えてもよい。ミラー９に代わるダイクロイックミラーは、共焦点走査型レーザー顕微鏡に係るレーザービームと蛍光を反射し、共焦点スキャナに係るレーザービームと蛍光を透過する。ミラー４６に代わるダイクロイックミラーは、全反射蛍光顕微鏡に係る蛍光を反射し、共焦点走査型レーザー顕微鏡と共焦点スキャナに係るレーザービームと蛍光を透過する。これにより、各観察像の同時観察が可能になる。
【００６９】
本第４の実施の形態によれば、レーザー光源２９，３０からのレーザービームを３本のレーザービームに分岐して各観察法の光源として用いる。また、共焦点走査型レーザー顕微鏡、全反射蛍光顕微鏡に加え、さらに共焦点スキャナを観察用途の異なる光学系として備えることができるので、目的に合った観察法に容易に対応することができる。これにより、レーザー光源を共通化できるため、システムのスペースを削減でき、レイアウトの自由度が増すとともに、コストの低減化を図ることができる。さらに、第３の実施の形態と同様に、異なる波長のレーザービームを同時に各観察法の光源として使用できるので、多重染色された標本の異なる染色毎の蛍光観察が可能になる。
【００７０】
本発明によれば、異なる観察法に対する観察光学系の共通化を図ることができる。これにより、例えば、蛍光色素で標識された一つの標本の蛍光を、異なる観察法を用いて観察するような場合に、同一の顕微鏡システムにて観察法を切換えるだけで精度の高い観察を行なうことができる。
【００７１】
また、本発明によれば、共通のレーザー光源を異なる観察法の光源として用いることができるので、システム全体を小型化できるとともに、経済的にも有利になる。
【００７２】
さらに、本発明によれば、複数の異なる観察法の光学系を一つのシステムとして備えることができるので、目的に合った観察法に容易に対応できる。
【００７３】
さらにまた、本発明によれば、ビームスプリッタから光ファイバにレーザービームを導入する光路中に光遮蔽部材を設け、実際に使用する観察法の光学系へのみレーザービームを導入できるので、不必要なレーザービームによる標本の退色を防止することができる。
【００７４】
以上述べたように本発明によれば、複数の異なる観察法の切換えまたは同時使用に簡単に対応できる顕微鏡システムを提供できる。
【００７５】
本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。
【００７６】
上記第１の実施の形態の図１では、光ファイバ３の出射端３ｂの光路上に、第１の観察法としての共焦点走査型レーザー顕微鏡を構成する光学系を配置し、光ファイバ４の出射端４ｂの光路上に、第２の観察法としての全反射蛍光顕微鏡を構成する光学系を配置した。例えば、光ファイバ３の出射端３ｂの光路上に、第１の観察法としての共焦点走査型レーザー顕微鏡を構成する光学系を配置し、光ファイバ４の出射端４ｂの光路上に、第３の観察法としての共焦点ディスクスキャン顕微鏡を構成する光学系を配置してもよい。また、光ファイバ３の出射端３ｂの光路上に、第３の観察法としての共焦点ディスクスキャン顕微鏡を構成する光学系を配置し、光ファイバ４の出射端４ｂの光路上に、第２の観察法としての全反射蛍光顕微鏡を構成する光学系を配置してもよい。
【００７７】
なお、本発明は上記各実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。
【００７８】
【発明の効果】
本発明によれば、複数の異なる観察法の切換えまたは同時使用に簡単に対応できる顕微鏡システムを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る顕微鏡システムの概略構成を示す図。
【図２】本発明の第２の実施の形態に係る顕微鏡システムの概略構成を示す図。
【図３】本発明の第３の実施の形態に係る顕微鏡システムの概略構成を示す図。
【図４】本発明の第４の実施の形態に係る顕微鏡システムの概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…レーザー光源 ２…ビームスプリッタ ３，４…光ファイバ
５…コリメートレンズ ６…ダイクロイックミラー ７…ＸＹスキャナ
８…瞳投影レンズ ９…ミラー １０…結像レンズ １１…対物レンズ
１２…標本 ２１…落射照明投光管 ２２…ダイクロイックミラー
２３…吸収フィルタ ２４…撮像素子 ２５…シャッター
２６…シャッター ２７…ミラー ３０…レーザー光源
３１…ダイクロイックミラー ３２，３３，３７…ＡＯＴＦ
３４…ダイクロイックミラー ３５，３６…ビームスプリッタ
３８…光ファイバ ３９…ビームエクスパンダー
４０…マイクロレンズアレイディスク ４１…ピンホールディスク ４２…軸
４３…ダイクロイックミラー ４４…集光レンズ ４５…撮像素子
４６…ミラー １００…制御部 ２０１，２０２，２０４，２０５…挿脱機構
２０３…移動機構 ３０１，３０２，３０３…集光レンズ ３０４…ミラー
４０１，４０２…ミラー

Claims (14)

1. レーザ光源と、
   前記レーザ光源からのレーザビームの光路を少なくとも２つに分割する光路分割部と、
   前記光路分割部で分割された光路上の各レーザビームがそれぞれ入射される複数の光ファイバと、
   前記複数の光ファイバを通った各レーザビームをそれぞれ使用する複数の異なる顕微鏡光学系と、を単一の顕微鏡内に備えたことを特徴とする顕微鏡システム。
2. 前記複数の異なる顕微鏡光学系は、共焦点走査型レーザ顕微鏡の光学系および全反射蛍光顕微鏡の光学系であることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡システム。
3. 前記複数の異なる顕微鏡光学系は、共焦点走査型レーザ顕微鏡の光学系および共焦点ディスクスキャン顕微鏡の光学系であることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡システム。
4. 前記複数の異なる顕微鏡光学系は、共焦点ディスクスキャン顕微鏡の光学系および全反射蛍光顕微鏡の光学系であることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡システム。
5. 前記光路分割部は、ビームスプリッタであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
6. 前記光路分割部で分割された光路上の各レーザビームをそれぞれ遮蔽する複数の光遮蔽部材を前記顕微鏡内に備えたことを特徴とする請求項５記載の顕微鏡システム。
7. 前記光路分割部は、レーザビームを反射する少なくとも一つの反射部材と、前記反射部材を前記レーザ光源からのレーザビームの光路上に挿脱する挿脱部と、を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
8. 前記レーザ光源と前記複数の光ファイバとの間にそれぞれ設けられ、前記複数の光ファイバの各々に入射するレーザビームの波長を選択する複数の選択部材を前記顕微鏡内に備えたことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
9. 前記レーザ光源は、波長の異なる複数のレーザビームを出射し、さらに、前記レーザ光源からの波長の異なる複数のレーザビームを合成する光路合成部材を前記顕微鏡内に備え、前記光路合成部材で合成されたレーザビームの光路上に、前記光路分割部を配置したことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
10. 波長の異なる複数のレーザビームを出射するレーザ光源と、
    前記レーザ光源からの複数のレーザビームの光路を分割する光路分割部と、
    前記光路分割部で分割された光路上の各レーザビームがそれぞれ入射される複数の光ファイバと、
    前記光路分割部と前記複数の光ファイバとの間にそれぞれ設けられ、前記複数の光ファイバの各々に入射するレーザビームの波長を選択する複数の選択部材と、
    前記複数の光ファイバを通った各レーザビームをそれぞれ使用する共焦点走査型レーザ顕微鏡の光学系および全反射蛍光顕微鏡の光学系と、を単一の顕微鏡内に備えたことを特徴とする顕微鏡システム。
11. 前記共焦点走査型レーザ顕微鏡の照明光路に、前記全反射蛍光顕微鏡の照明光路を合成するダイクロイックミラーを備えることを特徴とする請求項１０の顕微鏡システム。
12. 前記複数の異なる顕微鏡光学系の光路をひとつに合成する光学部材と、
    を単一の顕微鏡内に備えたことを特徴とする請求項１〜９の顕微鏡システム。
13. 前記光学部材は前記複数の顕微鏡光学系の照明光を標本へ同時に導くように機能することを特徴とする請求項１２の顕微鏡システム。
14. 前記複数の異なる顕微鏡光学系にそれぞれ導入される各レーザビームは、互いに波長が異なることを特徴とする請求項１２または１３の顕微鏡システム。

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