JP2005337730A - 測定システム - Google Patents

Abstract

【課題】 細胞等の測定対象物の一部分だけに所定のタイミングで与えられた刺激に対する、測定対象物の応答を適切に評価し得る測定システムを提供する。
【解決手段】 微粒子２０を保持する光ピンセットユニット２と、微粒子２０を測定対象物の方へ移動させるレンズ１０およびアクチュエーター１６と、微粒子２０から測定対象物３５に作用する力を計測する４分割光検出器１５と、測定対象物３５を拡大して見ることが可能な共焦点ユニット３および顕微鏡ユニット４とを備えている。
【選択図】 図１

Description

本発明は、たとえば細胞や生体分子に対して、力による刺激や化学物質による刺激が与えられた場合に、細胞等に生じる応答を計測するための測定システムに関するものである。

細胞生物学等の研究分野、医療分野、および製薬分野においては、力や化学物質による刺激が細胞に対して与えられた場合に、その細胞に生じる応答を計測することへの必要性が高い。たとえば糖尿病罹患時に起こる赤血球の弾性特性を調べたり、癌細胞のシグナル伝達経路の変化を調べたりすることにより、医療診断や創薬の発展に寄与することができる。

そのような細胞の応答を観察するためには、通常、細胞に刺激を与えるための化学物質をマイクロピペットなどで細胞の近傍に撒くことにより、細胞が化学物質に対してどのように応答するかが観察される。

また、細胞等の微小な測定対象物の物性を測定するためのデバイスとして、以下に説明する共焦点顕微鏡や、光ピンセットが広く用いられている。

共焦点顕微鏡は、高分子、ガラス、細胞等のマイクロメートル単位の大きさを微小試料内部の３次元形状や分子の空間分布を観察するデバイスである。共焦点顕微鏡の特徴は、その名に示されているとおり、共焦点を利用すること、およびレーザー光源等の点光源を使用することにある。なお、共焦点とは、光源と光検出器とが対物レンズに対して光学的に共役の位置関係にあること、すなわち光源の一点から出た光が検出器の一点に集まる状態をいう。

つまり、共焦点顕微鏡は、レーザー光を集光して測定対象物に照射して集光点付近で蛍光を励起し、光学系を通して光を集めて、集光点と光学的に共役な位置にあるピンホールを通してその光を検出する。ここで、集光点の前後では励起レーザー光のエネルギー密度が低いので蛍光の励起確率が低くなり、さらにピンホールを光が通過する確率が低くなるので、３次元的な構造をもつ対象物を光学的に切断（光学切断）したいわゆる断層像を得ることができる。さらに対物レンズを動かすなどして、集光点の前後位置を移動させて光学切断像を取得し、それらを積み重ねることで対象物の３次元構造を観察することができる。

また、光ピンセットは、エネルギー密度の高いレーザー光を対物レンズで集光して微粒子に照射することにより、微粒子に光の放射圧を働かせて、微粒子をレーザー光のスポット付近に捕まえることができる現象（レーザートラッピング）を用いるデバイスである。この光ピンセットは、顕微鏡下の粒子を捕まえて操作することができるので（非特許文献１参照）、マイクロマニピュレーションなどに用いられている。

光ピンセットで粒子を捕まえると、粒子はバネに吊るされたような状態でレーザー光のスポット中に捕まえられる。ここで、その粒子に外力が働くと、粒子は微小変位する。この粒子の変位量を計測することで、粒子に働いている力を計測することができる。

その変異量を計測するために、粒子にエバネッセント状態の光を照射して散乱光を検出したり、集光したビームを照射して散乱光の位置を検出したりすることが行われている。その代表的な例として、粒子と基板との間に働く力をフェムトニュートンオーダーの最小力感度で計測した例（非特許文献２参照）や、アクチン−ミオシン間に働く力を計測した例（非特許文献３参照）、DNAとRNAポリメラーゼとの間に働く力を計測した例がある。

また、このような共焦点顕微鏡および光ピンセットを用いる技術として、たとえば特許文献１に記載された３次元イメージ取得方法を挙げることができる。
特開２００１−１４７３７４号公報（２００１年５月２９日公開） A. Ashkin, J.M.Dziedic, J.E.Bjorkholm and S.Chu, "Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles," Optics Letters, Vol.11, No.5, pp.288-290(1986) "Surface-force measurement with a laser-trapped microprobe in solution", APPLIED PHYSICS LETTERS, Vol.80 No.18, May 6 2002 "Single molecule nanomanipulation of biomolecules",TRENDS in Biotechnology Vol.19 No.6, pp211〜216, June 2001 「限界を超える生物顕微鏡−見えないものを見る 日本分光学会測定法シリーズ２１」、学会出版センター、１９９１年６月３０日発行

しかしながら、細胞に刺激を与えるための化学物質をマイクロピペットなどで細胞の近傍に撒く方法では、（１）細胞にどのタイミングで化学物質による刺激を与えられたのか特定することが困難である、（２）細胞の一部分だけに限定して刺激を与えるのが困難であるという問題点があった。また、化学物質などを用いて細胞に刺激を与えた場合に、（３）刺激が適切に与えられたのか、（４）与えた刺激の大きさはどの程度か、ということを評価するのが困難であった。

また、特許文献１に記載されている３次元イメージ取得方法は、光ピンセットを用いて測定対象の微小試料をトラップし、その微小試料を共焦点顕微鏡により観察するだけである。つまり、特許文献１の３次元イメージ取得方法では、光ピンセットにより固定された微小試料に対してどのように刺激を与えるかということは考慮されていない。したがって、化学物質をマイクロピペットなどにより細胞の近傍に撒く上述の方法と同様の問題点が、特許文献１に記載の３次元イメージ取得方法でも生じる。

本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、細胞等の測定対象物の一部分だけに所定のタイミングで与えられた刺激に対する、測定対象物の応答を適切に評価し得る測定システムを提供することを目的とする。

本発明の測定システムは、上記課題を解決するために、微粒子を保持する保持手段と、上記微粒子を測定対象物の方へ移動させる移動手段と、上記微粒子から上記測定対象物に作用する刺激の量を計測する計測手段と、上記測定対象物を拡大して見ることが可能な観察手段とを備えていることを特徴としている。ここで、「刺激の量」には、上記測定対象物に作用する刺激の量のみではく、上記測定対象物からの応答の量も含まれる。また、「刺激」や「応答」としては、力、化学的な刺激、熱的な作用が含まれる。

上記構成によれば、保持手段により保持された微粒子を、移動手段により移動させて測定対象物に押し当てることができる。また、微粒子に化学物質を固定しておけば、化学物質による刺激を測定対象物に与えることもできる。したがって、保持手段により測定対象物と接触されるべき位置に微粒子を保持しておき、さらに移動手段を用いて所定のタイミングで微粒子を測定対象物に移動させれば、測定対象物の一部分だけに限定して、所望のタイミングで刺激を与えることができる。

さらに、移動手段により微粒子が測定対象物に押し当てられることにより測定対象物に生じる刺激の量、たとえば力の大きさは、計測手段を用いることにより計測することができる。これにより、測定対象物に与えられた刺激を評価することができる。

また、微粒子が測定対象物に押し当てられることにより発生する、測定対象物の形状変化、測定対象物の内部構造の変化、または測定対象物を構成する分子の空間的な分布は、観察手段を用いて測定対象物を拡大して見ることにより把握することができる。したがって、微粒子から測定対象物に適切な刺激が与えられたのかを評価することができる。

さらに、上記保持手段は、光ピンセットであることが好ましい。この構成によれば、光ピンセットにより微粒子を保持するので、保持手段に微粒子を接触させることなく微粒子を保持することができる。よって、移動手段を用いて微粒子を移動させる際に、保持手段が微粒子に物理的な外力を与えることを防止し、微粒子の形状が変形してしまうというような微粒子の物理的な変化を防止できる。

さらに、上記光ピンセットは、複数のレーザー光により複数の微粒子を保持するものであることが好ましい。この構成によれば、光ピンセットにより複数の微粒子を保持することができるので、測定対象物に複数の微粒子を押し当てることが可能となる。

たとえば、ＤＮＡに結合されたタンパク質分子を測定対象物とした場合に、そのＤＮＡの両端に微粒子を固定するとともにその微粒子を光ピンセットにより固定すれば、そのタンパク質とＤＮＡとの関係を観察することができる。それゆえ、より多様な測定手法に本発明の測定システムを対応させることができる。

さらに、上記光ピンセットは、上記観察手段が上記測定対象物を拡大するために用いる第１レンズとは別の第２レンズを用いて、レーザー光を微粒子に入射してその微粒子を保持するものであることが好ましい。

上記構成によれば、光ピンセットの光学系と、観察手段との光学系が独立して構成されるので、光ピンセットによる微粒子の保持と、観察手段による測定対象物の拡大とを、独立して調整することが可能となる。これにより、測定システムの利便性を向上させることができる。

さらに、上記計測手段は、光ピンセットユニットから発せられるレーザー光が上記微粒子で反射した光の強度に基づき、上記微粒子の位置変位量を算出し、この位置変位量と、上記光ピンセットによる上記微粒子に対する保持力が示すバネ定数とに基づき、上記微粒子から上記測定対象物に作用する刺激の量としての力の大きさを計測するものであることが好ましい。

つまり、光ピンセットにより微粒子を保持する際、その微粒子に対する保持力は、微粒子の位置変位量に比例する。したがって、この比例係数をバネ係数として予め算出しておけば、微粒子の位置変位量とバネ係数とから、上記保持力を算出することができる。

そこで上記構成では、光ピンセットユニットのレーザー光を用いて微粒子の位置変位量を求める。つまり、光ピンセットユニットの光学系を流用して微粒子の位置変位量を求めることができるので、位置変位量を算出するための構成を簡略化することができる。これにより、測定システム全体の構成も簡略化することができる。

さらに、上記観察手段は、共焦点顕微鏡であることが好ましい。すなわち、共焦点顕微鏡によれば、測定対象物を光学的に切断した断層像を得ることができる。よって、微粒子が押し当てられることにより測定対象物に生じる変化を、共焦点顕微鏡を用いて得られる測定対象物の断層像に基づき、より詳細に観察することが可能となる。

さらに、上記共焦点顕微鏡は、複数のピンホールが表面に形成されたピンホールディスクと、その複数のピンホールのそれぞれに光を集光する第３レンズを複数有しているマイクロレンズディスクと、上記ピンホールディスクおよび上記マイクロレンズディスクを回転させる回転手段と、上記回転手段によるディスクの回転速度を調整可能な調整手段とを備えていることが好ましい。

上記構成によれば、回転手段を用いてピンホールディスクおよびマイクロレンズディスクを回転させることにより、第３レンズおよびピンホールを通過したレーザー光を用いて測定対象物をスキャンすることが可能となる。

そして、調整手段を用いて回転手段によるディスクの回転速度を高速に設定すれば、測定対象物を高速でスキャンすることが可能となる。これにより、測定対象物の断層像を短い時間間隔で得ることができる。よって、微粒子が押し当てられることにより測定対象物に生じる変化をより詳細に観察することができる。

さらに、上記観察手段は、上記測定対象物の変化を時系列で見るものであることが好ましい。

上記構成によれば、微粒子が押し当てられることにより測定対象物が経時的に変化するような場合、その測定対象物の変化を観察手段により時系列で見ることができる。たとえば測定対象物が細胞であり、微粒子がその細胞に対して刺激を与えるリガンドが固定されたものである場合、リガンドに対する細胞の応答を時系列で見ることができる。

このように、上記構成によれば、微粒子が押し当てられることにより生じる測定対象物のさらに詳細な観察が可能となる。

また、上記測定対象物を載せておく載置台に対して、上記保持手段、上記計測手段、および上記観察手段が同じ側に配置されていてもよい。

上記構成によれば、載置台に対して、保持手段、計測手段、および観察手段が同じ側に配置されているので、載置台に対してこれらの手段が配された側と反対側のスペースを有効利用することができる。

さらに、上記構成において、上記保持手段は光ピンセットであり、上記観察手段が上記測定対象物を拡大するために用いる第１レンズの移動量に基づき、上記光ピンセットのレーザー光のスポット位置を変更するスポット位置変更手段を備えていることが好ましい。

つまり、保持手段としての光ピンセットと、観察手段とが載置台に対して同じ側に配置されている場合、光ピンセットのレーザー光は第１レンズを介して微粒子に入射する。

したがって、第１レンズが移動すると、光ピンセットのレーザー光のスポット位置が変更され、そのスポット位置において保持されている微粒子も移動する。このように微粒子が移動すると、微粒子を測定対象物へ適切に押し当てることができず、測定対象物の応答を計測する上で好ましくない場合がある。

そこで上記構成では、第１レンズの移動量に基づき、光ピンセットのレーザー光のスポット位置を変更するスポット位置変更手段を備えている。すなわち、第１レンズの移動量と、光ピンセットのレーザー光のスポット位置とは、所定の関係を示す。この関係に基づきスポット位置変更手段を用いてそのスポット位置を変更すれば、微粒子を一定の位置において保持し、測定対象物と微粒子との位置関係を一定に維持することができる。これにより、微粒子を測定対象物に安定して押し当てることができ、測定対象物の応答を適切に計測することができる。

さらに、本発明の測定システムは、上記測定対象物を切断することが可能な切断手段を備えていることが好ましい。

上記構成によれば、切断手段を用いて測定対象物を切断することにより、測定対象物の内部構造をより詳細に観察手段で観察することができる。したがって、微粒子が押し当てられることにより測定対象物の内部に生じる変化を、さらに仔細に観察することが可能となる。

本発明の測定システムによれば、保持手段により保持された微粒子を、移動手段により移動させて測定対象物に押し当てることができる。また、微粒子に化学物質を固定しておけば、化学物質による刺激を測定対象物に与えることもできる。したがって、保持手段により測定対象物と接触されるべき位置に微粒子を保持しておき、さらに移動手段を用いて所定のタイミングで微粒子を測定対象物に移動させれば、測定対象物の一部分だけに限定して、所望のタイミングで刺激を与えることができるという効果を奏する。

さらに、移動手段により微粒子が測定対象物に押し当てられることにより測定対象物に生じる刺激の量は、計測手段を用いることにより計測することができる。これにより、測定対象物に与えられた力の大きさを評価することができるという効果を奏する。

また、微粒子が測定対象物に押し当てられることにより発生する、測定対象物の形状変化、測定対象物の内部構造の変化、または測定対象物を構成する分子の空間的な分布は、観察手段を用いて測定対象物を拡大して見ることにより把握することができる。したがって、微粒子から測定対象物に適切な刺激が与えられたのかを評価することができるという効果を奏する。

〔１．顕微鏡システムの構成〕
図１に本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムの構成を示す。本実施形態に係る顕微鏡システム（測定システム）１は、図１に示すように、光ピンセットユニット（保持手段）２と、共焦点ユニット（観察手段、共焦点顕微鏡）３と、顕微鏡ユニット（観察手段、共焦点顕微鏡）４とから構成される。これら共焦点ユニット３および顕微鏡ユニット４により、共焦点顕微鏡が構成される。

光ピンセットユニット２は、レンズ５と、ビームスプリッター６と、レンズ７・８と、２色性ミラー９と、レンズ（第２レンズ、移動手段）１０と、フィルター１１と、レンズ１２と、ＣＣＤカメラ１３と、レンズ１４と、４分割光検出器（計測手段）１５と、アクチュエーター（移動手段）１６とを備えている。

上記構成により、光ピンセットユニット２は、光ファイバー１７により導かれた光ピンセット用レーザー光源１８の光をレンズ５によりコリメートした後、レンズ７により一旦集光する。さらに、光ピンセットユニット２は、レンズ７により集光された光を、レンズ８を用いて再びコリメートした後、２色性ミラー９により反射する。

そして、光ピンセットユニット２は、２色性ミラー９が反射した光をレンズ１０により集光することにより、試料セル（載置台）１９中において微粒子２０を捕まえる。さらに、光ピンセットユニット２は、微粒子２０から戻ってくる散乱光を、レンズ１０を用いて集光してから２色性ミラー９で反射し、レンズ７・８を通過させた後、ビームスプリッター６を用いて反射する。その後、光ピンセットユニット２は、ビームスプリッター６により反射された光を、レンズ１４により集光して、４分割光検出器１５の上に結像する。なお、４分割光検出器１５は、微粒子からの散乱光の位置を検出する働きをするものであり、詳細な構成は後述する。

また、共焦点ユニット３は、レンズ２１と、リレーレンズ２２と、ガルバノミラー２３・２４と、レンズ２５と、２色性ミラー２６ａと、フィルター２６ｂと、レンズ２７と、ピンホール２８とを備えている。そして、顕微鏡ユニット４は、レンズ２９と、フィルター３０と、レンズ（第１レンズ）３１と、アクチュエーター３２とを備えている。

上記構成により、共焦点ユニット３は、光ファイバー３３により導かれたレーザー光源３４の光を、レンズ２１を用いてコリメートする。その後、共焦点ユニット３は、レンズ２１によりコリメートされた光を、２枚のレンズ２２ａ・２２ｂからなるリレーレンズ２２内を通過させた後、２枚のガルバノミラー２３・２４で反射してから、レンズ２５で集光する。

また、光ピンセットユニット２におけるレンズ１０は、アクチュエーター１６に保持されている。このアクチュエーター１６を動作させることにより、光軸方向にレーザースポットの位置を動かすことができる。

そして、顕微鏡ユニット４は、レンズ２５により集光された光をレンズ２９によりコリメートしてからレンズ３１で集光し、蛍光染色した測定対象物３５に照射する。この測定対象物３５により反射される光は、レンズ３１により集められた後、フィルター３０を通過することにより光ピンセットユニット２から入射する光の波長がカットされてから、再びガルバノミラー２３・２４にて反射される。

このようにガルバノミラー２３・２４により反射された光は、２色性ミラー２６ａにより反射されてフィルター２６ｂを通過する。フィルター２６ｂを通過した光は、レンズ２７により集光された後、ピンホール２８に照射される。このピンホール２８を通過した光は、光検出器３６により検出される。

また、共焦点ユニット３においては、レーザー光源３４からの光は２色性ミラー２６ａでほとんど反射せず、若干反射したとしても、その反射光はフィルター２６ｂでカットされるので、ピンホール２８には測定対象物３５から発せられた蛍光のみが通過する。

また、ガルバノミラー２３・２４の角度を変えると、測定対象物３５におけるレーザー光が照射される位置を変更することができる。したがって、その変更された位置から戻ってくる光がピンホール２８を通過するようになる。それゆえ、２枚のガルバノミラー２３・２４の角度を同調して走査することで、測定対象物３５の２次元的な画像を得ることができる。

また、共焦点ユニット３は、ピンホール２８を有することから、コンフォカリティを持ち、レーザー光が集光される位置を、３次元的に１点に限定して計測することができる。なお、コンフォカリティとは、焦平面の対象物を上下の構造とは独立に観察できる能力のことを表し、共焦点顕微鏡で物体の断層像が観察できるのは、共焦点顕微鏡がコンフォカリティを有しているからである。したがって、共焦点顕微鏡で得られる２次元的な画像は、測定対象物の断層像となる。

また、顕微鏡ユニット４におけるレンズ３１は、アクチュエーター３２に保持されている。したがって、アクチュエーター３２を動作させることにより、レンズ３１をレーザー光の光軸方向に移動させることができる。さらに、ガルバノミラー２３・２４を走査して断層像を得るのと同期して、アクチュエーター３２を動作させてレンズ３１を光軸方向に移動させることで、測定対象物３５の複数の断層像を得ることができる。これにより、測定対象物３５の内部の３次元的な物質分布を計測することができる。

また、光ピンセットユニット２には、ＣＣＤカメラ１３が設置されている。このＣＣＤカメラ１３を通して、測定対象物３５の拡大像を時系列で観察することができる。さらに、ＣＣＤカメラ１３を用いて、光ピンセットユニット２、共焦点ユニット３、および顕微鏡ユニット４の光学的な位置関係を調整することができる。

つまり、光ピンセットユニット２は試料セル１９に対して上側に配置されている一方、共焦点ユニット３および顕微鏡ユニット４は試料セル１９に対して下側に配置されており、光ピンセットユニット２と、共焦点ユニット３および顕微鏡ユニット４とは、光学的に独立な関係にある。したがって、実験のはじめの段階で、各ユニットの光学系の位置を決定する必要がある。そのためには、ＣＣＤカメラ１３を用いて、顕微鏡ユニット４からの共焦点レーザー光を確認し、そのレーザー光を目印に光学系の調整を行えばよい。

また、試料セル１９の上側に光ピンセットユニット２を設置することで、光ピンセットで捕捉した微粒子２０を、測定対象物３５としての細胞へ接触させた場合に、微粒子２０と細胞との位置関係を変えずに、観察側の焦点位置を変化させることができる。つまり、共焦点顕微鏡で細胞の３次元画像を撮る場合には、観察側のレンズ３１を光軸方向に移動させて焦平面を変えて２次元画像を順次得ていくことになるが、このようにレンズ３１を移動させても、光ピンセットユニット２における各構成要素の光学的な位置関係は何ら影響を受けることはない。したがって、光ピンセットにより捕捉されている微粒子２０の位置が変わることもないので、上記焦平面を変化させ、細胞の３次元画像を得ることができる。

図２に、測定対象物３５としての細胞へ、微粒子２０を近づけて、細胞を観察している様子を示す。図２に示すように、試料セル１９には、光ピンセットユニット２からのレーザー光が入射している。微粒子２０は、このレーザー光により捕捉されている。

ここで、微粒子２０を細胞へ近づけていくと、細胞に対しては刺激や力が付与され、微粒子２０に対しては、細胞表面の分子との相互作用で発生した力や細胞膜で押し返される力などが働く。

また、微粒子２０から刺激を与えられた細胞は、それに対する反応（カルシウム波の発生等）を示したり、弾性変形したりする。この刺激に対する細胞の反応や弾性変形等を、本実施形態では上述した共焦点顕微鏡で観察する。

また、微粒子２０に対して細胞から与えられる力によって微粒子２０の位置は変位する。ここで、光ピンセットで微粒子を捕まえている状態は、バネに微粒子をぶら下げる状態に似ていることから、微粒子に対して外力が働いた場合、そのバネの長さが変化するものと把握することができる。そして、光ピンセットのバネ定数を予め求めておけば、微粒子の位置変位量を計測することで微粒子に対して働く力を求めることができる。微粒子に対して働く力を求める手順に関しては後述する。

図３（ａ）および図３（ｂ）は、細胞膜に微粒子２０を近づけた状態を示している。光ピンセットにより捕まえられた微粒子２０を細胞膜に近づけると、細胞膜と微粒子２０との間で相互に作用する力（相互作用力）が発生する。また、微粒子２０の表面にリガンドとなる物質が固定されていると、細胞膜上の受容体分子と微粒子２０とが相互に作用することになる。このときに発生する相互作用力は、静電力、双極子相互作用、van der Waals力である。

〔２．相互作用力を算出する手順〕
４分割光検出器１５は、図４に示すように、その検出領域が４つの扇形領域Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄに等分割されている。これら４つの扇形領域Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄにおいては、微粒子からの散乱光のスポットが形成されるとともにその光強度が検出される。そして、その光強度がアナログ演算回路（計測手段）３７で演算処理された後、コンピューターに出力される。

アナログ演算回路３７は、３つの減算器３８…と、２つの加算器３９…とからなる。また、アナログ演算回路３７には、出力端子が３つ設けられている。これら３つの出力端子のそれぞれから出力される信号のレベルをＩ_ｘ，Ｉ_ｙ，Ｉ_ｚとし、４分割検出器の領域Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄのそれぞれにおいて検出される信号のレベルをＩ_Ａ，Ｉ_Ｂ，Ｉ_Ｃ，Ｉ_Ｄとした場合、Ｉ_ｘ，Ｉ_ｙ，Ｉ_ｚは以下のように設定される。

Ｉ_ｘ＝（Ｉ_Ａ＋Ｉ_Ｂ）−（Ｉ_Ｃ＋Ｉ_Ｄ）
Ｉ_ｙ＝（Ｉ_Ａ＋Ｉ_ｃ）−（Ｉ_Ｂ＋Ｉ_Ｄ）
Ｉ_ｚ＝Ｉ_Ａ＋Ｉ_Ｂ＋Ｉ_Ｃ＋Ｉ_Ｄ
そして、本実施形態の顕微鏡システムにおいては、これらの信号レベルＩ_ｘ，Ｉ_ｙ，Ｉ_ｚを用いて、微粒子の変位を以下のように算出することができる。

まず、光ピンセットのレーザー光の光軸に垂直な方向である、ｘ方向およびｙ方向の変位について説明する。すなわち、平衡位置からの微粒子の変位がレーザー光のスポット径に比べて十分小さい場合、ｘおよびｙ方向のそれぞれへの微粒子の変位量をｄ_ｘ，ｄ_ｙとすると、これらの変位量と信号レベルＩ_ｘ，Ｉ_ｙとの間には、ａ，ｂ，ｃを比例定数として、ｄ_ｘ＝ａＩ_ｘ，ｄ_ｙ＝ｂＩ_ｙの関係が成り立つ。この関係を用いて、微粒子に働く力を求める。なお、「平衡位置」とは、微粒子が光ピンセットにより安定してトラップされている際の微粒子の位置である。

先ず、ｘ, ｙ方向のそれぞれに働くトラップ力のバネ定数をｋ_ｘ, ｋ_ｙとした場合、微粒子がブラウン運動する性質を考慮すると、これらのバネ定数はｄ_ｘ，ｄ_ｙを用いて以下のように表現することができる。すなわち、所定時間だけＩ_ｘ，Ｉ_ｙを計測した場合におけるこれらの値の平均値に対して、各時刻におけるＩ_ｘ，Ｉ_ｙの値がずれている量を時間平均した値を〈Ｉ_ｘ〉，〈Ｉ_ｙ〉とする。また、微粒子の変位量の時間平均を〈ｄ_ｘ〉，〈ｄ_ｙ〉とすると、〈ｄ_ｘ〉＝ａ〈Ｉ_ｘ〉，〈ｄ_ｙ〉＝ｂ〈Ｉ_ｙ〉と求めることができる。さらに、〈ｄ_ｘ〉，〈ｄ_ｙ〉と、ｋ_ｘ，ｋ_ｙとの間には、以下の関係が成り立つ。

１／２ＫＴ＝１／２ｋ_ｘ〈ｄ_ｘ〉^２＝１／２ｋ_ｙ〈ｄ_ｙ〉^２ なお、Ｋはボルツマン定数、Ｔは絶対温度である。

上式に基づけば、以下の式を導くことができる。

ｋ_ｘ＝ＫＴ／（ａ^２〈Ｉ_ｘ〉^２）
ｋ_ｙ＝ＫＴ／（ｂ^２〈Ｉ_ｙ〉^２）
そして、微粒子に働く力Ｆ_ｉは、Ｆ_ｉ＝ｋ_ｉｄ_ｉとして表され、ポテンシャルＵ_ｉは、Ｕ_ｉ＝Ｆ_ｉｄ_ｉとして表されるので（ｉはｘ，ｙ，ｚのいずれかである）、
Ｆ_ｘ＝｛ＫＴ／（ａ^２〈Ｉ_ｘ〉^２）｝・ａＩ_ｘ＝｛ＫＴ／（ａ〈Ｉ_ｘ〉^２）｝Ｉ_ｘ
Ｕ_ｘ＝Ｆ_ｘａＩ_ｘ＝｛ＫＴ／（〈Ｉ_ｘ〉^２）｝Ｉ_ｘ ^２
Ｆ_ｙ＝｛ＫＴ／（ｂ^２〈Ｉ_ｙ〉^２）｝・ｂＩ_ｙ＝｛ＫＴ／（ｂ〈Ｉ_ｙ〉^２）｝Ｉ_ｙ
Ｕ_ｙ＝｛Ｆ_ｙｂＩ_ｙ＝ＫＴ／（〈Ｉ_ｙ〉^２）｝Ｉ_ｙ ^２
これらの式から、力Ｆ_ｘ，Ｆ_ｙを求める場合には、比例係数ａ，ｂを求める必要があるが、ポテンシャルはこれらの比例係数が未知でも求められることがわかる。

また、比例係数ａ, ｂを求めるには、試料ステージを等速度ｖで移動させて、そのときの移動距離からバネ定数ｋ_ｉを求めて、これを先にブラウン運動から求めたバネ定数ｋ_ｘ, ｋ_ｙと比較する。つまり、微粒子の半径をｒ、周りの媒質の粘性をηとして、微粒子をトラップした状態で試料ステージをｘ方向に等速度ｖ_ｘで移動させたときの微粒子の横ずれをｄ_ｘ＝ａＩ_ｘとすると、ストークスの法則により微粒子に働く力Ｆ_ｘは、
Ｆ_ｘ＝ｋ_ｘｄ_ｘ＝ｋ_ｘａＩ_ｘ＝６πηｒｖ_ｘ
と表される。

すると、ｋ_ｘ＝６πηｒｖ_ｘ／（ａＩ_ｘ）となる。このように求められたｋ_ｘを、ブラウン運動から求めたｋ_ｘと比較すると、
ｋ_ｘ＝ＫＴ／（ａ^２〈Ｉ_ｘ〉^２）＝６πηｒｖ_ｘ／（ａＩ_ｘ）
となるので、ａは
ａ＝ＫＴＩ_ｘ／（６πηｒｖ_ｘ〈Ｉ_ｘ〉^２）
同様に、
ｂ＝ＫＴＩ_ｙ／（６πηｒｖ_ｙ〈Ｉ_ｙ〉^２）と求めることができる。

これらの比例係数を用いてＩ_ｘ, Ｉ_ｙの計測値から実際の位置変位を求めることができる。また微粒子に働く力を求めることができる。

次に、光軸方向の変位について説明する。微粒子がｚ方向に移動すると、微粒子の移動量ｄ_ｚと、微粒子からの散乱光強度Ｉ_ｚとの関係は、微粒子の位置変位が小さければ近似的に２次関数で示される。そして、散乱光強度Ｉ_ｚと位置変位ｄ_ｚとの関係を２次関数で近似すると、
Ｉ_ｚ＝ｄ_ｚ ^２／ｐ^２＋ｑ
と表され、Ｉ_ｚからｄ_ｚを求めることができる。

この式から
ｄ_ｚ＝（Ｉ_ｚｐ^２−ｑｐ^２）^１／２＝ｐ（Ｉ_ｚ−ｑ）^１／２
と表される。

したがって、
〈ｄ_ｚ〉^２＝ｐ^２〈（Ｉ_ｚ−ｑ）^１／２〉^２となり、
ｋ_ｚ＝ＫＴ／（ｐ^２〈（Ｉ_ｚ−ｑ）^１／２〉^２）
として、ｚ方向のバネ定数ｋ_ｚが与えられる。

よって、
Ｆ_ｚ＝｛ＫＴ／（ｐ^２〈（Ｉ_ｚ−ｑ）^１／２〉^２）｝ｐ（Ｉ_ｚ−ｑ）^１／２
＝｛ＫＴ／（ｐ〈（Ｉ_ｚ−ｑ）^１／２〉^２）｝（Ｉ_ｚ−ｑ）^１／２
Ｕ_ｚ＝｛ＫＴ／（ｐ〈（Ｉ_ｚ−ｑ）^１／２〉^２）｝（Ｉ_ｚ−ｑ）^１／２ｐ（Ｉ_ｚ−ｑ）^１／２
＝｛ＫＴ／（〈（Ｉ_ｚ−ｑ）^１／２〉^２）｝（Ｉ_ｚ−ｑ）
となる。

なお、係数ｐとｑは実験により決定しなければならない。係数ｐとｑを決定するには、光ピンセットのレーザー光強度を変化させてバネ定数ｋ_ｚを計測することを繰り返し、バネ定数が光強度に比例して変化することを利用して、その関係を満たすようにｐ, ｑを最小二乗法で決定することができる。この場合、微粒子からの散乱光強度がレーザー光強度に比例するので、最小二乗法で解析するときに散乱光強度も考慮する必要がある。

また、微粒子のｚ方向の移動に関しては、一般に、光ピンセットでは、スポットよりレーザー光の下流側で微粒子は安定に捕まえられる。微粒子からの散乱光強度Ｉ_ｚは微粒子の中心が、スポット中の集光点と一致した場合に最大になるので、微粒子がスポットよりも下流側にあるということは、Ｉ_ｚが最大値より幾分か小さい値になっていることを意味する。この安定に捕まえられている状態から微粒子が光源側に移動するとＩ_ｚは増加し、微粒子がレーザー光の下流側に移動するとＩ_ｚは減少する。

また、顕微鏡システム１で計測する微粒子の変位量は、微粒子の中心とスポット中の集光点との距離に比べて小さいと仮定することができる。したがって、Ｉ_ｚが最大となる付近で微粒子の移動方向が不定になることは、微粒子が細胞に与える力を計測する上で特に問題にならない。

なお、本実施形態の４分割光検出器１５による微粒子位置の計測系では、光ピンセット用のレーザーとは別のレーザービーム（たとえばガイド光）を微粒子に照射して、その散乱光を同様な方法で検出することによっても実現できる。

具体的には、光ピンセット用のＮｄ：ＹＡＧレーザー（波長１０６４ｎｍ）と同軸にＨｅ−Ｎｅレーザー（波長６３２．８ｎｍ）を微粒子に入射して、微粒子によって散乱されたＨｅ−Ｎｅレーザーの光を４分割光検出器１５で検出することにより、微粒子の位置変位を検出できることを確認した。

このように、光ピンセット用のレーザーとは別のレーザーを用いて、微粒子の位置変位を計測することにより、４分割光検出器１５の感度調整が容易になる。光ピンセット用のレーザーおよびそれ以外のレーザーのいずれを４分割光検出器１５で検出するかは、観察する対象と観察方法に依存して決定すればよい。

また微粒子からの散乱光を検出するデバイスとして、ポジション・センシティブ・ディテクター（ＰＳＤ）を用いても同様に粒子の位置ずれを検出することができる。ポジション・センシティブ・ディテクターは、ディテクター面上のスポット位置をｘ座標とｙ座標のそれぞれの値を電圧として出力するデバイスである。このディテクターをレンズ１４（図１参照）の後段の４分割光検出器１５の代わりに配置することにより、微粒子からの散乱光をディテクター面上に投影して粒子位置の検出を行うことができる。

〔３．細胞への接触実験〕
本実施形態の顕微鏡システムを用いて細胞への接触実験を行ったので、その結果を以下に説明する。なお、光ピンセット用のレーザーとして、波長１０６４ｎｍのＮｄ：ＹＡＧレーザーを用いるとともに、微粒子として直径１μｍのものを用いた。そして、微粒子を光ピンセットで捕まえるとともに、レンズ１０（図１参照）を徐々に光軸方向に移動させることにより、微粒子を細胞へ接触させた。

すると、微粒子を細胞へ接触させたときに、微粒子から散乱されるレーザー光のパターンが変化して、微粒子が位置ずれすることを確認できた。また細胞に対して接触した状態で微粒子を横に移動させると、微粒子が横ずれすることで散乱光の中心が横ずれすることを確認した。これらのパターン変化や散乱光の中心の横ずれを、４分割光検出器１５で検出した。

そして、共焦点顕微鏡を用いることにより得られた細胞の断層像を図５に示す。なお、細胞はヒト血管内皮細胞でカバーガラス上に広がった状態で固着している。また、Alexa488-ファロイジン（Molecular Probes Inc.製）を用いてこの細胞内のアクチン繊維を染色し、共焦点顕微鏡で観察した。図５に示すように、細胞内部にアクチン繊維を観察することができる。また、光ピンセットで捕まえた粒子は、図５の断層像内に観察することはできない。

〔４．化学物質による刺激付与実験〕
また、細胞に対して化学物質による刺激を与えるために、微粒子表面に刺激物質となる分子（リガンド）を固定しておき、その分子と相互作用する受容体へ刺激を与える方法について以下に説明する。なお、微粒子表面へリガンドを固定するには、たとえばクロスリンカー分子を用いる方法や、リガンドへつけたビオチン分子を微粒子表面に固定したストレプトアビジン分子に結合させる方法、ＣｙＢｒ法やシランコート法等を用いることができる。

図６に、これらの方法のそれぞれについて、微粒子と受容体との相互作用の様子を示す。まず、クロスリンカー分子を用いる方法では、図６（ａ）に示すように、微粒子２０の表面にクロスリンカー分子４０を固定し、さらにクロスリンカー分子４０にリガンド分子４１を固定する。この状態で、リガンド分子４１を細胞膜の脂質二重膜（測定対象物）４２に近づけると、その中に存在する受容体分子（測定対象物）４３にリガンド分子４１を結合できる。

なお、クロスリンカー分子４０として、ＤＳＰ（ピアス社製、Double-AgentTM Cross-linker Number: 22585）分子などを用いることができる。ＤＳＰ分子は、以下の化学式に示すように、チオール基およびアミノ基に反応性のある末端を両端に持つ分子である。上記構成により、ＤＳＰ分子は、微粒子２０の表面に固定したチオール基と、リガンド分子４１に含まれるアミノ基とに反応して、リガンド分子４１を微粒子２０の表面に固定することができる。

次にビオチンによる固定法について説明する。図６（ｂ）に示すように、微粒子２０の表面にビオチン分子４４を固定しておき、そこにストレプトアビジン分子４５を結合させる。ストレプトアビジン分子４５には結合サイトが４つあるので、反対側の結合サイトにリガンド分子４１を固定する。

このように表面にリガンド分子４１を固定した微粒子２０を細胞表面に近づけて刺激を与えると、微粒子２０の断面積か、それより小さい面積を有する範囲にのみ、リガンド分子４１による刺激を与えられる。たとえば、直径が１μｍの微粒子２０の表面にリガンド分子４１を固定して細胞表面に刺激を与えた場合、微粒子の接触により細胞表面が０．１μｍ凹んだのであれば、そのときの接触面積は２．８μｍ^２となる。

〔５．細胞手術ユニットへの応用〕
上述した構成の顕微鏡システム１は、図７に示すように、細胞手術ユニット（切断手段）５０を付加することが可能である。この細胞手術ユニット５０は、チタンサファイアレーザーなどのフェムト秒パルスレーザーを顕微鏡光学系内に入射し、そのレーザーを集光した状態で細胞に照射して、細胞膜や細胞内小器官を切断するものである。以下、細胞手術ユニット５０の構成について説明する。なお、図１に示した顕微鏡システム１と同一の機能を有する部材については、図７において同一の参照番号を付すことにより、その詳細な説明を省略する。

細胞手術ユニット５０は、レーザー光源５１と、ガルバノミラーユニット５２と、シャッター５３と、レンズ５４と、アクチュエーター５５とを備えている。

ガルバノミラーユニット５２は、レーザー光源５１から出射されたレーザー光のスポットを移動させるために用いられるものであり、２つのガルバノミラー（図示せず）を直角に組み合わせることにより構成される。さらに、ガルバノミラーユニット５２は、レーザー光源５１から出射されたレーザーをオン／オフするためのシャッター５３を備えている。

また、細胞切断用のレーザー光源５１から出射されたレーザー光は、ガルバノミラーユニット５２で反射された後、レンズ５４で集光される。このレンズ５４には、アクチュエーター５５が設けられている。このアクチュエーター５５を動作させることにより、レンズ５４を移動させて、試料セル１９内におけるレーザースポットの高さを変更することができる。

さらに、レンズ５４で集光されたレーザー光は、顕微鏡ユニット４内においてレンズ５６でコリメートされた後、２色性ミラー５７で反射されてからレンズ３１に入射する。このようにして、レーザー光源５１から出射されたレーザー光を、試料セル１９内の細胞へ集光することができる。なお、細胞にて反射されたレーザー光源５１のレーザー光は、フィルター５８で吸収された後に共焦点ユニット３に導かれる。

上記構成の細胞手術ユニット５０を用いて細胞膜を切断すると、次のような計測が実現できる。まず、光ピンセットによりトラップされた微粒子２０を測定対象物３５としての細胞に押し付けるか、または細胞に固定された微粒子２０を光ピンセットによりトラップすることで、細胞に横方向の力を付与する。

次に、細胞において力が付与されている場所の近傍の細胞膜を、細胞手術ユニット５０を用いて切断するとともに、そのときの微粒子２０の移動を計測し、細胞の形態変化を共焦点顕微鏡で観察する。これにより、細胞膜の物理的な強度や、細胞内部の骨格などの細胞構造を知ることができる。

なお、細胞手術ユニット５０のレーザーとしては、チタンサファイアレーザー（波長７６０〜９００ｎｍで可変、パルス幅８０ｆｓ、最大出力８００ｍＷ）を用いることが可能である。本発明者らは、波長８００ｎｍでレーザー光を入射したときに細胞膜を切断できることを確認した。また、本発明者らは、このときに細胞膜表面に固着した微粒子２０に対して、光ピンセットユニット２を用いて細胞膜の横方向に力を掛けておくと、細胞膜の切断時に微粒子２０が変位することを確認した。

〔６．光ピンセットの他の配置例〕
また、本実施形態の顕微鏡システム１においては、図８に示すように、光ピンセットユニット２（図１参照）に代えて、試料セル１９の下側、すなわち試料セル１９に対して共焦点顕微鏡が配置されている側と同じ側に、別の光ピンセットユニット（以下、単に下側光ピンセットユニット６０と記載する）を設けることが可能である。以下、下側光ピンセットユニット（保持手段）６０の構成について説明する。なお、図１および図７に示した顕微鏡システム１と同一の機能を有する部材については、図８において同一の参照番号を付すことにより、その詳細な説明を省略する。

下側光ピンセットユニット６０は、図８に示すように、レーザー光源６１と、ミラー６２と、ガルバノミラーユニット６３と、レンズ（移動手段、スポット位置変更手段）６４と、アクチュエーター（移動手段、スポット位置変更手段）６５と、ビームスプリッター６６と、レンズ６７と、４分割光検出器１５とを備えている。

レーザー光源６１から出射された光は、ビームスプリッター６６を通過した後、ガルバノミラーユニット６３にて反射されてレンズ６４により一旦集光される。このようにレンズ６４により集光されたレーザー光は、顕微鏡ユニット４内のレンズ６８でコリメートされ、２枚の２色性ミラー５７・６９で反射された後にレンズ３１に入射される。

このようにしてレンズ３１に入射されたレーザー光源６１のレーザー光は、微粒子２０により散乱される。そして、その散乱光が、レンズ３１により集められた後に、２色性ミラー５７・６９で反射されてから、２枚のレンズ６４・６８を通過する。さらに、２枚のレンズ６４・６８を通過した光は、ガルバノミラーユニット６３およびビームスプリッター６６で反射された後に、レンズ６７で集光される。このようにレンズ６７で集光された光を、４分割光検出器１５により検出する。

また、下側光ピンセットユニット６０は、レンズ６４とレンズ６８との距離を変更するためのアクチュエーター６５を備えている。このアクチュエーター６５は、レンズ６４に設けられるものであり、アクチュエーター６５を動作させるとレンズ６４が移動する。このようにしてレンズ６４とレンズ６８との距離を変更すると、レンズ３１で集光したレーザーのスポットの高さを光軸方向に移動させることができ、光ピンセットによりトラップされている微粒子２０の高さを変えることができる。

上記した微粒子２０の高さを変更するための機構を利用すると、測定対象物３５と微粒子２０との位置関係を変えずに、共焦点顕微鏡で測定対象物の３次元断層像を得ることができる。

つまり、共焦点顕微鏡を用いて、測定対象物の種々の高さにおける断層像を撮影する場合には、レンズ３１を光軸方向に移動させることになる。このレンズ３１の移動に同調させて後述するようにアクチュエーター６５を動作させれば、レンズ３１の移動に同調させて、レーザー光源６１から出射されるレーザーのスポット高さを移動させることができる。これにより、測定対象物３５と微粒子２０との位置関係を一定に保つことが可能となる。

レンズ３１の移動に同調して、レンズ６４とレンズ６８との距離を変える方法について説明する。先ず、レンズ６４とレンズ６８との距離をｄだけ変更した場合に、微粒子２０が光軸方向に移動する距離をｇとすると、ｇ＝Ａｄの関係が成り立つ。なお、Ａは、レンズ６８とレンズ３１とで構成される光学系の縦倍率である。

一方、レンズ３１が光軸方向に距離Ｐだけ移動した場合に、試料セル１９内で微粒子２０が光軸方向に移動する距離をｈとし、試料セル１９内の測定対象物の屈折率をｎ_１とし、レンズ３１と測定対象物との間のインデックス・マッチング液（マッチングオイルか水か空気）の屈折率をｎ_０とすると、ｈ＝Ｐ（ｎ_０／ｎ_１）として表される。

上記式におけるｇおよびｈは、微粒子２０をトラップするための光ピンセットのレーザーのスポット位置として共通するものである。よって、測定対象物３５と微粒子２０との位置関係を変えないためには、Ａｄ＝Ｐ（ｎ_０／ｎ_１）の関係が満たされるように、距離ｄを変化させればよい。

また、本実施形態でレンズ３１の移動に同調して、下側光ピンセットユニット６０のスポット高さを移動させるには、レンズ３１に入射する光の波面を湾曲させればよい。したがって、反射面を微小に湾曲させて反射光の波面を湾曲させるデフォーマブルミラーや、回折光の位相を局所的に変化させることができる位相シフトデバイスを用いても、測定対象物３５と微粒子２０との位置関係を変えずに、共焦点顕微鏡で測定対象物の３次元断層像を得ることができる。

また、図８で示す構成の顕微鏡システム１で用いる２色性ミラー５７・６９およびフィルター５８の特性について述べる。２色性ミラー６９は、下側光ピンセットユニット６０に設けられたレーザー光源６１の光を反射する一方で、細胞手術ユニット５０に設けられたレーザー光源５１の光を透過するものである。

また、２色性ミラー５７は、レーザー光源５１およびレーザー光源６１から出射されるレーザーを反射して、かつ共焦点顕微鏡のレーザー光源３４から発せられるレーザーと、試料から発せられる蛍光とを透過するものである。

具体的には、下側光ピンセットユニット６０のレーザー光源６１として、波長１０６４ｎｍのＮｄ：ＹＡＧレーザー光源、細胞手術ユニット５０のレーザー光源５１として波長７６０〜９００ｎｍのチタンサファイアレーザー光源、共焦点顕微鏡のレーザー光源３４として波長４８８ｎｍのアルゴンレーザー光源を用い、そのアルゴンレーザーにより励起される蛍光の波長域を５００〜６５０ｎｍとした場合、それぞれの２色性ミラー５７・６９の波長特性を以下のように設定するとよい。

先ず、２色性ミラー６９は、９５０ｎｍより長い波長を反射し、９５０ｎｍよりも短い波長を透過するミラーであればよい。また、２色性ミラー５７の２色性ミラーは、７００ｎｍより長い波長を反射し、７００ｎｍよりも短い波長を透過するミラーであればよい。そして、フィルター５８は、７００ｎｍより長い波長を吸収して、それより短い波長を透過するフィルターであればよい。

〔７．共焦点顕微鏡の他の構成例〕
また、上述の顕微鏡システム１においては、ガルバノミラー２３・２４を用いるユニットを共焦点ユニット３として用いる構成について説明したが（図１参照）、共焦点ユニット３の構成はこれに限定されるものではない。

たとえば、図９に示すように、共焦点ユニット３の代わりに、マルチピンホール共焦点ユニット（観察手段、共焦点顕微鏡）７０を用いることができる。このマルチピンホール共焦点ユニット７０は、たとえば横河電機株式会社から市販されているものを用いることができる。以下、マルチピンホール共焦点ユニット７０の構成について説明する。なお、上述の顕微鏡システム１と同一の機能を有する部材については、図９において同一の参照番号を付すことにより、その詳細な説明を省略する。

マルチピンホール共焦点ユニット７０は、図９に示すように、レンズ２１・２７と、マイクロレンズディスク７１と、ピンホールディスク７２と、これらのディスク７１・７２を回転させるためのモーター（回転手段）７３と、２色性ミラー７４と、モーター７３の回転速度を調整するための調整手段（図示せず）とを備えている。

また、マイクロレンズディスク７１は、ピンホールディスク７２の表面に形成されたピンホールのそれぞれに光を集光して照射するためのレンズ（第３レンズ、図示せず）を、複数備えているものである。また、ピンホールディスク７２は、その表面に多くのピンホール（図示せず）が形成されているものである。

上記構成により、マルチピンホール共焦点ユニット７０は、試料セル１９から戻ってきてピンホールディスク７２を通過したレーザー光を、２色性ミラー７４にて反射する。このように２色性ミラー７４で反射されたレーザー光は、レンズ２７で集光されてＣＣＤカメラ（観察手段）７５で検出される。

このマルチピンホール共焦点ユニット７０を使った場合、ガルバノミラーによるスキャニングなしにＣＣＤカメラ７５を用いて測定対象物の断層像を得ることができる。また、測定対象物における１０００点程度を同時に励起して発光を検出できるので、高速度での画像取り込みに向いている。

また、マルチピンホール共焦点ユニット７０を用いた場合、測定対象物の断層像を１秒あたり５００枚以上取り込め、レンズ３１を画像の取り込みに同期して移動させると、１秒あたり３０セット以上の速さで３次元画像を取り込むことができる。したがって、測定対象物の時系列で観察する場合に、より短い時間間隔で測定対象物の断層像を得ることができ、測定結果の時間分解能を飛躍的に向上させることができる。

〔８．光ピンセットの他の構成例〕
また、上記の説明では、微粒子２０をトラップするための構成として、光ピンセットユニット２（図１等参照）や下側光ピンセットユニット６０（図８参照）を採用する場合について説明したが、以下に図１０を用いて説明するダブルビーム下側光ピンセットユニット（保持手段）８０を採用することも可能である。

ダブルビーム下側光ピンセットユニット８０は、光ピンセット用のレーザーとして２本のレーザーを入射して、２つの粒子を同時に保持することができるものである。より具体的には、ダブルビーム下側光ピンセットユニット８０は、図１０に示すように、レーザー光源８１と、偏光ビームスプリッター８２ａ・８２ｂと、ガルバノミラーユニット８３ａ・８３ｂと、レンズ８４（移動手段、スポット位置変更手段）と、アクチュエーター（移動手段、スポット位置変更手段）８５と、半波長板８６ａ・８６ｂ・８９と、４分割光検出器（計測手段）９０ａ・９０ｂとを備えている。

上記構成において、光ピンセット用のレーザー光源８１からのレーザーは、偏光ビームスプリッタ−８２ａで２つに分けられる。その一方のレーザーは、ガルバノミラーユニット８３ａで反射され、他方のレーザーは、ガルバノミラーユニット８３ｂで反射される。このようにガルバノミラーユニット８３ａ・８３ｂのそれぞれで反射されたレーザーは、偏光ビームスプリッタ−８２ｂで再び重ね合わせられる。その後、重ね合わせられたレーザーは、レンズ８４およびレンズ６８を通過した後に試料セル１９に入射される。このように入射されたレーザーにより、微粒子２０を保持することができる。

また、ガルバノミラーユニット８３ａ・８３ｂで反射されたレーザーは、それぞれ独立な場所に集光されるので、それぞれのレーザーで保持される微粒子２０は、独立してｘｙ面内を移動させることができる。

また、それぞれの微粒子２０から戻ってくる散乱光は、図９の構成と同様に、ダブルビーム下側光ピンセットユニット８０へ戻ってくる。このように戻ってきた散乱光のうち、ビームスプリッター８８ａで反射されたものはレンズ８９ａで集光されて、４分割光検出器９０ａで検出される。

一方、ダブルビーム下側光ピンセットユニット８０へ戻ってきた散乱光のうち、ビームスプリッター８８ｂで反射されたものは、レンズ８９ｂで集光された後、４分割光検出器９０ｂで検出される。

また、偏光ビームスプリッター８２ａ・８２ｂを用いるのは、半波長板８７の回転角で２つのパスを通過するビームの強度比を制御でき、また反射光の偏光でそれぞれの粒子からの反射光を分離できるからである。

また、半波長板８６ａ・８６ｂは、偏光面を回転させるためのものであり、偏光ビームスプリッター８２ａで反射した光が、偏光ビームスプリッター８２ｂを透過するように偏光面を調整するためのものである。

なお、マリュースの定理によって、偏光面の回転角θと偏光ビームスプリッター８２ｂを通過した後のビーム強度Ｉ’については、次の関係が成り立つ。

Ｉ’＝Ｉ_Ｏ（ｃｏｓ２θ＋１）／２
ここで、Ｉ_Ｏは偏光ビームスプリッター８２ｂの手前での光強度である。また、回転角θは、透過率が最大になる角を０°に設定して図った値である。

また、直線偏光状態で粒子に光を入射した場合、粒子からの反射光は大部分が元の偏光状態を保ったものとなっている。この性質を利用すると、偏光方向によって狙った散乱光を選別して検出することができる。

また、レンズ８４とレンズ６４との距離は、上述したレンズ６４とレンズ６８との距離と同様に、レンズ３１の移動に同調して変更することが可能である、これにより、測定対象物３５と微粒子との位置関係を一定に保つことができる。

上記構成のダブルビーム下側光ピンセットユニット８０によれば、図１１に示すように、ＤＮＡ９１の両端にそれぞれ付着された微粒子２０ａと微粒子２０ｂとを、光ピンセットユニットからの２つのレーザーにより別個にトラップすることができる。これにより、ＤＮＡ９１を伸張させておくとともに、ＤＮＡ９１にタンパク質（測定対象物）９２・９３・９４を付着させ、ＤＮＡ９１の変化を計測することが可能である。なお、ＤＮＡ９１を伸張させると、微粒子２０ａおよび微粒子２０ｂのそれぞれには、図１１中矢印ＡおよびＢで示す方向に力が作用する。

タンパク質９２は、ＤＮＡ９１を湾曲させる働きのある分子で、このような分子が付着することでＤＮＡ９１は長さが変化する。その長さの変化を、それぞれの微粒子２０ａ・２０ｂからの散乱光の位置を検出することで計測することができる。

またタンパク質９３は、タンパク質９２の近傍に付着して固定される分子であり、タンパク質９４は、ＤＮＡ９１上に結合してＤＮＡ９１上をスライドする分子である。このようなタンパク質９２・９３・９４のそれぞれの位置は、共焦点顕微鏡からのレーザーを入射して、それぞれのタンパク質に付加した蛍光プローブからの蛍光発光を検出することで計測することができる。これにより、タンパク質９２の結合状態と微粒子２０ａ・２０ｂとの位置変化との関係や、タンパク質９４のスライド状態を時系列で観察することなどが可能になる。このようにして、図１０の顕微鏡システムによれば、ＤＮＡの伸張と、ＤＮＡタンパク質との相互作用を計測することができる。

以上のように、本実施形態の顕微鏡システム１は、微粒子２０を保持する光ピンセットユニット２と、微粒子２０を測定対象物の方へ移動させるレンズ１０およびアクチュエーター１６と、微粒子２０から測定対象物３５に作用する力を計測する４分割光検出器１５と、測定対象物３５を拡大して見ることが可能な共焦点ユニット３および顕微鏡ユニット４とを備えているものである。

上記構成によれば、光ピンセットユニット２により保持された微粒子２０を、レンズ１０およびアクチュエーター１６により移動させて測定対象物３５に押し当てることができる。また、微粒子２０に化学物質を固定しておけば、化学物質による刺激を測定対象物３５に与えることもできる。したがって、光ピンセットユニット２により測定対象物３５と接触されるべき位置に微粒子２０を保持しておき、さらにレンズ１０およびアクチュエーター１６を用いて所定のタイミングで微粒子２０を測定対象物３５に移動させれば、測定対象物３５の一部分だけに限定して、所望のタイミングで刺激を与えることができる。

さらに、レンズ１０およびアクチュエーター１６により微粒子２０が測定対象物３５に押し当てられることにより測定対象物３５に生じる力は、４分割光検出器１５を用いることにより計測することができる。これにより、測定対象物３５に与えられた力の大きさを評価することができる。

また、微粒子２０が測定対象物３５に押し当てられることにより発生する、測定対象物３５の形状変化、測定対象物３５の内部構造の変化、または測定対象物３５を構成する分子の空間的な分布は、共焦点ユニット３および顕微鏡ユニット４を用いて測定対象物３５を拡大して見ることにより把握することができる。したがって、微粒子２０から測定対象物３５に適切な刺激が与えられたのかを評価することができる。

さらに、光ピンセットユニット２により微粒子２０を保持することにより、光ピンセットユニット２に微粒子２０を接触させることなく微粒子２０を保持することができる。よって、レンズ１０およびアクチュエーター１６を用いて微粒子を移動させる際に、微粒子２０に物理的な外力が与えられることを防止し、微粒子２０の形状が変形してしまうというような微粒子２０の物理的な変化を防止できる。

さらに、光ピンセットユニットとして、複数のレーザー光により複数の微粒子を保持するダブルビーム下側光ピンセットユニット８０を用いてもよい。この構成によれば、ダブルビーム下側光ピンセットユニット８０により複数の微粒子を保持することができるので、測定対象物に複数の微粒子を押し当てることが可能となる。

たとえば、ＤＮＡに結合されたタンパク質９２・９３・９４を測定対象物とした場合に、そのＤＮＡの両端に微粒子２０ａ・２０ｂを固定するとともに、その微粒子２０ａ・２０ｂを光ピンセットにより固定すれば、そのタンパク質９２・９３・９４とＤＮＡとの関係を観察することができる。それゆえ、より多様な測定手法に顕微鏡システム１を対応させることができる。

さらに、光ピンセットユニット２は、共焦点ユニット３および顕微鏡ユニット４が上記測定対象物３５を拡大するために用いるレンズ３１とはレンズ１０を用いて、レーザー光を微粒子２０に入射してその微粒子を保持する。

上記構成によれば、光ピンセットユニット２の光学系と、共焦点ユニット３および顕微鏡ユニット４の光学系が独立して構成されるので、光ピンセットユニット２による微粒子２０の保持と、共焦点ユニット３および顕微鏡ユニット４による測定対象物３５の拡大とを、独立して調整することが可能となる。これにより、顕微鏡システム１の利便性を向上させることができる。

さらに、４分割光検出器１５は、光ピンセットユニット２から発せられるレーザー光が微粒子２０で反射した光の強度に基づき、微粒子２０の位置変位量を算出し、この位置変位量と、光ピンセットユニット２による微粒子２０に対する保持力が示すバネ定数とに基づき、微粒子２０から測定対象物３５に作用する力を計測するものである。

つまり、光ピンセットユニット２により微粒子２０を保持する際、その微粒子２０に対する保持力は、微粒子２０の位置変位量に比例する。したがって、この比例係数をバネ係数として予め算出しておけば、微粒子２０の位置変位量とバネ係数とから、上記保持力を算出することができる。

そこで上記構成では、光ピンセットユニット２のレーザー光を用いて微粒子２０の位置変位量を求める。つまり、光ピンセットユニット２の光学系を流用して微粒子２０の位置変位量を求めることができるので、位置変位量を算出するための構成を簡略化することができる。これにより、顕微鏡システム１全体の構成も簡略化することができる。

さらに、測定対象物３５を共焦点顕微鏡を用いて観察することにより、測定対象物３５を光学的に切断した断層像を得ることができる。よって、微粒子２０が押し当てられることにより測定対象物３５に生じる変化を、共焦点顕微鏡を用いて得られる測定対象物３５の断層像に基づき、より詳細に観察することが可能となる。

さらに、共焦点顕微鏡としては、複数のピンホールが表面に形成されたピンホールディスク７２と、その複数のピンホールのそれぞれに光を集光するレンズを複数有しているマイクロレンズディスク７１と、ピンホールディスク７２およびマイクロレンズディスク７１を回転させるモーター７３と、モーター７３によるこれら２つのディスク７１・７２の回転速度を調整可能な調整手段とを備えているマルチピンホール共焦点ユニット７０を用いることが好ましい。

上記構成によれば、モーター７３を用いてピンホールディスク７２およびマイクロレンズディスク７１を回転させることにより、レンズおよびピンホールを通過したレーザー光を用いて測定対象物３５をスキャンすることが可能となる。

そして、調整手段を用いてモーター７３によるディスクの回転速度を高速に設定すれば、測定対象物３５を高速でスキャンすることが可能となる。これにより、測定対象物３５の断層像を短い時間間隔で得ることができる。よって、微粒子２０が押し当てられることにより測定対象物３５に生じる変化をより詳細に観察することができる。

さらに、共焦点顕微鏡は、測定対象物３５の変化を時系列で見るもの、たとえばＣＣＤカメラ７５を用いるものであることが好ましい。

上記構成によれば、微粒子２０が押し当てられることにより測定対象物３５が経時的に変化するような場合、その測定対象物３５の変化をＣＣＤカメラ７５により時系列で見ることができる。たとえば測定対象物３５が細胞であり、微粒子２０がその細胞に対して刺激を与えるリガンドが固定されたものである場合、リガンドに対する細胞の応答を時系列で見ることができる。このように、上記構成によれば、微粒子２０が押し当てられることにより生じる測定対象物３５のさらに詳細な観察が可能となる。

また、測定対象物３５を載せておく試料セル１９に対して、下側光ピンセットユニット６０、４分割光検出器１５、およびレンズ６４およびアクチュエーター６５が同じ側に配置されていてもよい。

上記構成によれば、試料セル１９に対して、下側光ピンセットユニット６０、４分割光検出器１５、およびレンズ６４およびアクチュエーター６５が配された側と反対側のスペースを有効利用することができる。

さらに、共焦点ユニット３および顕微鏡ユニット４が測定対象物３５を拡大するために用いるレンズ３１の移動量に基づき、下側光ピンセットユニット６０のレーザー光のスポット位置を変更するレンズ６４およびアクチュエーター６５を備えていることが好ましい。

つまり、下側光ピンセットユニット６０と、共焦点ユニット３および顕微鏡ユニット４とが試料セル１９に対して同じ側に配置されている場合、下側光ピンセットユニット６０のレーザー光は、レンズ３１を介して微粒子に入射する。

したがって、レンズ３１が移動すると、下側光ピンセットユニット６０のレーザー光のスポット位置が変更され、そのスポット位置において保持されている微粒子２０も移動する。このように微粒子２０が移動すると、微粒子２０を測定対象物３５へ適切に押し当てることができず、測定対象物３５の応答を計測する上で好ましくない場合がある。

そこで上記構成では、レンズ３１の移動量に基づき、下側光ピンセットユニット６０のレーザー光のスポット位置を変更するレンズ６４およびアクチュエーター６５を備えている。すなわち、レンズ３１の移動量と、上記スポット位置とは、所定の関係を示す。この関係に基づきレンズ６４およびアクチュエーター６５を用いてそのスポット位置を変更すれば、微粒子２０を一定の位置において保持し、測定対象物３５と微粒子２０との位置関係を一定に維持することができる。これにより、微粒子２０を測定対象物３５に安定して押し当てることができ、測定対象物３５の応答を適切に計測することができる。

さらに、顕微鏡システム１は、測定対象物３５を切断することが可能な細胞手術ユニット５０を備えていることが好ましい。

上記構成によれば、細胞手術ユニット５０を用いて測定対象物３５を切断することにより、測定対象物３５の内部構造をより詳細に共焦点顕微鏡で観察することができる。したがって、微粒子２０が押し当てられることにより測定対象物３５の内部に生じる変化を、さらに仔細に観察することが可能となる。

このように、顕微鏡システム１によれば、微粒子のｘ，ｙ，およびｚ方向の位置変位、測定対象物への刺激の時系列的な変化、および測定対象物に作用する力として、５次元の物理量を測定することができる。この点からすれば、本実施形態の顕微鏡システム１は「５次元顕微鏡」と呼ぶことも可能である。

なお、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。たとえば、保持手段としては、光ピンセット以外に、マイクロマニピュレータを用いてもよいし、磁場を用いて微粒子を固定するデバイスを用いてもよい。また、観察手段としては、共焦点顕微鏡以外に、立体顕微鏡写真法を用いるデバイス、ＣＴ顕微鏡、またはデコンボーリューション法を用いて画像のボケを取り除き３次元観察するデバイス（非特許文献４参照）を用いてもよい。

上記構成の顕微鏡システムの利用分野の例について、以下に説明する。まず、上記構成の顕微鏡システムを用いて赤血球の硬さを計測することで、糖尿病などの疾病の状態を評価することができる。

赤血球の硬さを計測するには、赤血球をガラス基板上に固定するとともに、赤血球に力を印加するための微粒子をバッファー液中に分散しておく。そして、顕微鏡システム１の光ピンセットを用いて微粒子を捕まえ、それを赤血球表面に押し付ける。このときの微粒子の変位量を計測しながら、赤血球の変形を共焦点顕微鏡で３次元計測する。

これにより、微粒子の変位量から赤血球表面に印加した力を求めることができ、さらにそのときの赤血球の変形から、局所的な応力の分布を推定することができる。この推定結果から赤血球の力学的特性を定量評価できる。

同様に、顕微鏡システムを用いて刺激に対する細胞の応答を調べることで、病変による細胞の変化について調べることもできる。なお、細胞に与える刺激としては、化学物質による刺激、細胞を押すといった物理的な刺激、局所的な温度変化による刺激、などが挙げられる。

化学物質により細胞に刺激を与える場合、粒子の表面に化学物質を固定しておくか、粒子の内部に化学物質を含ませておき、この粒子を光ピンセットで捕まえて試料である細胞に対して接触させて刺激を与える。このときの刺激に対する応答は顕微鏡光学系を通して観察する。

物理的な刺激を与えることは、刺激を与えるための微粒子を光ピンセットで捕まえておき、その微粒子を細胞に対して押し当てたり、横方向の力を加えたりすることで実現可能である。また、局所的な温度変化による刺激を与えることは、特定の波長の光を照射することによって温度上昇を起こす物質を内部に含ませた微粒子を光ピンセットで捕まえておき、その微粒子を細胞に接触させるとともに、その特定波長の光を微粒子に照射することで実現可能である。

このようにして刺激に対する細胞の応答を調べた結果は、環境ホルモンに対する細胞応答の検査、創薬分野での薬剤に対する細胞応答の調査や、薬理物質のスクリーニング、医療診断目的で摘出した細胞の細胞診などに応用することが可能である。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムの構成を示す図である。 図１の顕微鏡システムにおける微粒子と細胞との位置関係を、光ピンセットユニットおよび顕微鏡ユニットからのレーザー光とともに示す図である。 （ａ）および（ｂ）は、細胞膜に微粒子を近づけた状態を示す図である。 図１の４分割光検出器に設けられるアナログ演算回路の構成を示す図である。 図１の共焦点顕微鏡を用いて得られた細胞の断層像である。 （ａ）および（ｂ）は、微粒子にリガンド分子を固定する状態を示す図である。 図１の顕微鏡システムに細胞手術ユニットを設けた構成を示す図である。 試料セルに対して共焦点顕微鏡および光ピンセットユニットを同じ側に配置した場合の顕微鏡システムの構成を示す図である。 図１の顕微鏡システムにおける共焦点ユニットの代わりに、マルチピンホール共焦点ユニットを用いた場合の構成を示す図である。 図１の顕微鏡システムにおける光ピンセットユニットの代わりに、ダブルビーム下側光ピンセットユニットを用いた場合の構成を示す図である。 図１０の顕微鏡システムにより２つの微粒子を保持し、ＤＮＡの伸張と、ＤＮＡタンパク質との相互作用を計測する状態を示す図である。

符号の説明

１ 顕微鏡システム（測定システム）
２ 光ピンセットユニット（保持手段）
３ 共焦点ユニット（観察手段、共焦点顕微鏡）
４ 顕微鏡ユニット（観察手段、共焦点顕微鏡）
１０ レンズ（第２レンズ、移動手段）
１５ ４分割光検出器（計測手段）
１６ アクチュエーター（移動手段）
１９ 試料セル（載置台）
２０・２０ａ・２０ｂ 微粒子
３１ レンズ（第１レンズ）
３５ 測定対象物
３７ アナログ演算回路（計測手段）
４２ 脂質二重膜（測定対象物）
４３ 受容体分子（測定対象物）
５０ 細胞手術ユニット（切断手段）
６０ 下側光ピンセットユニット（保持手段）
６４ レンズ（移動手段、スポット位置変更手段）
６５ アクチュエーター（移動手段、スポット位置変更手段）
７０ マルチピンホール共焦点ユニット（観察手段、共焦点顕微鏡）
７１ マイクロレンズディスク
７２ ピンホールディスク
７３ モーター（回転手段）
７５ ＣＣＤカメラ（観察手段）
８０ ダブルビーム下側光ピンセットユニット（保持手段）
８４ レンズ（移動手段、スポット位置変更手段）
８５ アクチュエーター（移動手段、スポット位置変更手段）
９０ａ・９０ｂ ４分割光検出器（計測手段）
９２・９３・９４ タンパク質（測定対象物）

Claims (11)

1. 微粒子を保持する保持手段と、
   上記微粒子を測定対象物の方へ移動させる移動手段と、
   上記微粒子から上記測定対象物に作用する刺激の量を計測する計測手段と、
   上記測定対象物を拡大して見ることが可能な観察手段とを備えていることを特徴とする測定システム。
2. 上記保持手段は、光ピンセットであることを特徴とする請求項１に記載の測定システム。
3. 上記光ピンセットは、複数のレーザー光により複数の微粒子を保持するものであることを特徴とする請求項２に記載の測定システム。
4. 上記光ピンセットは、上記観察手段が上記測定対象物を拡大するために用いる第１レンズとは別の第２レンズを用いて、レーザー光を微粒子に入射してその微粒子を保持するものであることを特徴とする請求項２または３に記載の測定システム。
5. 上記計測手段は、
   光ピンセットユニットから発せられるレーザー光が上記微粒子で反射した光の強度に基づき、上記微粒子の位置変位量を算出し、
   この位置変位量と、上記光ピンセットによる上記微粒子に対する保持力が示すバネ定数とに基づき、上記刺激の量としての力の大きさを計測するものであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の測定システム。
6. 上記観察手段は、共焦点顕微鏡であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の測定システム。
7. 上記共焦点顕微鏡は、
   複数のピンホールが表面に形成されたピンホールディスクと、
   その複数のピンホールのそれぞれに光を集光する第３レンズを複数有しているマイクロレンズディスクと、
   上記ピンホールディスクおよび上記マイクロレンズディスクを回転させる回転手段と、
   上記回転手段によるディスクの回転速度を調整可能な調整手段とを備えていることを特徴とする請求項６に記載の測定システム。
8. 上記観察手段は、上記測定対象物の変化を時系列で見るものであることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の測定システム。
9. 上記測定対象物を載せておく載置台に対して、上記保持手段、上記計測手段、および上記観察手段が同じ側に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の測定システム。
10. 上記保持手段は光ピンセットであり、
    上記観察手段が上記測定対象物を拡大するために用いる第１レンズの移動量に基づき、上記光ピンセットのレーザー光のスポット位置を変更するスポット位置変更手段を備えていることを特徴とする請求項９に記載の測定システム。
11. 上記測定対象物を切断することが可能な切断手段を備えていることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の測定システム。

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