JP2010517102A - ホログラフィックにトラップされた３次元構造のホログラフィック顕微鏡法 - Google Patents

Abstract

光トラップされた構造の３Ｄホログラフィック顕微鏡法を実行する方法及びシステムが提供される。本方法及びシステムは、倒立型顕微鏡と、対物レンズによって複数の光トラップに収束するトラッピング用レーザ光線を生成するレーザ源とを備える。本方法及びシステムはイメージング波長を有する平行レーザも使用して光トラップによって生成される構造に照明を当てる。光トラップされた構造によって散乱されたイメージング光はビデオカメラによって画像化されるホログラムを形成する。形成されたホログラムは光学形式によって解析され、解析及び評価のための３Ｄ画像を再生するためのライトフィールドを決定する。

Description

［関連出願の相互参照］
本願は２００７年１月２６日に出願された米国特許出願第６０／８９７，７８４号の米国特許法（35 U.S.C.）第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張するものである。同特許出願はこの参照によりその内容全体が本願明細書に含まれるものとする。

米国政府は、米国科学財団（National Science Foundation）からの助成金（助成金番号ＤＢＩ−０６２９５８４及びＤＭＲ−０６０６４１５）の規定に従って本発明に一定の権利を有する。

［発明の分野］
本発明は、コンピュータで設定されたホログラムによって生成される光トラップを利用して試料を立体的に配置し、顕微鏡光学系を適用して３次元で該試料を検査・分析するためのホログラフィック光トラッピングシステムに関する。特に、ホログラフィックビデオ顕微鏡システムは３Ｄ微細構造のリアルタイムの分解体積画像を使用して試料集合体の分析と検査を実行する。

ホログラフィック光トラッピングはコンピュータで生成されたホログラムを使用してミクロンサイズのオブジェクト（物体）を任意の３次元的配置に捕捉して配置する。従来技術には従来の２次元顕微鏡法を除いては光トラップされた構造の検査に利用できる補完方法は存在していない。３次元イメージングは、ホログラフィックに配置されたシステム（系）の構造をそれらを適切な位置に固定する前に確認するなど、様々な用途に有用であろう。それは生体試料など３次元構造を持つオブジェクトをインタラクティブに操作し、検査するのにも有用であろう。３次元イメージングをホログラフィックトラッピングと一体化させることはその両方の技術がそれぞれ同じ対物レンズを利用してレーザ光を集光し、投射できることから簡単なように思える。しかしながら、共焦点顕微鏡法（confocal microscopy）などの従来の３次元イメージング方法は焦点面を試料全体にわたって機械的に並進移動させることを含む。しかしながらホログラフィックトラップは焦点面に関して配置され、移動もするであろう。トラッピングパタンは顕微鏡の機械的な動きを相殺するように並進移動される必要があろう。このため、かなりの複雑度が加わり、イメージング速度が大きく低減し、試料が経験する検査と分析が阻害される可能性がある。

デジタルホログラフィック顕微鏡法は従来技術の技術的問題を全て解決するものであり、分析下の試料全体にわたって焦点面を並進移動させることが不要なことを含め、一切の機械的な動きを必要とすることなく、リアルタイムの３次元（３Ｄ）イメージングデータを提供する。特に、相性の良いタイプのインラインホログラフィック顕微鏡法は明視野顕微鏡における従来の照明器を平行レーザ（collimated laser）で置き換える。レーザ光線からオブジェクトによって散乱された光は入射照明光の残りと干渉して、対物レンズで拡大されるとともにビデオカメラで記録されるヘテロダイン（heterodyne）散乱パタンを形成する。この干渉パタンが多重光散乱によってぼやけないという条件で、それは散乱体の３次元構造（configuration）に関する包括的な情報を含む。結果のビデオストリームにおける各２次元スナップショットは、直接解析可能又は数値的に３次元表現に復号可能な時間分解（time-resolved）ボリュメトリック情報を符号化する。本システム及び方法はホログラフィック光学操作システムにおけるデジタルホログラフィック顕微鏡法の容易な商用利用を可能にするとともに、両方の技術の精度を直接評価し、任意の限度を設定する複合的な能力を利用する。

以下、本発明の実施形態を詳細に説明するとともに、本発明の上記及び他の改良点及び特徴について、添付図面を含めて以下詳しく説明する。

本発明の実施の一形態による統合システムを示す概要図である。 図２Ａは、ｘｙ平面内にトラップされた５個のコロイド球の従来の明視野像（スケールバーは５ミクロン）を示す図である。図２Ｂは、図２Ａのパタンをｙ軸の周りに４５°回転させた図である。図２Ｃは、ｘｙ平面で見られる図２Ｂの回転後パタンの明視野像を示す図である。図２Ｄは、ｘｙ平面で見られる同じ構造のコヒーレント画像を示す図である。図２Ｅは、傾斜パタンに沿ったｘｚスライスのホログラフィック再生画像（サークルは意図した微粒子座標を表す）を示す図である。 図３Ａは、焦点面からの高さｘ＝１７μｍのところでトラップされた単一球体のｘｙ平面内に記録されたホログラフを示す図である。図３Ｂは、図３Ａから再構成された散乱フィールドの実部を示す図である。図３Ｃは、ｘ＝０にある球体で記録されたホログラムを示す図である。図３Ｄは、対象となるコロイド球をΔ_z＝０．１２２μｍステップで焦点面を通過させることによって得られた散乱フィールドの軸方向断面を示す図である。図３Ｅは、従来の照明を用いた等価再生画像を示す図である。 軸方向再生の精度を実証する、図３Ｂと図３Ｄからの軸方向強度分布を示す図である。 図４Ａは、ｘｙ平面内における遮られたオブジェクトの分解能限界を示す図である。図４Ｂは、ｚｙ平面内における遮られたオブジェクトの分解能限界を示す図である。

図１に本発明の実施の一形態による統合システム１０の構成を概略的に示す。システム１０は１００×ＮＡ１．４油浸対物レンズ２０を備えた倒立型光学顕微鏡（例えばZeiss Axiovert S100-TV）に基づく。このレンズ２０はホログラフィック光トラップを投影するとともにトラップされたオブジェクトのインラインホログラフィック画像を収集するために用いられる。ホログラフィックトラップは好ましくは、５３２ｎｍの波長で入力レーザ光線３０を生成する働きをする周波数二倍化半導体励起固体レーザー２５（例えばCoherent Verdi）で駆動される。液晶空間光変調器３５（例えばHamamatsu PAL-SLM X7550）は所望のトラッピングパタンを符号化する位相限定ホログラム（phase-only holograms）をビーム波面にインプリントする。変調トラッピング光線４０は対物レンズ２０の入射瞳（input pupil）に中継され、光トラップに収束する。

トラッピング光線４０は好ましくは、トラッピング用レーザの波長に合わせたダイクロイックミラー（dichroic mirror）５０で対物レンズ２０に中継される。他の波長はダイクロイックミラー５０を通過し、ＣＣＤカメラ６０（例えばNEC TI-324AII）上に像を形成する。最も好ましい実施形態では、白熱照明器と集光レンズ６２の標準的な組み合わせは大気中で波長λ＝６３２ｎｍのコヒーレント光の５ｍＷ平行光線を提供するヘリウムネオンレーザで置き換えられる。システム１０は感知された画像データを操作し、当該分野で既知の従来のソフトウェアによってここに提供される全ての式の計算を実行することによって画像データを解析するためのコンピュータ６５を更に備える。コンピュータ６５は、本明細書に記述される解析機能を満たすために実行できるプログラム、データその他の命令を格納可能なＲＯＭ、ＲＡＭその他の周知メモリといった任意の従来型実行可能メモリも含むことができる。

図２Ａには、３次元パタンでホログラフィックにトラップされたコロイド球７０のホログラフィックイメージングを示す。これらの直径１．５３μｍのシリカ球７０（Bangs Labs Lot No. L011031 B）はクリーンガラス製の顕微鏡スライドの表面に＃１．５カバースリップの端を密封することによって形成されたスリット孔内に閉じ込められた層厚５０μｍの水の層の中に分散している。各々の球体７０は個別の点状光ピンセットにトラップされ、個々の光トラップは３次元で独立に配置される。図２Ａは焦点面内に配置された球体又は微粒子７０の従来の明視野像を示している。トラッピングポジションがわずかに変位した一連のホログラムを投影することにより、図２Ｂに示す様に、３次元で全体のパタンを回転させることが可能である。微粒子７０が焦点面から離れるにつれ、それらの像は図２Ｃから分かるように不鮮明になる。この画像からとにかく最も遠い微粒子７０が存在するかどうかを決定することは困難である。

図２Ｄは同一視野であるがレーザ照明によるものを示している。各々の微粒子７０はこの画像の中ではそれが散乱するレーザ光と入力レーザ光線３０の未回折部分とのコヒーレント重ね合わせとして現れる。この画像における他の特徴はシステム１０の光学ユニット（optical train）の表面による反射、屈折及び散乱の結果として生じる。これらは視野内に微粒子又はトラップされた構造の無い場合に得られる参照画像（reference image）を差し引くことによって最小化可能である。

少なくとも近似的に３次元複素数値ライトフィールド（light field）を再構成するのに十分な情報が図２Ａ乃至図２Ｅといった２次元実数値画像に符号化される。図２Ｅにおける画像はずらりと並んだ微粒子７０にわたる数値的に再構成された垂直断面を示す１つの例である。これはホログラフィック顕微鏡法をホログラフィック光トラッピングと組み合わせることの実現可能性を実証している。再構成画像はアレイ（微粒子の並び）の予想した４５°の傾斜と、微粒子７０間の較正間隔５．９μｍと一致する。意図した微粒子座標は画像に重ね合わされたサークル（円）として示されている。この定量的な比較はホログラフィックアセンブリを確認することに対するホログラフィック顕微鏡法の有用性を実証している。図２Ｄのようなホログラフィック画像はビデオカメラ６０のフルフレームレートで得られるので、ホログラフィック顕微鏡法はリアルタイムデータ取得において共焦点及びデコンボリューション顕微鏡法よりもメリットがある。

最も好ましい実施形態では、非常に正確な結果はレイリー・ゾンマーフェルト形式（Rayleigh-Sommerfield formalism）を利用することにより得られる。これは図２Ｄにあるようなホログラムは光の波長に匹敵するレンジで形成されるからである。顕微鏡の焦点面からの高さｚにおけるオブジェクトにって散乱されたフィールドｕ（ｒ，ｚ）は焦点面まで伝搬し、そこでそれはレーザ照明光の未回折部分から成る参照フィールドａ（ｒ）と干渉する。光軸８０に沿ったオブジェクトフィールド（object field）の伝搬関数（プロパゲータ）を記述するレイリー・ゾンマーフェルト伝搬関数は次式で与えられる。

上式においてＲ²＝ｒ²＋ｚ²、ｋ＝２πｎ／λは屈折率ｎの媒質における光の波数である。焦点面内におけるフィールドは畳み込み

である。従って観測される干渉パタンは次式で表される。

式（２）における最初の項は視野内にオブジェクトが存在しないときの強度を測定することによって近似できる。図２Ｄは斯かる参照画像を観測された干渉パタンから引き算することによって得られた。散乱フィールドが参照フィールドよりもずっと薄暗いと更に仮定する場合、式（２）における第２項は第３項を圧倒する。その場合、

がｕ（ｒ）を再構成する合理的な基礎を与える。

式（３）の解析は参照フィールドに対してａ（ｒ）＝１を仮定することによって単純化できる。しかしながら、我々の用途では、照明レーザトラッピング光線４０は焦点面に到達する前に不均質試料を通過する。結果として生じるどんな振幅変動もＩ（ｒ）を｜ａ（ｒ）｜で規格化することによって消すことができる。照明の位相の構造はこのような方法では補正することはできず、関心のあるどんな特徴よりもゆるやかに変動することが仮定されなければならない。

３次元強度フィールド（intensity field）の再構成は、フーリエ畳み込みの定理を用いて次式のように最も容易に実行される。

上式においてＵ（ｑ）はｕ（ｒ，０）のフーリエ変換である。また、

はレイリー・ゾンマーフェルト伝搬関数のフーリエ変換である。

焦点面からの高さｚ’におけるオブジェクトフィールドのフーリエ変換の推定値は次の様にレイリー・ゾンマーフェルト伝搬関数を適用して有効焦点面を並進移動することによって得られる。

式（８）における第１項は再構成されたフィールドで、ｚ’＝ｚのときにベストフォーカスになる。第２項はｚ’が増大するにつれ次第にぼやけるアーチファクトである。残念ながら、この項はｚ＝０の周りに鏡像を形成し、焦点面直下のオブジェクトが焦点面直上のオブジェクトと区別できないという結果をもたらす。このゴースト発生（ghosting）は図２Ｅにおいて明らかである。

焦点面からの高さｚにおける複素ライトフィールドの我々の最終的な推定値は次式で与えられる。

式（９）は単一のホログラフィックスナップショットＩ（ｒ）から検査下の試料における瞬間ライトフィールドのボリュメトリック表現を再構成することができる。図２Ｅにおける画像は再構成された強度分布｜ｖ（ｒ，ｚ）｜²による断面である。

図２Ｅ内の各球体はオブジェクトの３次元ポジションにおける比較的暗いディンプル（へこみ）に中心を置く明るい軸方向のすじとして現れている。図２Ｅに重ねられたサークルは球体７０の意図した３次元ポジションを示しており、それらは球体７０を配置したトラップ形成ホログラムを計算するために使用された。結果の再構成フィールドにおける特徴と光トラップのデザインとの間の非常に良い一致は投影法とイメージング法の双方の精度を実証している。

従来技術におけるこれまでの報告とは対照的に、図３Ａ乃至図３Ｆにあるような画像は我々のホログラフィック再生画像の軸方向（軸上）分解能が回折限界面内分解能に近づいていることを示唆している。図３Ａは焦点面からの高さｚ＝１７μｍのところで光ピンセットによって保持された球体７０の１つに対して得られるホログラムを示している。図３Ｂは再構成されたフィールドの実部Ｒ［ｖ（ｒ，ｚ）］＝｜ｖ（ｒ，ｚ）｜ｃｏｓ（φ（ｒ，ｚ））による軸方向断面である。この表現は従来の３次元明視野顕微鏡法において観察される散乱フィールドに最も近く似るというメリットを有する。球体はこの場合、明るい領域と暗い領域との間のカプスに中心を置く。散乱フィールドの符号のこの交差部分は強度における暗いディンプルを形成する。

有効軸方向分解能は球体を焦点面を通過させるように走査し、結果の画像を積み重ねてボリュメトリックデータセットを生成することによって評価することができる。図３Ｃはｚ＝０における図３Ａと同じ球体のホログラムである。一連の斯かる画像を軸方向ステップΔ_z＝０．１２２μｍでコンパイルすることで、図３Ｄの軸方向断面が得られる。

軸方向に沿った球体の像の構造は、球体７０をｚ座標のほか、ｘ座標とｙ座標でも追跡するために解析することができる。例えば、ここでの研究対象であるミクロンスケールの微粒子又は球体７０に関して言えば、散乱パタンの軸に沿ったダウンストリームの強度最大値（intensity maximum）とアップストリームの強度最小値（intensity minimum）の間のヌル平面内に重心が位置する。従ってコロイド微粒子のホログラフィック顕微鏡法は３次元トラジェクトリを従来の２次元イメージングで可能な精度よりもより正確に、かつ、走査型３次元イメージング技術よりもはるかに迅速に取り出すために使用することができる。特に、面内追跡は従来技術を利用することができ、徹底した追跡には追加の計算が必要であるが追加の較正は不要である。

画像の解析は、図４Ａと図４Ｂが示す様に、オブジェクトが光軸に沿って互いに遮っているときにははるかにずっとチャレンジングなものになる。ここでは、図２Ａ乃至図２Ｅと同じパタンの球体７０は９０°回転されており、その結果、４個の球体７０は光軸８０に沿って一列に並んでいる。図４Ａは結果のホログラムの詳細画像であり、図４Ｂは当該構造の垂直面内におけるホログラフィック再生画像である。図４Ｂから主に言えることは、（一列に並んだ）４個の球体７０は、互いに直接遮っていても、全て分解されるということである。他の球体によって直接遮られない第５の球体７０がリファレンスとして含まれた。図４Ａと図４Ｂにおいてそれはその他の球体の右側に見られる。

図４Ｂにおける最上部の球体７０はより焦点面近くでトラップされたものよりもかなり薄暗く見える。このため図４Ａと図４Ｂはライトフィールドの強度ではなく振幅｜ｖ（ｒ，ｚ）｜を示すことによってこれを補正している。しかしながら、参照球体７０はその遮られた隣接球体よりも明るくはなく、図２Ａ乃至図２Ｅにおける球体７０のどれよりも薄暗くはない。むしろ、下部の球体７０はレンズとして働き、上部の球体から散乱された光を集めてそれを光軸８０上に収束させる。結果として、これらの球体７０は通常よりも十分に明るく見え、それらの像はゆがめられる。式（９）はライトフィールドを再構成するときにこのような多重光散乱を考慮に入れていない。

斯かる結果を解釈する際の結果の不確定性は複数の焦点面からの画像を取得することによって、あるいは調査対象の試料を直にインラインではなく複数の角度から照明することによって軽減できる。結果はより正確な記録によっても改善されよう。ホログラフィック画像の各ピクセルはおおざっぱに６ビットの利用可能な情報を含み、カメラの応答を線形化する努力はなされなかった。カメラ６０は１／２０００秒シャッタ速度に設定されたが、それでもなお各露光中に微粒子の移動が可能である。より広いダイナミックレンジ、較正後強度応答、及びより高速なシャッタは全てより鮮鋭で、より正確なホログラムをもたらし、延いてはよりクリアな３次元再生画像をもたらすであろう。

これらの補足説明を踏まえて、図４Ｂにおける画像は３次元ホログラフィック操作にとってのホログラフィックイメージングの潜在的な重要性を明らかにしている。最も遠い微粒子７０は参照微粒子に関して、両者が同じ高さに投影された光ピンセットにローカライズされたとしても、光軸に沿って変位しているように見える。３次元可視化により、投影されたトラッピングフィールドの構造が確認される。明白な軸方向変位はおおざっぱに８０°未満の傾きに対しては明白ではなかった。従ってそれは３次元イメージングアーチファクトかあるいはより高い蓋然性で微粒子７０の設計された配置からの現実的な変位を反映する。より焦点面近くに投影されたトラップからの光は資料（サンプル）内のより深くにトラップされた微粒子に対して力を発揮するので、これは理に適っている。この効果はより焦点面近くにトラップされた微粒子−これらの微粒子は光をより遠くの微粒子へとそらし、それらの有効なポテンシャルエネルギーウェルを変更する−によって増幅される。この効果は細長いベッセル（Bessel）光線に沿ってトラップされた微粒子のインライン光学的束縛に活用されている。ホログラフィックイメージングは斯かる歪みを測定するための手段、延いてはそれらを補正するための基礎を提供する。これは斯かる微粒子その他のオブジェクトの正確な配置に依存するフォトニックヘテロ構造のホログラフィックアセンブリといったプロセスに非常に重要になる可能性がある。

本発明の実施形態についての上記記述は説明目的で提示されたものである。網羅的であること、又は逆に開示されたままの正確な形に本発明を限定することは意図されてはおらず、様々な変更及び修正が上記の教示に照らして可能であり、あるいは本発明の実践から獲得される可能性がある。提示された実施形態は、当業者が本発明を様々な形で、また意図した特定の用途に適するような様々な変更を含めて利用することができるように、本発明の原理と実際の用途を説明するために選択、記述された。

Claims (18)

1. 光学顕微鏡を提供するステップと、
   倒立型光学顕微鏡に入力される光学照明のための付随するイメージング波長を有する第１のレーザ光線を生成するステップと、
   複数の光トラップを生成するステップであって、改良点として、第２のレーザ光線を用いて前記複数の光トラップを生成し、所望の光トラッピングパタンを符号化する位相限定ホログラムを有する付随するトラッピング波長を持つトラッピング用レーザ光線の波面を用いることを含む、ステップと、
   前記倒立型光学顕微鏡の対物レンズを提供するステップであって、当該対物レンズが、前記複数の光トラップを投影するとともに前記トラップされた構造のインラインホログラフィック像を収集する、ステップと、
   前記トラップされた構造の像をＣＣＤカメラに提供するとともに前記レイリー・ゾンマーフェルト形式を前記トラップされた構造の３Ｄホログラフィック顕微鏡法に用いてそれらの画像を解析するステップと
   を含む、レイリー・ゾンマーフェルト形式を用いて光トラップされた構造を解析する３Ｄ（３次元）ホログラフィック顕微鏡法を実行する方法。
2. 前記対物レンズと前記ＣＣＤカメラとの間に、前記トラッピング用レーザ光線のトラッピング波長に合わせたダイクロイックミラーを間置するステップを更に含む請求項１に記載の方法。
3. 前記画像は前記トラップされた構造を焦点面から並進移動させることによって最小化可能なゴーストを含む請求項１に記載の方法。
4. 前記イメージング用レーザ光線は平行光線出力を有するヘリウムネオンレーザによって提供される請求項１に記載の方法。
5. 前記倒立型光学顕微鏡は焦点面を含み、当該方法は、トラップされた構造の３次元ホログラフィック顕微鏡法を実行する機械的な動きを一切含まない請求項１に記載の方法。
6. 前記ＣＣＤカメラにおいて形成された画像から参照画像を差し引くステップを更に含み、それにより、トラップされた構造が一切存在しないときの変動するバックグランド照明が除去される請求項１に記載の方法。
7. 前記トラップされた構造の画像は３次元複素数値ライトフィールドを再構成するための２次元実数値画像を含む請求項１に記載の方法。
8. 前記レイリー・ゾンマーフェルト形式は前記倒立型光学顕微鏡の光軸に沿ったトラップされた構造の伝搬を解析することを含む請求項１に記載の方法。
9. 前記トラップされた構造は前記光学顕微鏡の焦点面の上流距離ｚのところに散乱フィールドｕ（ｒ，ｚ）を生み出し、該散乱フィールドｕ（ｒ，ｚ）は、
   

   

   によって再構成される請求項８に記載の方法。
10. 前記画像の３Ｄライトフィールドｖ（ｒ、ｚ）を
    

    

    を解くことによって再構成するステップを更に含む請求項１に記載の方法。
11. 前記ライトフィールドｖ（ｒ、ｚ）は前記画像の単一ホログラフィックスナップショットから再構成される請求項１０に記載の方法。
12. 前記トラップされた構造の動きを追跡するステップを更に含む請求項１１に記載の方法。
13. 前記トラップされた構造は遮られた複数のオブジェクトを含み、その３次元画像が再構成され、前記複数のオブジェクトは再構成されたライトフィールドの中で全て分解される請求項１１に記載の方法。
14. 前記光学顕微鏡の複数の焦点面から画像データを取得するステップと、前記トラップされた構造を複数のアングルから照明するステップの少なくとも１つのステップを更に含み、それにより、前記トラップされた構造の画像の精度を高めるようにした請求項１に記載の方法。
15. 光学顕微鏡と、
    トラッピング用レーザ光線を生み出すためのレーザ源と、
    前記トラッピング用レーザ光線にインプリントするための位相限定ホログラムを提供するための空間光変調器と、
    イメージング用レーザ光線を生み出すためのレーザ源であって、改良点として、前記イメージング用レーザ光線と比較して異なるレーザ光線を用いて前記トラッピング用レーザ光線を形成することを含むとともに前記トラッピング用レーザ光線は所望の光トラッピングパタンを符号化する位相限定ホログラムを有する、レーザ源と、
    倒立型光学顕微鏡を構成する、前記光学顕微鏡に付随する対物レンズと、
    前記トラップされた構造のイメージングから生じるレーザ光を検出し、画像データを出力するＣＣＤカメラと、
    前記レイリー・ゾンマーフェルト形式を適用して前記画像データを解析するコンピュータソフトウェアを実行して前記画像データを解析するためのコンピュータと
    を備える、レイリー・ゾンマーフェルト形式を用いて光トラップされた構造を解析する３Ｄ（３次元）ホログラフィック顕微鏡法を実行するシステム。
16. 前記レーザ源はコヒーレント光の平行光線を生み出すレーザを含む請求項１５に記載のシステム。
17. 前記対物レンズと前記ＣＣＤカメラとの間に間置されたダイクロイックミラーを更に備える請求項１５に記載のシステム。
18. レイリー・ゾンマーフェルト計算は、
    

    

    を計算するためにコンピュータによって実行される埋込型コンピュータソフトウェアを含む請求項１５に記載のシステム。

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