KR20060030467A

KR20060030467A - 광학 분류 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20060030467A
Application number: KR1020057021897A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 지. 그리어
Original assignee: 더 유니버시티 오브 시카고
Priority date: 2003-05-16
Filing date: 2004-05-14
Publication date: 2006-04-10
Also published as: HK1092995A1; JP2007516095A; EP1625777A4; US7233423B2; CA2525843A1; US20050078343A1; WO2004104551A2; RU2005139384A; WO2004104551A3; AU2004241455A1; EP1625777A2

Abstract

광학 트랩들의 정적 어레이들은 크기에 대해 지수적인 민감도를 갖는 미시적 물체들을 분류하는데 이용될 수 있다. 그와 같은 광학 분류법은 외부적으로 인가되는 힘과 광학 경사 트랩들에 대한 운동하는 물체들의 서로 다른 친화력들 간의 경쟁에 의존한다. 역 분류 방법에서, 상기 트랩들에 의해 더 강하게 영향받는 물체들은 상기 어레이에 운동적으로 고정되는 경향이 있으며 입력 흐름으로 계통적으로 재편향된다. 열적 래칫 방법에서, 패턴들은 입자 확산을 허용하도록 이격됨으로써 상기 패턴들을 통해 순방향 또는 역방향 운동의 기회를 제공한다. 다른 분류 기술들과 달리, 광학 분류법은 연속적으로 작용할 수 있고 연속적으로 최적화될 수 있다. 지수적인 민감도는 일반적으로 상기 전위 웰들의 명확한 폭들의 입자 크기 의존성으로부터 발생한다.

Description

광학 분류 방법 및 장치{OPTICAL FRACTIONATION METHODS AND APPARATUS}

본 발명은 국립 과학 재단(National Science Foundtion)에 의해 수여된 허가 번호 No. DMR-0304960 및 DBI-0233971 하에 미국 정부의 지원으로 그리고 수여 번호 No. DMR-0213745 하에 국립 과학 재단의 MRSEC 프로그램을 통해 이루어진 것이다.

본 발명은 일반적으로 소형 입자들을 분류하기 위한 방법 및 시스템의 구현에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 거대 분자들, 생체 분자들, 나노클러스터(nanocluster)들, 콜로이드 입자들 및 생물 세포들 등의 소형 물체들을 분류하는 홀로그래픽 광학 트위저(tweezer) 기술의 이용에 관한 것이다.

광학 트위저들은 광 경사력(gradient force)을 이용하여 소형의, 대개는 마이크로미터-척도의 2차원 및 3차원 양측에서 다량의 물질을 트랩한다. 광학 트위저의 홀로그래픽 형태는 컴퓨터로 생성된 회절 광학 소자를 이용하여 단일 레이저빔으로부터 다수의 광학 트위저들을 생성할 수 있다. 이들 트위저들은 필요에 따라 임의의 원하는 구성으로 될 수 있다.

시스템들은 비교적 높은 정도의 신뢰성으로 정확하게 입자들을 이동시키는 것으로 알려져 있지만, 종래의 시스템들은 입자 운동의 각 개별의 단계에 대해 투 영될 별도의 홀로그램을 필요로 한다. 다수의 홀로그램들을 컴퓨팅하는데는 시간이 소모되고 실질적인 컴퓨터 노력을 요구할 수 있다. 또한, 그와 같은 컴퓨터로 생성된 광학 트위저들 또는 주사 광학 트위저들 등의 다른 동적 광학 트위저 시스템을 구현하는데 필요한 컴퓨터-어드레싱가능 투영 시스템들은 가격이 너무 비싼 경향이 있다.

기술적으로 그리고 상업적으로 중요한 많은 시스템들의 동작에 의해 변조된 전위 에너지 랜드스케이프(landscape)를 통한 고전적인 이송이 발생된다. 이들 동작을 이용하는 일 방법은 광학 분류법이다. 광학 분류법은 계속적으로(주어진 시간 세그먼트 내에서) 소형 물체들의 집단을 그들의 서로 다른 능력에 기초하여 분리된 부분들로 분류하여 광학 트랩들의 어레이들을 통해 이동시킬 수 있다. 특히, 유체 상태의 점성 항력(viscous drag) 등의 외력에 의해 구동되는 물체들은 그 대칭 축들이 구동력에 대해 소정 각도를 향하는 트랩들의 어레이와 부딪히게 된다. 전형적으로, 이들 트랩들은 홀로그래픽 광학 트위저 기술로 생성된다. 상기 트랩들에 의해 생성되는 전위 에너지 웰(well)에 의해 더 강하게 영향받는 이들 물체들은 트랩 간을 홉핑(hopping)하는 경향이 있고, 따라서 구동력의 방향으로부터 편향된다. 상기 구동력에 의해 더 강하게 영향받거나 또는 상기 광학 트랩들에 의해 덜 영향받는 다른 물체들은 편향되지 않은 어레이를 통과한다. 상기 트랩들의 구성에 따라, 본 발명은 서로 다른 부분들을 서로 다른 양만큼 편향시키도록 이용될 수 있다. 일부의 환경들에서, 상술한 이원적 실시예의 명확한 구분이 바람직하다. 그러나, 수집을 위해 다수의 단편들을 선택하는 것은 본 발명의 범위내에 있다. 예를 들어, 일 실시예에서 이종의 샘플은 "광학 크로마토그래피" 방법으로 연속하는 범위의 방향들로 펼쳐질 수 있다. 편향된 부분 및 편향되지 않은 부분들은 별도로 수집될 수 있다.

전형적으로, 이종의 입력 샘플 및 출력 부분들은 채널들을 통해 흐르는 유체에서 분산된다. 바람직한 일 실시예에서, 채널들은 소위 H-접합의 형태를 취하고, 하나는 입력 혼합 샘플을 포함하고 다른 하나는 배경 유체만을 포함하는 2개의 입력들이 2개의 출력 채널들로 분리되기 전에 설정된 거리만큼 나란히 함께 흐르게 된다. 상기 채널들이 충분히 작으면, 유동 유체에 대한 레이놀드(Reynold) 수는 충분히 작아서 2개의 흐름들이 혼합되지 않고, 유선형 방식으로 나란히 흐르게 된다. 결과적으로, 상기 입력 흐름에서의 물체들은 확산에 의한 것을 제외하고, 대개는 완충 채널로의 흐름들 사이의 분할선(separatrix)을 횡단하지 않는다.

본 발명의 일 양상은 개별적인 광학 트랩들의 어레이를 이용하여 광학 트랩들 및 경쟁하는 외부적으로 인가된 힘에 대한 상대적 친화력(affinity)에 기초하여 연속적으로 소형의 물체들을 분류하는 광학 분류법에 관한 것이다. 원하지 않는 부분은 원하는 부분보다 더 확산성이 있거나 운동성이 있다. 그러나, 본 발명의 또 다른 양상은 "역" 광학 분류법에 관한 것이다. 역 광학 분류법에서, 원하는 부분은 원하지 않는 부분보다 더 확산성이 있거나 운동성이 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 소형 물체들이 광학 트랩핑 패턴들의 투영된 시퀀스에 의해 결정론적으로 이송되는 광학 연동운동(peristalsis)으로 알려진 기술의 변경과 관련된다. 광학 연동운동과 개시된 광학 열 래칫(latchet) 기술 간의 차이점은 양방향 펌핑 쓰루(pumping through)의 제한없이 플럭스 역전(flux reversal)으로 알려진 효과를 포함하는 정성적으로 새로운 성능을 갖는 시스템 및 방법을 제공하고 또한 이종의 샘플들을 분류하기 위한 새로운 가능성들을 구현하는데 있다.

도 1은 미세 유체 H-접합이 분류될 이종 샘플을 포함하는 제 1 흐름 및 배경 또는 완충 유체로 구성되는 제 2 흐름을 포함하는 광학 분류법을 도시한다.

도 2는 미세 유체 H-접합이 2개의 유체를 포함하는 역 광학 분류법을 도시하며, 상기 2개의 유체 중 하나는 분류될 이종 샘플을 포함하고, 다른 하나는 완충 용액만을 포함한다.

도 3a는 광학 분류법에 대한 개략적 측면도를 도시하며; 도 3b는 도 3a의 광학 분류법의 상면도를 도시한다.

도 4는 소형 실리카 구(sphere)들로부터 대형 실리카 구의 광학 분리를 도시한다; 도 4a는 1/60초 간격으로 측정된 0.79 마이크로미터 반경의 구들의 대표적인 궤적들을 도시한다; 도 4b는 동시에 획득된 0.5 마이크로미터 반경의 구들의 궤적을 도시한다; 도 4c는 그들의 평균 면 밀도와 비교되는 0.79 마이크로미터 반경 구들의 시간-평균 면 밀도이다; 그리고, 도 4d는 그들의 평균 면 밀도와 비교되는 0.50 마이크로미터 반경 직경의 구들의 시간-평균 면 밀도이다.

도 5는 광학 트랩들의 단일 라인으로 획득된 분리의 공간적으로 분해된 특성을 도시한다.

도 6a는 광학 트랩들의 패턴이 물체를 국소화하는 종래의 광학 연동운동을 도시한다; 도 6b는 일정한 거리만큼 시프트된 광학 트랩 패턴의 교체를 도시한다; 도 6c는 또 다른 시프트된 트랩들의 패턴을 도시한다; 그리고 도 6d는 광학 연동운동의 1 주기의 완료를 도시한다.

도 7은 플럭스 역전을 나타내는 광학 열 래칫 구현에 대한 운동 방정식의 수치적 해답을 도시한다.

본 발명은 광학 분류를 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 일 양상은 광학 트랩들 및 경쟁하는 외부적으로 인가된 힘에 대한 상대적 친화력에 기초하여 소형 물체들을 계속적으로 분류하기 위해 개별 광학 트랩들의 어레이를 이용하는 광학 분류법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양상은 "역" 광학 분류법에 관한 것이다. 본 발명의 제 3 양상은 "래칫" 광학 분류 기술의 이용에 관한 것이다.

개별적인 콜로이드 구들이 이산 광학 트위저들로 생성된 전위 웰의 규칙적인 어레이를 통해 구동되는 한편, 그들의 운동은 디지털 비디오 현미경으로 분석되는, 변조된 이송을 연구하기 위한 모델 시스템이 개발되었다. 상기 시스템의 실험들은 상기 어레이가 구동력에 대해 회전함에 따라 구동된 입자들이 운동적으로 고정 상태인 악마의 계단(Devil's staircase) 계층을 추적하는 것을 나타낸다. 이들 상태들의 각각내에서, 상기 입자들의 궤적들은 어레이의 배향에 독립한 트랩들의 격자를 통해 대칭적으로 선택된 방향들을 따르며, 따라서 상기 구동력으로부터 횡방향으로 편향된다. 그와 같은 편향이 예측되어 연속적인 분류 기술에 대한 기초를 제 공하고, 상기 선택된 집단은 트랩들의 어레이에 의해 편향되는 한편, 상기 샘플의 나머지는 제약없이 통과한다. 상기 방법은 광학 분류법의 실질적인 데모(demonstration)를 나타내고, 또한 광학 분류의 분해능은 입자 크기에 지수적으로 의존할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 상기 방법은 임의의 이전에 보고된 분류 기술에 비길데 없는 민감도를 제공한다.

광학 트랩들 및 경쟁하는 외부적으로 인가된 힘에 대한 상대적인 친화력에 기초하여 연속적으로 소형의 물체들을 분류하기 위해 이산 광학 트랩들의 어레이를 이용함으로써 광학 분류의 개념의 일 형태가 나타날 수 있다. 이러한 방법은 흐름에 대해 소정 각도로 배열된 광학 트위저들의 과거의 선형 어레이를 흘려보내는 물에서 분산된 콜로이드 실리카 구들의 2개의 서로 다른 크기들의 궤적들을 이용한다. 유동성 콜로이드 분산은 커버 슬립(cover slip)의 에지들을 초소형 슬라이드에 본딩함으로써 형성되는 4 mm x 0.7 mm x 40 ㎛ 유리 채널로 한정되었다. 상기 채널을 통해 인가된 압력차는 수분에 걸쳐 약 60 ㎛/sec의 대략 일정한 Poisseuille 흐름을 생성한다. 샘플은 a = 0.79 ㎛ 반경의 구들과(Duke Scientific Duke Scientific Corporation, 2463 Faber Place Palo Alto, California 94303, Lot No. 24169) 및 a = 0.5 ㎛ 반경 구들(Duke Scientific Lot No. 19057)로 이루어지고, 이들 양쪽 구들은 종래의 명-시야(bright-field) 현미경 및 디지털 비디오 분석을 이용하여 1/60 초 간격의 평면의 30 nm 내로 추적될 수 있다. 또한, 이들 구들은 그들의 모양에 기초하여 신뢰성있게 구별될 수 있으며, 따라서 광학 분류에 대한 미시적 응답이 실시간으로 모니터링될 수 있는 이상적인 모델 시스템을 제공할 수 있다. 대형 및 소형 구들에 대한 전형적인 궤적들은 도 4a 및 도 4b 각각에 나타난다.

실리카 구들은 물보다 대략 2배로 조밀하고, 따라서 상기 채널의 더 낮은 유리벽 바로 위의 단층에 적응되며, 더 작은 구들은 더 가볍기 때문에 다소 더 높이 떠 있다. 상기 채널내의 Poisseulle 흐름 프로파일이 주어지면, 상기 더 작은 구들은 더 큰 구들의 u_b = 13 ± 2 ㎛/sec에 비해 u_s = 17 ± 9 ㎛/sec의 평균 속도로 다소 빠르게 이동한다. 정지한 구 상의 점성 항력, F₁ = γu는 구의 반경 a 및 경계 표면들에 대한 근접도에 의존하는 항력 계수 γ에 의해 특성화된다. 집단의 항력 계수들은 Einstein-Smoluchowsky 관계 D = k_bT/γ를 이용하여 그들의 확산 계수 D로부터 추정될 수 있으며, 여기서 K_BT는 온도 T에서의 열 에너지 척도이다. 상기 확산 계수들은 도 4a 및 도 4b에서와 같은 궤적들의 횡단 속도 변동으로부터 측정될 수 있다. 더 일반적으로, 인가된 힘 F₁은 전기이동, 전기삼투, 자기이동(magnetophoresis) 또는 중력 침강(gravitational sedimentation) 등의 프로세스에 의해 제공될 수 있다.

이와 같은 예시에 대한 광학 트랩들은 동적 홀로그래픽 광학 트위저 기술로 생성되었다. 532 nm의 레이저 광의 1.7 ± 0.8 mW로 각각 전원공급되는 12개의 이산 광학 트위저들은 b = 3.6 ± 0.1 ㎛의 중심 간 간격으로 채널의 축에 대해 θ = 12.0°± 0.5°의 라인으로 배열되었다. 각 트랩은 그 깊이가 V_o이고 폭이 ε_r이며, 둘다 구의 반경 a에 의존하는 대략의 가우시안(Gaussian) 전위 웰로서 모델링될 수 있다.

광학 트랩들이 없다면, 인가된 힘 F₁에 의해 점성 유체를 통해 구동된 입자는 평균 속도 u = F1/ζ로 이동한다. 인가된 힘 F₁이 충분히 크면, 광학 트랩들은 그 궤적으로부터 떨어져 있는 입자만을 편향시킨다. 상기 편향이 작으면, 상기 입자는 트랩들의 라인으로부터 다운스트림으로 계속해서 이동하며 트랩들의 라인으로부터 이탈되었다고 말할 수 있다. 반면에, 각 트랩은 상기 입자를 그의 인접한 영향 영역으로 편향시키도록 충분히 강할 수 있다. 이 경우에, 상기 입자는 트랩 사이를 통과하며 상기 어레이에 의해 효율적으로 포획된다. 이는 운동적으로 고정된 이송의 메카니즘이다. 편향각 θ는 상기 고정 이송에 대한 최대 편향각에 근접하도록 선택되었다. 이탈된 입자들의 궤적들에 대해 포획된 입자들의 궤적들의 상대적인 편향은 광학 분류법에 의한 분류를 위한 기반이다. 편향 및 비편향 부분들은 별도로 수집될 수 있고, 상기 프로세스는 도 1에 개략적으로 도시되어 있다.

트랩들의 기하구조가 제공되면, 레이저 전력이 대형 및 소형 구들의 이탈에 대해 경험적으로 결정된 임계치들 사이에 설정되었다. 도 4a 및 도 4b의 궤적들은 더 큰 구들이 이들 조건 하의 트랩들의 어레이에 의해 계통적으로 편향되는 반면, 더 작은 구들은 그렇지 않은 것을 나타낸다. 결과적으로, 소형 구들은 대형 구들의 분배의 결과로서 발생하는 음영에 방해되지 않게 흘러가고, 여기서 상기 소형 구들이 수집될 수 있다. 역으로, 편향된 대형 구들은 광학 트랩 어레이 단부의 작은 영 역에 농축되고, 여기서 상기 대형 구들은 별도로 수집될 수 있다. 소형 구들의 정화(purification) 및 대형 구들의 농축에 의해 더 큰 부분의 횡방향 편향이 발생하기 때문에, 상기 광학 분류 프로세스는 계속해서 진행될 수 있으며, 겔 전기이동 등의 배치-모드 기술을 능가하는 장점들을 제공한다.

이와 같은 약간의 궤적들만의 정성 해석은 도 4c 및 도 4d에서 수집된 수만의 궤적들의 통계를 고려하여 더 강제적으로 이루어질 수 있다. 여기서, 각 집단에 대해 표준 시간 평균 면 밀도 n_o에 의해 정규화된,

에 중심을 둔 면적

의 영역에 구들의 시간 평균 면 밀도

을 그린다. 상기 트랩들에 대한 구들의 상대적 친화력은 대형 구들이 벌크 흐름에서보다 트랩에서 대략 18배만큼 발견되기 쉬운 한편, 소형 구들은 3배만큼만 발견될 수 있다는 점에서 측정될 수 있다. 구들의 상대 속도들이 제공되면, 이들 비율은 더 큰 구들이 국소적 전위 최소치들에서 일시적으로 멈추는 한편 더 작은 구들이 단순하게 느려지는 것과 일치한다.

결과로서 발생하는 분리의 품질은 흐름에서의 위치 함수로서 상대적인 집단 농도를 측정함으로써 평가될 수 있다:

도 5a 및 도 5b에 도시된 도면의 장점은 대형 구들만을 포함하는 영역에서 단일의 최대값에 도달하고 소형 구들만을 포함하는 영역에서 1을 마이너스하는 것 이다. 도 5b의 작은 원들에 의해 도시된 바와 같이, 트랩들의 어레이 전에 도 5a의 라인 A를 따른 흐름을 횡단하는 섹션은 도 5b의 작은 원들에 의해 도시된 바와 같이, 완벽하게 혼합된 샘플인 Q(y) = 0을 나타낸다. 트랩들의 어레이 후에 라인 B를 따르는, 도 5b의 큰 원들로 그려지는 유사한 섹션은 대형 및 소형 구들 양쪽에 대해 대략 40%의 정화를 나타낸다. 배경의 많은 부분은 대형 구들이 이탈되게 하는 트랩들의 어레이에서의 충돌에 기인할 수 있다. 충돌이 유도된 이탈은 도 4c의 트랩 어레이의 대형 구들의 농도 프로파일 다운스트림에서 명백하며, 충돌들 및 이탈은 대형 구들이 트랩 어레이의 다운스트림 단부를 포화시킴에 따라 증가하게 되는 경향이 있다. 그와 같은 충돌들은 트랩들의 여러 평행 라인들을 투영함으로써 가장 효율적으로 회피된다. 3개 라인들이 본질적으로 현재의 실험 조건들 하에서 완벽한 분류를 거의 제공하지 못함에 따라, 더 조밀한 서스펜션(suspension)들이 필요하게 된다.

도 4a와 도 4b 및 도 5a와 도 5b의 데이터는 이산 광학 트랩들의 어레이들이 구들의 크기에 기초하여 계속적으로 상기 구들을 분리할 수 있음을 나타낸다. 일 타입의 입자가 트랩들의 어레이로부터 이탈하는 한편 다른 타입의 입자는 포획되게 하는 물리적 조건들을 고려하여, 광학 분류를 최적화하기 위한 기반을 제공한다.

간략화를 위해, x = 0에서의 중간 지점 근처의 입자상에, x = ±b/2에 중심을 둔 2개의 이산 광학 트랩들만의 영향이 분석되었다. 입자의 총 위치 에너지는,

다음의 지점을 통과함으로써 입자가 이탈한다.

총 힘의 y 성분은 0이 된다. 입자들은 x = 0의 근처에서 가장 쉽게 탈출해야 하고, 여기서 트랩핑 힘은 가장 취약하고, y = σ에서 상기 분리에 최대 힘이 든다. 이 경우에, 포획된 궤적들을 여전히 허용하는 최대 도달 편향은 다음과 같이 주어진다.

여기서, 상대 트랩 강도 f(a) = (2/√e)V₀/V₁는 그 크기를 포함하여 입자들의 물질 특성들에 의존하며, 트랩들의 구성에 의존하지 않는다. 여기서, V₁ = F₁σ는 구동력을 특성화한다. 유사하게, 광학 트랩의 명확한 범위 σ(a)는 집속된 광 빔의 폭 σ_o 뿐 아니라 입자의 크기에도 의존한다:

더 큰 입자들은 더 작은 입자들보다 더 큰 범위에서 광학 트랩에 의해 영향받는다. 이와 같은 a 상의 σ의 정성 의존도는 지수적으로 민감한 분리들에 대한 조건들을 확립한다. 계속해서 예시적인 실시예들에 대해 수식 (5)를 이용한다.

현재의 데이터에 대해, 광학 트랩들의 깊이들을 특성화하기 위해 열 변동 분 석을 이용하여, 대형 구들 및 소형 구들 각각에 대해 V₀/V₁ = 1.3 및 0.73이 얻어졌다. 동일한 분석이 상기 트랩들의 명확한 폭들에 대해 σ= 0.94 ± 0.07 ㎛ 및 0.74 ± 0.07 ㎛를 나타낸다. 이들 결과는 대형 구들에 대해 θ= 14°± 1° 및 소형 구들에 대해 θ= 3°± 2°의 임계 각들을 제시하며, 이는 대형 구들이 계통적으로 포획되는 한편, 소형 구들이 이탈한다는 관찰과 일치한다. N-트랩 어레이에서 여유도로 포획된 입자에 대한 총 횡방향 편향은 (N-1)b sinθ이다. 따라서,

상기 수식 (6)은 트랩 당 횡방향 편향을 확립하고, 따라서 어레이의 효율을 특성화한다. 트랩 간 간격 b = 2σ(a)를 선택함으로써, Δ= 4/e V₀/F₁에서 상기 효율을 최적화한다. 이 결과는 실제적인 광학 분류 시스템을 설계하는데 유용하지만, 입자 크기에 대한 민감도를 반드시 최적화하는 것은 아니다.

민감도는 다음과 같이 공식화될 수 있다.

그리고 다음의 식을 설정함으로써 최적화된다.

이는 다음의 식을 산출하고,

여기서,

수식 (9)는 각도 θ에서의 광학 트랩들의 어레이가 포획될 "대형" 입자들과 이탈될 "소형" 입자들 사이를 가장 민감하게 구별하는 트랩들(b) 사이의 간격을 확립한다.

실제적인 예로서, 이들 결과들은 점성 유체의 광학 분류를 최적화하는데 적용될 수 있다. 광의 파장에 대해 크기로 비교가능한 입자들에 대해, 또는 더 작은 전위 웰의 깊이는 입자들의 부피 V₀ = Aa³으로 척도화해야 하는 한편, 점성 항력은 그들의 반경 V₁ = Ba에 비례하여, f(a)는 a²에 비례한다. 최적화된 간격 b를 수식 (4)의 흐름-기반 분리에 대한 기준으로 대체함으로써, 다음의 수식을 산출한다.

수식 (4) 및 수식 (5)는 광학 분류법이 전위 웰의 깊이에 선형적으로만 의존하는 것을 나타낸다. 따라서, 광 와동들(vortice)의 실제적인 어레이들에 대한 전위 웰 깊이들의 변동은 분리의 분해능을 선형적으로만 저하시켜야 하고, 일반적으 로 입자 크기에 대한 실질적으로 더 강한 의존도에 의해 보상될 수 있다.

요컨대, 전술한 예들은 콜로이드 실리카 구들의 모델 시스템에 대한 실질적인 광학 분류법을 나타내며, 상기 기술은 크기-기반 분리들에 대한 지수적인 민감도를 보증하는 것을 나타내었다. 전술한 고려사항들은 광학 분류 시스템의 기하구조가 크기에 기초한 분리를 최적화하도록 선택될 수 있으며, 지수적인 민감도가 표준이 되어야 함을 나타낸다. 다른 특성들에 기초한 분리는 지수적인 민감도가 일반적인 경우에 예측되어서는 안되는 경우에도, 유사한 추론의 라인에 의해 최적화될 수 있다.

수식 (11)은 그 면적 a가 수십 나노미터로 측정되는 단백질들 및 나노클러스터들과 같은 물체에 광학 분류법을 적용하는 가능성에 통찰력을 더 제공한다. 특히, 수식 (11)은 고정각 θ에서의 1 마이크로미터-척도 물체들로부터 10 나노미터-척도 물체들로의 이동은 수배의 크기 정도의 비율 A/B의 보강을 필요로 함을 나타낸다. 이는 원래, 광의 강도를 증가시키고, 그의 파장을 감소시키며 입자들과의 상호작용이 공진하여 강화되는 파장을 선택함으로써 달성될 수 있다.

그와 같은 시스템에서의 광학 분류법의 구현은 입자들의 원하는 부분이 분할선을 통해 그리고 완충 흐름으로 편향되는 방식으로 입력 혼합 흐름에 걸쳐있는 트랩들의 어레이를 생성하는 것과 관련된다. 일 양상에서, 성공적인 동작에 의해 상기 샘플이 충분히 낮은 확산도 또는 운동성을 가져 원하지 않는 부분이 자발적으로 수용가능하게 낮은 비율로 상기 분할선을 교차하게 된다.

그러나, 본 발명의 또 다른 양상은 반대의 경우와 관련되며, 여기서 원하는 부분은 원하지 않는 부분보다 더 확산성이 있거나 운동성이 있다. 또한, 상기 본 발명의 양상은 원하는 부분이 다른 부분보다 덜 강하게 상호작용하며, 따라서 종래의 광학 분류법에 의해 선택되지 않는 경우와 관련된다. 본 발명으로부터의 최대의 장점은 어느 한쪽이 충분하더라도, 양쪽 조건들을 적용하는 시스템으로 구현된다는 것이다. 도 1은 2개의 유체 흐름들을 갖는 미세 유체 H-접합(100)을 도시한다. 하나의 흐름인 혼합 입력 흐름(110)은 분류되는 이종 샘플을 포함한다. 또 다른 흐름인 완충 흐름(120)은 배경 또는 완충 유체로 구성된다. 입력 흐름(110)의 물체들은 상기 흐름에 대해 각도 θ로 배열되는 광학 트위저(130)의 어레이와 부딪히고, 상기 어레이는 상기 샘플의 선택된 부분을 수집하기 위해 상기 완충 출력 흐름(140)으로 편향시킨다. 상기 샘플의 비편향 부분은 원래의 스트림 또는 출력 흐름(150)에 남아있고, 여기서 수집된다.

도 2에 도시된 바와 같이, 물체들을 혼합 입력 흐름(110) 바깥으로 인도하거나 완충 흐름(120)으로 인도하도록 광학 트랩 어레이들을 생성하기 보다는, 본 발명은 광학 트랩들을 이용하여 확산에 의하거나 또는 능동적으로 스위밍(swimming)에 의해 분할선을 횡단하려 할 때, 물체들을 입력 혼합 흐름으로 되돌릴 수 있다. 도 1에 도시된 종래의 방법에 따라, 미세 유체 H-접합(200)은 2개의 유동하는 유체 스트림들을 포함하고, 그 중 하나(210)는 분류되는 이종 샘플을 포함하고, 다른 하나(220)는 완충 용액만을 포함한다. 2개의 흐름들 사이의 분할선을 횡단하려 하는 혼합 입력 흐름(210)에서의 물체들만이 상기 물체들을 혼합 입력 흐름(210)로 되돌리도록 배열된 광학 트랩들(230)의 어레이와 부딪히게 된다. 트랩들(230)의 어레이 를 통해 분할선을 횡단하는 물체들은 완충 출력 흐름(240)에서 수집된다. 원래의 입력 흐름에 남아있는 물체들은 덜 확산되거나 또는 트랩들(230)의 어레이에 의해 편향되기 때문에, 출력 흐름(250)에서 별도로 수집된다. 이 경우에, 덜 확산하거나 덜 운동하는 물체들은 혼합 입력 흐름으로 재편향되는 반면, 더 운동성있는 부분은 트랩들을 이탈하여 수집되는 분할선을 횡단한다. 유사하게, 광학 트랩들에 의해 덜 강하게 영향받는 물체들이 수집되도록 분할선을 더 횡단할 수 있다.

광학 분류법은 전체 혼합 입력 흐름을 채우기 위해 충분히 많은 수의 광학 트랩들을 필요로 하는데 반해, 이것의 역 프로세스는 상기 흐름들 간의 분할선 주변의 영역만을 커버하는데 충분한 트랩들만을 필요로 한다. 결과적으로, 역 광학 분류는 종래의 광학 분류보다 훨씬 더 적은 광학 트랩들을 필요로 하며, 따라서 상기 트랩들을 생성하는데 필요한 레이저 광을 더 효율적으로 이용할 수 있다.

광학 분류법이 다른 분류 기술들을 능가하는 잘 증명된 장점들을 갖는 범위까지, 역 광학 분류는 동일한 장점들을 제공한다. 이들은 배치-모드 동작보다는 연속하는 동작을 포함하고, 레이저 전력, 레이저 파장, 광학 트위저 기하구조, 구동력 및 크기에 대한 지수적 민감도의 조정을 통한 계속적인 최적화를 포함한다. 역 광학 분류법은 이들 장점들을 종래의 광학 분류법이 적용불가하거나 비실용적인 시스템으로 확장시킨다. 종래의 광학 분류법에서와 같이, 역 광학 분류법은 크기, 광 산란 단면, 광 흡수성, 표면 전하 및 모양 등의 특성 뿐 아니라 그들의 복굴절, 광 활성도, 탄성에 기초하여 물체들을 분류하도록 트랩핑 빔들의 모드 구조 또는 트랩핑 광의 편광을 유리하게 이용할 수 있다.

미세 유체 H-접합은 그들의 확산도에 기초하여 물체들을 분류하는데 유용한 것으로 알려져 있다. 역 광학 분류를 위해 편성된 광학 트위저 어레이를 추가함으로써, 프로세스의 선택도가 보강되고, 물체들을 분류하는 새로운 물리적 기반의 광대한 어레이가 제공된다.

본 발명의 또 다른 양상에서, 열 래칫이 이용된다. 도 6a ~ 도 6d는 광학 연동운동이 작용하고 상기 광학 열 래칫의 특징을 설명하는데 유용한 원리를 도시한다. 도 6a에서, 이산 광학 트랩들의 패턴이 단일 물체를 국소화하는 것이 도시되어 있다. 상기 패턴은 각각의 폭이 σ이고, 거리 L만큼 떨어져 있는 2개의 이산 전위 에너지 웰들로서 개략적으로 나타난다. 실제로, 실제 패턴은 매니폴드(manifold)로 편성되는 다량의 광학 트랩들을 포함한다. 광학 연동운동 및 여기에 개시된 광학 열 래칫 방법의 목적은 물체들을 트랩들의 하나의 매니폴드로부터 또 다른 매니폴드로 전달하는 것이다. 2가지 방법들은 이것을 달성하는 방법에 있어서 서로 다르다.

광학 연동운동에서, 트랩들의 초기의 패턴은 매니폴드들이 σ와 비교가능한 거리만큼 시프트되는 또 다른 패턴으로 교체된다(도 6b를 참조). 새로운 전위 웰은 이전의 전위 웰과 중복되기 때문에, 입자들은 새로운 패턴 상의 최근접 매니폴드들에 결정론적으로 전달된다. 상기 프로세스는 트랩들의 또 다른 시프트된 패턴으로 도 6c에서 반복된다. 광학 연동운동의 일 주기는 원래의 패턴이 투영될 때 완료된다(도 6을 참조). 상기 주기의 실 효과(net effect)는 제 1 패턴의 트랩들의 하나의 매니폴드로부터 또한 상기 제 1 패턴의 다음의 매니폴드로 상기 트랩된 입자를 전달하는 것이다. 실질적으로, 다량의 입자들이 다량의 트랩들에 트랩핑될 수 있다; 그리고 이들 모두는 각 광학 연동운동 주기에서 매니폴드들의 일 세트에 의해 앞으로 전달된다. 운동 방향은 시퀀스의 순서에 의해 명확하게 결정되고 상기 순서를 역전시킴으로써 역전될 수 있다.

상기 광학 열 래칫은 운동 방향의 매니폴드들 사이의 분리 간격이 개별적인 트랩들의 폭보다 실질적으로 크다는 점에서 광학 연동운동과 다르다. 결과적으로, 제 1 패턴으로 트랩된 입자들은 제 2 패턴이 활성화(energize)될 때 자유롭게 확산하도록 남아있다. 제 2 패턴의 최근접 매니폴드에 도달하는데 충분하게 확산하는 입자들은 급속하게 국소화된다. 상기 국소화된 부분은 일단 제 3 패턴이 투영되면 순방향으로 전달될 수 있고(다시 확산에 의해), 상기 주기가 제 1 패턴으로 리턴할 때 다시 전달될 수 있다. 광학 연동운동과 달리, 결정성 이송은 모든 트랩된 물체들이 각 주기에서 순방향으로 이동하도록 보장하고, 상기 바이어스된 확산은 순방향의 샘플 부분만을 이송한다.

그러나, 열 래칫들의 상기 실시예는 새로운 기회를 유도한다. 너무 느려서 전방으로 진행하는 파장들을 포획할 수 없는 입자들은 도 6c의 제 3 패턴이 조명될 때 그들의 시작 지점에 역행하는 웰을 포획하도록 충분히 확산할 수 있다. 이들 입자들은 각 주기에서 매니폴드 간 분리의 1/3만큼 역방향으로 전달된다. 트랩핑 패턴들의 시퀀스를 통해 순방향 또는 역방향으로 집단이 이동하는지 여부는 입자들의 확산 속도 및 시퀀스가 순환하는 속도 사이의 균형에 의해 결정된다. 따라서, 순환 속도의 변경에 의해, 플럭스 역전으로 알려진 현상인, 평균 운동의 방향이 변경될 수 있다.

순환하는 광학 트위저 패턴들의 영향 하에 있는 입자들의 예측된 플럭스가 계산될 수 있다. 위치 x_j에서의 트위저는 가우시안 전위 웰로서 모델링될 수 있다.

상기 웰은 깊이 V_o 및 폭 σ를 갖는다. 상기 전위 웰은 명백하게 공간적으로 대칭적이다. 웰들의 패턴은 래칫 동작에 필요한 3-상태 주기 중 일 상태를 확립한다. 예시적인 예로서, 상기 웰들은 거리 L만큼 동등하게 이격되는 패턴으로 고려될 수 있으며, 상태 k에서의 전체 전위는,

여기서, k = 0, 1, 또는 2이다. 다시, 예시적인 예로서, 전위 에너지 랜드스케이프는 짝수의 간격들(T)로 이들 3가지 상태들을 통해 반복적으로 순환하는 것으로 고려될 수 있다. 상기 시간은 다음의 시간과 비교되는 것이다.

상기 시간은 시스템을 통해 확산하기 위해 확산도 D의 입자들에 대해 요구된다. T와 τ사이의 균형에 의해 전위 에너지 상태들의 시퀀스에 의해 상기 시스템을 통해 입자가 구동되는 방향이 결정된다.

광학 트랩들과 랜덤 열적 힘의 조합된 영향 하에 시간 t에서 위치 x의 dx를 갖는 브라운 입자를 발견하는 확률 p(x,t)dx는 마스터 방정식에 의해 지배된다.

여기서, 각 상태 k에 대한 전파 인자는 다음과 같이 제공된다.

시간 t<T에 대해:

여기서 β^-1은 열 에너지 척도이다. 하나의 완전한 3-상태 주기에 대한 마스터 방정식은,

고려하는 대칭성 광학 트위저 전위에 대해, 상기 마스터 방정식은 다음과 같은 정상 상태 해답을 갖고:

상기 정상 상태의 평균 속도는 다음과 같이 주어진다:

도 7은 βV_o = 10에 대한 시스템 방정식의 수치적 해답들 및 σ/L의 2개의 대표 값들을 도시한다. 주기 시간 T의 매우 작은 값들에 대해, 입자들은 급속하게 진화하는 전위 에너지 랜드스케이프를 유지할 수 없어, 랜덤하게 확산한다; 상기 평균 속도는 결과적으로 이러한 한계에서 소멸한다. 연속적인 패턴들의 트랩들이 중첩하면(도 7에 도시된 σ= 0.15 L), 입자들은 결정론적으로 트랩 간을 통과하고, 균일하게 양의 표류 속도를 산출한다. 상기 전송은 보통의 주기 시간(T) 동안 최대 효율에 도달하며, 더 긴 지속 시간 동안 향상하지 않는다. 결과적으로, 상기 표류 속도는 긴 시간 한계에서 1/T만큼 감소한다.

더 넓게 분리된 트랩들(도 7에서, σ= 0.10L)은 또 다른 동작을 발생시킨다. 여기서, 입자들은 충분히 큰 T의 값들에 대해 순방향-진행파를 유지할 수 있다. 그러나, 더 빠른 주기는 v의 음의 값들로 특징화되는 플럭스 역전을 유도한다. 상기 수치적 결과는 광학 트위저들의 어느 어레이들이 플럭스 역전을 갖는 완전히 대칭적인 열 래칫을 구현하는데 이용될 수 있는지의 원리를 나타낸다.

도 7에 도시된 바와 같이, βV_o = 10에서의 가우시안 웰 전위의 3-상태 주기 동안 σ= 0.10L에서의 플럭스 역전을 갖는 열 래칫 동작에 대해 σ= 0.15L에서의 결정성 광학 연동운동으로부터 크로스오버가 발생한다.

이점에서, 플럭스 역전은 주기 시간(T)의 변동을 발생시키는 것으로 설명되었다. 그의 서로 다른 확산 계수들이 서로 다른 τ값들을 산출하는 이종 샘플의 서로 다른 집단들에 대해 동일한 효과가 발생할 수 있다. 이들 서로 다른 집단들은 하나의 집단을 전방으로 구동시키고 다른 집단을 후방으로 구동시키도록 T가 선택 되면, 동시에 서로 반대 방향으로 이동하도록 유발될 수 있다. 이러한 방식에서, 설명한 광학 열 래칫은 소형의 유체성(fluid-borne) 물체들을 분리하고 정화시키는데 유용하다.

가역 열 래칫을 구현하는 바람직한 광학 방법은 다른 래칫-기반 분리 방법을 능가하는 장점들을 갖는다. 예를 들어, 서로 맞물린 전극 어레이들에 기초한 열 래칫들은 DNA 조각들을 분류하는데 적용되었다. 그러나, 이들은 정교한 마이크로제작을 필요로 하는 반면, 광학 래칫은 저가로 구현될 수 있고 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip) 응용에 대한 미세 유체 디바이스들에 용이하게 집적될 수 있다. 단일 시간-공유 주사 광학 트위저에 기초한 광학 래칫은 플럭스 역전을 유발하는 것으로 이전에 나타났다. 상기 방법은 시간-평균 의미에서 공간적으로 비대칭성 전위 에너지 랜드스케이프를 생성하는 것에 의존하며, 따라서 상기 시스템은 상술한 프로세스로부터 서로 다른 원리로 동작한다. 여기서 설명한 바람직한 시스템에서, 각 패턴의 각 광학 트랩은 공간적으로 대칭적인 전위 에너지 웰을 제공한다; 그리고 상기 패턴들 자체는 공간적으로 대칭적이다. 단방향 이송은 각 주기에서 적어도 3개의 패턴들의 시퀀스를 통해 시공적 대칭을 파괴함으로써 구동된다.

이전에 제안된 대칭성 열 래칫 예들 중 하나는 3가지 상태의 시퀀스와 관련된다. 상기 방법은 입자들이 하나의 상태로만 확산하도록 허용되지만, 다른 2가지 상태들은 결정성 래칫으로서 동작함으로써 상기 확산을 바이어스하는 것에 의존한다. 상기 문서에서 설명한 프로세스는 모든 3가지 상태들에서의 확산 및 국소화 양측과 관련되며, 따라서 더 많은 선택성을 제공하며 이종 샘플들을 더 고속으로 분 류한다.

바람직한 실시예들이 예시되고 설명되었지만, 이해되는 바와 같이 본 발명의 범위를 이탈하지 않고서 당업자에 의해 변경들 및 변형들이 이루어질 수 있다. 본 발명의 다양한 특징들은 다음의 청구범위에서 정의된다.

Claims

소형 물체들의 집단들을 분류하는 장치에 있어서,

제 1 채널 및 제 2 채널과;

상기 채널들을 통하게 상기 소형 물체들의 집단을 구동시키는 동력원과; 그리고

상기 제 1 채널과 상기 제 2 채널의 수렴부에 위치하며, 복수의 패턴들로 조직되는 복수의 광학 트랩들을 형성하는 레이저 광 빔들을 포함하는 복수의 매니폴드들로 구성되며;

여기서, 상기 패턴들은 일 패턴의 매니폴드들이 나머지 패턴들의 매니폴드들과 분리되도록 배치되고;

상기 광학 트랩들은 상기 광학 트랩들의 각 패턴이 다른 광학 트랩들의 패턴과 분리되도록 구동력에 대하여 소정 각도로 지향되며;

상기 소형 물체들의 집단은 적어도 하나의 원하는 부분 및 원하지 않는 부분으로 분류되는 것을 특징으로 하는 소형 물체들의 집단들을 분류하는 장치.
제 1 항에 있어서, 상기 소형 물체들의 집단은 제 1 채널에 배치된 유체 매체에서 분산되고, 상기 제 2 채널에 완충물이 배치되는 것을 특징으로 하는 소형 물체들의 집단들을 분류하는 장치.
제 1 항에 있어서, 상기 채널들은 H-접합을 포함하는 것을 특징으로 하는 소형 물체들의 집단들을 분류하는 장치.
제 1 항에 있어서, 상기 광학 트랩들은 홀로그래픽 광학 수단에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 소형 물체들의 집단들을 분류하는 장치.
제 1 항에 있어서, 상기 원하지 않는 부분은 상기 원하는 부분보다 더 확산하거나 운동하는 것을 특징으로 하는 소형 물체들의 집단들을 분류하는 장치.
제 1 항에 있어서, 상기 원하는 부분은 상기 원하지 않는 부분보다 더 확산성이거나 운동성인 것을 특징으로 하는 소형 물체들의 집단들을 분류하는 장치.
제 1 항에 있어서, 상기 구동력의 방향으로의 매니폴드들 간의 분리 간격은 실질적으로 개별 트랩 폭들보다 큰 것을 특징으로 하는 소형 물체들의 집단들을 분류하는 장치.
제 7 항에 있어서, 상기 광학 트랩들은 상기 패턴들이 순차적으로 활성화됨에 따라 상기 소형 입자들의 집단의 일부분만을 순방향으로 이동시키도록 된 것을 특징으로 하는 소형 물체들의 집단들을 분류하는 장치.
제 7 항에 있어서, 상기 패턴들은 일 패턴으로 트랩된 상기 소형 입자들의 집단을 또 다른 패턴이 활성화될 때 확산시키게 하도록 된 것을 특징으로 하는 소형 물체들의 집단들을 분류하는 장치.
소형 입자들의 집단들을 적어도 하나의 원하는 부분 및 원하지 않는 부분으로 연속적으로 분리하는 방법에 있어서,

상기 소형 입자들의 집단을 구동하도록 외력을 제공하는 단계와;

복수의 광학 트랩들을 형성하기 위해 레이저 광 빔들을 제공하는 단계와; 그리고

상기 원하는 부분이 유지되는 동안 원하지 않는 부분이 상기 트랩들을 이탈하게 하도록 상기 광학 트랩들을 편성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단들을 적어도 하나의 원하는 부분 및 원하지 않는 부분으로 연속적으로 분리하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 소형 물체들의 집단을 유체 흐름으로 분산시키는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 제 2 채널에 완충물이 주입되는 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단들을 적어도 하나의 원하는 부분 및 원하지 않는 부분으로 연속적으로 분리하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 채널들은 H-접합을 포함하는 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단들을 적어도 하나의 원하는 부분 및 원하지 않는 부분으로 연속적으로 분리하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 광학 트랩들을 홀로그래픽 광학 트위저 기술에 의해 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단들을 적어도 하나의 원하는 부분 및 원하지 않는 부분으로 연속적으로 분리하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 구동력 방향으로의 매니폴드들 간의 분리 간격은 상기 개별적인 트랩 폭들보다 실질적으로 큰 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단들을 적어도 하나의 원하는 부분 및 원하지 않는 부분으로 연속적으로 분리하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 소형 입자들의 집단의 적어도 일부분은 상기 패턴들이 순차적으로 활성화됨에 따라 상기 광학 트랩들을 통해 순방향으로 이동하는 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단들을 적어도 하나의 원하는 부분 및 원하지 않는 부분으로 연속적으로 분리하는 방법.
제 10 항에 있어서, 일 패턴으로 트랩된 상기 소형 입자들의 집단은 또 다른 패턴이 활성화될 때 자유로운 확산 상태로 되는 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단들을 적어도 하나의 원하는 부분 및 원하지 않는 부분으로 연속적으로 분리하 는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 입자들 중 일부는 상기 광학 트랩 어레이를 통해 순방향으로 이동하고 상기 입자들 중 일부는 상기 광학 트랩 어레이를 통해 역방향으로 이동하는 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단들을 적어도 하나의 원하는 부분 및 원하지 않는 부분으로 연속적으로 분리하는 방법.
소형 입자들의 집단을 연속적으로 분리하는 방법에 있어서,

상기 소형 입자들의 집단을 구동하기 위해 외력을 제공하는 단계와;

복수의 광학 트랩들을 형성하도록 레이저 광 빔들을 집속하는 단계와;

각각이 적어도 하나의 매니폴드를 포함하는 복수의 패턴을 제공하는 단계와, 여기서 각 매니폴드는 적어도 하나의 트랩을 포함하며; 그리고

각 패턴을 일정한 간격으로 열적으로 활성화시키는 단계를 포함하며, 여기서 이전에 열적으로 활성화된 패턴으로 트랩된 입자들은 또 다른 패턴이 열적으로 활성화될 때 자유롭게 확산하며;

여기서 상기 소형 물체들의 집단은 적어도 하나의 원하는 부분 및 원하지 않는 부분으로 분류되는 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단을 연속적으로 분리하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 광학 트랩들을 홀로그래픽 광학 트위저 기술에 의 해 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단을 연속적으로 분리하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 구동력 방향으로의 매니폴드들 간의 분리 간격은 상기 개별적인 트랩 폭들보다 실질적으로 큰 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단을 연속적으로 분리하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 패턴들이 순차적으로 활성화됨에 따라 상기 소형 입자들의 집단의 일부분만이 상기 광학 트랩들을 통해 순방향으로 이동하는 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단을 연속적으로 분리하는 방법.
제 18 항에 있어서, 일 패턴으로 트랩된 상기 소형 입자들의 집단은 또 다른 패턴이 활성화될 때 자유로운 확산 상태로 되는 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단을 연속적으로 분리하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 입자들 중 일부는 상기 광학 트랩 어레이를 통해 순방향으로 이동하고 상기 입자들 중 일부는 상기 패턴들을 통해 역방향으로 이동하는 것을 특징으로 하는 소형 입자들의 집단을 연속적으로 분리하는 방법.