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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Sortieren von Partikeln. Dabei bezeichnet der Begriff Partikel lebende Zellen, Zellteile oder Kügelchen (so genannte „Beads”) mit Durchmessern von einigen 100 Nanometern bis einigen Mikrometern.
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Das Sortieren kleiner Partikel hat in den letzten Jahren insbesondere in der Biotechnologie große Bedeutung erlangt. Es besteht ein zunehmender Bedarf, funktionalisierte Kügelchen, biologische Zellen oder Chromosomen anhand einer Vielzahl von Charakteristika aus einem Gemisch abzutrennen. Zellen beispielsweise müssen oft anhand ihrer Gestalt und Größe oder anhand der Verteilung eines Fluoreszenzfarbstoffes separiert werden. Diese Farbstoffe können an spezifische Moleküle angebunden werden, welche wiederum an Target-Proteine anbinden, oder sie können eine DNA-Sequenz innerhalb des Zellkerns kennzeichnen. Weitere mögliche Kopplungsmechanismen und Anwendungsgebiete für Fluoreszenzfarbstoffe sind dem Fachmann selbstverständlich geläufig.
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Eine interessante Eigenschaft lebender Zellen ist ihre Fähigkeit, fluoreszente Proteine (z. B. green fluorescent proteins, GFP) zu synthetisieren, die unter anderem die erfolgreiche Transfektion von DNA in eine Zelle signalisieren. Ein weiteres Beispiel ist die Anzeige des Replikationspotentials von hämatopoetischen Stammzellen.
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Weiterhin steht die Analyse kodierter Proteine nach der erfolgreichen Sequenzierung des Humangenoms im Rahmen des Humangenomprojektes im Vordergrund heutiger Forschung und Entwicklung. In diesem Zusammenhang werden Proteinmikroarrays und gemultiplexten Sandwichimmunoassays, die darauf basieren, dass Proteine an Kügelchen gebunden werden, die größten Chancen eingeräumt. Auch her dominiert die Fluoreszenzmarkierung über andere Techniken, wie beispielsweise eine Separierung mittels magnetischer Marker.
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Es ist bekannt, kleine Partikel mit Hilfe fluoreszenzaktivierter Zellsortierer, sogenannter fluorescent activated cell sorters, FACS, zu sortieren. Bei diesen bekannten FACS-Geräten werden die Partikel in winzige Tröpfchen eingebettet, mittels einer Elektrode aufgeladen und dann in einem elektrischen Feld abgelenkt, nachdem ihr Emissionsspektrum analysiert worden ist. Bei dieser Technik befinden sich die Partikel zunächst im Fluid-Strom, werden dann in Tröpfchen separiert und anschließend erst sortiert. Diese Tröpfchenseparation ist technisch vergleichsweise aufwändig.
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FACS ist gut untersucht, schnell und verlässlich, aber diese Technik weist einige gravierende Nachteile auf.
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Zum einen erfordern die Geräte relativ große Probenvolumina, zum anderen können sie nur durch speziell ausgebildetes Personal bedient und gewartet werden und zudem stellt die Sterilisation ein Problem dar. Die Effizienz der Sortierung nimmt für Probenmengen von weniger als 100.000 Zellen deutlich ab. Darüber hinaus sind die Anschaffungs- und Betriebskosten der FACS-Geräte für kleinere Laboratorien in der Regel zu hoch. Schließlich ist ein portables Einmalsystem auf der Basis der FACS-Technik gegenwärtig nicht absehbar.
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Optische Kräfte stellen für die Verwendung beim Sortieren kleiner Partikel in der Biotechnologie eine vielversprechende Alternative dar. Mit optischen Fallen oder optischen Pinzetten, wie sie häufig genannt werden, können Partikel in allen drei Raumrichtungen mit hoher Präzision bewegt werden. Da bei dieser Technik kein mechanischer Kontakt zwischen Manipulationseinrichtung und Partikel stattfindet, werden Anhaftungsprobleme, die normalerweise bei diesen Größenverhältnissen von großer Bedeutung sind, vollständig vermieden. Wenn Objektivlinsen mit hoher numerischer Apertur verwendet werden, können hohe Gradienten des elektrischen Feldes und somit hohe optische Kräfte auf lebendes Gewebe ausgeübt werden, wobei die Gesamtintensität auf einem vertretbaren Wert gehalten werden kann, sodass Zellschädigungen vermieden werden können.
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Diese schonende Behandlung kann dadurch unterstützt werden, dass für die Falle Licht mit einer Wellenlänge im Infrarotbereich verwendet wird, das nicht durch die wässrige Lösung im Inneren der Zelle absorbiert wird. Optische Fallen erlauben eine sehr schnelle Verschiebung von Partikeln und ermöglichen eine Parallelisierung über multiple Fallen oder optische Gitter. Darüber hinaus können die Kräfte auf die eingefangenen Teilchen in einfacher Weise durch die Laserleistung und den Wellenlängenbereich von Nanonewton bis einigen Femtonewton eingestellt werden. Gleichzeitig kann die Position mit einer Nanometerpräzision gesteuert und gemessen werden.
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Es existieren verschiedene Ansätze, optische Manipulation mit mikrofluidischen Systemen zu kombinieren, um eine Partikelsortierung zu erreichen. Miniaturisierte Durchflusskammern können beispielsweise mit Hilfe der sogenannten Softlithographie innerhalb einiger Stunden als Einzelteile hergestellt werden. Auf diese Weise können verschiedene Geometrien während der Entwicklungsphase flexibel getestet werden. Da die Kosten für Material und Herstellungswerkzeuge relativ niedrig sind, können derartige Kammern sowohl als billige und tragbare Wegwerfartikel, wie auch als wiederverwertbare Kammern hergestellt werden. Die geringen Kanaldimensionen verlangen nur geringe Volumina an Transportmedium und weniger an teuren biochemischen Reagenzien.
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Die Konzepte bei bekannten mikrofluidischen Systemen mit optischer Manipulation können in passive und aktive Sortierstrategien unterteilt werden. Im Fall des passiven Sortierens werden optische Gitter oder optische Linienpinzetten mit asymmetrischem Intensitätsprofil verwendet. Sie erlauben ein effizientes paralleles Sortieren von Kügelchen, sind aber auf eine Unterscheidung anhand der Größe oder des Brechungsindex beschränkt.
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Beinahe alle vielversprechenden aktiven Sortiervorrichtungen arbeiten in mikrofluidischer Umgebung, aber unterscheiden sich entsprechend ihrer Partikelklassifizierungs- und Manipulierungsstrategien. Beispielsweise ist bekannt, Partikel in eine Vielzahl von Mikrokanälen zu sortieren, indem eine statische Linienfalle zeitweise aktiviert wird. Außerdem nutzt keine Methode dreidimensionale optische Fangkräfte aus, was eine optische Pinzette definiert.
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Weiterhin existieren Sortiervorrichtungen, bei denen die Teilchen hydrodynamisch innerhalb eines Sortierkanals fokussiert werden, um durch Aktivieren einer statischen Falle, die durch einen Laser erzeugt wird, sortiert zu werden. Ein Beispiel für eine solche bei Bedarf einschaltbare optische Falle ist in Lin et al. „Microfluidic cell sorter/counter utilizing multiple particle tracing technique and optically switching approach” Biomed Microdevices (2008) 10: 55–63, beschrieben.
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Die Fluoreszenz der Partikel kann, ähnlich wie bei einer FACS-Vorrichtung, dadurch analysiert werden, dass die Emissionswellenlänge mit einer Photomultiplierröhre detektiert wird. Sie kann aber auch mit einer CCD- oder CMOS-Kamera, als 2D Bild gemessen und analysiert werden.
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Die
US 7,428,971 B2 bezieht sich auf eine Sortiervorrichtung, die den optischen Druck zum Auslenken der Partikel in vorbestimmte Kammern verwendet. Dabei befinden sich die zu sortierenden Teilchen in einem Gas- oder Flüssigkeitsstrom und werden von einem Laserstrahl, der in Richtung auf die Sammelkammer gerichtet ist, aus dem Trägerstrom herausgedrückt. Ausdrücklich ist in dieser Druckschrift erwähnt, dass der Laserstrahl an einem anderen Ort konvergiert als an der Öffnung der Kammer, insbesondere in der Nähe des Kammerbodens.
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Die
WO 2008/088395 A2 offenbart eine Vorrichtung zum Sortieren und Strukturieren von Partikeln, basierend auf einem optofluidischen Verfahren. Die Partikel werden in einzelne Kammern der Vorrichtung gegeben, dann erfolgt eine Detektion und/oder Analyse der Teilchen, um zu definieren, welche Zellen entfernt oder weiterbefördert werden sollen. Durch Einwirkung einer optischen Kraft und eines Fluidstroms werden die Teilchen entsprechend entfernt oder weiterbefördert. Dabei wird die optische Gradientenkraft nur zur Unterstützung des Strahlungsdrucks verwendet. Explizit wird erwähnt, dass die Kraft, welche die strömende Flüssigkeit auf die Teilchen ausübt, größer ist als die optische Gradientenkraft und daher nur eine Positionierung der Zellen in den Strom hinein, d. h. eine Koordinatenveränderung in einer Raumrichtung erfolgt.
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Die
JP 2008-199919 A bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Trennen und Sammeln von Zellen. Dabei wird ein Fluid mit Hilfe von Pumpen entlang einer Fließstrecke transportiert und Zellen mit Hilfe einer „optischen Pinzette” in verschiedene Sammelkammern sortiert. Allerdings geht diese Druckschrift nirgendwo auf die wirkenden Kräfte ein und aus den Größenverhältnissen der
und
lässt sich schließen, dass ausschließlich die radiale Gradientenkraft verwendet wird.
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Die
WO 02/44689 A2 bezieht sich auf eine Vorrichtung zum optischen Schalten und Sortieren von biologischen Proben, die in einer Mikrodurchflusszelle transportiert werden. Insbesondere offenbart diese Druckschrift die Verwendung von Strahlungsdruck zum Schalten kleiner Partikel, die in mikrofluidischen Kanälen fließen. Allerdings offenbart diese Druckschrift nicht, dass der Laserstrahl auslenkbar sein könnte. Stets ist in dieser Druckschrift nur von einem Ein- und Ausschalten des Laserstrahls die Rede.
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Die
DE 6 93 21 748 T2 offenbart ein Verfahren zum Handhaben und Messen von Teilchen unter Verwendung mehrerer Laserstrahlenbündel. Allerdings werden die Teilchen im Fluidfluss durch einen hochfokussierten Laser lediglich angehalten oder gebremst, aber nicht ausgelenkt. Durch Variation der Anhaltezeiten lassen sich verschieden große oder optische dichte Teilchen separieren. Durch die Interaktion einer Vielzahl von Laserstrahlen kann die Separier-Effektivität erhöht werden. Eine Bewegung des Teilchen senkrecht zur Flussrichtung durch die Einwirkung des Strahlungsdrucks ist zusätzlich möglich.
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Die
DE 1 01 57 032 A1 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Sortieren von Partikeln, bei dem Partikel in einem Strömungskanal bewegt werden und mittels eines einschaltbaren Lasers in eine Auffangeinrichtung gedrückt werden. Dabei ist aus
2 und
3 deutlich, dass das Teilchen mit Hilfe des Strahlungsdrucks ausgelenkt wird. Der Laser selbst ist dabei nicht dreidimensional beweglich. Darüber hinaus handelt es sich hierbei nicht um einen hochfokussierten Laser, sondern es wird eine Fokuslinie angestrebt.
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Die
US 4,887,721 A offenbart einen Laserpartikelsortierer, bei dem ein erster Laser einen optischen Pfad mit einem Intensitätsgradienten definiert, um die Teilchen voranzutreiben, aber nicht zu fixieren. Ein zweiter Laserstrahl, der den Antriebslaserstrahl schneidet, kann zwischen zwei Intensitäten hin- und hergeschaltet werden und treibt die Teilchen entweder weiter voran, oder an einen Ort außerhalb des durch den ersten Laser verursachten Hauptstroms. Weiterhin ist explizit erwähnt, dass der Strahl schwach fokussiert ist. Schließlich enthält die Anordnung gemäß dieser Druckschrift keine Vorrichtungen zum Bewegen der Laserstrahlen, sondern lediglich Anordnungen zum Schalten der Intensität.
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Die
US 2008/0213821 A1 bezieht sich auf ein mikrofluidisches Zellsortiersystem, bei dem elektromagnetische Felder verwendet werden, um den Strom der Zellen zu steuern. Eine Ausnutzung der Kräfte eines Laserstrahls ist in dieser Entgegenhaltung nirgendwo gezeigt.
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Die
WO 2006/063 335 A2 offenbart eine Vorrichtung zur automatisierten Extraktion und Aufreinigung von Proben basierend auf optischen Pinzetten. Das Sortiersystem gemäß dieser Druckschrift basiert auf dem Prinzip des sogenannten holographic optical trapping (HOT), bei dem das Laserlicht entsprechend einem vorgegebenen räumlichen Pixelmuster moduliert wird. Das System gemäß dieser Druckschrift verwendet einen räumlichen Lichtmodulator (spatial light modulator, SLM), um den einzelnen Laserstrahl holographisch in eine Vielzahl von optischen Fallen aufzuspalten. Hierzu wird das gewünschte holographische Muster in den räumlichen Lichtmodulator eingeschrieben. Nachdem der Laserstrahl diese Modulation durchlaufen hat, wird er in das gewünschte Fallenmuster aufgetrennt. Dadurch wird eine Auslenkung der zu sortierenden Teilchen derart ermöglicht, dass bestimmte Teilchen über Barrieren hinweg in Reservoirs gehoben werden, aus denen sie später gesammelt werden können.
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Die
US 6 055 106 A bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Manipulieren kleiner Partikel basierend auf optischen Gradientenkräften. Diese Anordnung ist dazu ausgelegt, eine Vielzahl von optischen Fallen zu erzeugen. Insbesondere werden Hologramme dazu verwendet, um das optische Gradientenfeld zu erzeugen. Die
US 6 624 940 B1 stellt eine Continuation der Anmeldung
US 6 055 106 A dar und befasst sich ebenfalls mit einem holographischen optischen Fallenarray.
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Die
US 2005/0 121 604 A1 bezieht sich auf eine Sortiervorrichtung mit einer Vielzahl von laminaren Probenströmen, um verschiedene Komponenten in einer Probenlösung voneinander zu trennen. Holographische optische Fallen oder optische Pinzetten werden verwendet, um ausgewählte Komponenten aus einem laminaren Strom in einen anderen zu bewegen. Die Vorrichtung gemäß dieser Druckschrift arbeitet mit mehreren geschichteten Probenströmen und die Teilchen können auch durch Sedimentation von einem Strom in den nächsten gelangen.
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Eine weitere Sortiervorrichtung unter Verwendung einer holographischen optischen Falle ist aus der
US 7 241 988 B2 bekannt. Gemäß dieser Entgegenhaltung werden zum Auslenken der Teilchen holographisch erzeugte optische Fallenarrays verwendet. Das zu dislozierende Teilchen wird also in die einzelnen Brennpunkte hineingezogen und dadurch bewegt.
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Die
US 5 212 382 A bezieht sich auf eine Laserfalle, die darauf basiert, dass ein fokussierter Laserstrahl mit hoher Geschwindigkeit rotiert. Durch diese Rotation lassen sich Teilchen im Zentrum des Rotationsradius des Brennpunktes einfangen.
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Die
US 7 233 423 B2 benutzt ein statisches Array optischer Fallen, um mikroskopisch kleine Objekte der Größe nach zu ordnen.
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Die
EP 1 684 312 A2 bezieht sich auf eine Vorrichtung zum fotochemischen Umwandeln und/oder Sortieren kleiner Teilchen, bei der diffraktive optische Elemente (DOE) dazu verwendet werden, um aus einem Laserstrahl eine Vielzahl von Laserstrahlen zu erzeugen, welche wiederum durch eine Objektivlinse fokussiert werden, um in einem Brennpunkt ein Array von optischen Fallen zu erzeugen.
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Die
US 2007/0 235 640 A1 und die zugehörige Stammanmeldung US 2004/0 089 798 A1 beziehen sich auf ein System und ein Verfahren zum Sortieren von Substanzen mittels einer holographischen Laserfalle.
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Die
WO 2005/020 244 A1 bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Transportieren mikroskopisch kleiner Objekte mit Hilfe eines Laserstrahls mit einem unsymmetrischen Intensitätsgradienten, der durch ein elliptisches Strahlprofil verursacht wird. Hierzu wird der Laser so montiert, dass er in einem großen Winkel bezogen auf die optische Achse des Objektivs einstrahlt, so dass ein Brennpunkt mit unsymmetrischem Intensitätsprofil erzeugt wird. In diesem unsymmetrischen Intensitätsprofil werden mikroskopische Objekte mechanisch bewegt. Somit fungiert dieses asymmetrische Potential als eine Art Wegeventil, und Eingang- und Ausgangsrichtung des zu sortierenden Objekts kann über die Ausrichtung der Unsymmetrie gesteuert werden.
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Die
US 2007/0069119 A1 bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Ausbilden einer optischen Falle mit Hilfe eines Siliziumsubstrats. Weiterhin können mit Hilfe der optischen Falle auch Objekte sortiert werden, indem die optische Falle zum Bewegen der zu sortierenden Teilchen verwendet wird.
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Die
WO 2005/020244 A1 bezieht sich auf ein System und ein Verfahren zum Transport mikroskopisch kleiner Teilchen mit Hilfe einer unsymmetrischen Falle, die neben einem elliptischen Strahldurchmesser auch einen unsymmetrischen Intensitätsgradienten verwendet um die Bewegung von Teilchen zu ermöglichen. Die Falle besitzt ein elliptisches Strahlprofil und einen entsprechenden optischen Kraftgradienten mit einer Unsymmetrie bezüglich des Mittelpunkts der Hauptachse dieses Strahls. Dadurch werden die Teilchen beschleunigt und eine Bewegung ohne Vorsehen eines Scanners oder irgendwelcher beweglicher Teile wird verursacht.
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Als Alternative zu optischer Manipulation könnte auch eine dielektrophoretische Sortierung verwendet werden. Dielektrophoretische Kräfte basieren auf derselben Physik wie optische Kräfte, aber die Sortiervorrichtungen arbeiten mit einer sehr viel größeren Wellenlänge und die Feldgradienten und Kräfte sind deshalb viel geringer. Da elektrische Felder außerdem mittels fester Elektroden angelegt werden, ist die Flexibilität bezüglich unterschiedlicher Sortierschemata gering.
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Die Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, besteht daher darin, ein Sortierverfahren zum Sortieren von Partikeln anzugeben, welche die Nachteile der bekannten Systeme überwinden und die Entwicklung eines flexiblen, schnellen und kostengünstigen Systems ermöglichen.
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Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der vorliegenden Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche.
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Die vorliegende Erfindung basiert auf der Idee, dass eine Sortiervorrichtung zum Sortieren von Partikeln eine miniaturisierte Durchflusszelle mit einem Kanal, der im Betrieb laminar von einer die zu sortierenden Partikel enthaltenden Probenlösung durchströmt wird, umfasst. Weiterhin ist eine optische Detektionseinheit zum Bestimmen einer geometrischen Position der zu sortierenden Partikel und zum optischen Klassifizieren der zu sortierenden Partikel vorgesehen. Erfindungsgemäß umfasst die Sortiervorrichtung außerdem eine dynamische optische Pinzette zum sequentiellen Sortieren der klassifizierten Partikel durch gezieltes Bewegen des Partikels aus der detektierten Position in eine vorbestimmte Zielposition in dem laminaren Probenlösungsstrom. Insbesondere ist die erfindungsgemäße Sortiervorrichtung durch die Verwendung einer dreidimensionalen Falle in der Lage, die Partikel dynamisch im (dreidimensionalen) Raum zu bewegen.
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Mit einer solchen Anordnung können Partikel mit Hilfe eines dynamischen hochfokussierten Kraftfeldes verschoben werden, wobei die gesamte Anordnung in wässriger Lösung arbeitet. Durch den Einsatz in mirkrofluidischer Umgebung kann die Gesamtmenge an benötigten Reagenzien signifikant reduziert werden.
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Dabei wird im Sinne der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „optischer Pinzette” ein hochfokussierter Laser verstanden, der als physikalisches Prinzip die dreidimensionale optische Gradientenkraft verwendet. Der Strahlungsdruck ist hier vernachlässigbar. Diese optische Gradientenkraft beruht im Wesentlichen auf Dipolkräften und wirkt am stärksten lateral zur Strahlrichtung. Ashkin et al. „Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles” Optics Letters, Vol. 11, No. 5, May 1986, 288–290, beschreibt im Detail die auftretenden optischen Kräfte.
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Der Vorteil gegenüber einer Verwendung schwach fokussierter Laserstrahlung besteht vor allem darin, dass die Effizienz bei gleicher Laserleistungsstärke und die Wirkung wesentlich höher ist. Damit ist das Risiko einer Zellschädigung signifikant reduziert. Die Verwendung sehr hoher Laserleistungen hat auch zusätzlich wirtschaftliche Nachteile, wie Beeinträchtigung der Laborsicherheit oder hohe Anschaffungskosten der Apparatur.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die optische Detektionseinheit eine erste Lichtquelle, um die Durchflusszelle zu durchleuchten sowie eine digitale Bildverarbeitungseinheit, um ein Durchlichtbild der Durchflusszelle auszuwerten. Auf diese Weise kann ein vollautomatischer Betrieb ermöglicht werden. Die optische Pinzette wird in Antwort auf die detektierte Position der zu sortierenden Partikel jeweils gezielt auf das Partikel gerichtet und angesteuert, um das Partikel zu bewegen.
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Durch die Verwendung einer laminaren Strömung bewirkt das Verschieben des Partikels in eine definierte Zielposition den Weitertransport des Partikels in einen vorbestimmten Ausgangskanal. Auf diese Weise ist es möglich, auf eine Vielzahl von Ausgangskanälen zu sortieren und damit ein paralleles Sortieren unterschiedlicher Partikel aus einem Partikelgemisch durchzuführen.
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Für die vollautomatisierte Weitenverarbeitung der optischen Information bezüglich der zu sortierenden Partikel umfasst die digitale Bildverarbeitungseinheit gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform eine CCD-Kamera (charged couple device).
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Die Lichtquelle, die dazu verwendet wird, ein Durchlichtbild zu erstellen, kann beispielsweise eine lichtemittierende Diode, LED, umfassen.
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Häufig handelt es sich bei den zu detektierenden Partikeln um ganze, oft lebende, Zellen. Um den Sortiervorgang für solche Zellen möglichst schonend durchführen zu können, ist die digitale Bildverarbeitungseinheit angepasst, die Außenhülle der Zelle und deren exakte Position im Probenlösungsstrom zu detektieren. Anhand der festgestellten Position der Zelle und insbesondere ihrer Außenhülle kann der stark fokussierte Laserstrahl der optischen Pinzette so angesteuert werden, dass er gezielt auf die Membran der Außenhülle gerichtet ist. Auf diese Weise wird eine Schädigung der im Inneren der Zelle befindlichen Elemente weitestgehend vermieden.
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Zusätzlich oder auch alternativ zu der Analyse anhand des sichtbaren Lichts kann eine Auswertung von Fluoreszenzstrahlung, die von den zu sortierenden Partikeln emittiert wird, erfolgen. Wie bereits erwähnt, kann diese Fluoreszenzstrahlung von künstlich angebrachten Fluoreszenzmarkern stammen oder aber durch die Zelle selbst erzeugt sein.
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Entsprechend der zu detektierenden Fluoreszenzstrahlung muss als Empfänger eine Detektionseinheit vorgesehen sein, die in dem gesuchten Wellenlängenbereich empfindlich ist.
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Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der vorliegenden Erfindung ist die Sortiervorrichtung an einem handelsüblichen Mikroskop montierbar, sodass die Kosten für die Einrichtung eines derartigen Sortierarbeitsplatzes möglichst gering gehalten werden können.
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Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen näher erläutert. Dabei werden gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen und denselben Bauteilbezeichnungen versehen.
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Es zeigen:
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1 eine perspektivische Schemadarstellung einer Durchflusszelle während eines Sortiervorgangs für zwei Sorten von Partikeln;
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2 eine Übersichtsdarstellung der zur Durchführung des Verfahrens verwendeten Sortiervorrichtung bei Einbau in einem Mikroskop;
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3 eine erste schematische Darstellung der durch die optische Pinzette verursachten Kräfte auf ein Vollkügelchen;
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4 eine zweite schematische Darstellung der durch die optische Pinzette verursachten Kräfte auf ein Vollkügelchen;
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5 ein Durchlichtbild auf eine basophile Leukämiezelle der Ratte, RBL-Zelle, und Darstellung der Geschwindigkeitskomponenten der optischen Pinzette in x- und y-Richtung;
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6 Sequenzen von Bildern einer Zelle in verschiedenen Stadien der digitalen Bildauswertung;
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7 eine Durchlichtdarstellung eines Pfades eines Kügelchen mit einem Durchmesser von 5 μm;
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8 eine Durchlichtdarstellung eines Pfades einer RBL-Zelle bei Manipulation mittels der optischen Pinzette.
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Mit Bezug auf 1 soll zunächst das allgemeine Grundprinzip der erfindungsgemäßen Sortiervorrichtung erläutert werden. Eine miniaturisierte Durchflusszelle 104, die aus einem transparenten Material besteht, weist ein Kanalsystem zum Durchströmen mit einer Probenlösung auf. Dabei ist der Hauptkanal 108 von einem laminaren Strom aus einer Probenlösung mit den injizierten zu sortierenden Partikeln 110 durchströmt. Ein erster Eingangskanal A führt die Trägerlösung zu, während die Partikel 110 durch einen zweiten Eingangskanal B in das System eingegeben werden. Der Pfeil 112 versinnbildlicht dabei die generelle Strömungsrichtung. Der Hauptkanal 108 teilt sich an seinem Ende in Strömungsrichtung in zwei Ausgangskanäle, C und D. Selbstverständlich sind die erfindungsgemäßen Prinzipien auch auf mehr als zwei Ausgangskanäle übertragbar, wenn entsprechend mehr Komponenten separiert werden sollen.
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Wie in 1 schematisch angedeutet, wird erfindungsgemäß die Durchflusszelle 104 im Bereich des Hauptkanals 108 von einer dynamischen optischen Pinzette, also einem Laserstrahl mit starker Fokussierung 114, durchdrungen. Ein Infrarotlaser wird dabei durch ein Mikroskopobjektiv mit hoher numerischer Apparatur (NA) fokussiert. Auf diese Art und Weise werden hohe Feldgradienten in dem Hauptkanal 108 erzeugt. Kügelchen oder Zellmembranen, allgemein Partikel 110, die sich in dem Fokusbereich befinden, erfahren starke Kräfte quer zu der Strahlachse, d. h. in lateraler Richtung. Der Pfeil 113, welcher senkrecht zur Strömungsrichtung 110 gerichtet ist, zeigt die Auslenkungsrichtung der Falle quer zur Strömungsrichtung an. Die entscheidenden lateralen Kräfte quer zur Strahlachse werden erst durch die Verschiebung der Falle ermöglicht.
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Durch die Möglichkeit, die Fokussierung der optischen Pinzette 114 mittels des Objektivs vorzunehmen, eröffnet sich für die erfindungsgemäße Lösung die Möglichkeit, diese in einem handelsüblichen Durchlichtmikroskop zu integrieren.
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Die Durchflusszelle 104 wird vorteilhafterweise mit Hilfe eines Softlithographieprozesses hergestellt. Ein SU-8 Negativphotoresist wird mittels UV-Licht strukturiert, anschließend wird Polydimethylsiloxan, PDMS, darüber vergossen und ausgeheizt. Nachdem das strukturierte PDMS mittels eines Sauerstoffplasmas aktiviert wurde, wird es mit einer Standardobjektträgerplatte verbunden. Anschlussschläuche werden an den Ein- und Auslässen der Eingangs- und Ausgangskanäle A, B, C, D angebracht. Der Hauptkanal weist bei dieser Anordnung eine Querschnittsfläche von beispielsweise 50 × 50 μm2 auf und die Durchflussgeschwindigkeit kann hydrostatisch eingestellt werden.
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Mit Bezug auf 2 soll im Folgenden die erfindungsgemäße Sortiervorrichtung 100 gemäß einer ersten an einem handelsüblichen Mikroskop anbringbaren Ausführungsform erläutert werden. Dabei wird teilweise das Linsensystem des Mikroskops 102 genutzt.
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Erfindungsgemäß wird die mit Bezug auf 1 beschriebene Durchflusszelle 104 auf dem Objekttisch 106 fixiert. Bei der hier gezeichneten Anordnung werden zwei Lichtquellen 116 und 118 verwendet, die alternierend die Durchflusszelle 104 beleuchten. Eine beispielsweise im Grünen strahlende Lichtquelle dient als Hellfeldbeleuchung und wird für die Erfassung der Partikelpositionierung sowie für die Ansteuerung der optischen Pinzette benötigt.
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Die zweite Lichtquelle 118 kann in einem blauen Wellenlängenbereich Strahlung emittieren, um Fluoreszenz in dem Partikel anzuregen. Diese Fluoreszenzstrahlung wird für eine Klassifizierung der Partikel verwendet. In jedem Fall wird die durch die Tubuslinse TL fallende Strahlung mittels eines Umlenkspiegels und eines Filters F2 von einer CCD-Kamera 120 erfasst und ausgewertet.
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Ein im infraroten Wellenlängenbereich strahlender Laser 122 ist Teil der optischen Pinzette. Mit Hilfe einer Scanneranordnung 115, die einen beweglichen Spiegel SM und eine Linse SL umfasst, kann der Fokus des Lasers innerhalb des Hauptkanals 108 der Durchflusszelle 104 sowohl in x- wie auch in y-Richtung verschoben werden. Die Verschiebung kann beispielsweise ±40 μm mit einer Rate von etwa einem kHz betragen. In der 2 nicht dargestellt ist eine elektronische Steuereinheit, die entsprechend der durch die CCD-Kamera 120 gewonnenen Information über die Position des zu sortierenden Partikels die Scannereinheit ansteuert, um gezielt das detektierte und analysierte Partikel auszulenken.
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Die in 2 dargestellte Anordnung umfasst außerdem zwei Strahlteiler D1, D2 (sogenannte dichroitische Strahlteiler), die für einen bestimmten Wellenlängenbereich reflektierend wirken, für andere Wellenlängenbereiche aber transparent sind. So erlaubt der Strahlteiler D1 das Hindurchtreten der blauen Fluoreszenzanregungsstrahlung der zweiten Lichtquelle 118, ist aber für die Strahlung des IR-Lasers undurchlässig, sodass diese ins Innere des Mikroskops und zum Strahlteiler D2 umgelenkt wird. Der Strahlteiler D2 reflektiert sowohl die Fluoreszenzanregungsstrahlung, wie auch das Licht des Lasers 122 durch die Objektivlinse OL in den Hauptkanal der Durchflusszelle 104. Für die Hellfeldstrahlung der Lichtquelle 116 jedoch ist der Strahlteiler D2 ebenso transparent wie für die gegebenenfalls an den Partikeln angeregte Fluoreszenzstrahlung. Diese Strahlung wird über den Mikroskopspiegel M2 zur CCD-Kamera 120 geleitet.
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Erfindungsgemäß wird der Fokus 114 der optischen Pinzette, je nachdem, welche geometrische Position und welche Art von Partikel die Analyse durch die als optische Detektionseinheit fungierende CCD-Kamera ergeben hat, so bewegt, dass das Partikel der Bewegung folgt und von einer detektierten Ist-Position in der laminaren Strömung des Hauptkanals 108 in eine gewünschte Zielposition bewegt wird. Die Bewegung der optischen Pinzette ist dabei prinzipiell in allen drei Raumrichtungen x, y und z möglich, wobei für die Auslenkung des Fokus in z-Richtung ein piezoelektrischer akusto-optischer Deflektor eingesetzt werden muss. Bei der in 1 dargestellten Anordnung werden beispielsweise heller dargestellte erste Partikel 109 in den Ausgangskanal C bewegt, während die dunkler dargestellten zweiten Partikel 111 in Richtung auf den Ausgangskanal D bewegt werden, wie dies durch den Auslenkpfeil 113 angedeutet ist.
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Wie bereits erwähnt, können aber auch mehr als nur zwei Sorten Partikel sortiert werden, wenn mehr als zwei Ausgangskanäle C, D vorgesehen werden.
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Mit Bezug auf die 3 und 4 sollen nachfolgend die Kräfte, die durch die fokussierte Strahlung der optischen Pinzette auf die zu sortierenden Partikel ausgeübt werden, näher betrachtet werden. Dabei sind die Kraftverhältnisse in diesen Figuren für Kügelchen aus homogenem Material dargestellt. Für derartige Partikel mit einem Durchmesser, der sehr viel größer ist als die Wellenlänge der optischen Pinzette, können die auftretenden optischen Kräfte mit Hilfe der Strahlenoptik modelliert werden. Man bezeichnet solche Partikel auch als Mie-Partikel und geht davon aus, dass zwar nach wie vor die Gradientenkräfte wirken, diese aber leichter durch den Impulsübertrag der Photonen auf das Objekt illustrierbar sind. Die Photonen werden dabei in den Partikeln nicht absorbiert, sondern nur an den Grenzflächen reflektiert und gebrochen.
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Eine rechnerische Behandlung der an einer Zellmembran auftretenden Kräfte ist beispielsweise dem Aufsatz Robert C. Gauthier: „Computation of the optical trapping force using an FDTD based technique”, 16 May 2005, Vol. 13, No. 10, OPTICS EXPRESS 3707–3718, zu entnehmen.
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Die optische Kraftdichte berechnet sich zu f →opt = ħg →/Δt wobei g der Nettoimpuls ist, der auf das Partikel wirkt. Integration über das gesamte Partikel, F →opt = ∫Af →dA, liefert die optische Gesamtkraft. Diese muss groß genug sein, um die entgegengesetzt wirkende hydrodynamische Reibungskraft F →frict = 6πaη·v, die durch den Radius a des Partikels, die Viskositärt η der Flüssigkeit und die Ziehgeschwindigkeit v bestimmt ist, zu überwinden.
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Bei der Darstellung der 3 liegt der Fokus des Lasers mit seinem Brennpunkt F im Inneren des sphärischen Partikels oberhalb des Mittelpunkts. Der Strahl wird an den Grenzflächen gebrochen und durch vektorielle Addition erhält man eine Nettokraft in Richtung des Brennpunktes, also in der 3 nach oben.
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Die 4 zeigt eine seitliche Verschiebung, bei der wiederum das Teilchen in Richtung des Brennpunktes gezogen wird, was durch den nach links gerichteten Pfeil g symbolisiert wird. Das heißt, die Partikel werden immer in Richtung auf den Brennpunkt der optischen Pinzette bewegt. Die Gesamtkraft auf das Partikel F →opt = ∫Af →dA muss, wie bereits erwähnt, groß genug sein, um die hydrodynamische Reibungskraft zu überwinden.
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Die Sortiervorrichtung ist grundsätzlich für alle Suspensionszellen geeignet, also für Zellen, die nicht auf einem Substrat fixiert sind und auch nicht in größeren Verbänden, wie beispielsweise Ketten, vorkommen. Neben den für die nachfolgenden beipielhaften Experimente verwendeten basophilen Leukämiezellen der Ratte, RBL-Zellen, sind z. B. auch Hefezellen derartige Suspensionszellen. Die erreichbaren Geschwindigkeiten liegen bei einigen 100 μm/s.
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Die optische Sortiervorrichtung erlaubt es, aufgrund der starken Fokussierung des Lasers, Zellen nur an ihrer Membran anzugreifen. Hierzu wird mit Hilfe der optischen Detektionseinheit, die bei der Darstellung der 2 durch die Lichtquelle 116 und die zugehörige CCD-Kamera 120 gebildet ist, die Position der Zellmembran in der laminaren Strömung des Hauptkanals 108 bestimmt.
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5. zeigt in der Übersicht ein Durchlichtbild auf den Hauptkanal mit einer RBL-Zelle darin sowie schematisch die Fallengeschwindigkeiten in x- und y-Richtung. Die RBL-Zelle hat einen Radius a und bewegt sich durch die Strömung in Flussrichtung 112 (hier als die x-Richtung angenommen) mit der Geschwindigkeit VTransport. Um beim Sortieren einen möglichst geringen Strömungswiderstand überwinden zu müssen, bewegt sich erfindungsgemäß die optische Pinzette während des gesamten Sortiervoganges ebenfalls mit dieser Geschwindigkeit in x-Richtung.
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Zum Zeitpunkt ➀ wird die optische Pinzette in y-Richtung beschleunigt, bis sie um die Strecke b ausgelenkt ist (Zeitpunkt ➁). Dann zieht die optische Pinzette mit konstanten Geschwindigkeiten in x- und y-Richtung, bis eine ausreichende Auslenkung des Partikels in die angestrebte Sollposition erreicht ist. Zum Zeitpunkt ➂ wird die optische Pinzette von dem Partikel abgekoppelt und dieses wird von der laminar strömenden Probenlösung zu dem entsprechenden Ausgangskanal transportiert. In der gezeigten Anordnung entspricht die Strecke b, über die hinweg eine Beschleunigung der optischen Pinzette erfolgt, in etwa dem Zellradius a. Allerdings ist für einen Fachmann klar, dass auch andere Werte eingestellt werden können.
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6 zeigt die einzelnen Auswerteschritte I bis IV, die dabei durch eine digitale Bildverarbeitung durchgeführt werden. Basierend auf der gewonnenen Information wird der Laser auf die Membran der Zelle fokussiert und anschließend mittels, des Scannerspiegels SM ausgelenkt, um die Zelle, an ihrer Membran angreifend, an eine gewünschte Zielposition in dem laminaren Strom zu ziehen.
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Die Kräfte, die auf eine Zellmembran wirken, sind proportional zu dem Intensitätsgradienten der Strahlung. Die Membran der Zelle besitzt einen höheren Brechungsindex als die umgebende Lösung und auch einen höheren Brechungsindex als das Zellinnere.
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7 zeigt durch die Überlagerung mehrerer Bilder den Weg eines homogen Kügelchens mit einem Durchmesser von 5 μm, das von der Eingangskanalseite A des Hauptkanals auf die Ausgangskanalseite D gezogen wird.
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Demgegenüber zeigt 8 die Verhältnisse für eine RDL-Zelle, wobei hier Geschwindigkeiten von 250 μm/s erreicht werden, wenn die Laserleistung im Fokus 28 mW beträgt. Bekannt ist, dass Laserleistungen bis 100 mW von der Zelle toleriert werden können, ohne sie signifikant zu schädigen. Mit diesem Wert von 28 mW Laserleistung kann eine Sortierrate von bis zu 10 Zellen pro Sekunde erreicht werden, wenn die Zellen am Eingangskanal B dicht und kontinuierlich vorliegen.
