WO2010063478A1 - Mikrofluidische sortiervorrichtung mit optischer pinzette - Google Patents

Mikrofluidische sortiervorrichtung mit optischer pinzette Download PDF

Info

Publication number
WO2010063478A1
WO2010063478A1 PCT/EP2009/008641 EP2009008641W WO2010063478A1 WO 2010063478 A1 WO2010063478 A1 WO 2010063478A1 EP 2009008641 W EP2009008641 W EP 2009008641W WO 2010063478 A1 WO2010063478 A1 WO 2010063478A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
particles
sorting
sorted
optical
sample solution
Prior art date
Application number
PCT/EP2009/008641
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2010063478A4 (de
Inventor
Alexander Rohrbach
Benjamin Landenberger
Original Assignee
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Albert-Ludwigs-Universität Freiburg filed Critical Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Publication of WO2010063478A1 publication Critical patent/WO2010063478A1/de
Publication of WO2010063478A4 publication Critical patent/WO2010063478A4/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1429—Signal processing
    • G01N15/1433—Signal processing using image recognition
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1484—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry microstructural devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties

Definitions

  • the present invention relates to a sorting apparatus for sorting particles and to a corresponding method.
  • particles refers to living cells, cell parts or globules (so-called "beads") with diameters of a few hundred nanometers to a few micrometers.
  • An interesting feature of living cells is their ability to synthesize fluorescent proteins (eg, green fluorescent proteins, GFPs) that, among other things, signal the successful transfection of DNA into a cell.
  • fluorescent proteins eg, green fluorescent proteins, GFPs
  • Another example is the display of the replication potential of hematopoietic stem cells.
  • FACS fluorescent activated cell sorters
  • the devices require relatively large sample volumes, on the other hand, they can only be operated and maintained by specially trained personnel and, in addition, sterilization poses a problem.
  • the efficiency of the sorting clearly decreases for sample volumes of less than 100,000 cells.
  • the acquisition and operating costs of FACS equipment for smaller laboratories are usually too high.
  • a portable single-use system based on the FACS technique is currently not foreseeable.
  • Optical forces are a promising alternative for use in sorting small particles in biotechnology.
  • optical traps or optical tweezers as they are often called, particles can be moved in all three spatial directions with high precision. Since there is no mechanical contact between the manipulation device and the particles in this technique, adhesion problems, which are normally of great importance in these proportions, are completely avoided.
  • high numerical aperture objective lenses are used, high electric field gradients, and thus high optical forces, can be exerted on living tissue, keeping the overall intensity at an acceptable level, so that cell damage can be avoided.
  • This gentle treatment can be assisted by using for the trap light with a wavelength in the infrared range that is not absorbed by the aqueous solution inside the cell.
  • Optical traps allow very fast particle displacement and allow parallelization via multiple traps or optical grids.
  • the forces on the trapped particles can be easily determined by the laser power and the wavelength.
  • the position can be controlled and measured with a nanometer precision.
  • miniaturized flow chambers can be manufactured as individual parts within a few hours with the aid of so-called soft lithography. In this way, different geometries can be flexibly tested during the development phase. Since the cost of materials and tools is relatively low, such compartments can be made both as cheap and portable disposables, as well as reusable compartments. The small channel dimensions require only small volumes of transport medium and less expensive biochemical reagents.
  • optical grids or optical line tweezers with asymmetrical intensity profile are used. They permit efficient parallel sorting of balls, but are limited to a distinction based on size or refractive index.
  • sorting devices in which the particles are hydrodynamically focused within a sorting channel to be sorted by activating a static trap generated by a laser.
  • An example of such an optically switchable optical trap is disclosed in Lin et al. "Microfluidic cell sorter / counter utilizing multiple particle tracing technique and optically switching ap- proach" Biomed Microdevices (2008) 10: 55-63. Similar to a FACS device, the fluorescence of the particles can be analyzed by detecting the emission wavelength with a photomultiplier tube. It can also be measured and analyzed with a CCD or CMOS camera, as a 2D image.
  • dielectrophoretic sorting could also be used. Dielectrophoretic forces are based on the same physics as optical forces, but the sorters operate at a much greater wavelength and the field gradients and forces are therefore much lower. In addition, since electric fields are applied by means of fixed electrodes, the flexibility with respect to different sorting schemes is small.
  • the object underlying the present invention is therefore to provide a sorting device for sorting particles and an associated sorting method, which overcomes the disadvantages of the known systems and enables the development of a flexible, fast and cost-effective system.
  • a sorting device for sorting particles comprises a miniaturized flow cell having a channel which in operation is flowed through in a laminar manner by a sample solution containing the particles to be sorted. Furthermore, an optical detection unit is provided for determining a geometric position of the particles to be sorted and for optically classifying the particles to be sorted. According to the invention, the sorting device further comprises a dynamic optical tweezers for sequentially sorting the classified particles by selectively moving the particle from the detected position to a predetermined target position in the laminar sample solution stream.
  • the use of a three-dimensional trap enables the sorting device according to the invention to move the particles dynamically in (three-dimensional) space.
  • optical tweezers is understood to mean a high-focussed laser which uses the three-dimensional optical gradient force as the physical principle. This optical gradient force is essentially based on dipole forces and acts most laterally to the beam direction Ashkin et al., "Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles” Optics Letters, Vol. 5, May 1986, 288-290 describes in detail the occurring optical forces.
  • the advantage compared to the use of weakly focused laser radiation is, above all, that the efficiency at the same laser power level and the effect is much higher. This significantly reduces the risk of cell damage.
  • the use of very high laser powers also has additional economic disadvantages, such as impairment of laboratory safety or high acquisition costs of the apparatus.
  • the optical detection unit comprises a first light source to illuminate the flow cell and a digital image processing unit to evaluate a transmitted light image of the flow cell.
  • a fully automatic operation can be enabled.
  • the optical tweezers are respectively targeted to the particle and driven to move the particle.
  • moving the particle to a defined target position causes the further transport of the particle into a predetermined exit channel.
  • the digital image processing unit comprises a CCD camera (charged couple device).
  • the light source used to form a transmitted light image may include a light emitting diode, LED.
  • the particles to be detected are whole, often living, cells.
  • the digital image processing unit is adapted according to an advantageous development of the present invention, to detect the outer shell of the cell and its exact position in the sample solution flow. Based on the determined position of the cell and in particular its outer shell of the highly focused laser beam of the optical tweezers can be controlled so that it is aimed specifically at the membrane of the outer shell. In this way, damage to the elements located inside the cell is largely avoided.
  • fluorescence radiation emitted by the particles to be sorted can take place.
  • this fluorescence radiation can come from artificially attached fluorescence markers or else be generated by the cell itself.
  • a detection unit must be provided as the receiver, which is sensitive in the sought wavelength range.
  • the sorting device can be mounted on a commercially available microscope, so that the cost of setting up such a sorting workstation can be kept as low as possible.
  • FIG. 1 is a perspective schematic view of a flow cell during a sorting process for two types of particles.
  • FIG. 2 shows an overview of the sorting device according to the invention when installed in a microscope
  • FIG. 3 shows a first schematic representation of the forces caused by the optical tweezers on a solid sphere
  • Fig. 5 is a transmitted light image of a rat basophilic leukemia cell, RBL cell, and showing the velocity components of the optical tweezers in the x and y directions;
  • FIG. 7 shows a transmitted light representation of a path of a bead with a diameter of 5 ⁇ m
  • FIG. 8 shows a transmitted light representation of a path of an RBL cell during manipulation by means of the optical tweezers.
  • a miniaturized flow cell 104 made of a transparent material has a channel system for flowing with a sample solution.
  • the main channel 108 is flowed through by a laminar flow from a sample solution with the injected particles 1 to 10 to be sorted.
  • a first input channel A supplies the carrier solution while the particles 1 through 10 O
  • a second input channel B are entered into the system.
  • the arrow 112 symbolizes the general flow direction.
  • the main channel 108 is divided at its end in the flow direction into two output channels, C and D.
  • the principles of the invention are transferable to more than two output channels, if more components are to be separated accordingly.
  • the flow cell 104 in the region of the main channel 108 is penetrated by a dynamic optical tweezer, that is to say a laser beam with strong focus, 114.
  • a dynamic optical tweezer that is to say a laser beam with strong focus
  • An infrared laser is focused by a microscope objective with high numerical apparatus (NA).
  • NA numerical apparatus
  • Beads or cell membranes, generally particles 110 located in the focus area experience strong forces transverse to the beam axis, i. in lateral direction.
  • the arrow 113 which is directed perpendicular to the flow direction 110, indicates the deflection direction of the trap transversely to the flow direction. The decisive lateral forces transverse to the beam axis are only made possible by the displacement of the trap.
  • the flow cell 104 is advantageously produced by means of a soft lithography process.
  • An SU-8 negative photoresist is patterned by means of UV light, then polydimethylsiloxane, PDMS, is poured over it and baked.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the structured PDMS has been activated by means of an oxygen plasma, it is connected to a standard slide plate.
  • Connecting hoses are attached to the inlets and outlets of the input and output channels A, B, C, D.
  • the main channel has a cross-sectional area of, for example, 50 ⁇ 50 ⁇ m 2 , and the flow rate can be adjusted hydrostatically.
  • the sorting apparatus 100 With reference to FIG. 2, the sorting apparatus 100 according to the invention will be described hereinafter in accordance with a first embodiment attachable to a commercially available microscope. y
  • the lens system of the microscope 102 is partially used.
  • a light source radiating in the green serves as a bright field illumination and is required for the detection of the particle positioning as well as for the control of the optical tweezers.
  • the second light source 118 can emit radiation in a blue wavelength range in order to excite fluorescence in the particle. This fluorescence radiation is used for a classification of the particles.
  • the radiation falling through the tube lens TL is detected and evaluated by a CCD camera 120 by means of a deflecting mirror and a filter F2.
  • a laser 122 radiating in the infrared wavelength range is part of the optical tweezers.
  • a scanner arrangement 115 which according to the invention comprises a movable mirror SM and a lens SL, the focus of the laser according to the invention within the main channel 108 of the flow cell 104 can be moved in both the x and y direction.
  • the displacement may be, for example, ⁇ 40 ⁇ m at a rate of about one kHz.
  • an electronic control unit which, in accordance with the information obtained by the CCD camera 120 about the position of the particle to be sorted, drives the scanner unit in order to deflect the detected and analyzed particle in a targeted manner.
  • the arrangement shown in FIG. 2 also comprises two beam splitters D1, D2 (so-called dichroic beam splitters), which have a reflective effect for a specific wavelength range but are transparent to other wavelength ranges.
  • the beam splitter D1 allows the passage of the blue fluorescence excitation radiation of the second light source 118, but is impermeable to the radiation of the IR laser, so that it is deflected into the interior of the microscope and to the beam splitter D2.
  • the beam splitter D2 reflects both the fluorescence excitation radiation and the light from the laser 122 through the objective lens OL into the main channel of the through-beam. flow cell 104.
  • the beam splitter D2 is just as transparent as for the fluorescence radiation possibly excited on the particles. This radiation is conducted via the microscope mirror M2 to the CCD camera 120.
  • the focus of the optical tweezers 114 is moved so that the particle follows the movement and from a detected actual position, depending on which geometric position and which type of particle the analysis has resulted from acting as an optical detection unit CCD camera is moved in the laminar flow of the main channel 108 in a desired target position.
  • the movement of the optical tweezers is in principle possible in all three spatial directions x, y and z, wherein a piezoelectric acousto-optic deflector must be used for the deflection of the focus in the z-direction.
  • lighter-colored first particles 109 are moved into output channel C, for example, while darker second particles 111 are moved in the direction of exit channel D, as indicated by deflection arrow 113.
  • the forces exerted on the particles to be sorted by the focused radiation of the optical tweezers will be considered below.
  • the force ratios in these figures are shown for globules of homogeneous material.
  • the occurring optical forces can be modeled with the aid of the beam optics.
  • These particles are also referred to as Mie particles and assume that although the gradient forces still act, they are more easily illustrated by the momentum transfer of the photons to the object.
  • the photons are not absorbed in the particles, but only reflected and broken at the interfaces.
  • a computational treatment of the forces occurring on a cell membrane is, for example, in the article Robert C. Gauthier: "Computation of the optical trapping force using FDTD-based technique", May 16, 2005, Vol. 13, No. 10, OPTICS EXPRESS 3707-3718, refer to.
  • the optical power density is calculated to
  • the focus of the laser with its focal point F lies in the interior of the spherical particle above the center point.
  • the beam is refracted at the interfaces and by vectorial addition one obtains a net force in the direction of the focal point, ie in FIG. 3 upward.
  • FIG. 4 shows a lateral displacement, in which again the particle is pulled in the direction of the focal point, which is symbolized by the arrow g directed to the left. That is, the particles are always moved toward the focal point of the optical tweezers.
  • the total force on the particle F * must, as already mentioned, be large enough to overcome the hydrodynamic friction force.
  • the sorting device according to the invention is basically suitable for all suspension cells, that is to say for cells which are not fixed on a substrate and also do not occur in larger dressings, such as, for example, chains.
  • RBL cells used for the following exemplary experiments, z.
  • yeast cells such suspension cells.
  • the achievable speeds are several 100 ⁇ m / s.
  • the optical sorting device according to the invention makes it possible to attack cells only on their membrane due to the strong focusing of the laser.
  • the position of the cell membrane in the laminar flow of the main channel 108 is determined by means of the optical detection unit, which is formed in the representation of FIG. 2 by the light source 116 and the associated CCD camera 120.
  • FIG. 5 shows an overview of a transmitted light image on the main channel with an RBL line therein and, schematically, the trapping speeds in the x and y directions.
  • the RBL line has a radius a and moves through the flow in the flow direction 112 (assumed here as the x direction) at the speed Vn-ansp o r t - in order to overcome the lowest possible flow resistance during sorting, moves according to the invention the optical tweezers also during the entire sorting process at this speed in the x-direction.
  • the optical tweezers are accelerated in the y-direction until they are deflected by the distance b (time ⁇ ).
  • the optical tweezers then pull at constant speeds in the x and y directions until a sufficient deflection of the particle into the desired target position is achieved.
  • the optical tweezers are decoupled from the particle and transported from the laminar sample solution to the corresponding exit channel.
  • the distance b over which an acceleration of the optical tweezers takes place corresponds approximately to the cell radius a.
  • other values can also be set.
  • Fig. 6 shows the individual evaluation steps I to IV 1 which are carried out by a digital image processing. Based on the information obtained, the laser is focused on the membrane of the cell and then deflected by means of the scanning mirror SM in order to pull the cell, acting on its membrane, to a desired target position in the laminar flow.
  • the forces acting on a cell membrane are proportional to the intensity gradient of the radiation.
  • the membrane of the cell has a higher refractive index than the surrounding solution and also a higher refractive index than the cell interior.
  • FIG. 7 shows, by superimposing a plurality of images, the path of a homogeneous sphere having a diameter of 5 ⁇ m, which is drawn from the inlet channel side A of the main channel to the outlet channel side D.
  • FIG. 8 shows the conditions for an RDL cell, in which case speeds of 250 ⁇ m / s are achieved when the laser power in focus is 28 mW. It is known that laser powers up to 100 mW can be tolerated by the cell without significantly damaging it. With this value of 28 mW laser power, a sorting rate of up to 10 cells per second can be achieved if the cells on the input channel B are dense and continuous.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Sortiervorrichtung zum Sortieren von Partikeln sowie auf ein entsprechendes Verfahren. Dabei bezeichnet der Begriff Partikel lebende Zellen, Zellteile oder Kügelchen mit Durchmessern von einigen 100 Nanometern bis einige Mikrometer. Um eine Sortiervorrichtung zum Sortieren von Partikeln sowie ein zugehöriges Sortierverfahren anzugeben, das die Nachteile der bekannten Systeme überwindet und die Entwicklung eines flexiblen, schnellen und kostengünstigen Systems ermöglicht, umfasst die Sortiervorrichtung eine miniaturisierte Durchflusszelle mit einem Kanal, der im Betrieb laminar von einer die zu sortierenden Partikel enthaltenden Probenlösung durchströmt wird. Weiterhin ist mindestens eine optische Detektionseinheit zum Bestimmen einer geometrischen Position der zu sortierenden Partikel und zum optischen Klassifizieren der zu sortierenden Partikel vorgesehen. Eine über einen Spiegel oder einen akusto-optischen Deflektor auslenkbare optische Pinzette ist zum sequentiellen Sortieren der klassifizierten Partikel durch gezieltes Bewegen des Partikels aus der detektierten Position in eine vorbestimmte Zielposition in dem laminaren Probenlösungsstrom vorgesehen.

Description

MIKROFLUIDISCHE SORTIERVORRICHTUNG MIT OPTISCHER PINZETTE
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Sortiervorrichtung zum Sortieren von Partikeln sowie auf ein entsprechendes Verfahren. Dabei bezeichnet der Begriff Partikel lebende Zellen, Zellteile oder Kügelchen (so genannte „Beads") mit Durchmessern von einigen 100 Nanometern bis einigen Mikrometern.
Das Sortieren kleiner Partikel hat in den letzten Jahren insbesondere in der Biotechnologie große Bedeutung erlangt. Es besteht ein zunehmender Bedarf, funktionalisier- te Kügelchen, biologische Zellen oder Chromosomen anhand einer Vielzahl von Charakteristika aus einem Gemisch abzutrennen. Zellen beispielsweise müssen oft an- hand ihrer Gestalt und Größe oder anhand der Verteilung eines Fluoreszenzfarbstoffes separiert werden. Diese Farbstoffe können an spezifische Moleküle angebunden werden, welche wiederum an Target-Proteine anbinden, oder sie können eine DNA- Sequenz innerhalb des Zellkerns kennzeichnen. Weitere mögliche Kopplungsmechanismen und Anwendungsgebiete für Fluoreszenzfarbstoffe sind dem Fachmann selbstverständlich geläufig.
Eine interessante Eigenschaft lebender Zellen ist ihre Fähigkeit, fluoreszente Proteine (z. B. green fluorescent proteins, GFP) zu synthetisieren, die unter anderem die erfolgreiche Transfektion von DNA in eine Zelle signalisieren. Ein weiteres Beispiel ist die Anzeige des Replikationspotentials von hämatopoetischen Stammzellen.
Weiterhin steht die Analyse kodierter Proteine nach der erfolgreichen Sequenzierung des Humangenoms im Rahmen des Humangenomprojektes im Vordergrund heutiger Forschung und Entwicklung. In diesem Zusammenhang werden Proteinmikroarrays und gemultiplexten Sandwichimmunoassays, die darauf basieren, dass Proteine an Kügelchen gebunden werden, die größten Chancen eingeräumt. Auch hier dominiert die Fluoreszenzmarkierung über andere Techniken, wie beispielsweise eine Separierung mittels magnetischer Marker.
Es ist bekannt, kleine Partikel mit Hilfe fluoreszenzaktivierter Zellsortierer, sogenannter fluorescent activated cell sorters, FACS, zu sortieren. Bei diesen bekannten FACS-Geräten werden die Partikel in winzige Tröpfchen eingebettet, mittels einer Elektrode aufgeladen und dann in einem elektrischen Feld abgelenkt, nachdem ihr Emissionsspektrum analysiert worden ist. Bei dieser Technik befinden sich die Partikel zunächst im Fluid-Strom, werden dann in Tröpfchen separiert und anschließend erst sortiert. Diese Tröpfchenseparation ist technisch vergleichsweise aufwändig.
FACS ist gut untersucht, schnell und verlässlich, aber diese Technik weist einige gravierende Nachteile auf.
Zum einen erfordern die Geräte relativ große Probenvolumina, zum anderen können sie nur durch speziell ausgebildetes Personal bedient und gewartet werden und zudem stellt die Sterilisation ein Problem dar. Die Effizienz der Sortierung nimmt für Probenmengen von weniger als 100.000 Zellen deutlich ab. Darüber hinaus sind die Anschaffungs- und Betriebskosten der FACS-Geräte für kleinere Laboratorien in der Regel zu hoch. Schließlich ist ein portables Einmalsystem auf der Basis der FACS- Technik gegenwärtig nicht absehbar.
Optische Kräfte stellen für die Verwendung beim Sortieren kleiner Partikel in der Bio- technologie eine vielversprechende Alternative dar. Mit optischen Fallen oder optischen Pinzetten, wie sie häufig genannt werden, können Partikel in allen drei Raumrichtungen mit hoher Präzision bewegt werden. Da bei dieser Technik kein mechanischer Kontakt zwischen Manipulationseinrichtung und Partikel stattfindet, werden An- haftungsprobleme, die normalerweise bei diesen Größenverhältnissen von großer Bedeutung sind, vollständig vermieden. Wenn Objektivlinsen mit hoher numerischer Apertur verwendet werden, können hohe Gradienten des elektrischen Feldes und somit hohe optische Kräfte auf lebendes Gewebe ausgeübt werden, wobei die Gesamtintensität auf einem vertretbaren Wert gehalten werden kann, sodass Zellschädigungen vermieden werden können.
Diese schonende Behandlung kann dadurch unterstützt werden, dass für die Falle Licht mit einer Wellenlänge im Infrarotbereich verwendet wird, das nicht durch die wässrige Lösung im Inneren der Zelle absorbiert wird. Optische Fallen erlauben eine sehr schnelle Verschiebung von Partikeln und ermöglichen eine Parallelisierung über multiple Fallen oder optische Gitter. Darüber hinaus können die Kräfte auf die einge- fangenen Teilchen in einfacher Weise durch die Laserleistung und den Wellenlän- O
genbereich von Nanonewton bis einigen Femtonewton eingestellt werden. Gleichzeitig kann die Position mit einer Nanometerpräzision gesteuert und gemessen werden.
Es existieren verschiedene Ansätze, optische Manipulation mit mikrofluidischen Systemen zu kombinieren, um eine Partikelsortierung zu erreichen. Miniaturisierte Durch- flusskammem können beispielsweise mit Hilfe der sogenannten Softlithographie innerhalb einiger Stunden als Einzelteile hergestellt werden. Auf diese Weise können verschiedene Geometrien während der Entwicklungsphase flexibel getestet werden. Da die Kosten für Material und Herstellungswerkzeuge relativ niedrig sind, können derartige Kammern sowohl als billige und tragbare Wegwerfartikel, wie auch als wie- derverwertbare Kammern hergestellt werden. Die geringen Kanaldimensionen verlangen nur geringe Volumina an Transportmedium und weniger an teuren biochemischen Reagenzien.
Die Konzepte bei bekannten mikrofluidischen Systemen mit optischer Manipulation können in passive und aktive Sortierstrategien unterteilt werden. Im Fall des passiven Sortierens werden optische Gitter oder optische Linienpinzetten mit asymmetrischem Intensitätsprofil verwendet. Sie erlauben ein effizientes paralleles Sortieren von Ku- gelchen, sind aber auf eine Unterscheidung anhand der Größe oder des Brechungsindex beschränkt.
Beinahe alle vielversprechenden aktiven Sortiervorrichtungen arbeiten in mikrofluidi- scher Umgebung, aber unterscheiden sich entsprechend ihrer Partikelklassifizie- rungs- und Manipulierungsstrategien. Beispielsweise ist bekannt, Partikel in eine Vielzahl von Mikrokanälen zu sortieren, indem eine statische Linienfalle zeitweise aktiviert wird. Außerdem nutzt keine Methode dreidimensionale optische Fangkräfte aus, was eine optische Pinzette definiert.
Weiterhin existieren Sortiervorrichtungen, bei denen die Teilchen hydrodynamisch innerhalb eines Sortierkanals fokussiert werden, um durch Aktivieren einer statischen Falle, die durch einen Laser erzeugt wird, sortiert zu werden. Ein Beispiel für eine solche bei Bedarf einschaltbare optische Falle ist in Lin et al. „Microfluidic cell sorter/counter utilizing multiple particle tracing technique and optically switching ap- proach" Biomed Microdevices (2008) 10:55-63, beschrieben. Die Fluoreszenz der Partikel kann, ähnlich wie bei einer FACS-Vorrichtung, dadurch analysiert werden, dass die Emissionswellenlänge mit einer Photomultiplierröhre de- tektiert wird. Sie kann aber auch mit einer CCD- oder CMOS-Kamera, als 2D Bild gemessen und analysiert werden.
Als Alternative zu optischer Manipulation könnte auch eine dielektrophoretische Sortierung verwendet werden. Dielektrophoretische Kräfte basieren auf derselben Physik wie optische Kräfte, aber die Sortiervorrichtungen arbeiten mit einer sehr viel größeren Wellenlänge und die Feldgradienten und Kräfte sind deshalb viel geringer. Da elektrische Felder außerdem mittels fester Elektroden angelegt werden, ist die Flexibi- lität bezüglich unterschiedlicher Sortierschemata gering.
Die Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, besteht daher darin, eine Sortiervorrichtung zum Sortieren von Partikeln sowie ein zugehöriges Sortierverfahren anzugeben, das die Nachteile der bekannten Systeme überwindet und die Entwicklung eines flexiblen, schnellen und kostengünstigen Systems ermöglicht.
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der unabhängigen Patentansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der vorliegenden Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Idee, dass eine Sortiervorrichtung zum Sortieren von Partikeln eine miniaturisierte Durchflusszelle mit einem Kanal, der im Be- trieb laminar von einer die zu sortierenden Partikel enthaltenden Probenlösung durchströmt wird, umfasst. Weiterhin ist eine optische Detektionseinheit zum Bestimmen einer geometrischen Position der zu sortierenden Partikel und zum optischen Klassifizieren der zu sortierenden Partikel vorgesehen. Erfindungsgemäß umfasst die Sortiervorrichtung außerdem eine dynamische optische Pinzette zum sequentiellen Sor- tieren der klassifizierten Partikel durch gezieltes Bewegen des Partikels aus der de- tektierten Position in eine vorbestimmte Zielposition in dem laminaren Probenlösungsstrom. Insbesondere ist die erfindungsgemäße Sortiervorrichtung durch die Verwendung einer dreidimensionalen Falle in der Lage, die Partikel dynamisch im (dreidimensionalen) Raum zu bewegen. O
Mit einer solchen Anordnung können Partikel mit Hilfe eines dynamischen hochfokus- sierten Kraftfeldes verschoben werden, wobei die gesamte Anordnung in wässriger Lösung arbeitet. Durch den Einsatz in mirkrofluidischer Umgebung kann die Gesamtmenge an benötigten Reagenzien signifikant reduziert werden.
Dabei wird im Sinne der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „optischer Pinzette" ein hochfokussierter Laser verstanden, der als physikalisches Prinzip die dreidimensionale optische Gradientenkraft verwendet. Der Strahlungsdruck ist hier vernachlässigbar. Diese optische Gradientenkraft beruht im Wesentlichen auf Dipolkräften und wirkt am stärksten lateral zur Strahlrichtung. Ashkin et al. „Observation of a single- beam gradient force optical trap for dielectric particles" Optics Letters, Vol. 11 , No. 5, May 1986, 288-290, beschreibt im Detail die auftretenden optischen Kräfte.
Der Vorteil gegenüber einer Verwendung schwach fokussierter Laserstrahlung besteht vor allem darin, dass die Effizienz bei gleicher Laserleistungsstärke und die Wirkung wesentlich höher ist. Damit ist das Risiko einer Zellschädigung signifikant redu- ziert. Die Verwendung sehr hoher Laserleistungen hat auch zusätzlich wirtschaftliche Nachteile, wie Beeinträchtigung der Laborsicherheit oder hohe Anschaffungskosten der Apparatur.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der vorliegenden Erfindung umfasst die optische Detektionseinheit eine erste Lichtquelle, um die Durchflusszelle zu durchleuch- ten sowie eine digitale Bildverarbeitungseinheit, um ein Durchlichtbild der Durchflusszelle auszuwerten. Auf diese Weise kann ein vollautomatischer Betrieb ermöglicht werden. Die optische Pinzette wird in Antwort auf die detektierte Position der zu sortierenden Partikel jeweils gezielt auf das Partikel gerichtet und angesteuert, um das Partikel zu bewegen.
Durch die Verwendung einer laminaren Strömung bewirkt das Verschieben des Partikels in eine definierte Zielposition den Weitertransport des Partikels in einen vorbestimmten Ausgangskanal. Auf diese Weise ist es möglich, auf eine Vielzahl von Ausgangskanälen zu sortieren und damit ein paralleles Sortieren unterschiedlicher Partikel aus einem Partikelgemisch durchzuführen. D
Für die vollautomatisierte Weiterverarbeitung der optischen Information bezüglich der zu sortierenden Partikel umfasst die digitale Bildverarbeitungseinheit gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform eine CCD-Kamera (charged couple device).
Die Lichtquelle, die dazu verwendet wird, ein Durchlichtbild zu erstellen, kann bei- spielsweise eine lichtemittierende Diode, LED, umfassen.
Häufig handelt es sich bei den zu detektierenden Partikeln um ganze, oft lebende, Zellen. Um den Sortiervorgang für solche Zellen möglichst schonend durchführen zu können, ist gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der vorliegenden Erfindung die digitale Bildverarbeitungseinheit angepasst, die Außenhülle der Zelle und deren exak- te Position im Probenlösungsstrom zu detektieren. Anhand der festgestellten Position der Zelle und insbesondere ihrer Außenhülle kann der stark fokussierte Laserstrahl der optischen Pinzette so angesteuert werden, dass er gezielt auf die Membran der Außenhülle gerichtet ist. Auf diese Weise wird eine Schädigung der im Inneren der Zelle befindlichen Elemente weitestgehend vermieden.
Zusätzlich oder auch alternativ zu der Analyse anhand des sichtbaren Lichts kann eine Auswertung von Fluoreszenzstrahlung, die von den zu sortierenden Partikeln emittiert wird, erfolgen. Wie bereits erwähnt, kann diese Fluoreszenzstrahlung von künstlich angebrachten Fluoreszenzmarkem stammen oder aber durch die Zelle selbst erzeugt sein.
Entsprechend der zu detektierenden Fluoreszenzstrahlung muss als Empfänger eine Detektionseinheit vorgesehen sein, die in dem gesuchten Wellenlängenbereich empfindlich ist.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der vorliegenden Erfindung ist die Sortiervorrichtung an einem handelsüblichen Mikroskop montierbar, sodass die Kosten für die Einrichtung eines derartigen Sortierarbeitsplatzes möglichst gering gehalten werden können.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen näher erläutert. Dabei werden gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen und denselben Bauteilbezeichnungen versehen. Weiterhin können auch Merkmale oder Merkmalskombinationen aus den gezeigten und beschriebenen unterschiedlichen Ausführungsformen für sich eigenständige erfinderische oder erfindungsgemäße Lösungen darstellen.
Es zeigen:
Fig. 1 eine perspektivische Schemadarstellung einer Durchflusszelle während eines Sortiervorgangs für zwei Sorten von Partikeln;
Fig. 2 eine Übersichtsdarstellung der erfindungsgemäßen Sortiervorrichtung bei Einbau in einem Mikroskop;
Fig. 3 eine erste schematische Darstellung der durch die optische Pinzette verursachten Kräfte auf ein Vollkügelchen;
Fig. 4 eine zweite schematische Darstellung der durch die optische Pinzette verursachten Kräfte auf ein Vollkügelchen;
Fig. 5 ein Durchlichtbild auf eine basophile Leukämiezelle der Ratte, RBL-ZeIIe, und Darstellung der Geschwindigkeitskomponenten der optischen Pinzette in x- und y-Richtung;
Fig. 6 Sequenzen von Bildern einer Zelle in verschiedenen Stadien der digitalen Bildauswertung;
Fig. 7 eine Durchlichtdarstellung eines Pfades eines Kügelchen mit einem Durch- messer von 5 μm;
Fig. 8 eine Durchlichtdarstellung eines Pfades einer RBL-ZeIIe bei Manipulation mittels der optischen Pinzette.
Mit Bezug auf Fig. 1 soll zunächst das allgemeine Grundprinzip der erfindungsgemäßen Sortiervorrichtung erläutert werden. Eine miniaturisierte Durchflusszelle 104, die aus einem transparenten Material besteht, weist ein Kanalsystem zum Durchströmen mit einer Probenlösung auf. Dabei ist der Hauptkanal 108 von einem laminaren Strom aus einer Probenlösung mit den injizierten zu sortierenden Partikeln 1 10 durchströmt. Ein erster Eingangskanal A führt die Trägerlösung zu, während die Partikel 1 10 durch o
einen zweiten Eingangskanal B in das System eingegeben werden. Der Pfeil 112 versinnbildlicht dabei die generelle Strömungsrichtung. Der Hauptkanal 108 teilt sich an seinem Ende in Strömungsrichtung in zwei Ausgangskanäle, C und D. Selbstverständlich sind die erfindungsgemäßen Prinzipien auch auf mehr als zwei Ausgangs- kanäle übertragbar, wenn entsprechend mehr Komponenten separiert werden sollen.
Wie in Fig. 1 schematisch angedeutet, wird erfindungsgemäß die Durchflusszelle 104 im Bereich des Hauptkanals 108 von einer dynamischen optischen Pinzette, also einem Laserstrahl mit starker Fokussierung, 114, durchdrungen. Ein Infrarotlaser wird dabei durch ein Mikroskopobjektiv mit hoher numerischer Apparatur (NA) fokussiert. Auf diese Art und Weise werden hohe Feldgradienten in dem Hauptkanal 108 erzeugt. Kügelchen oder Zellmembranen, allgemein Partikel 110, die sich in dem Fokusbereich befinden, erfahren starke Kräfte quer zu der Strahlachse, d.h. in lateraler Richtung. Der Pfeil 113, welcher senkrecht zur Strömungsrichtung 110 gerichtet ist, zeigt die Auslenkungsrichtung der Falle quer zur Strömungsrichtung an. Die entschei- denden lateralen Kräfte quer zur Strahlachse werden erst durch die Verschiebung der Falle ermöglicht.
Durch die Möglichkeit, die Fokussierung der optischen Pinzette 114 mittels des Objektivs vorzunehmen, eröffnet sich für die erfindungsgemäße Lösung die Möglichkeit, diese in einem handelsüblichen Durchlichtmikroskop zu integrieren.
Die Durchflusszelle 104 wird vorteilhafterweise mit Hilfe eines Softlithographieprozes- ses hergestellt. Ein SU-8 Negativphotoresist wird mittels UV-Licht strukturiert, anschließend wird Polydimethylsiloxan, PDMS, darüber vergossen und ausgeheizt. Nachdem das strukturierte PDMS mittels eines Sauerstoffplasmas aktiviert wurde, wird es mit einer Standardobjektträgerplatte verbunden. Anschlussschläuche werden an den Ein- und Auslässen der Eingangs- und Ausgangskanäle A, B, C, D angebracht. Der Hauptkanal weist bei dieser Anordnung eine Querschnittsfläche von beispielsweise 50x50 μm2 auf und die Durchflussgeschwindigkeit kann hydrostatisch eingestellt werden.
Mit Bezug auf Fig. 2 soll im Folgenden die erfindungsgemäße Sortiervorrichtung 100 gemäß einer ersten an einem handelsüblichen Mikroskop anbringbaren Ausführungs- y
form erläutert werden. Dabei wird teilweise das Linsensystem des Mikroskops 102 genutzt.
Erfindungsgemäß wird die mit Bezug auf Fig. 1 beschriebene Durchflusszelle 104 auf dem Objekttisch 106 fixiert. Bei der hier gezeichneten Anordnung werden zwei Licht- quellen 116 und 118 verwendet, die alternierend die Durchflusszelle 104 beleuchten. Eine beispielsweise im Grünen strahlende Lichtquelle dient als Hellfeldbeleuchung und wird für die Erfassung der Partikelpositionierung sowie für die Ansteuerung der optischen Pinzette benötigt.
Die zweite Lichtquelle 118 kann in einem blauen Wellenlängenbereich Strahlung emit- tieren, um Fluoreszenz in dem Partikel anzuregen. Diese Fluoreszenzstrahlung wird für eine Klassifizierung der Partikel verwendet. In jedem Fall wird die durch die Tubuslinse TL fallende Strahlung mittels eines Umlenkspiegels und eines Filters F2 von einer CCD-Kamera 120 erfasst und ausgewertet.
Ein im infraroten Wellenlängenbereich strahlender Laser 122 ist Teil der optischen Pinzette. Mit Hilfe einer Scanneranordnung 115, die erfindungsgemäß einen beweglichen Spiegel SM und eine Linse SL umfasst, kann der Fokus des Lasers erfindungsgemäß innerhalb des Hauptkanals 108 der Durchflusszelle 104 sowohl in x- wie auch in y-Richtung verschoben werden. Die Verschiebung kann beispielsweise ±40 μm mit einer Rate von etwa einem kHz betragen. In der Fig. 2 nicht dargestellt ist eine elekt- ronische Steuereinheit, die entsprechend der durch die CCD-Kamera 120 gewonnenen Information über die Position des zu sortierenden Partikels die Scannereinheit ansteuert, um gezielt das detektierte und analysierte Partikel auszulenken.
Die in Fig. 2 dargestellte Anordnung umfasst außerdem zwei Strahlteiler D1 , D2 (sogenannte dichroitische Strahlteiler), die für einen bestimmten Wellenlängenbereich reflektierend wirken, für andere Wellenlängenbereiche aber transparent sind. So erlaubt der Strahlteiler D1 das Hindurchtreten der blauen Fluoreszenzanregungsstrahlung der zweiten Lichtquelle 118, ist aber für die Strahlung des IR-Lasers undurchlässig, sodass diese ins Innere des Mikroskops und zum Strahlteiler D2 umgelenkt wird. Der Strahlteiler D2 reflektiert sowohl die Fluoreszenzanregungsstrahlung, wie auch das Licht des Lasers 122 durch die Objektivlinse OL in den Hauptkanal der Durch- flusszelle 104. Für die Hellfeldstrahlung der Lichtquelle 116 jedoch ist der Strahlteiler D2 ebenso transparent wie für die gegebenenfalls an den Partikeln angeregte Fluoreszenzstrahlung. Diese Strahlung wird über den Mikroskopspiegel M2 zur CCD- Kamera 120 geleitet.
Erfindungsgemäß wird der Fokus der optischen Pinzette 114, je nachdem, welche geometrische Position und welche Art von Partikel die Analyse durch die als optische Detektionseinheit fungierende CCD-Kamera ergeben hat, so bewegt, dass das Partikel der Bewegung folgt und von einer detektierten Ist-Position in der laminaren Strömung des Hauptkanals 108 in eine gewünschte Zielposition bewegt wird. Die Bewe- gung der optischen Pinzette ist dabei prinzipiell in allen drei Raumrichtungen x, y und z möglich, wobei für die Auslenkung des Fokus in z-Richtung ein piezoelektrischer akusto-optischer Deflektor eingesetzt werden muss. Bei der in Fig. 1 dargestellten Anordnung werden beispielsweise heller dargestellte erste Partikel 109 in den Ausgangskanal C bewegt, während die dunkler dargestellten zweiten Partikel 111 in Rich- tung auf den Ausgangskanal D bewegt werden, wie dies durch den Auslenkpfeil 113 angedeutet ist.
Wie bereits erwähnt, können aber auch mehr als nur zwei Sorten Partikel sortiert werden, wenn mehr als zwei Ausgangskanäle C, D vorgesehen werden.
Mit Bezug auf die Fig. 3 und 4 sollen nachfolgend die Kräfte, die durch die fokussierte Strahlung der optischen Pinzette auf die zu sortierenden Partikel ausgeübt werden, näher betrachtet werden. Dabei sind die Kraftverhältnisse in diesen Figuren für Kü- gelchen aus homogenem Material dargestellt. Für derartige Partikel mit einem Durchmesser, der sehr viel größer ist als die Wellenlänge der optischen Pinzette, können die auftretenden optischen Kräfte mit Hilfe der Strahlenoptik modelliert wer- den. Man bezeichnet solche Partikel auch als Mie-Partikel und geht davon aus, dass zwar nach wie vor die Gradientenkräfte wirken, diese aber leichter durch den Impulsübertrag der Photonen auf das Objekt illustrierbar sind. Die Photonen werden dabei in den Partikeln nicht absorbiert, sondern nur an den Grenzflächen reflektiert und gebrochen. Eine rechnerische Behandlung der an einer Zellmembran auftretenden Kräfte ist beispielsweise dem Aufsatz Robert C. Gauthier: „Computation of the optical trapping force using an FDTD based technique", 16 May 2005, Vol. 13, No. 10, OPTICS EXPRESS 3707-3718, zu entnehmen.
Die optische Kraftdichte berechnet sich zu
wobei g der Nettoimpuls ist, der auf das Partikel wirkt. Integration über das gesamte Partikel, F = \ JdA , liefert die optische Gesamtkraft. Diese muss groß genug sein,
JA um die entgegengesetzt wirkende hydrodynamische Reibungskraft Ffnct = βπaη ■ v , die durch den Radius a des Partikels, die Viskositärt η derFlüssigkeit und die Ziehgeschwindigkeit v bestimmt ist, zu überwinden.
Bei der Darstellung der Fig. 3 liegt der Fokus des Lasers mit seinem Brennpunkt F im Inneren des sphärischen Partikels oberhalb des Mittelpunkts. Der Strahl wird an den Grenzflächen gebrochen und durch vektorielle Addition erhält man eine Nettokraft in Richtung des Brennpunktes, also in der Fig. 3 nach oben.
Die Fig. 4 zeigt eine seitliche Verschiebung, bei der wiederum das Teilchen in Richtung des Brennpunktes gezogen wird, was durch den nach links gerichteten Pfeil g symbolisiert wird. Das heißt, die Partikel werden immer in Richtung auf den Brennpunkt der optischen Pinzette bewegt. Die Gesamtkraft auf das Partikel F * =
Figure imgf000013_0001
muss, wie bereits erwähnt, groß genug sein, um die hydrodynamische Reibungskraft zu überwinden.
Die erfindungsgemäße Sortiervorrichtung ist grundsätzlich für alle Suspensionszellen geeignet, also für Zellen, die nicht auf einem Substrat fixiert sind und auch nicht in größeren Verbänden, wie beispielsweise Ketten, vorkommen. Neben den für die nachfolgenden beipielhaften Experimente verwendeten basophilen Leukämiezellen der Ratte, RBL-Zellen, sind z. B. auch Hefezellen derartige Suspensionszellen. Die erreichbaren Geschwindigkeiten liegen bei einigen 100 μm/s. Die erfindungsgemäße optische Sortiervorrichtung erlaubt es, aufgrund der starken Fokussierung des Lasers, Zellen nur an ihrer Membran anzugreifen. Hierzu wird mit Hilfe der optischen Detektionseinheit, die bei der Darstellung der Fig. 2 durch die Lichtquelle 116 und die zugehörige CCD-Kamera 120 gebildet ist, die Position der Zellmembran in der laminaren Strömung des Hauptkanals 108 bestimmt.
Fig 5. zeigt in der Übersicht ein Durchlichtbild auf den Hauptkanal mit einer RBL-ZeIIe darin sowie schematisch die Fallengeschwindigkeiten in x- und y-Richtung. Die RBL- ZeIIe hat einen Radius a und bewegt sich durch die Strömung in Flussrichtung 112 (hier als die x-Richtung angenommen) mit der Geschwindigkeit V-n-ansport- Um beim Sortieren einen möglichst geringen Strömungswiderstand überwinden zu müssen, bewegt sich erfindungsgemäß die optische Pinzette während des gesamten Sortier- voganges ebenfalls mit dieser Geschwindigkeit in x-Richtung.
Zum Zeitpunkt © wird die optische Pinzette in y-Richtung beschleunigt, bis sie um die Strecke b ausgelenkt ist (Zeitpunkt ©). Dann zieht die optische Pinzette mit konstan- ten Geschwindigkeiten in x- und y-Richtung, bis eine ausreichende Auslenkung des Partikels in die angestrebte Sollposition erreicht ist. Zum Zeitpunkt ® wird die optische Pinzette von dem Partikel abgekoppelt und dieses wird von der laminar strömenden Probenlösung zu dem entsprechenden Ausgangskanal transportiert. In der gezeigten Anordnung entspricht die Strecke b, über die hinweg eine Beschleunigung der optischen Pinzette erfolgt, in etwa dem Zellradius a. Allerdings ist für einen Fachmann klar, dass auch andere Werte eingestellt werden können.
Fig. 6 zeigt die einzelnen Auswerteschritte I bis IV1 die dabei durch eine digitale Bildverarbeitung durchgeführt werden. Basierend auf der gewonnenen Information wird der Laser auf die Membran der Zelle fokussiert und anschließend mittels des Scan- nerspiegels SM ausgelenkt, um die Zelle, an ihrer Membran angreifend, an eine gewünschte Zielposition in dem laminaren Strom zu ziehen.
Die Kräfte, die auf eine Zellmembran wirken, sind proportional zu dem Intensitätsgradienten der Strahlung. Die Membran der Zelle besitzt einen höheren Brechungsindex als die umgebende Lösung und auch einen höheren Brechungsindex als das Zellinne- re. I O
Fig. 7 zeigt durch die Überlagerung mehrerer Bilder den Weg eines homogen Kügel- chens mit einem Durchmesser von 5 μm, das von der Eingangskanalseite A des Hauptkanals auf die Ausgangskanalseite D gezogen wird.
Demgegenüber zeigt Fig. 8 die Verhältnisse für eine RDL-ZeIIe, wobei hier Geschwindigkeiten von 250 μm/s erreicht werden, wenn die Laserleistung im Fokus 28 mW beträgt. Bekannt ist, dass Laserleistungen bis 100 mW von der Zelle toleriert werden können, ohne sie signifikant zu schädigen. Mit diesem Wert von 28 mW Laserleistung kann eine Sortierrate von bis zu 10 Zellen pro Sekunde erreicht werden, wenn die Zellen am Eingangskanal B dicht und kontinuierlich vorliegen.

Claims

Patentansprüche:
1. Sortiervorrichtung zum Sortieren von Partikeln umfassend:
eine miniaturisierte Durchflusszelle (104) mit einem Kanal, der im Betrieb laminar von einer die zu sortierenden Partikel (110) enthaltenden Proben- lösung durchströmt wird;
mindestens eine optische Detektionseinheit (116, 118, 120) zum Bestimmen einer geometrischen Position der zu sortierenden Partikel und zum optischen Klassifizieren der zu sortierenden Partikel;
eine auslenkbare optische Pinzette zum sequentiellen Sortieren der klassi- fizierten Partikel durch gezieltes Bewegen des Partikels aus der detektier- ten Position in eine vorbestimmte Zielposition in dem laminaren Probenlösungsstrom.
2. Sortiervorrichtung nach Anspruch 1 , wobei die optische Pinzette über einen Spiegel oder einen akusto-optischen Deflektor auslenkbar ist.
3. Sortiervorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die optische Detektionseinheit eine erste Lichtquelle (1 16) umfasst, um die Durchflusszelle zu durchleuchten, sowie eine digitale Bildverarbeitungseinheit (120), um ein Durchlichtbild der Durchflusszelle auszuwerten.
4. Sortiervorrichtung nach Anspruch 3, wobei die digitale Bildverarbeitungs- einheit eine Charge Couped Device, CCD, -Kamera umfasst.
5. Sortiervorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, wobei die erste Lichtquelle (116) eine Licht emittierende Diode, LED, umfasst.
6. Sortiervorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die digitale Bildverarbeitungseinheit angepasst ist, eine Position eines Au- ßenbereichs der zu sortierenden Partikel zu identifizieren.
7. Sortiervorrichtung nach Anspruch 6, wobei die dynamische optische Pinzette ansteuerbar ist, um in Antwort auf die identifizierte Position des Au- ßenbereichs der zu sortierenden Partikel auf den Außenbereich fokussiert zu werden.
8. Sortiervorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die optische Detektionseinheit zum Detektieren fluoreszenzmarkier- ter Partikel eingerichtet ist.
9. Sortiervorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die optische Detektionseinheit eine zweite Lichtquelle (1 18) umfasst, die separat von der ersten Lichtquelle angeordnet ist.
10. Sortiervorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dynamische optische Pinzette einen stark fokussierten Fanglaser
(122) oder eine Laserdiode umfasst.
11. Sortiervorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Durchflusszelle mindestens einen Zuführkanal (A, B) und mindestens zwei Ausgangskanäle (C, D) umfasst und die dynamische optische Pinzette betreibbar ist, das zu sortierende Partikel entsprechend einem
Ausgangssignal der optischen Detektionseinheit zu einem ausgewählten Ausgangskanal zu bewegen.
12. Sortiervorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, die so ausgebildet ist, dass sie an einem handelsüblichen Mikroskop (102) montierbar ist.
13. Verfahren zum Sortieren von Partikeln mit den folgenden Schritten:
Transportieren einer die zu sortierenden Partikel enthaltenden Probenlösung in einem laminaren Probenlösungsstrom;
Bestimmen einer geometrischen Position und optisches Klassifizieren der zu sortierenden Partikel;
sequentielles Sortieren der klassifizierten Partikel durch gezieltes Bewegen des Partikels mittels einer dynamischen optischen Pinzette in eine vorbestimmte Zielposition in dem laminaren Probenlösungsstrom.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Schritt des Bestimmens einer geometrischen Position und des optischen Klassifizierens der zu sortierenden Partikel umfasst:
Durchleuchten eines Teils des Probenlösungsstroms und Auswerten eines Durchlichtbildes mittels einer digitalen Bildverarbeitungseinheit.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die digitale Bildverarbeitungseinheit eine Position eines Außenbereichs der zu sortierenden Partikel identifiziert.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die dynamische optische Pinzette in Antwort auf die identifizierte Position des Außenbereichs der zu sortieren- den Partikel auf den Außenbereich fokussiert wird.
PCT/EP2009/008641 2008-12-03 2009-12-03 Mikrofluidische sortiervorrichtung mit optischer pinzette WO2010063478A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102008060332.5 2008-12-03
DE102008060332A DE102008060332B4 (de) 2008-12-03 2008-12-03 Verfahren zum Sortieren von mindestens einem Partikel mit einer mikrofluidischen Sortiervorrichtung mit optischer Pinzette

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2010063478A1 true WO2010063478A1 (de) 2010-06-10
WO2010063478A4 WO2010063478A4 (de) 2010-07-22

Family

ID=41718932

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2009/008641 WO2010063478A1 (de) 2008-12-03 2009-12-03 Mikrofluidische sortiervorrichtung mit optischer pinzette

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102008060332B4 (de)
WO (1) WO2010063478A1 (de)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101893737A (zh) * 2010-06-11 2010-11-24 哈尔滨工程大学 三芯光纤光学微手及其控制方法
WO2014117784A1 (en) * 2013-02-04 2014-08-07 Danmarks Tekniske Universitet System for optical sorting of microscopic objects
CN107068230A (zh) * 2017-05-12 2017-08-18 深圳大学 一种可操纵的光镊模型
CN107603940A (zh) * 2017-09-07 2018-01-19 中国科学技术大学 利用楔形光镊光场分选微粒的方法
DE102019122981A1 (de) * 2019-08-27 2021-03-04 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Vorrichtung und Verfahren zum Sortieren von Partikeln mittels Strahlung

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102010035104A1 (de) * 2010-08-23 2012-04-05 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Vorrichtung und Verfahren zur automatischen Fokussierung für die Mikroskopie schwach leuchtender Substrate
US20120238032A1 (en) 2011-03-18 2012-09-20 International Business Machines Corporation Lab on a chip
US8464076B2 (en) 2011-03-24 2013-06-11 International Business Machines Corporation Born encrypted optical data
DE102014003386B4 (de) * 2014-03-07 2016-06-23 Celltool Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Qualitätskontrolle eines Blutprodukts

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020058332A1 (en) * 2000-09-15 2002-05-16 California Institute Of Technology Microfabricated crossflow devices and methods
WO2002087792A1 (en) * 2001-04-27 2002-11-07 Genoptix, Inc. Methods and apparatus for use of optical forces for identification, characterization and/or sorting of particles
US20040089798A1 (en) * 2002-07-31 2004-05-13 Lewis Gruber System and method of sorting materials using holographic laser steering
US20050121604A1 (en) * 2003-09-04 2005-06-09 Arryx, Inc. Multiple laminar flow-based particle and cellular separation with laser steering
WO2006063335A2 (en) * 2004-12-10 2006-06-15 Arryx, Inc. Automated extraction and purification of samples using optical tweezers

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4887721A (en) * 1987-11-30 1989-12-19 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Laser particle sorter
CA2057506C (en) * 1990-12-13 2003-05-13 Keiji Sasaki Laser trapping and method for applications thereof
EP0556748B1 (de) * 1992-02-20 1998-10-28 Canon Kabushiki Kaisha Verfahren und Messapparatur zur Handhabung von Teilchen
US6055106A (en) * 1998-02-03 2000-04-25 Arch Development Corporation Apparatus for applying optical gradient forces
WO2002044689A2 (en) * 2000-11-28 2002-06-06 The Regents Of The University Of California Storing microparticles in optical switch which is transported by micro-fluidic device
DE10157032A1 (de) * 2001-11-21 2003-06-12 Evotec Ag Verfahren und Vorrichtung zum Sortieren von Partikeln
US6863406B2 (en) * 2002-08-01 2005-03-08 The University Of Chicago Apparatus and method for fabricating, sorting, and integrating materials with holographic optical traps
DE60335411D1 (de) * 2002-11-01 2011-01-27 Techno Network Shikoku Co Ltd Verfahren zum sortieren und rückgewinnen von feinen teilchen und rückgewinnungsvorrichtung
US7233423B2 (en) * 2003-05-16 2007-06-19 University Of Chicago Optical fractionation methods and apparatus
ATE481715T1 (de) * 2003-08-22 2010-10-15 Secretary Dept Atomic Energy Vorrichtung und verfahren zum transport mikroskopischer objekt(e)
US20080213821A1 (en) * 2004-05-06 2008-09-04 Nanyang Technological University Microfluidic Cell Sorter System
US7745788B2 (en) * 2005-09-23 2010-06-29 Massachusetts Institute Of Technology Optical trapping with a semiconductor
US8691151B2 (en) * 2006-08-31 2014-04-08 Massachusetts Institute Of Technology Opto-fluidic architecture for particle manipulation and sorting
JP2008199919A (ja) * 2007-02-16 2008-09-04 Kyushu Univ 細胞選別分取方法および装置

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020058332A1 (en) * 2000-09-15 2002-05-16 California Institute Of Technology Microfabricated crossflow devices and methods
WO2002087792A1 (en) * 2001-04-27 2002-11-07 Genoptix, Inc. Methods and apparatus for use of optical forces for identification, characterization and/or sorting of particles
US20040089798A1 (en) * 2002-07-31 2004-05-13 Lewis Gruber System and method of sorting materials using holographic laser steering
US20050121604A1 (en) * 2003-09-04 2005-06-09 Arryx, Inc. Multiple laminar flow-based particle and cellular separation with laser steering
WO2006063335A2 (en) * 2004-12-10 2006-06-15 Arryx, Inc. Automated extraction and purification of samples using optical tweezers

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101893737A (zh) * 2010-06-11 2010-11-24 哈尔滨工程大学 三芯光纤光学微手及其控制方法
CN101893737B (zh) * 2010-06-11 2012-02-01 哈尔滨工程大学 三芯光纤光学微手及其控制方法
WO2014117784A1 (en) * 2013-02-04 2014-08-07 Danmarks Tekniske Universitet System for optical sorting of microscopic objects
CN107068230A (zh) * 2017-05-12 2017-08-18 深圳大学 一种可操纵的光镊模型
CN107603940A (zh) * 2017-09-07 2018-01-19 中国科学技术大学 利用楔形光镊光场分选微粒的方法
CN107603940B (zh) * 2017-09-07 2020-10-27 中国科学技术大学 利用楔形光镊光场分选微粒的方法
DE102019122981A1 (de) * 2019-08-27 2021-03-04 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Vorrichtung und Verfahren zum Sortieren von Partikeln mittels Strahlung

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010063478A4 (de) 2010-07-22
DE102008060332A1 (de) 2010-06-10
DE102008060332B4 (de) 2013-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102008060332B4 (de) Verfahren zum Sortieren von mindestens einem Partikel mit einer mikrofluidischen Sortiervorrichtung mit optischer Pinzette
US11480516B2 (en) Method and system for microfluidic particle sorting
DE10304653B4 (de) Mehrparametrige Detektion in einem fluidischen Mikrosystem
DE60319161T2 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Herstellung, Sortierung und Integration von Materialien mittels holographischer optischer Fallen
CN102128778B (zh) 用于分选细胞的方法和设备
US20070207061A1 (en) Optofluidic microscope device
US20050271548A1 (en) Optofluidic microscope device
DE102017122718A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur optischen Untersuchung einer Vielzahl mikroskopischer Proben
DE112019001098T5 (de) Verfahren zum optimieren von feinteilchenansaugbedingung, feinteilchentrennungsvorrichtung, feinteilchentrennungssystem und feinteilchentrennungsprogramm
EP1226419A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur partikeltrennung
DE102011055426A1 (de) Mikroskopieverfahren zur Erkennung biologischer Zielobjekte
DE102007027414B3 (de) Mikro- und Nanofluidsystem zur dynamischen Strukturanalyse von linearen Makromolekülen und Anwendungen davon
DE10320956B4 (de) Untersuchungsverfahren für biologische Zellen und zugehörige Untersuchungseinrichtung
WO2022029036A1 (de) Verfahren und fluidisches mikrosystem zur dielektrophoretischen manipulierung von suspendierten partikeln
DE102004017482A1 (de) Mikrofluidisches System mit einer Elektrodenanordnung und zugehöriges Ansteuerungsverfahren
DE10353985A1 (de) Einrichtung und Verfahren zum Manipulieren und Analysieren von Mikroobjekten auf Grundlage eines zumindest bereichsweise als fluidisches Mikrosystem oder/und Chipsystem ausgeführten Mikrosystems
WO2021041807A1 (en) Systems and methods for image cytometry
EP1711795A1 (de) Mikrofluidisches system mit einer elektrodenanordnung und zugehoriges ansteuerungsverfahren
DD258070A1 (de) Messeinrichtung fuer die durchflusszytometrie

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09765039

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09765039

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1