DE10320956B4

DE10320956B4 - Untersuchungsverfahren für biologische Zellen und zugehörige Untersuchungseinrichtung

Info

Publication number: DE10320956B4
Application number: DE10320956A
Authority: DE
Inventors: Torsten Dr. Müller; Stefan Hummel; Annette Pfennig; Gabriele Dr. Gradl; Axel Bonsen; Thomas Dr. Schnelle; Rüdiger Meyer
Original assignee: Evotec Technologies GmbH
Current assignee: PerkinElmer Cellular Technologies Germany GmbH
Priority date: 2003-02-05
Filing date: 2003-05-09
Publication date: 2005-02-17
Anticipated expiration: 2023-05-10
Also published as: DE10320956A1

Abstract

Untersuchungsverfahren für Partikel (48, 49), insbesondere für biologische Partikel (48; 49), mit den folgenden Schritten:
– Einbringung der zu untersuchenden Partikel (48, 49) in einen Trägerstrom eines mikrofluidischen Systems, so dass die Partikel in dem Trägerstrom suspendiert sind,
– Durchführung mindestens einer ersten Untersuchung der sich mit dem Trägerstrom bewegenden suspendierten Partikel (48, 49),
– Selektion mindestens eines suspendierten Partikels (48, 49) in Abhängigkeit von dem Ergebnis der ersten Untersuchung,
– Abbremsen des selektierten suspendierten Partikels (48, 49),
– Durchführung mindestens einer zweiten Untersuchung des selektierten suspendierten Partikels (48, 49) im abgebremsten Zustand.

Description

Die Erfindung betrifft ein Untersuchungsverfahren für vorzugsweise biologische Partikel, insbesondere zur Untersuchung biologischer Zellen in einem Zellsortierer, gemäß Anspruch 1 sowie eine entsprechende Untersuchungseinrichtung gemäß Anspruch 14.

Aus Müller, T. et al.: "A 3-D microelectrode system for handling and caging single cells and particles, Biosensors and Bioelectronics 14 (1999) 247-256 ist ein Untersuchungsverfahren für biologische Zellen bekannt, bei dem die zu untersuchenden Zellen in einem Trägerstrom eines mikrofluidischen Systems suspendiert sind und dielektrophoretisch manipuliert und sortiert werden. In dem Trägerstrom werden die zu untersuchenden Zellen zunächst durch eine trichterförmige dielektrophoretische Elektrodenanordnung (engl. "Funnel") aufgereiht und anschließend in einem dielektrophoretischen Käfig (engl. "cage") festgehalten, um die in dem Käfig befindlichen Zellen im ruhenden Zustand untersuchen zu können, wozu mikroskopische, spektroskopische oder fluoreszenzoptische Messmethoden angewendet werden können. In Abhängigkeit von der Untersuchung der in dem dielektrophoretischen Käfig gefangenen Zellenkönnen diese anschließend sortiert werden, wozu der Bediener eine Sortiereinrichtung ansteuert, die aus einer in dem Trägerstrom stromabwärts hinter dem dielektrophoretischen Käfig angeordneten dielektrophoretischen Elektrodenanordnung besteht.

Nachteilig an dem vorstehend beschriebenen bekannten Untersuchungsverfahren ist, dass die zu untersuchenden Zellen in einer Probe oft sehr unterschiedlich sind. Bei sehr heterogenen Proben, aus denen z.B. gewisse Zielzellen durch ein Verfahren identifiziert und diese Zielzellen dann isoliert werden sollen, machen die Zielzellen oftmals nur einen geringen Anteil an der gesamten Probe aus. Die anderen Zellen tragen nicht die gewünschten Eigenschaften oder sind nicht mehr vital, also bereits tot. Zudem kommt es oft vor, dass die Zellen nicht vollständig vereinzelt sind, sondern dass manche Zellen das System als Konglomerat von zwei oder mehr Zellen passieren. Dies ist ein unerwünschtes Ergebnis. Die detaillierte Untersuchung einzelner Zellen oder Konglomerate in einem Feldkäfig ist aber ein zeitaufwändiger Prozess, so dass die Untersuchung der gesamten Zellprobe im Feldkäfig sehr lange dauern würde.

Aus DE 199 46 110 C1 ist ein Verfahren zur Untersuchung von Partikeln in einem Luftstrom bekannt, bei dem die Partikel zunächst einer ersten Untersuchung unterzogen und in Abhängigkeit von dem Untersuchungsergebnis selektiert werden. Die positiv selektierten Partikel werden dann abgebremst und einer zweiten Untersuchung unterzogen. Diese Druckschrift betrifft jedoch ein makroskopisches System, bei dem die zu untersuchenden Partikel nicht in einem Trägerstrom suspendiert sind.

Weiterhin ist aus EP 1 335 198 A1 ein Untersuchungsverfahren bekannt, bei dem Partikel in einem mikrofluidischen System untersucht werden. Hierbei erfolgt jedoch nur eine einzige Untersuchung der Partikel, wobei die Partikel in Abhängigkeit von dem Ergebnis der Untersuchung selektiert werden.

Ferner ist aus EP 0 649 014 A2 ein Untersuchungsverfahren bekannt, bei dem Partikel in einem makroskopischen System untersucht werden. Hierbei erfolgt zunächst eine erste Untersuchung und anschließend eine Selektion der Partikel in Abhän gigkeit von dem Untersuchungsergebnis, wobei die positiv selektierten Partikel anschließend der zweiten Untersuchung unterzogen werden.

Schließlich ist aus DE 199 52 322 A1 ein Untersuchungsverfahren bekannt, bei dem Partikel in einem mikrofluidischen System untersucht werden, wobei wiederum nur eine einzige Untersuchung erfolgt, welche die Selektion der untersuchten Partikel bestimmt.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, das vorstehend beschriebene bekannte Untersuchungsverfahren dahingehend zu verbessern, dass eine Untersuchung von nicht interessierenden biologischen Zellen (z.B. toten Zellen) oder Zellklumpen indem dielektrophoretischen Käfig vermieden werden kann.

Die Aufgabe wird, ausgehend von dem eingangs beschriebenen bekannten Untersuchungsverfahren, durch die Merkmale des Anspruchs 1 bzw. – hinsichtlich einer entsprechenden Untersuchungseinrichtung – durch die Merkmale des Anspruchs 14 gelöst.

Die Erfindung umfasst die allgemeine technische Lehre, vor der Untersuchung der in dem Trägerstrom suspendierten Partikel in dem dielektrophoretischen Käfig zunächst eine Voruntersuchung der sich mit dem Trägerstrom bewegenden Partikel durchzuführen, um die für eine weitere Untersuchung interessanten Partikel anschließend in dem dielektrophoretischen Käfig fangen und untersuchen zu können.

Die Voruntersuchung kann beispielsweise die Intensität einer Fluoreszenz, die Vitalität einer Zelle und/oder die Frage betreffen, ob es sich um eine einzelne Zelle oder ein Konglomerat handelt. Weiterhin kann bei der Voruntersuchung ermittelt werden, ob es sich um Zellen oder Material handelt, das in Form und Größe nicht Primärziel der näheren Untersuchung ist, z.B. Verunreinigungen oder andere Zellen, sofern sie sich von den Zielzellen unterscheiden.

Bei dem erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahren erfolgt also zunächst eine Voruntersuchung der in dem Trägerstrom suspendierten Partikel und eine Selektion bestimmter Partikel in Abhängigkeit von dem Ergebnis der Voruntersuchung, während die eigentliche Hauptuntersuchung nur für die zuvor selektierten Partikel durchgeführt wird, die hierzu abgebremst werden, um eine aussagefähige Hauptuntersuchung zu ermöglichen, die durch eine Bewegung der Partikel erschwert würde.

Es ist im Rahmen der Erfindung nicht zwingend erforderlich, dass die in Abhängigkeit von der Voruntersuchung selektierten Partikel vor der Hauptuntersuchung vollständig zum Stillstand gebracht werden, indem diese beispielsweise in einem dielektrophoretischen Käfig gefangen werden. Es ist im Rahmen der Erfindung vielmehr auch möglich, dass die in Abhängigkeit von der Voruntersuchung selektierten Partikel in dem Trägerstrom lediglich soweit abgebremst werden, dass eine aussagekräftige Untersuchung der Partikel möglich ist.

Weiterhin ist zu erwähnen, dass der im Rahmen der Erfindung verwendete Begriff eines Partikels allgemein zu verstehen ist und nicht auf einzelne biologische Zellen beschränkt ist. Vielmehr umfasst dieser Begriff auch synthetische oder biologische Partikel, wobei sich besondere Vorteile ergeben, wenn die Partikel biologische Materialien, also beispielsweise biologische Zellen, Zellgruppen, Zellbestandteile oder biologisch relevante Makromoleküle, jeweils ggf. im Verbund mit anderen biologischen Partikeln oder synthetischen Trägerpartikeln umfassen. Synthetische Partikel können feste Partikel, flüssige, vom Suspensionsmedium abgegrenzte Teilchen oder Mehrphasenpartikel umfassen, die gegenüber dem Suspensionsmedium in dem Trägerstrom eine getrennte Phase bilden.

Vorzugsweise wird der in Abhängigkeit von der Voruntersuchung selektierte und anschließend im Rahmen der Hauptuntersuchung näher untersuchte Partikel in Abhängigkeit von dem Ergebnis der Hauptuntersuchung sortiert und/oder behandelt. Beispielsweise können bei der Hauptuntersuchung verschiedene Zelltypen unterschieden und anschließend entsprechend sortiert werden. Es ist jedoch auch möglich, die im Rahmen der Voruntersuchung selektierten Partikel in Abhängigkeit von dem Ergebnis der Hauptuntersuchung durch dielektrophoretische Elemente zu manipulieren, wobei die in der eingangs erwähnten Veröffentlichung von Müller, T. et al. beschriebenen dielektrophoretischen Elemente Verwendung finden können.

Im Rahmen der Voruntersuchung kann beispielsweise eine Durchlichtmessung, eine Fluoreszenzmessung und/oder eine Impedanzspektroskopie erfolgen. In dem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung erfolgt jedoch zunächst eine Durchlichtmessung und anschließend eine Fluoreszenzmessung, wobei die Durchlichtmessung und die Fluoreszenzmessung vorzugsweise in räumlich getrennten Untersuchungsfenstern (engl. "region of interest") erfolgen. Die Durchlichtmessung kann beispielsweise die Unterscheidung zwischen lebenden und toten biologischen Zellen ermöglichen, während die Fluoreszenzmessung dazu verwendet werden kann, um zu untersuchen, ob die in dem Trägerstrom suspendierten Partikel einen Fluoreszenzmarker tragen.

Falls im Rahmen der Voruntersuchung sowohl eine Durchlichtmessung als auch eine Fluoreszenzmessung in räumlich getrennten Untersuchungsfenstern erfolgt, so ist es vorteilhaft, wenn das Untersuchungsfenster für die Durchlichtmessung im Trägerstrom stromaufwärts vor dem Untersuchungsfenster für die Fluoreszenzmessung liegt. Es ist jedoch alternativ auch möglich, dass das Untersuchungsfenster für die Durchlichtmessung in dem Trägerstrom stromabwärts hinter dem Untersuchungsfenster für die Fluoreszenzmessung angeordnet ist.

Vorzugsweise wird im Rahmen der Voruntersuchung der sich mit dem Trägerstrom bewegenden Partikel ein optisches Bild aufgenommen, was eine digitale Bildauswertung zur Klassifizierung der Partikel ermöglicht. Vorzugsweise werden die Partikel hierbei morphologisch untersucht, um beispielsweise eine einzelne biologische Zelle von einem Zellklumpen unterscheiden zu können.

Die Unterscheidung lebender und toter Zellen im Rahmen der Voruntersuchung kann bei einer Durchlichtmessung durch eine Auswertung der Intensitätsverteilung in dem aufgenommenen optischen Bild erfolgen. So weisen lebende biologische Zellen eine Ringstruktur mit einem in der Durchlichtmessung relativ hellen Rand und einem dunkleren Mittelpunkt auf, wohingegen tote biologische Zellen bei einer Durchlichtmessung eine annähernd einheitliche Helligkeit aufweisen und dunkel gegen den Hintergrund erscheinen. Ein spezielles Prinzip dieser Durchlichtmessung mit den erwähnten Eigenschaften ist beispielsweise die Phasenkontrast-Beleuchtung.

Bei der Hauptuntersuchung der Partikel können beispielsweise bestimmte Moleküle innerhalb einer Zelle lokalisiert werden.

Beispielsweise können im Rahmen der Hauptuntersuchung innerhalb einer Zelle Moleküle lokalisiert werden, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Bei dem Fluoreszenzfarbstoff kann es sich beispielsweise um molekularbiologisch produzierte "Tags" von "Green Fluorescent Protein" und dessen Derivate, andere autofluoreszente Proteine handeln. Als Fluoreszenzfarbstoffe eignen sich jedoch auch solche Fluoreszenzfarbstoffe, die an ein zelluläres Molekül kovalent oder nicht-kovalent binden. Darüber hinaus können als Fluoreszenzfarbstoffe auch fluorigene Substanzen eingesetzt werden, die von zellulären Enzymen in fluoreszierende Produkte umgesetzt werden oder sogenannte FRET-Paare (Fluoreszenz Resonanz Energietransfer). Der Zustand der eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe kann beispielsweise anhand ihrer spektralen Eigenschaften oder durch Bioluminenz unterschieden werden.

Anhand der Lokalisation von Molekülen innerhalb einer Zelle kann auch die Struktur und Funktion der Moleküle ermittelt werden. Hierbei kann beispielsweise unterschieden werden nach dem Vorkommen in der Plasmamembran, im Zytosol, in den Mitochondrien, im Golgi-Apparat, in Endosomen, in Lysosomen, im Zellkern, im Spindelapparat, im Zytoskelett, Kolokalisation mit Aktin, Tubulin.

Ferner kann im Rahmen der Haupt- und/oder Voruntersuchung die Morphologie einer Zelle bestimmt werden, wobei auch Farbstoffe eingesetzt werden können.

Darüber hinaus können im Rahmen der Haupt- und/oder Voruntersuchung auch zwei oder mehr Zustände einer Zellpopulation unterschieden werden.

Weiterhin ist es im Rahmen der Hauptuntersuchung möglich, ein zelluläres Signal anhand der Translokation eines fluoreszenz markierten Moleküls zu bestimmen, z.B. Rezeptoraktivierung gefolgt von Rezeptor-Internalisierung, Rezeptoraktivierung gefolgt von der Bindung von Arrestin, Rezeptoraggregation, Übergang eines Moleküls von der Plasmamembran ins Zytosol, vom Zytosol in die Plasmamembran, vom Zytosol in den Zellkern oder vom Zellkern ins Zytosol.

Ferner kann im Rahmen der Haupt- und/oder Voruntersuchung auch die Wechselwirkung zweier Moleküle bestimmt werden, wobei vorzugsweise mindestens eines der wechselwirkenden Moleküle einen Fluoreszenzmarker trägt und die Wechselwirkung z.B. durch Kolokalisation zweier Fluoreszenzfarben, ein FRET oder eine Änderung der Fluoreszenz-Lebenszeit gezeigt wird.

Im Rahmen der Haupt- und/oder Voruntersuchung kann jedoch auch der Status einer Zelle innerhalb eines Zellzyklus bestimmt werden, wobei vorzugsweise die Morphologie der Zelle oder die Anfärbung des zellulären Chromatins ausgewertet wird.

Eine weitere Möglichkeit für die Haupt- und/oder Voruntersuchung besteht darin, das Membranpotential einer Zelle zu bestimmen, wobei vorzugsweise membranpotentialsensitive Farbstoffe eingesetzt werden. Vorzugsweise werden hierbei Farbstoffe verwendet, die hinsichtlich des Plasmamembranpotentials und/oder des mitochondrialen Membranpotentials sensitiv sind.

Darüber hinaus kann im Rahmen der Haupt- und/oder Voruntersuchung auch die Vitalität einer Zelle ermittelt werden, wobei vorzugsweise die Morphologie der Zelle ausgewertet wird und/oder fluorigene Substanzen eingesetzt werden, die zwischen lebenden und toten Zellen unterscheiden können.

Ferner können bei der Haupt- und/oder Voruntersuchung auch zytotoxische Effekte untersucht und/oder der intrazelluläre pH-Werte bestimmt werden.

Es ist auch möglich, im Rahmen der Haupt- und/oder Voruntersuchung die Konzentration eines oder mehrerer Ionen innerhalb einer Zelle zu bestimmen.

Auch kann bei der Haupt- und/oder Voruntersuchung eine enzymatische Aktivität innerhalb einer Zelle ermittelt werden, wobei vorzugsweise fluorigene oder chromogene Substanzen, insbesondere Kinasen, Phosphatasen oder Proteasen, eingesetzt werden können.

Ferner kann bei der Haupt- und/oder Voruntersuchung die Produktionsleistung von Zellen bestimmt werden, die biologische Produkte erzeugen, wie beispielsweise Proteine, Peptide, Antikörper, Kohlenhydrate oder Fette, wobei eine der beschriebenen Methoden angewendet werden kann.

Schließlich können im Rahmen der Hauptuntersuchung auch Zell-Stress-Pfade, metabolische Pfade, Zellwachstums-Pfade, Zellteilungs-Pfade und andere Signaltransduktions-Pfade bestimmt werden.

Darüber hinaus umfasst die Erfindung eine entsprechende Untersuchungseinrichtung zur Ausführung des vorstehend beschriebenen Untersuchungsverfahrens.

Die erfindungsgemäße Untersuchungseinrichtung weist vorzugsweise eine Optik auf, um ein Bild der Partikel aufzunehmen.

Vorzugsweise ist die Optik der erfindungsgemäßen Untersuchungseinrichtung verstellbar, um die Vergrößerung, den Fokus und/oder das Sehfeld einzustellen oder ein bestimmtes optisches Filter auszuwählen, wobei die Einstellung der Optik durch ein Stellglied (z.B. einen Elektromotor) erfolgen kann.

Besonders vorteilhaft an der Erfindung ist die Tatsache, dass Zellen unter keimarmen, aseptischen Bedingungen untersucht und entsprechend isoliert werden können.

Andere vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet oder werden nachstehend zusammen mit der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Figuren näher erläutert. Es zeigen:
1 ein Fluidikdiagramm eines erfindungsgemäßen Zellsortierers mit einem Sortierchip,
2 den Trägerstromkanal des Sortierchips mit mehreren dielektrophoretischen Elementen,
3 eine schematische Darstellung der Untersuchungsoptik des Zellsortierers aus 1,
4 ein Schaubild zur Verdeutlichung der Unterscheidung von toten und lebenden biologischen Zellen sowie
5a–5e ein Beispiel des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens in Form eines Flussdiagramms.
Die schematische Darstellung in 1 zeigt einen erfindungsgemäßen Zellsortierer, der mittels eines mikrofluidischen Sortierchips 1 biologische Zellen dielektrophoretisch sortiert.
Die Techniken der dielektrophoretischen Beeinflussung von biologischen Zellen sind beispielsweise in Müller, T. et al.: "A 3-D microelectrode system for handling and caging single cells and particles", Biosensors & Bioelectronics 14 (1999) 247–256 beschrieben, so dass im folgenden auf eine detaillierte Beschreibung der dielektrophoretischen Prozesse in dem Sortierchip 1 verzichtet wird und diesbezüglich auf die vorstehende Veröffentlichung verwiesen wird.
Der Sortierchip 1 weist zur fluidischen Kontaktierung mehrere Anschlüsse 2–6 auf, wobei die fluidische Kontaktierung der Anschlüsse 2–6 in DE 102 13 272 beschrieben ist, deren Inhalt der vorliegenden Beschreibung zuzurechnen ist.
Der Anschluss 2 des Sortierchips 1 dient zur Aufnahme eines Trägerstroms mit den zu sortierenden biologischen Zellen, während der Anschluss 3 des Sortierchips 1 zur Abführung der ausselektierten biologischen Zellen dient, die auf dem Sortierchip 1 nicht weiter untersucht werden. Die ausselektierten biologischen Zellen können von einer Saugspritze 7 aufgefangen werden, die an den Anschluss 3 des Sortierchips 1 angeschlossen werden kann. Der Ausgang 5 des Sortierchips 1 dient dagegen zur Abführung der interessierenden biologischen Zellen, die anschließend weiter verarbeitet oder untersucht werden können.
Ferner dienen die Anschlüsse 4 und 6 des Sortierchips 1 zur Zuführung eines sogenannten Hüllstroms, der die Aufgabe hat, die selektierten biologischen Zellen zu dem Anschluss 5 des Sortierchips 1 zu führen. Hinsichtlich der Funktionsweise des Hüllstroms wird auf die deutsche Patentanmeldung DE 100 05 735 verwiesen, so dass im folgenden auf eine detaillierte Beschreibung der Funktionsweise des Hüllstroms verzichtet werden kann.
Die Anschlüsse 4 und 6 des Sortierchips sind über zwei Hüllstromleitungen 8, 9, ein Y-Stück 10 und ein Vier-Wege-Ventil 11 mit einem Druckbehälter 12 verbunden, in dem sich ein Kultivierungsmedium für den Hüllstrom befindet.
Der Druckbehälter 12 wird über eine Druckluftleitung 13 unter Überdruck gesetzt, so dass die in dem Druckbehälter 12 befindliche Pufferlösung (z.B. ein Kultivierungsmedium) bei einer entsprechenden Stellung des Vier-Wege-Ventils 11 über das Y-Stück 10 und die Hüllstromleitungen 8, 9 zu den Anschlüssen 4, 6 des Sortierchips 1 strömt.
Der Hüllstrom kann jedoch alternativ auch über andere Prinzipien als durch den Druckbehälter 12 mit der Pufferlösung realisiert werden, wie beispielsweise mit einer Spritzenpumpe oder einer peristaltischen Pumpe.
Der Anschluss 2 des Sortierchips 1 ist dagegen über eine Trägerstromleitung 14 mit einem Partikelinjektor 15 verbunden.
Stromaufwärts ist der Partikelinjektor 15 über ein T-Stück 16 mit einer Trägerstromspritze 17 verbunden, die maschinell angetrieben wird und einen vorgegebenen Flüssigkeitsstrom eines Trägerstroms injiziert.
Darüber hinaus ist das T-Stück 16 stromaufwärts über ein weiteres Vier-Wege-Ventil 18 und eine Hüllstromleitung 19 mit einem Drei-Wege-Ventil 20 verbunden. Das Drei-Wege-Ventil 20 ermöglicht eine Spülung der Hüllstromleitungen 8, 9 sowie der Trägerstromleitung 14 vor dem eigentlichen Betrieb.
Hierzu ist das Drei-Wege-Ventil 20 stromaufwärts über eine Peristaltikpumpe 21 mit drei Drei-Wege-Ventilen 22.1–22.3 verbunden, an die jeweils ein Spritzenreservoir 23.1–23.3 an geschlossen ist. Die Spritzenreservoire 23.1–23.3 dienen hierbei zur Zuführung eines Füllstroms zum Spülen des gesamten Fluidiksystems vor dem eigentlichen Betrieb, wobei das Spritzenreservoir 23.1 z.B. 70% Ethanol enthält, während das Spritzenreservoir 23.2 als Füllstromsubstanz vorzugsweise Aqua destillata enthält. Das Spritzenreservoir 23.3 enthält z.B. eine Pufferlösung als Füllstromsubstanz.
Ferner weist der Zellsortierer einen Auffangbehälter 27 für überschüssigen Hüllstrom sowie einen Auffangbehälter 28 für überschüssigen Füllstrom auf.
Im folgenden wird zunächst der Spülvorgang beschrieben, der vor dem eigentlichen Betrieb des Zellsortierers durchgeführt wird, um die Hüllstromleitung 8, 9, die Trägerstromleitung 14 und das restliche Fluidiksystem des Zellsortierers von Luftblasen und Verunreinigungen zu befreien.
Hierzu wird zunächst das Drei-Wege-Ventil 22.1 geöffnet und Ethanol von dem Spritzenreservoir 23.1 als Füllstrom eingespritzt, wobei das Ethanol von der Peristaltikpumpe 21 zunächst zu dem Drei-Wege-Ventil 20 gefördert wird. Das Ethanol dient sowohl zur Reduzierung der Keimzahl im System (für das Einrichten eines aseptischen Analyse- und Selektionsprozesses), als auch zur vollständigen Verdrängung der Luft aus dem fluidischen System.
Während des Spülvorgangs ist das Drei-Wege-Ventil 20 so eingestellt, dass ein Teil des von der Peristaltikpumpe 21 geförderten Füllstroms über die Füllstromleitung 19 weiter geleitet wird, während der restliche Teil des von der Peristaltikpumpe 21 geförderten Füllstroms zu dem Vier-Wege-Ventil 11 gelangt. Die beiden Vier-Wege-Ventile 11, 18 sind wiederum so eingestellt, dass der Füllstrom durch die Hüllstromleitun gen 8, 9 und die Trägerstromleitung 14 durchgeleitet wird. Weiterhin fliesst Kultivierungsmedium aus dem Druckbehälter 12 in den Auffangbehälter 27, um die Leitungen kurz zu fluten.
Nach der vorstehend beschriebenen Spülung des Zellsortierers mit Ethanol erfolgt in der gleichen Weise eine Spülung mit Aqua destillata bzw. Pufferlösung, wobei jeweils die Drei-Wege-Ventile 22.2 bzw. 22.3 geöffnet werden.
Bei dem vorstehend beschriebenen Spülvorgang kann überschüssiger Füllstrom von dem Vier-Wege-Ventil 18 in den Auffangbehälter 28 abgeleitet werden.
Nach dem Spülvorgang werden die Drei-Wege-Ventile 22.1–22.3 geschlossen und die Peristaltikpumpe 21 abgeschaltet.
Zur Einleitung des Sortierbetriebs wird das Vier-Wege-Ventil 11 so eingestellt, dass der Druckbehälter 12 mit dem Y-Stück 10 verbunden wird, so dass das in dem Druckbehälter 12 befindliche Kultivierungsmedium aufgrund des in dem Druckbehälter 12 herrschenden Überdrucks in die Hüllstromleitungen 8, 9 gedrückt wird.
Weiterhin wird während des Sortierbetriebs das Vier-Wege-Ventil 18 so eingestellt, dass keine Strömungsverbindung zwischen dem T-Stück 16 und dem Vier-Wege-Ventil 18 besteht.
Der von der Trägerstromspritze 17 eingespritzte Trägerstrom fließt dann über das T-Stück 16 in den Partikelinjektor 15, wobei durch eine weitere Injektionsspritze 29 biologische Zellen in den Trägerstrom eingespritzt werden. Anschließend fließt der Trägerstrom mit den injizierten biologischen Zel len von dem Partikelinjektor 15 über die Trägerstromleitung 14 zu dem Anschluss 2 des Sortierchips.
Weiterhin ist zu erwähnen, dass an dem Partikelinjektor 15 ein Temperatursensor 30 angebracht ist, um die Temperatur T des Partikelinjektors 15 zu messen.
Darüber hinaus befindet sich sowohl an dem Partikelinjektor 15 als auch an der Aufnahme für den Sortierchip 1 ein Temperierelement 31 in Form eines Peltier-Elements, um den Partikelinjektor 15 und den Sortierchip 1 beheizen oder abkühlen zu können.
Die Heiz- bzw. Kühlenergie Q wird hierbei von einem Temperaturregler 32 vorgegeben, der eingangsseitig mit dem Temperatursensor 30 verbunden ist und die Temperatur T des Partikelinjektors 15 auf einen vorgegebenen Sollwert einregelt.
Im folgenden wird nun unter Bezugnahme auf 2 ein Trägerstromkanal 33 beschrieben, der in dem Sortierchip 1 des Zellsortierers angeordnet ist und in zwei Ausgangsleitungen 34, 35 verzweigt, wobei die Ausgangsleitung 34 mit dem Anschluss 5 des Sortierchips 1 verbunden ist und zur Weiterleitung der positiv selektierten Partikel dient, während die Ausgangsleitung 35 mit dem Anschluss 3 des Sortierchips 1 verbunden ist und zum Abführen der ausselektierten Partikel dient.
In dem Trägerstromkanal 33 ist stromabwärts hinter dem Anschluss 2 des Sortierchips 1 eine trichterförmige dielektrophoretische Elektrodenanordnung 36 angeordnet, welche die Aufgabe hat, die in dem Trägerstrom suspendierten Partikel in dem Trägerstromkanal 33 hintereinander aufzureihen. Der genaue technische Aufbau und die Funktionsweise der Elektrodenanordnung 36 ist in der eingangs erwähnten Veröffentlichung von Müller, T. et al. beschrieben, deren Inhalt der vorliegenden Beschreibung zuzurechnen ist, so dass im folgenden auf eine detaillierte Beschreibung der Elektrodenanordnung 36 verzichtet werden kann.
Stromabwärts hinter der Elektrodenanordnung 36 ist in dem Trägerstromkanal 33 ein dielektrophoretischer Käfig 37 angeordnet, der es ermöglicht, die in dem Trägerstrom 33 suspendierten Partikel zu fangen und für eine eingehende Untersuchung zu fixieren. Hinsichtlich des Aufbaus und der Funktion des dielektrophoretischen Käfigs 37 wird ebenfalls auf die eingangs zitierte Veröffentlichung von Müller, T. et al. verwiesen, so dass diesbezüglich auf eine detaillierte Beschreibung verzichtet werden kann.
In einem Verzweigungsbereich des Trägerstromkanals 33 stromabwärts hinter dem dielektrophoretischen Käfig 37 befindet sich eine Sortiereinrichtung, die aus einer dielektrophoretischen Elektrodenanordnung 38 besteht, wobei hinsichtlich des Aufbaus und der Funktionsweise der Elektrodenanordnung 38 ebenfalls auf die eingangs zitierte Veröffentlichung von Müller, T. et al. verwiesen wird. Die Elektrodenanordnung 38 sortiert die in dem Trägerstrom suspendierten Partikel entweder in die Ausgangsleitung 34 oder in die Ausgangsleitung 35, wobei die Selektion in Abhängigkeit von einer an den in dem Käfig 37 fixierten Partikeln durchgeführten Hauptuntersuchung erfolgt, wie noch detailliert beschrieben wird.
Ferner ist im Verzweigungsbereich der Trägerstromleitung 33 eine Strömungsleiteinrichtung angeordnet, die ebenfalls aus einer dielektrophoretischen Elektrodenanordnung 39 besteht und die Aufgabe hat, eine Rückströmung von Partikeln aus der Ausgangsleitung 35 in die Ausgangsleitung 34 zu verhindern.
Hierzu ist die Elektrodenanordnung 39 v-förmig ausgebildet und weist zwei Schenkel auf, wobei der eine Schenkel der Elektrodenanordnung 39 in die Ausgangsleitung 34 hinein ragt, während der andere Schenkel der Elektrodenanordnung 39 in die Ausgangsleitung 35 hineinragt.
Im folgenden wird nun anhand der 2 und 3 beschrieben, wie die in dem Trägerstrom suspendierten Partikel in dem Sortierchip 1 untersucht werden.
Im Rahmen einer Voruntersuchung der Partikel erfolgt zunächst eine Durchlichtmessung in einem Untersuchungsfenster ROI1 (region of interest 1) sowie eine Fluoreszenzmessung in einem weiteren Untersuchungsfenster ROI2 (region of interest 2) wobei das Untersuchungsfenster ROI1 in dem Trägerstromkanal 33 stromaufwärts vor dem Untersuchungsfenster ROI2 für die Fluoreszenzmessung angeordnet ist.
Sowohl die Durchlichtmessung als auch die Fluoreszenzmessung erfolgt hierbei durch die in 3 schematisch dargestellte Detektionseinheit D, die zur Bilderfassung eine CCD-Kamera 40 aufweist, die unterhalb des Sortierchips 1 angeordnet und auf einen Umlenkspiegel 41 ausgerichtet ist.
Oberhalb des Sortierchips 1 ist als Lichtquelle für die Durchlichtmessung eine Leuchtdiode 42 angeordnet, wobei sich zwischen der Leuchtdiode 42 und dem Sortierchip 1 ein Kondensor 43 befindet, der beispielsweise eine Phasenkontrastblende aufweisen kann.
Unterhalb des Sortierchips 1 ist im Strahlengang des Kondensors 43 ein Objektiv 44 angeordnet.
Bei der Durchlichtmessung nimmt die CCD-Kamera 40 also über den Umlenkspiegel 41 und das Objektiv 44 ein Bild des Untersuchungsfensters ROI1 auf.
Weiterhin weist die Detektionseinheit D mehrere elektromotorische Stellglieder 45.1–45.3 auf, die eine Verstellung des Objektivs 44, des Filterblocks 47 bzw. des Umlenkspiegels 41 ermöglichen. Die Verstellung des Objektivs 44 ermöglicht hierbei eine Änderung der Vergrößerung und des Fokus. Der Filterblock 47 kann dagegen verstellt werden, um unterschiedliche Filter auszuwählen. Die Verstellung des Umlenkspiegels 41 hat dagegen den Zweck, das Sehfeld entlang dem Trägerstromkanal 33 zu verschieben, um etwaige Ablagerungen in dem Trägerstromkanal 33 erkennen zu können.
Zur Fluoreszenzanregung bei der Fluoreszenzmessung weist die Detektionseinheit D eine Lichtquelle 46 (z.B. ein Laser) auf, die über einen Filterblock 47 eine Fluoreszenzanregung der in der Trägerstromleitung 33 suspendierten biologischen Zellen ermöglicht, wobei die CCD-Kamera 40 ein entsprechendes Fluoreszenzbild aufnimmt.
Im folgenden werden anhand von 4 die unterschiedlichen Erscheinungsformen biologischer Zellen in dem Durchleuchtungsbild beschrieben. So zeigt die Darstellung in 4 im oberen Bereich eine lebende Zelle 48 sowie eine tote Zelle 49 und im unteren Bereich die zugehörigen Intensitätsverläufe 50, 51 in dem Durchleuchtungsbild. Daraus ist erkennbar, dass die lebende Zelle 48 einen relativ dunklen Kern aufweist, wohingegen die tote Zelle 49 im Inneren gleichmäßig ausgeleuchtet ist, was eine Unterscheidung der lebenden Zelle 48 von der toten Zelle 49 ermöglicht, wie noch detailliert beschrieben wird.
Im folgenden wird nun anhand des in den 5a bis 5e dargestellten Flußdiagramms das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren beschrieben.
Zu Beginn des Verfahrens werden zunächst die Trägerstromleitung 14 und die Hüllstromleitungen 8, 9 mit einer 70%-igen Ethanollösung, anschließend mit Aqua destillata und schließlich mit einer Pufferlösung gespült, um das Fluidiksystem des Zellsortierers zu reinigen und insbesondere von Luftblasen und Verschmutzungen zu befreien.
Anschließend wird dann aus der Trägerstromspritze 17 der Trägerstrom in die Trägerstromleitung 14 eingespritzt, wobei nach der Zufuhr des Hüllstroms wie nachfolgend beschrieben die zu untersuchenden biologischen Zellen von der Injektionsspritze 29 an dem Partikelinjektor 15 in den Trägerstrom eingespritzt werden.
Weiterhin wird das in dem Druckbehälter 12 befindliche Kultivierungsmedium für den Hüllstrom durch die über die Druckluftleitung 13 zugeführte Druckluft aus dem Druckbehälter 12 heraus in die Hüllstromleitungen 8, 9 gedrückt, die in die Anschlüsse 4 bzw. 6 des Sortierchips 1 münden und die Weiterleitung der in dem Sortierchip 1 selektierten Partikel über den Anschluss 5 des Sortierchips 1 unterstützen.
In dem Trägerstromkanal 33 des Sortierchips 1 werden die suspendierten Partikel zunächst durch die Elektrodenanordnung 36 in Strömungsrichtung hintereinander aufgereiht, wie schematisch durch einen gestrichelten Pfeil angedeutet ist.
Anschließend werden in dem Untersuchungsfenster ROI1 zeitlich hintereinander mehrere Phasenkontrastbilder B₁, ..., B_n aufgenommen, um die Bewegungsgeschwindigkeit der suspendierten Partikel zu ermitteln und lebende von toten Zellen zu unterscheiden, wie nachfolgend detailliert beschrieben wird.
Zur Bestimmung der Bewegungsgeschwindigkeit der suspendierten Partikel wird für jedes der Phasenkontrastbilder B₁, ..., B_n jeweils ein Intensitätssignal I₁, ..., I_n ermittelt, indem die Bildintensität in den Phasenkontrastbildern B₁, ..., B_n spaltenweise d.h. rechtwinklig zur Strömungsrichtung, aufintegriert wird. Die einzelnen Intensitätssignale I₁, ...,I_n weisen also jeweils an der Stelle einer biologischen Zelle eine Signalspitze auf, wobei sich eine Signalspitze zwischen den Intensitätssignalen I₁, ..., I_n entsprechend der Bewegungsgeschwindigkeit der Zellen und dem zeitlichen Abstand zwischen den Intensitätssignalen I₁, ...I_n verschiebt.
Anschließend wird für zeitlich aufeinander folgende Intensitätssignale I_i, I_i+1 jeweils eine Kreuzkorrelationsfunktion φ_i berechnet. Die Berechnung der Kreuzkorrelationsfunktion φ_i dient zur Bestimmung der Bewegungsgeschwindigkeit der Zellen in dem Trägerstromkanal 33 des Sortierchips 1, damit der dielektrophoretische Käfig 37 im richtigen Zeitpunkt angesteuert werden kann, um eine bestimmte Zelle zu fangen.
Anschließend werden für die einzelnen Kreuzkorrelationsfunktionen φ_i(x) in Abhängigkeit von der Verschiebung x in Längsrichtung des Trägerstromkanals 33 die Maxima berechnet.
Die Bewegungsgeschwindigkeit v der Zellen in dem Trägerstromkanal 33 ergibt sich daraus als Quotient aus dem Mittelwert der Maxima der Kreuzkorrelationsfunktionen und dem zeitlichen Abstand zwischen den aufeinander folgenden Phasenkontrastbildern B₁, ...B_n.
Die Bewegungsgeschwindigkeit v der Zellen kann im Rahmen einer Rückkopplung zur Pumpensteuerung verwendet werden, d.h. zur Kontrolle, ob berechnete und tatsächliche Pumprate übereinstimmen und wie ggf. nachgeregelt werden muss. Insbesondere kann anhand der Bewegungsgeschwindigkeit v erkannt werden, ob es Störungen im System gibt, aufgrund derer die Zellen zu langsam fliessen (Verstopfung), stehenbleiben oder sogar rückwärts fliessen. Alle diese Störungen können so erkannt und behoben werden, z.B, durch Spülen des Systems.
Darüber hinaus liefert die Signalform der Intensitätssignale I₁, ..., I_n Informationen über die Größe der Partikel und eine etwaige Aggregatbildung. Insgesamt ist die Auswertung der Intensitätssignale wichtig für die Steuerung und Automatisierung der gesamten Anlage, nämlich der Pumpen, der dielektrophoretischen Elektrodenelemente (z.B. wann erfolgt "Caging" und wann "Switching"), der detaillierten Bildaufnahme in dem Käfig 37 und der Probenablage.
Im folgenden wird nun der in 5c beschriebene Verfahrensabschnitt erläutert, in dem eine Unterscheidung von toten und lebenden Zellen erfolgt. Hierzu werden jeweils Zellrandpunkte x_l, x_r ermittelt, bei denen die Intensität in dem Phasenkontrastbild einen vorgegebenen Grenzwert I_TH überschreitet.
Anschließend wird überprüft, ob sich zwischen den Zellrandpunkten x_l, x_r ein Intensitätsminimum befindet. Falls dies der Fall ist und eine Mindestintensität vorhanden ist, so handelt es sich bei der Zelle um eine lebende Zelle, wie aus 4 ersichtlich ist. Andernfalls wird die Zelle dagegen als tot klassifiziert, um nachfolgend eine entsprechende Selektion vorzunehmen, wie noch detailliert beschrieben wird.
Nach der vorstehend beschriebenen Unterscheidung von toten und lebenden Zellen wird in dem Verfahrensabschnitt in 5d die Leuchtdichte L der einzelnen Zellen ermittelt, indem die Intensität I einer Zelle zwischen den Zellrandgruppen x_l und x_r aufintegriert wird.
Anschließend wird die so ermittelte Leuchtdichte L der Zelle mit einem Minimalwert L_min und einem Maximalwert L_max verglichen.
Falls sich die ermittelte Leuchtdichte der Zelle innerhalb dieses Fensters befindet, so wird die Durchlichtbeleuchtung ausgeschaltet und die Fluoreszenzanregung durch die Lichtquelle 46 eingeschaltet. Anschließend wird dann ein Fluoreszenzbild in dem Untersuchungsfenster ROI2 aufgenommen und die Fluoreszenz I_F der Zelle gemessen.
Falls die gemessene Fluoreszenz I_F der Zelle einen vorgegebenen Grenzwert I_min überschreitet, so deutet dies darauf hin, dass die betreffende Zelle einen Fluoreszenzmarker trägt. Falls die gemessene Fluoreszenz I_F dagegen den vorgegebenen Grenzwert I_min unterschreitet, so kann davon ausgegangen werden, dass die betreffende Zelle keinen Fluoreszenzmarker trägt.
In dem in 5e dargestellten Verfahrensabschnitt werden dann bestimmte Zellen selektiert, wobei die Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen sowie die Überprüfung auf einen Fluoreszenzmarker berücksichtigt wird. Beispielsweise können solche Zellen selektiert werden, die lebend sind und einen Fluoreszenzmarker tragen, wohingegen andere Zellen ausselektiert werden.
Die auf diese Weise selektierten Zellen werden dann in dem dielektrophoretischen Käfig 37 gefangen und dadurch fixiert, so dass anschließend eine Hauptuntersuchung der gefangenen Zelle mit einer höheren Auflösung und einer größeren Belichtungszeit möglich ist.
Die selektierten Zellen, d.h. in der Regel die lebenden und mit einem Fluoreszenzmarker versehenen Zellen werden dann von der Elektrodenanordnung 38 in die Ausgangsleitung 34 weitergelassen, wohingegen die ausselektierten Zellen (z.B. tote Zellen) in die Ausgangsleitung 35 befördert werden.
Bei der Hauptuntersuchung kann es sich um Bilder mit Fluoreszenzanregung handeln, wobei eine oder mehrere Anregungswellenlängen gleichzeitig oder zeitlich versetzt zum Einsatz kommen. Hierzu werden in dem Filterblock 47 geeignete dichroitische Spiegel verwendet. Dabei wird das Fluoreszenzlicht von einer oder mehreren Wellenlängen gleichzeitig auf eine oder mehrere Kameras geleitet. Hierzu werden geeignete Emissions-Filtereinsätze in dem Filterblock 47 oder auch geeignete Emissions-Splitter verwendet. So ist es möglich, gleichzeitig oder hintereinander weg Bilder bei mehreren Fluoreszenzfarben von der selektieren Zelle zu erzeugen. Weiterhin ist es möglich, ein Bild der selektierten Zelle bei einer Weisslicht-Phasenkontrastbeleuchtung zu erzeugen. Dies ist erforderlich, um festzustellen, ob an einer fluoreszenzmarkierten Zelle noch eine oder mehrere nicht fluoreszenzmarkierte Zellen anhaften, was zu einer – in der Regel unerwünschten – Verunreinigung dieser einen fluoreszenzmarkierten Zelle führt.

Claims

Untersuchungsverfahren für Partikel (48, 49), insbesondere für biologische Partikel (48; 49), mit den folgenden Schritten: – Einbringung der zu untersuchenden Partikel (48, 49) in einen Trägerstrom eines mikrofluidischen Systems, so dass die Partikel in dem Trägerstrom suspendiert sind, – Durchführung mindestens einer ersten Untersuchung der sich mit dem Trägerstrom bewegenden suspendierten Partikel (48, 49), – Selektion mindestens eines suspendierten Partikels (48, 49) in Abhängigkeit von dem Ergebnis der ersten Untersuchung, – Abbremsen des selektierten suspendierten Partikels (48, 49), – Durchführung mindestens einer zweiten Untersuchung des selektierten suspendierten Partikels (48, 49) im abgebremsten Zustand.
Untersuchungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der selektierte Partikel (48, 49) in Abhängigkeit von dem Ergebnis der zweiten Untersuchung sortiert und/oder behandelt wird.
Untersuchungsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der ersten Untersuchung und/oder im Rahmen der zweiten Untersuchung eine Durchlichtmessung und/oder eine Fluoreszenzmessung erfolgt.
Untersuchungsverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchlichtmessung in einem ersten Untersu chungsfenster (ROI1) und die Fluoreszenzmessung in einem zweiten Untersuchungsfenster (ROI2) durchgeführt wird, wobei die beiden Untersuchungsfenster (ROI1, ROI2) räumlich voneinander getrennt sind.
Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der ersten Untersuchung mindestens ein optisches Bild der Partikel (48, 49) aufgenommen wird.
Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der ersten Untersuchung eine elektrische Analyse durchgeführt wird.
Untersuchungsverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der ersten Untersuchung eine Impedanzanalyse durchgeführt wird.
Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (48, 49) bei der ersten Untersuchung und/oder bei der zweiten Untersuchung morphologisch und/oder hinsichtlich ihrer Größe untersucht werden.
Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der ersten Untersuchung überprüft wird, ob die Partikel (48, 49) in dem Trägerstrom jeweils aus einer einzelnen biologischen Zelle oder aus mehreren biologischen Zellen bestehen, wobei solche Partikel (48, 49) für die zweite Untersuchung selektiert werden, die aus einer einzigen biologischen Zelle bestehen.
Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der ersten Untersu chung überprüft wird, ob die Partikel (48, 49) in dem Trägerstrom lebende Zellen (48) oder tote Zellen (49) sind.
Untersuchungsverfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der ersten Untersuchung eine Durchlichtmessung der Partikel (48, 49) erfolgt, wobei ein optisches Bild der Partikel (48, 49) aufgenommen und die Intensitätsverteilung (50, 51) in dem Bild der Partikel (48, 49) ausgewertet wird.
Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der ersten Untersuchung durch eine Fluoreszenzmessung überprüft wird, ob die Partikel (48, 49) in dem Trägerstrom eine bestimmte Schwelle für einen Fluoreszenzmarker überschreiten.
Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der durch die erste Untersuchung selektierte Partikel (48, 49) zum Abbremsen in einem Feldkäfig (37) fixiert und/oder der Trägerstrom verlangsamt wird.
Untersuchungseinrichtung zur Untersuchung von Partikeln (48, 49), insbesondere von biologischen Partikeln (48, 49), mit – einem mikrofluidischen System mit – einem Trägerstromkanal (33) zur Aufnahme eines Trägerstroms mit den darin suspendierten Partikeln (48, 49), – einer ersten Messstation (ROI1) zur Durchführung einer ersten Untersuchung der sich mit dem Trägerstrom bewegenden suspendierten Partikel (48, 49), – einer Selektionseinheit (37) zur Selektion von suspendierten Partikeln in Abhängigkeit von dem Ergebnis der ersten Untersuchung, wobei die Selektionseinheit (37) eine Bremseinrichtung (37) zum Abbremsen der selektierten suspendierten Partikel (48, 49) aufweist, – sowie mit einer zweiten Messstation (ROI2) zur Durchführung einer zweiten Untersuchung der selektierten suspendierten Partikel (48, 49) im abgebremsten Zustand.
Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Messstation (ROI2) stromabwärts hinter der ersten Messstation (ROI1) angeordnet ist.
Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass stromabwärts hinter der zweiten Messstation (ROI2) eine Behandlungseinrichtung und/oder eine Sortiereinrichtung (38) angeordnet ist, um die selektierten Partikel (48, 49) in Abhängigkeit von dem Ergebnis der ersten und/oder der zweiten Untersuchung zu behandeln und/oder zu sortieren.
Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerstromkanal (33) stromabwärts hinter der zweiten Messstation (ROI2) in mindestens zwei , Strömungskanäle (34, 35) verzweigt ist, wobei die Sortiereinrichtung (38) im Verzweigungsbereich des Trägerstromkanals (33) angeordnet ist.
Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Sortiereinrichtung (38) eine dielektrische Weiche aufweist, die im Verzweigungsbereich des Trägerstromkanals (33) angeordnet ist.
Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass im Verzweigungsbereich des Trägerstromkanals (33) eine Strömungsleiteinrichtung (39) angeord net ist, um eine Rückströmung des Trägerstroms und/oder der Partikel (48, 49) von einem der beiden Strömungskanäle (34, 35) in den anderen Strömungskanal (34, 35) zu verhindern.
Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Strömungsleiteinrichtung (39) eine Elektrode aufweist.
Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrode der Strömungsleiteinrichtung (30) im wesentlichen v-förmig ausgebildet ist und zwei Schenkel aufweist, die sich im wesentlichen in Richtung der beiden abzweigenden Strömungskanäle (34, 35) erstrecken.
Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Bremseinrichtung (37) einen dielektrischen Käfig aufweist.
Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Trägerstromkanal (33) stromaufwärts vor der ersten Messstation (ROI1) Fokussierelektroden (36) angeordnet sind.
Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Messstation (ROI1) und/oder die zweite Messstation (ROI2) zur Aufnahme eines Bildes eine Optik (44) aufweist.
Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Optik (44) beweglich ist, um das Bild zumindest entlang des Trägerstromkanals (33) zu verschieben.
Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Optik (44) zur Bildverschiebung mit einem elektro-mechanischen Stellglied (45) verbunden ist.
Verwendung einer Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 26 in der medizinischen und/oder pharmazeutischen Forschung und/oder in der Diagnostik und/oder in der forensischen Medizin.
Verwendung einer Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 26 zur Separation verschiedener Zelltypen voneinander, wie insbesondere apoptischer und nekrotischer Zellen, Zellen mit unterschiedlichen Expressionsmustern und/oder Stammzellen.