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Stand der Technik
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In
einem Laser-Scanning-System werden Laser unterschiedlicher Leistungsklassen
verwendet. Weiterhin ist ein Laser-Scanning-System durch eine große
Anzahl von variablen Modulen gekennzeichnet, die als Detektor oder
zur Beleuchtung dienen. In 1 ist schematisch
ein Strahlengang eines Laser-Scanning-Mikroskops dargestellt.
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Ein
LSM gliedert sich im Wesentlichen wie in
1 dargestellt
in 4 Module: Lichtquelle, Scanmodul, Detektionseinheit und Mikroskop.
Diese Module werden im Folgenden näher beschrieben. Es
wird zusätzlich auf
DE19702753A1 verwiesen. Zur spezifischen
Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat
werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen
eingesetzt. Die Wahl der Anregungswellenlänge richtet sich
nach den Absorptionseigenschaften der zu untersuchenden Farbstoffe.
Der Anregungsstrahlung wird im Lichtquellenmodul erzeugt. Zum Einsatz
kommen hierbei verschiedene Laser (Argon, Argon Krypton, TiSa-Laser).
Weiterhin erfolgt im Lichtquellenmodul die Selektion der Wellenlängen
und die Einstellung der Intensität der benötigten
Anregungswellenlänge, z. B. durch den Einsatz eines akusto-optischen
Kristalls. Anschließend gelangt die Laserstrahlung über
eine Faser oder eine geeignete Spiegelanordnung in das Scanmodul.
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Die
in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs
beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scanoptik und die
Tubuslinse in das Präparat fokussiert. Der Fokus rastert
punktförmig die Probe in x-y-Richtung ab. Die Pixelverweilzeiten
beim Scannen über die Probe liegen meist im Bereich von
weniger als einer Mikrosekunde bis zu einigen 100 Mikrosekunden.
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Bei
einer konfokalen Detektion (descanned Detection) des Fluoreszenzlichtes,
gelangt das Licht das aus der Fokusebene (Specimen) und aus den darüber-
und darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner
auf einen dichroitischen Strahlteiler (MD). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom
Anregungslicht.
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Anschließend
wird das Fluoreszenzlicht auf eine Blende (konfokale Blende/Pinhole)
fokussiert, die sich genau in einer zur Fokusebene konjugierten Ebene
befindet. Dadurch werden Fluoreszenzlichtanteile außerhalb
des Fokus unterdrückt. Durch Variieren der Blendengröße
kann die optische Auflösung des Mikroskops eingestellt
werden. Hinter der Blende befindet sich ein weiterer dirchroitischer
Blockfilter (EF) der nochmals die Anregungsstrahlung unterdrückt.
Nach Passieren des Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht mittels
eines Punktdetektors (PMT) gemessen.
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Bei
Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der
Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen an dem die Anregungsintensität
besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich größer
als der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen Anordnung. Der
Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die Detektion
kann direkt nach dem Objektiv erfolgen (non descannte Detektion).
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In
einer weiteren Anordnung zur Detektion einer durch Mehrphotonenabsorption
angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin eine descannte Detektion,
jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives in die Detektionseinheit
abgebildet (nichtkonfokal descannte Detektion).
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Von
einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch beide Detektionsanordnungen
in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen bzw. Mehrphotonen-Absorption
nur die Ebene (optischer Schnitt) wiedergegeben, die sich in der
Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die Aufzeichnung mehrerer
optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen Tiefen z der
Probe kann anschließend rechnergestützt ein dreidimensionales
Bild der Probe generiert werden. Das LSM ist somit zur Untersuchung von
dicken Präparaten geeignet. Die Anregungswellenlängen
werden durch den verwendeten Farbstoff mit seinen spezifischen Absorptionseigenschaften bestimmt.
Auf die Emissionseigenschaften des Farbstoffes abgestimmte dichroitische
Filter stellen sicher, dass nur das vom jeweiligen Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht
vom Punktdetektor gemessen wird.
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In
biomedizinischen Applikationen werden zur Zeit mehrere verschiedene
Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffe gleichzeitig markiert
(Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit
den Stand der Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften
oder Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Dazu
erfolgt eine zusätzliche Aufspaltung des Fluoreszenzlichts
von mehreren Farbstoffen mit den Nebenstrahlteilern (DBS) und eine
getrennte Detektion der einzelnen Farbstoffemissionen in getrennten Punktdetektoren
(PMT x).
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Das
LSM LIVE der Carl Zeiss Micolmaging GmbH realisiert einen sehr schnellen
Linienscanner mit einer Bilderzeugung um 120 Bildern pro Sekunde
(http://www.zeiss.de/c12567be00459794/Contents-Frame/fd9fa0090eee01a641256a550036267b).
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Nachdem
in den 80er und 90er Jahren in der biomedizinischen Forschung im
Wesentlichen Strukturaufklärung betrieben wurde, steht
mittlerweile die Evaluierung von Funktionen und Mechanismen biologischer
Systeme im Vordergrund.
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Zunehmend
erstreckt sich dieser Trend auch auf die Wirkstoffforschung der
Pharmaindustrie, in der durch Einbringung von Substanzen die Reaktion biologischer
Testsysteme beobachtet wird (Drug Discovery & Toxikologie).
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Diese
Verfahren, sowohl in der Wissenschaft als auch in der Industrie,
haben einen zunehmenden Bedarf, ihre Aussagen statistisch zu hinterlegen
um verlässlichere Aussagen machen zu können. Ersichtlich
ist diese Entwicklung z. B. an neuen Gerätetypen mit hohem
Durchsatz in der optischen Bildgebung, wie High-Content Screener.
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Ein
weiterer Trend ist die Fokussierung von einfachen Lösungsmessungen
auf immer detailliertere Messungen, wie die statistische Betrachtung
einzelner Zellenevents (Beispiele: Entwicklung der Intentsitäts-Durchflußzytometrie
zur bildgebenden Durchflußzytometrie oder High-Throughput
Screening (HTS) zu High-Content-Screening (HCS)).
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Um
die nötigen Bildaufnahmen aufzunehmen und auszuwerten,
wird eine Reihe von Programmen verwendet. Die derzeitige Engstelle
befindet sich jedoch in der automatisierten Bildaufnahme. Die zumeist
komplexen Themenstellungen lassen sich nicht oder nur unzureichend
mit einfachen Mitteln lösen.
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In
optischen Verfahren (e. g. Mikroskopie) werden Bilder zumeist nach
folgendem Muster aufgenommen (teilweise werden nicht alle Punkte
benötigt):
- 1. Platzierung der Probe
auf dem Instrument
Probe kann manuell oder automatisch (Roboter) platziert
werden
- 2. Bestimmung der interessanten Regionen oder Betrachtung der
gesamten Probe. Die Definition der interessanten Regionen kann über
die folgenden Parameter erfolgen: manuelle Bestimmung (Positionierung), Übersichtsscan
(Preview), Benutzung gespeicherter Positionsdaten (bei bekannten
oder wiederkehrenden Objektpositionen), automatische Definition
interessanter Regionen mittels simpler Algorithmen (z. B. Threshold beim
MIRAX SCAN der Firma Carl Zeiss)
- 3. Eingabe der Bildaufnahmeparameter bzw. Definition der aufzunehmenden
Region(en) manuell oder mittels einfachster Algorithmen
- 4. Eventuell Definition von Manipulationsparametern (Injektion,
FRAP, FLIP) Bisher werden Manipulationen nur manuell oder automatisch
an genau definierten Punkten durchgeführt
- 5. Aufnahme des/der Bilder
- 6. Auswertung der Bilder über manuelle oder automatische
Bildverarbeitung, im Wesentlichen werden Pixel-basierte Auswerteverfahren
benutzt.
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Es
gibt Anwendungsgebiete in der optischen Bildgebung bei denen simple
Objekterkennung bereits zur Bildaufnahme benutzt wird. Diese sind
insbesondere Lebendanwendungen, wie z. B. Objekt-Tracking: Nachverfolgen
von Objekten (e. g. Zellen) in Zeitexperimenten (time-lapse experiments), (Journal
of Microscopy, Vol. 216, Pt 2 November 2004, pp. 131–137,
Lösung basierend auf Schwerpunktsalgorithmus.
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Hierarchische
Auswertealgorithmen zur Segmentierung der Bilddaten bzw. Bildobjekte
bei Satellitenaufnahmen sind aus
US
6,832,002 bekannt.
DE103 32 060A1 beschreibt ein Verfahren zum
Betrieb eines Laser-Scanning-Mikroskops, wobei mindestens zwei detektierte
Bilder oder Bildbereiche miteinander verglichen werden und zeitliche
und/oder örtliche Veränderungen der Farbe und/oder
der Intensität zur Bildung von Steuersignalen für
die Beleuchtung und/oder Detektion und/oder Scanneransteuerung und/oder
weiterer einstellbarer Mikroskopkomponenten führen.
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DE10 2004 034 963 beschreibt
ein Verfahren zur bildlichen Erfassung von Objekten mittels eines Lichtrastermikroskops
wobei eine Abtastung einer Probe zur Erzeugung eines Probenbildes
in Abtastschritten erfolgt und der Abstand zwischen mindestens zwei
Abtastschritten variabel einstellbar ist und mindestens eine zweite
Abtastung der Probe erfolgt, bei dem die Lage der Abtastschritte
zur Abtastrichtung versetzt wird,
wobei durch Erhöhung
des Abstands eine Verringerung der optischen Auflösung
erfolgt.
und über Eingabemittel für eine
Bedienperson das Verhältnis von räumlicher und
zeitlicher Auflösung anhand der Einstellung verändert
wird.
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DE 19829981C2 beschreibt
die Bildung von «regions of interest» (ROI, interessierende
Gebiete), indem das Laserlicht während der Bildaufnahme
in seiner Intensität und/oder in seiner spektralen Zusammensetzung
verändert wird und in einer Scanzeile nebeneinander liegende
Probenorte mit Laserlicht unterschiedlicher Intensität
und/oder unterschiedlicher spektraler Zusammensetzung beaufschlagt werden.
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Die
Erfindung betrifft die vorteilhafte Verwendung der hierarchischen
Objekterkennung, in einem Mikroskop, insbesondere einem Laser-Scanning-Mikroskop,
besonders vorteilhaft zur Erkennung von morphologischen Veränderungen,
insbesondere in Zellen.
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Zur
Bildauswertung und/oder Manipulation eines mit einem Mikroskop,
insbesondere einem Laser-Scanning-Mikroskop auf genommenen digitalen Bildes,
das Bildobjekte enthält, erfolgt eine hierarchische Bildauswertung
erfolgt, indem mehrere Bildobjektebenen gebildet werden, die jeweils
Objekte mit gemeinsamen Struktureigenschaften aufweisen und nach
Erstellen und Auswertung eines Übersichtsbildes als oberste
Bildobjektebene wird bei Auftreten gemeinsamer Bildobjektkriterien
die Bildobjektebene durch Erhöhung der Bildauflösung,
beispielsweise durch Verkleinerung des Bildfeldes, schrittweise
gewechselt, bis ein Minimum, Maximum oder ein anderer festgelegter
Wert an gemeinsamen (übereinstimmenden) Struktureigenschaften
erreicht ist.
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Vorteilhaft
wird bei Erreichen der untersten Bildobjektebene ein Mess- und/oder
Manipulationsvorgang ein- oder mehrere Male ausgelöst.
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Als
Struktureigenschaft können einzeln oder gemeinsam Form,
Größe, spektrale Zusammensetzung oder eine ausgewählte
Objektbeschaffenheit dienen.
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Für
den Vergleich von Struktureigenschaften können Abweichungen,
vorzugsweise als prozentuale Schwellwerte, festgelegt werden.
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Ein
vorteilhaftes Verfahren besteht darin, nach einem Übersichtsscan
zum Finden von Objekten zu bestimmen, ob das Objekt bestimmten Anforderungen
genügt (beispielsweise Unterscheidung interessanter von
uninteressanten Objekten wie z. B. die Erkennung von Zellen mit
bestimmtem komplexen Expressionsmuster), automatisiert auf interessante
Objekte zu fokussieren und interessante Objekte und/oder interessante
Strukturen oder Substrukturen aufzunehmen.
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Beim
Betrieb eines Laser-Scanning-Mikroskops, wird eine hierarchische
Objekterkennung in folgenden Schritten durchgeführt:
- 1. Übersichtsscan mit geringerer Auflösung
des gesamten Scanfeldes
- 2. Identifizierung von Objekten in Übersichtsbild anhand
ihrer Form, Größe und/oder spektralen Eigenschaften
- 3. Beaufschlagung spezieller „regions of interest” (ROI,
interessierende Gebiete) mit spezieller Intensität und
oder Wellenlängenzusammensetzung
- 4. Identifizierung von gemeinsamen Kriterien wie Form, Größe
und oder spektraler Zusammensetzung in mindestens einer ROI
- 5. Wiederholung von Schritt 3 und 4 in mindestens einer ROI
solange festgelegte Bildkriterien erfüllt sind
- 6. Auslösung eines Mess- und/oder Manipulationsvorganges,
insbesondere zeitlich wiederholend oder kontinuierlich über
eine festgelegte Zeit
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Die
Erfindung betrifft die Anwendung von Algorithmen der hierarchischen
Bilderkennung zur automatischen Bildaufnahme in der optischen Bildgebung
im Bereich der Mikroskopie und/oder für Screening-Anwendungen
(definierbar durch die Notwendigkeit statistischer Aussagen über
verschiedene Objektgruppen bzw. über eine Kombination gleicher oder ähnlicher
Einzelobjekte), insbesondere für fluoreszenzbasierte Verfahren
(aber auch für andere Kontrastverfahren), insbesondere
bei Laser-Scanning-Mikroskopen.
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Die
automatische Bildaufnahme kann insbesondere folgende Bereiche (auch
nur Teilbereiche) einschließen (jeweils wahlweise automatisch
oder manuell durchgeführt):
- • Übersichtsscan
zum Finden von Objekten
- • Bestimmung ob das Objekt den Anforderungen genügt
(Unterscheidung interessanter von uninteressanten Objekten; mit
einfacher Bilderkennung nicht oder nur unzureichend zu machen ist,
z. B. Erkennung von Zellen mit bestimmtem komplexen Expressionsmuster)
- • Automatisierte Fokussierung oder Bildeinstellung
auf interessante Objekte
- • Automatisierte Aufnahme interessanter Objekte und/oder
interessanter Substrukturen. Diese Substrukturen müssen
nicht gleich derer sein, die vorher das interessante Objekt definiert
haben. (z. B. finden von Zellen bei denen die Nuclei eine bestimmte
Größe haben und gleichzeitig GFP exprimieren,
bei diesen soll speziell der Golgi-Apparat abgebildet werden.)
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Die
Bildaufnahme kann sich insbesondere auch auf automatische Manipulation
erstrecken, insbesondere durch FRAP, FLIP oder andere auf Photozerstörung
(Bleaching) basierende Methoden. Die Definition der zu bleichenden
Bereiche erfolgt automatisch durch die hierarchische Erkennungssoftware.
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Mögliche
Objekte schließen Zellen, Gewebe und kleine Organismen
(z. B. Zebrafische, Drosophila) ein.
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Neben
toten bzw. fixierten Proben sind insbesondere lebende Proben eingeschlossen
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VORTEILE GEGENÜBER
DEM STAND DER TECHNIK
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- [I] Selektion der aufzunehmenden Objekte in
der Probe führt zu kleineren Datenmengen. Bei der bisherigen
Bildaufnahme in 3D bzw. 4D kommt es häufig zu Datenmengen
im Gigabyte-Bereich oder darüber, die mit Computer derzeit
nur schwer zu handhaben sind.
- [II] Die Aufnahmezeit erniedrigt sich wesentlich
- [III] Die Notwendigkeit einer manuellen Interaktion wird reduziert.
Dadurch ergibt sich eine deutlich Kosteneinsparung
- [IV] Die Erfindung ermöglicht eine automatisierte Manipulation
automatisch oder manuell selektierter Objekte und erschließt
damit der Mikroskopie neue Möglichkeiten
- [V] Die Benutzung hierarchischer Objekterkennung bei der automatischen
Bildaufnahme erlaubt eine genauere Selektion/Diskriminierung bei
komplexen Objekten, deren Genauigkeit von Pixel-basierten Methoden
nicht erreicht wird.
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AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
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Die
Erfindung wird nachstehend anhand konkreter Anwendungen weiter erläutert.
- a) Eine mögliche Aufgabenstellung
wäre die Analyse von 100 Zebrafischembryonen mit bestimmtem
Herzfehler
Ablauf der Verfahrensschritte:
- • Übersichtsscan im Weitfeldmodus um Positionen
der Fische zu erkennen.
- • Positionierung der ersten Fisches im Fokus
- • Konfokale Aufnahme eines 3D-Stapels des gesamten
Fisches
- • Analyse der Daten mittels hierarchischer Bildanalyse
- • Wenn das Programm bei diesem Fisch einen Herzfehler
erkennt, erfolgt eine Detailaufnahme des Herzens mit hoher Detailgenauigkeit – Wenn das
Programm keinen Herzfehler findet, erfolgt keine Aufnahme oder Speicherung
- • Analyse der nächsten Fische bis 100 Herzfehler aufgenommen
sind
- b) Eine weitere Aufgabenstellung: Statistik über 100
lebende Zellen mit verschiedenen Expressionsmustern (beispielsweise
a: Golgi exprimiert GFP, b: Nucleus exprimiert YFP)
Ablauf:
- • Scan zum Lokalisieren der Zellen
- • Entscheidung über hierarchische Bilderkennung welche
Zellen diese beiden Expressionsmuster aufweisen. Ausselektion der
anderen Zellen (z. B. Zellen ohne diese Expressionsmuster bzw. mit Expression
von GFP bzw. YFP in anderen Kompartimenten)
- • Lokalisation der einzelnen Zellen im Fokus
- • Zeitserien der selektierten Zellen in höherer
Auflösung
- c) Aufgabenstellung: Suche nach speziellen Events in Zellen,
die nur kurzzeitig im Laufe der Zeit auftreten, hier Veränderung
der Zellform.
Ablauf:
- • Übersichtsbild alle 15 Minuten
- • Die hierarchische Bilderkennung erkennt eine Formänderung
bei einer Zelle
- • Lokalisation der Zelle im Fokus
- • Aufnahme des Zellkerns dieser Zelle alle 10 Sekunden
für die nächsten 10 Minuten
- • Weiter mit Übersichtsbild
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Ein
detailierteres Ausführungsbeispiel zu c) ist in 2 schematisch
dargestellt:
- • Die Probe ist beispielsweise
eine lebende Zellkultur in einer Petrischale (je nach Zelltyp mit/ohne
Anfärbung)
- • Ein Mikroskop mit einer geeigneten Kontrastmethode
(z. B. Durchlicht, Fluoreszenz) mit automatischer Verfahreinheit
der Probe wird eingesetzt.
- • Es werden mehrere (z. B. 10) Zellen im Bildfeld gehalten
und alle 15 Minuten ein Bild mit einer Kamera aufgenommen. Das Kamerabild
wird über eine hierarchische Bildverarbeitungssoftware segmentiert
und analysiert. Im Einzelnen erfolgen die folgenden Schritte zum
Auffinden der Zellen (alle angegeben Werte sind beispielhaft und
hängen stark vom Zelltyp und den Messbedingungen ab):
1.
Bestimmung und Subtraktion der Hintergrundhelligkeit (Thresholding)
2.
Vereinzelte Zellen werden gefunden über die erste simple
Kriterien K1, K2, K3: Rundheit (vertikal: horizontal-Verhältnis
zwischen 0,7–1,3) und Flächenbelegung/Größe
(25–250 μm2). Überlappende
Zellen und Artefakte werden über die obigen Kriterien aussortiert.
3.
Eine Zelle wird darüber hinaus über den Zellkern
und den Golgi-Apparat definiert. Der Zellkern ist wiederum über
seine Rundheit (vertikal: horizontal-Verhältnis zwischen
0,7–1,3) und seine Fläche (2–30 μm2) definiert. Ebenso können mehrere
Zellkerne innerhalb einer Zelle vorkommen und erkannt werden. Der
Golgi-Apparat besitzt ebenfalls einen minimale und eine maximale
Fläche (5–50 μm2),
sowie eine sehr inhomogene Form (viele verschiedene Parameter),
die ebenfalls über einen Algorithmus erkannt wird.
Die
Hierarchische Objekterkennung beruht nun auf der Relation einzelner
Objekte (wie hier Zellkern, Zelle, Golgi) zueinander. Es wird definiert, dass
der oder die Zellkerne und der Golgi-Apparat innerhalb der Zelle
(bzw. Zellmembran) liegen. Andere Objekte und Artefakte werden aussortiert.
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Falls
eine gewisse Anzahl von Zellen (10) im Bildfeld unterschritten wird
(z. B. durch Wanderung der Zellen), wird eine Verfahreinheit des
Mikroskops dazu benutzt, einen Bereich mit dichterer Zellbelegung
zu finden. Dies kann nötig sein, um seltene Ereignisse
mit gewisser Mindestwahrscheinlichkeit zu sehen.
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Das
eigentliche Experiment kann auch in der Manipulation der Zellen
und der Beobachtung der detaillierten Zellreaktion darauf bestehen,
z. B. durch Aussetzen der Zellen mit elektromagnetischen Feldern
oder kurzwelliger Strahlung. Nach dem Auffinden der Zellen gemäß 1 wird
der Schwerpunkt auf die Erkennung von Zellveränderungen
gelegt. Hierfür werden entsprechende Kriterien KVR (Volumen,
Rundheit) aufgestellt – siehe 3. in 2
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Das
ist in 3 weiterführend schematisch anhand der
Apoptose dargestellt.
- – Die Manipulationsbedingungen
führen zum Absterben der Zellen (Apoptose), wie in 2 am Beispiel
einer gesunden Zelle Z1 und einer apoptotischen Zelle Z2 beschrieben
ist.
- – Das Programm soll Apoptose frühzeitig erkennen
und dann eine Detailaufnahme des/der Zellkerne N der betroffenen
Zelle Z2 mit hoher Zeitauflösung initiieren, da dort eine
gewünschte (fiktive) Reaktion bzw. Morphologieänderung
zu erwarten ist.
- – Apoptose zeigt sich zuerst in einer Deformation der
Zelle bzw. Zellmembran, d. h. das Rundheitskriterium des Algorithmus
wird aufgehoben, es können anstelle der Rundheit andere
komplexere Kriterien treten; die Zellgröße reduziert
sich im Vergleich zu der gleichen Zelle im vorherigen Bild (Z2S).
Sobald die Größenreduktion mehr als 15% zur vorherigen
Zellgröße beträgt, wird eine Detailserie
des Nukleus N initiiert.
• Die Erkennung der Zellveränderung
und des Zerfalls in Versikel V initiiert eine Reaktion des Mikroskops,
d. h. das Mikroskop fokussiert auf den Nukleus N der veränderten
Zelle und nimmt alle 10 Sekunden für insgesamt 10 Minuten
ein Detailbild (Zeitserie) auf.
• Es wird wie oben
beschrieben verfahren, bis eine bestimmte Zahl von Zellen (z. B.
50) aufgenommen wurde.
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Die
Erfindung ist vorteilhaft insbesondere in Laser-Scanning-Mikroskopen
anwendbar.
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Die
hierarchische Objekterkennung wird hierbei vorteilhaft in folgenden
Schritten analog der obigen Beschreibung durchgeführt:
- 1. Übersichtsscan mit geringerer Auflösung
des gesamten Scanfeldes
- 2. Identifizierung von Objekten in Übersichtsbild anhand
ihrer Form, Größe und/oder spektralen Eigenschaften
- 3. Beaufschlagung spezieller „regions of interest” (ROI,
interessierende Gebiete) mit spezieller Intensität und
oder Wellenlängenzusammensetzung
- 4. Identifizierung von gemeinsamen Kriterien wie Form, Größe
und oder spektraler Zusammensetzung in mindestens einer ROI
- 5. Wiederholung von Schritt 3 und 4 in mindestens einer ROI
solange festgelegte Bildkriterien erfüllt sind
- 6. Auslösung eines Mess- und/oder Manipulationsvorganges,
insbesondere zeitlich wiederholend oder kontinuierlich über
eine festgelegte Zeit
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 19702753
A1 [0002]
- - US 6832002 [0018]
- - DE 10332060 A1 [0018]
- - DE 102004034963 [0019]
- - DE 19829981 C2 [0020]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - http://www.zeiss.de/c12567be00459794/Contents-Frame/fd9fa0090eee01a641256a550036267b [0010]
- - Journal of Microscopy, Vol. 216, Pt 2 November 2004, pp. 131–137 [0017]