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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur hochauflösenden Mikroskopie einer Probe, wobei (a) die Probe zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung mit Beleuchtungsstrahlung angeregt wird, wobei auf der Probe eine Beleuchtungsintensitätsverteilung erzeugt wird, die Streifen geringerer Intensität aufweist, und die derart angeregte, fluoreszierende Probe abgebildet wird, (b) die Lage der Streifen auf der Probe variiert wird und für jede Lage ein Einzelbild der fluoreszierenden Probe aufgenommen wird, so dass ein Satz an Einzelbildern mit verschiedenen Lagen der Streifen erzeugt wird, und (c) aus dem Satz an Einzelbildern unter Berücksichtigung der Lagen der Streifen ein hochaufgelöstes Bild eines Bereiches der Probe erzeugt wird.
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Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Mikroskop zur hochauflösenden Mikroskopie einer Probe, mit einem Probenraum zur Aufnahme einer Probe, die zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar ist, einer Optik, die eine im Probenraum liegende Fokalebene und eine Auflösungsgrenze hat, einer Beleuchtungseinrichtung, die Probe zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung mit Beleuchtungsstrahlung anregt, wobei die Beleuchtungseinrichtung auf der Probe eine Beleuchtungsintensitätsverteilung erzeugt, die Streifen geringerer Intensität aufweist, wobei die Lage der Streifen verstellbar ist, einer Abbildungseinrichtung zum Abbilden angeregte, fluoreszierende Probe durch die Optik, eine Steuereinrichtung, die die Beleuchtungseinrichtung so ansteuert, dass die Lage der Streifen auf der Probe variiert ist, und die für jede Lage ein Einzelbild die fluoreszierende Probe aufnimmt, dadurch so einen Satz an Einzelbildern mit verschiedenen Lagen der Streifen erzeugt, und aus dem Satz an Einzelbildern unter Berücksichtigung der Lagen der Streifen ein hochaufgelöstes Bild eines Bereiches der Probe erzeugt.
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Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Lumineszenzmikroskopie. Hierbei werden bestimmte Farbstoffe (sogenannte Phosphore oder Fluorophore) zur spezifischen Markierung von Proben, z. B. von Zellteilen, verwendet. Die Probe wird mit Anregungsstrahlung darstellender Beleuchtungsstrahlung beleuchtet und die dadurch angeregte Lumineszenzstrahlung mit geeigneten Detektoren erfasst. Durch dieses Vorgehen ist die Darstellung einzelner, verschieden gefärbter Zellteile im Mikroskop möglich. Natürlich können auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen, sich spezifisch an unterschiedliche Strukturen des Präparates anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden. Dieses Verfahren bezeichnet man als Mehrfachlumineszenz. Auch kann man Proben vermessen, die per se, also ohne Farbstoffzugabe lumineszieren.
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Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und Fluoreszenz verstanden, erfasst also beide Prozesse. Soweit hier von Fluoreszenz gesprochen wird, ist das Aars pro toto und nicht einschränken zu verstehen.
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Zur Probenuntersuchung ist es auch bekannt, Laser-Scanning-Mikroskope (auch LSM abgekürzt) zu verwenden, die mittels einer konfokalen Detektionsanordnung (dann spricht man von einem konfokalen LSM) oder einer nichtlinearen Probenwechselwirkung (sogenannte Multiphotonenmikroskopie) nur diejenige Ebene abbilden, die sich in der Fokusebene des Objektives befindet. Es wird ein optischer Schnitt gewonnen, und die Aufzeichnung mehrerer optischer Schnitte in verschiedenen Tiefen der Probe erlaubt es, ein dreidimensionales Bild der Probe zu generieren, das aus den verschiedenen optischen Schnitten zusammengesetzt ist. Die Laser-Scanning-Mikroskopie ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Natürlich wird auch eine Kombination von Lumineszenzmikroskopie und Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet, bei der eine lumineszierende Probe in verschiedenen Tiefenebenen mit Hilfe eines LSM abgebildet wird.
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Prinzipiell ist die optische Auflösung eines Lichtmikroskops, auch die eines LSM, durch die physikalischen Gesetze beugungsbegrenzt. Der Begriff „hochauflösend” wird hier für Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze verwendet.
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Ein hochauflösendes Mikroskopieverfahren und Mikroskop der eingangs genannten Art ist aus
US 5867604 oder
EP 1157297 B1 bekannt. Die Probe wird im Weitfeld mit einer periodischen Struktur, z. B. einer Streifenstruktur, beleuchtet, die in verschiedene Lagen gebracht wird, wobei für jede Lage eines der Einzelbilder aufgenommen wird. Ein Rekonstruktionsalgorithmus zur Bilderzeugung verwertet die Einzelbilder und erzeugt daraus ein hochaufgelöstes Bild der Probe.
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Ein andersartiges Verfahren und Mikroskop ist aus der
EP 2317362 A1 bekannt. Diese gattungsbildende Druckschrift kombiniert in der dort in
5 dargestellten und beschriebenen Ausführungsform eine beugungsbegrenzte Beleuchtung der Probe mit einem Flächendetektor, der das Beugungsbild des beleuchteten Punktes auflöst. Der Detektor liegt damit in einer Ebene, in der bei einem herkömmlichen LSM das Pinhole wäre. Eine Scaneinrichtung verschiebt den Beleuchtungsspot über die Probe und ist so ausgebildet, dass das Beugungsbild des mit dem Beleuchtungsspot beleuchteten Punktes auf dem Flächendetektor ruht. Im Konzept der
EP 2317362 A1 ist der Flächendetektor in der Pinhole-Ebene mit einer Ortsauflösung versehen, die bezogen auf den Abbildungsmaßstab eine Überabtastung des Beugungsbildes bewirkt und es somit zusammen mit einer besonderen Signalverarbeitung erlaubt, aus der Beugungsstruktur des Beugungsbildes ein hochaufgelöstes Bild zu erzeugen.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bzw. ein Mikroskop der eingangs genannten Art so weiterzubilden, dass eine Hochauflösung über die Beugungsgrenze hinaus besonders aufwandsgering erzeugt werden kann.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einem Verfahren zur hochauflösenden Mikroskopie einer Probe, wobei
- (a) die Probe zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung mit Beleuchtungsstrahlung angeregt wird, wobei auf der Probe eine Beleuchtungsintensitätsverteilung erzeugt wird, die Streifen geringerer Intensität aufweist, und die derart angeregte, fluoreszierende Probe abgebildet wird,
- (b) die Lage der Streifen auf der Probe variiert wird und für jede Lage ein Einzelbild der fluoreszierenden Probe aufgenommen wird, so dass ein Satz an Einzelbildern mit verschiedenen Lagen der Streifen erzeugt wird, und
- (c) aus dem Satz an Einzelbildern unter Berücksichtigung der Lagen der Streifen ein hochaufgelöstes Bild eines Bereiches der Probe erzeugt wird,
wobei im Schritt (a) die Beleuchtungsstrahlung auf der Probe zu einer einen Fleck beleuchtenden Beleuchtungslinie mit einer Längserstreckung, die kürzer ist als der Bereich der Probe, und einer gegenüber der Längserstreckung kürzeren Quererstreckung gebündelt wird,
wobei eine Intensität der Beleuchtungslinie am Ende der Längserstreckung auf Null abfällt, und die Probe mit der Beleuchtungslinie zeilenweise abgescannt wird, wobei die Beleuchtungslinie längs jeder Zeile quer zu ihrer Längserstreckung über die Probe verschoben wird, so dass die Streifen geringerer Intensität an den Überganggen benachbarter Zeilen entstehen,
wobei im Schritt (b) der beleuchtete Fleck der Probe descannt und damit ruhend in ein Fleckbild abgebildet wird, wobei das Fleckbild mit einer Detektoreinrichtung, welche eine Intensitätsverteilung des Fleckbildes örtlich auflöst, zeitaufgelöst aufgenommen wird, und
wobei im Schritt (b) weiter aus den Daten der Detektoreinrichtung unter Berücksichtigung von ihnen zugeordneten Scanpositionen des zeilenweisen Abscannens eines der Einzelbilder der Probe erzeugt wird, und das zeilenweise Abscannen und das Erzeugen eines der Einzelbilder der Probe mehrmals durchgeführt wird, wobei die Lage der Zeilen und damit der Übergänge zwischen benachbarten Zeilen auf der Probe verschoben werden, um den Satz an Einzelbildern zu bilden.
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Die Aufgabe wird weiter gelöst mit einem Mikroskop zur hochauflösenden Mikroskopie einer Probe, mit einem Probenraum zur Aufnahme einer Probe, die zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar ist, einer Optik, die eine im Probenraum liegende Fokalebene und eine Auflösungsgrenze hat, einer Beleuchtungseinrichtung, die Probe zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung mit Beleuchtungsstrahlung anregt, wobei die Beleuchtungseinrichtung auf der Probe eine Beleuchtungsintensitätsverteilung erzeugt, die Streifen geringerer Intensität aufweist, wobei die Lage der Streifen verstellbar ist, einer Abbildungseinrichtung zum Abbilden angeregte, fluoreszierende Probe durch die Optik, eine Steuereinrichtung, die die Beleuchtungseinrichtung so ansteuert, dass die Lage der Streifen auf der Probe variiert ist, und die für jede Lage ein Einzelbild die fluoreszierende Probe aufnimmt, dadurch so einen Satz an Einzelbildern mit verschiedenen Lagen der Streifen erzeugt, und aus dem Satz an Einzelbildern unter Berücksichtigung der Lagen der Streifen ein hochaufgelöstes Bild eines Bereiches der Probe erzeugt, wobei die Beleuchtungseinrichtung die Beleuchtungsstrahlung auf der Probe zu einer einen Fleck beleuchtenden Beleuchtungslinie mit einer Längserstreckung, die kürzer ist als der Bereich der Probe, und einer gegenüber der Längserstreckung kürzeren Quererstreckung bündelt, wobei eine Intensität der Beleuchtungslinie am Ende der Längserstreckung auf Null abfällt, das Mikroskop einen Scanner aufweist, der die Probe mit der Beleuchtungsstrahlung zeilenweise abscannt, wobei der Scanner die Beleuchtungslinie längs jeder Zeile quer zu deren Längserstreckung über die Probe verschiebt, so dass die Streifen geringerer Intensität an Übergängen benachbarter Zeilen entstehen, eine Abbildungseinrichtung den beleuchteten Fleck der Probe über dem Scanner descannt und damit ruhend in ein Fleckbild abbildet und eine Detektoreinrichtung umfasst, welche eine Intensitätsverteilung des Fleckbildes örtlich aufgelöst und zeitaufgelöst aufnimmt, die Steuereinrichtung Daten der die Detektoreinrichtung ausliest und daraus unter Berücksichtigung von diesen zugeordneten Scanpositionen des zeilenweisen Abscannens eines der Einzelbilder der Probe erzeugt, und die Steuereinrichtung weiter das zeilenweise Abscannen und das Erzeugen eines der Einzelbilder der Probe mehrmals durchführt, wobei die Lagen der Zeilen und damit der Übergänge zwischen benachbarten Zeilen auf der Probe verschoben werden, um den Satz an Einzelbildern zu bilden.
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Die Erfindung erzeugt ein hochaufgelöstes Bild mittels der im Stand der Technik und in den eingangs genannten Druckschriften als SIM bezeichneten Mikroskopietechnik. Die Probe wird streifenförmig beleuchtet. Man variiert die Lage der Streifen, so dass der Satz an Einzelbildern gewonnen wird, die jeweils eine andere Lage der Streifen im mikroskopierten Bereich aufweisen. Die Streifen sind eine Intensitätsmodulation, d. h. jedes Einzelbild hat Streifen größerer und geringerer Fluoreszenz. Durch eine mathematische Rekonstruktion, die in den eingangs genannten Literaturstellen erwähnt und dem Fachmann bekannt ist, wird aus dem Satz an Einzelbildern mit unterschiedlicher Streifenlage ein hochaufgelöstes Bild errechnet. Die Streifen in den Einzelbildern werden dadurch erzeugt, dass die Probe mit einer Beleuchtungszeile in Form eines längserstreckten Beleuchtungsflecks zeilenweise abgescannt wird. Die Intensität der Beleuchtungsstrahlung nimmt zum Rand des längserstreckten Beleuchtungsflecks ab. Dadurch entsteht am Übergang benachbarter Zeilen, also an den Nahtstellen zwischen benachbarten Zeilen, jeweils ein Bereich, der je nach Art des Abfalls der Intensität an den Enden des längserstreckten Beleuchtungsfleckes eine geringere Beleuchtungsintensität und eine höhere Beleuchtungsintensität hat. Liegen benachbarte Zeilen so eng aneinander, dass die Beleuchtungsintensität aus der ersten Zeile und die Beleuchtungsintensität aus der zweiten Zeile sich zu einem Betrag addieren, der größer ist, als die Beleuchtungsintensität im längserstreckten Beleuchtungsfleck, ergibt sich im Überlappbereich eine höhere Intensität, also ein hellerer Streifen. Im gegengesetzten Fall, in dem die Zeilen größer beabstandet sind, ergibt sich ein Streifen niederer Intensität. Aufgrund des Abfalls der Beleuchtungsintensität am Ende des längserstreckten Beleuchtungsfleckes ist es unvermeidlich, dass das Bild längs der Zeilen verlaufende Streifen unterschiedlicher Intensität hat. Um diese Steifen aufzunehmen, wird eine Detektionssystematik verwendet, welche die Intensitätsstruktur des auf den Detektor descannt abgebildeten, durch den Beleuchtungsfleck zur Fluoreszenz angeregten Bereiches auflöst. Anders als bei herkömmlicher SIM-Technik wird also keine Weitfeldbeleuchtung vorgesehen. Im Unterschied zur Laser-Scanning-Technologie mit zeilenförmiger Probenabtastung wird in der Ebene, welche der Pinhole-Ebene in einem klassischen LSM entspricht, eine ortsauflösende Detektion vorgenommen und dadurch die streifenförmige Struktur im Bild erfasst. Der Scanner bzw. das Abscannen ist also so ausgebildet, dass das Bild des mit dem Beleuchtungsfleck beleuchteten, fluoreszierenden Flecks auf dem ortsauflösenden Detektor ruht. Eine solche descannte Detektoranordnung wird üblicherweise dadurch erreicht, dass zwischen einem Vereinigungspunkt zwischen der Beleuchtungseinrichtung und der Abbildungseinrichtung und der Probe ein Scanner angeordnet ist, der den Strahlengang ablenkt. Der Scanner wirkt dann sowohl auf die den Fleck beleuchtende Beleuchtungslinie als auch auf die Abbildung des beleuchteten Flecks, so dass in Abbildungsrichtung nach dem Scanner der Abbildungsstrahlengang ruht. Eine Alternative zu einem solchen Scanner ist die Verwendung eines bewegbaren Probentischs, der die Probe verschiebt. Auch dann ruht das Fleckbild auf dem Detektor.
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Im Rahmen der Abbildung, d. h. der Erzeugung des Fleckbildes, ist der Detektor üblicherweise in eine Ebene gestellt, die konjugiert zur Fokalebene der Beleuchtung mit dem Beleuchtungsfleck ist. Diese Ebene wird bei herkömmlichen LSM auch als Pinhole-Ebene bezeichnet, da in ihr das tiefenfilternde Blendenelement angeordnet ist. Dieses ist nun durch einen ortsauflösenden Detektor ersetzt, um das mit den Intensitätsstreifen versehene Bild aufzunehmen.
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Das Bild entsteht letztlich durch Zusammenfügen der zeitaufgelösten Abbildungsinformation unter Berücksichtigung der zeilenförmigen Ablenkung. Die Verhältnisse gleichen insoweit denen eines LSM mit dem Unterschied, dass an einen Bildpunkt des LSM nun die ortsaufgelöste Information über die Intensitätsverteilung des Fleckbildes tritt.
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Das SIM-Prinzip erzeugt ein hochaufgelöstes Bild quer zur Zeilenrichtung. Um eine möglichst isotrope Auflösungssteigerung zu erhalten, ist es für die SIM-Technik bekannt, das Beleuchtungsmuster zu drehen. Falls für Anwendungen eine Auflösungssteigerung in einer Richtung im Bild nicht genügt, ist eine Weiterbildung zweckmäßig, welche die Zeilenrichtung gegenüber der Probe relativ verdreht, beispielsweise durch Einsetzen einer entsprechenden Bilddreheinrichtung oder eines drehbaren Probentisches. Eine Bilddreheinrichtung kann beispielsweise als sogenannter Faraday-Rotator ausgeführt werden und ist im Strahlengang zwischen Probe und Scanner anzuordnen.
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Eine bevorzugte Weiterbildung erzeugt die höhere Ortsauflösung längs der Zeilenrichtung durch Ausnutzung der Prinzipien, die aus der sogenannten Airy-Scan-Mikroskopie bekannt sind. Dieses Konzept ist aus der
EP 2317362 A1 bekannt, die eingangs bereits genannt wurde. In der Airy-Scan-Mikroskopie wird die Probe mit einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck beleuchtet, und der Flächendetektor erfasst als Fleckbild das Beugungsbild des Flecks der Probe, der mit dem Beleuchtungsspot beleuchtet ist. Zugleich wird das Abscannen so vorgenommen, dass eine Vielzahl von Scanpositionen verwendet wird, die voneinander nicht mehr als die halbe Beugungsgrenze, d. h. die halbe Größe des beugungsbegrenzten Beleuchtungsspots/Beleuchtungsbildes voneinander beabstandet sind. Die Airy-Scan-Mikroskopie stellt für jede Scanposition ein Gleichungssystem auf, das durch die Vielzahl an Scanpositionen lösbar ist und zu einer Ortsauflösung führt, die über die Beugungsgrenze hinaus gesteigert ist. Da die Beugungsgrenze bei einem Punkt durch das sogenannte Airy-Scheibchen definiert ist, erhielt dieses Mikroskopieverfahren den Namen Airy-Scan-Mikroskopie. Dieses Verfahren kann nun in einer Weiterbildung des Mikroskopieverfahrens bzw. des Mikroskops eingesetzt werden, indem die Beleuchtungslinie quer zur Linienrichtung beugungsbegrenzt ist, und die Scanpositionen längs der Zeilenrichtung die genannte Bemessungsgrenze einhalten, d. h. um nicht mehr als die halbe Abmessung, die die Beleuchtungslinie in der beugungsbegrenzten Richtung, d. h. quer zur Längserstreckung hat, beabstandet sind. Auf diese Weise wird mittels der aus der Airy-Scan-Mikroskopie bekannten Verrechnungsmethode ein Bild gewonnen, das längs der Zeilenrichtung hochaufgelöst ist. Quer zur Zeilenrichtung wird durch die Airy-Scan-Mikroskopie in diesem Fall keine besonders gesteigerte Auflösung erreicht, da die Beleuchtungslinie länger ist, als die Beugungsgrenze vorgibt. Deshalb wird dieses mittels Airy-Scan-Mikroskopie gewonnene Bild, das eine Hochauflösung längs der Zeilenlinie hat, kombiniert mit der Hochauflösung, die durch die SIM-Technologie quer zur Zeilenrichtung erreicht wird. Man fasst das aus der Airy-Scan-Auswertung stammende hochaufgelöste Bild mit dem Bild, das aus dem Satz an Einzelbildern gemäß SIM-Technik gewonnen wird, zu einem hochaufgelösten Gesamtbild zusammen, das sowohl längs als auch quer zur Zeilenrichtung eine über die Auflösungsgrenze gesteigerte Ortsauflösung hat.
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Ein Beugungsscheibchen entsteht bei der Beugung eines optischen Strahls an einer kreisförmigen Blende. Es erscheint ein zentrales Maximum, das Beugungsscheibchen, das umgeben ist von Ringen abnehmender Strahlungsintensität. Selbst ein nach den Gesetzen der geometrischen Optik perfektes Mikroskop, also auch ohne Abbildungsfehler, kann einen Punkt nicht genau auf einen Punkt abbilden, sondern durch die Beugung des Lichts an der Apertur nur auf einen unscharfen Fleck. Dies wird als beugungsbegrenzte Abbildung bezeichnet. Gleiches gilt bei beugungsbegrenzter Beleuchtung eines Punktes. Zwei Punkte lassen sich in klassischer Strahlenoptik nach dem sog. Rayleigh-Kriterium trennen, wenn die Maxima ihrer Abbilder im Beugungsbild mindestens um den Radius r des Beugungsscheibchens auseinander liegen. Die Form des Flecks hängt reziprok von der Form der Apertur ab, insbesondere ist seine Größe umgekehrt proportional zur Größe der Apertur. Die Größe des Beugungsscheibchens ergibt sich aus der ersten Nullstelle der Besselfunktion erster Art, die bei etwa r = 0,6098 liegt. Das Beugungsscheibchen (also der zentrale Beugungsfleck) wird nach dem englischen Astronomen George Biddell Airy auch Airy-Scheibchen genannt. Im Scanning-Mikroskop ist sowohl bei Beleuchtung als auch bei Abbildung die Apertur, gegeben durch die runde Fassung der Optiken, kreisförmig. Da Größe des Beugungsscheibchens zudem von der Wellenlänge abhängt, ist es bei der zu Anregung dienenden beugungsbegrenzten Beleuchtung kleiner als bei der stokesverschobenen, also langwelligeren Fluoreszenzstrahlung. Der Begriff „beugungsbegrenzt” soll hier nicht auf die Beugungsgrenze gemäß der Abbe'schen Theorie beschränkt sein, sondern auch Fälle erfassen, in denen auf Grund realer Unzulänglichkeiten oder Einschränkungen das theoretische Maximum um 20% verfehlt wird. Auch dann hat das Einzelbild eine Struktur, die hier als Beugungsstruktur bezeichnet wird. Sie wird überabgetastet.
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Die Abbildung der Probe erfolgt wie in einem üblichen LSM scannend. Da in Ausführungsformen Beleuchtung und Abbildung bzw. die entsprechenden Einrichtungen eine gemeinsame optische Scaneinrichtung haben, welche die Beleuchtungslinie über die Probe führt und zugleich den derart beleuchteten und angeregten Fleck, an dem die Probe abgebildet wird, in Bezug auf den Detektor wieder descannt, kann man eine Zoomoptik in den gemeinsamen Teil von Beleuchtungs- und Abbildungseinrichtung setzen. Sie erlaubt es, eine Anpassung des Beugungsbildes an die Größe des Flächendetektors vorzunehmen und zusätzlich die verfügbare Beleuchtungsstrahlung ohne Randverluste vollständig in die Objektivpupille, welche sich mit Wahl des Objektivs ändern kann, einzukoppeln.
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Soweit hier ein Verfahren beschrieben wird, realisiert eine Steuer- und/oder Auswerteeinrichtung, z. B. ein Steuergerät, diese Verfahrensschritte im Betrieb des Mikroskops.
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Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
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1 eine Schemadarstellung eines Laser-Scanning-Mikroskops zur hochauflösenden Mikroskopie,
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2 eine Draufsicht auf eine mit dem Mikroskop der 1 abgebildete Probe zur Veranschaulichung des Scan-Prinzips,
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3 eine Draufsicht auf eine Detektorfläche des Mikroskops 1 zur Veranschaulichung der Auflösung einer Intensitätsstruktur eines Fleckbildes und
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4 eine Verdeutlichung einer Intensitätsverteilung quer zu einer Zeilenrichtung beim Scan-Prinzip gemäß 2 mit dem Mikroskop der 1.
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1 zeigt schematisch ein Laserscanningmikroskop 1, das zum Mikroskopieren einer Probe 2 ausgebildet ist. Das Laserscanningmikroskop (nachfolgend als LSM abgekürzt) 1 wird von einem Steuergerät C gesteuert und umfasst einen Beleuchtungsstrahlengang 3 sowie einen Abbildungsstrahlengang 4. Der Beleuchtungsstrahlengang beleuchtet einen Fleck in der Probe 2, und der Abbildungsstrahlengang 4 bildet diesen Fleck zur Detektion ab. Beleuchtungsstrahlengang 3 und Abbildungsstrahlengang 4 teilen sich eine Optik.
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Die Beleuchtung der Probe 2 erfolgt im LSM 1 mittels eines bereitgestellten Laserstrahls 5, der über einen nicht weiter funktionell erforderlichen Umlenkspiegel 6 und eine Linse 7 auf einen Spiegel 8 eingekoppelt wird. Der Spiegel 8 sorgt dafür, dass der Laserstrahl 5 unter einem Reflexionswinkel auf ein Einkoppelelement 9 fällt. Zur übersichtlicheren Darstellung ist für den Laserstrahl 5 lediglich dessen Hauptachse eingezeichnet.
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Nach Reflexion am Einkoppelelement 9 wird der Laserstrahl 5 von einem Scanner 10 zweiachsig abgelenkt und mittels Linsen 11 und 12 durch ein Objektiv 13 als Beleuchtungsfleck 14 in eine Fokalebene 29 in der Probe 2 fokussiert. Der Beleuchtungsfleck 14, z. B. durch geeignete Ausbildung der Optik 7, ist linienförmig. Fluoreszenzstrahlung, die am beleuchteten Fleck angeregt wurde, wird aus der Fokalebene 29 über das Objektiv 13, die Linsen 11 und 12 wieder zum Scanner 10 geleitet, nach dem in Abbildungsrichtung wiederum ein ruhender Lichtstrahl vorliegt. Dieser fällt durch das Einkoppelelement 9 und einen Emissionsfilter 15, der die Funktion hat, die Fluoreszenzstrahlung im Beleuchtungsfleck 14 hinsichtlich ihrer Wellenlänge zu selektieren und eventuell rückreflektierte Beleuchtungsstrahlung abzublocken. Eine Linse 16 sorgt dafür, dass insgesamt der beleuchtete Fleck in ein ebenfalls linienförmiges Fleckbild 17 abgebildet wird, welches in einer Detektionsebene 18 auf einer Detektionsfläche 22 liegt. Die Detektionsebene 18 ist eine konjugierte Ebene zur Fokalebene 29, in welcher der Beleuchtungsfleck 14 in der Probe 2 liegt.
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Das Fleckbild 17 des mit den Beleuchtungsfleck 14 beleuchteten Flecks wird in der Detektionsebene 18 von einer Detektoreinrichtung 19 aufgenommen. Sie löst das Fleckbild 17 auf der Detektionsfläche 22 in der Detektionsebene 18 räumlich auf, bewirkt also eine Überabtastung in der Pinhole-Ebene.
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Ein Steuergerät C steuert alle Komponenten des LSM 1, insbesondere den Scanner 10 und die Detektoreinrichtung 19, Das Steuergerät nimmt für verschiedene Scanstellungen die Daten der Detektionseinrichtung 19 auf und erzeugt ein hochaufgelöstes Gesamtbild der Probe 2, wie nachfolgend noch erläutert werden wird.
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a der Beleuchtungsfleck 14 ein linienförmiger Spot ist, wird in einem linienförmigen Fleck Fluoreszenz angeregt und folglich ist das Fleckbild 17 ebenfalls linienförmig. Seine Ausdehnung liegt innerhalb des Kreises, welcher in 1 die Detektionsebene 18 veranschaulicht. Es sei darauf hingewiesen, dass 1 in dieser Hinsicht eine Vereinfachung enthält. Die Ausdehnung des Fleckbildes 17 ist so groß, dass es die Detektionsfläche 22 abdeckt.
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Die Detektoreinrichtung 19 weist exemplarisch ein Lichtleitfaserbündel auf, welches ein Detektorarray speist. Eintrittsfacetten der Lichtleitfasern des Lichtleitfaserbündels bilden einen Lichtleitfaserbündeleingang, der in der Detektionsebene 18 liegt. Es sei darauf hingewiesen, dass die Ausführung der Detektoreinrichtung 19 exemplarisch ist. Grundsätzlich genügt für das Mikroskop 1 eine Detektoreinrichtung 19, die in der Detektionsebene 18 eine Ortsauflösung des Fleckbildes 17 vornimmt. Insbesondere kann es sich auch um eine rechteckige Detektorfläche mit Pixeln handeln.
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Der Scanner 10 steuert, angesteuert durch das Steuergerät C, die Abtastung der Probe 2 mit dem Beleuchtungsfleck 14. 2 zeigt eine Draufsicht auf einen Bereich 20 der Probe 2. Dieser abzubildende Bereich ist größer als die Erstreckung des linienförmigen Beleuchtungsflecks 14. Dieser wird zum Abbilden des Bereiches 20 zeilenförmig über den Bereich 20 verschoben. Exemplarisch liegen die Zeilen längs einer x-Richtung, und mehrere Zeilen 21a, 21b, 21c, 21d stoßen in y-Richtung nebeneinanderliegend aneinander, so dass zwischen den Zeilen 21a–21d Übergänge 24 gebildet sind, die aneinandergrenzende Bereiche der nebeneinanderliegenden Zeilen sind.
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3 zeigt eine Draufsicht auf die Detektionsfläche 22, auf welche das Fleckbild 23 abgebildet ist. Aufgrund der Anordnung des Scanners 10 ruht das Fleckbild 23 auf der Detektionsfläche 22. Diese nimmt die Intensitätsverteilung des Fleckbildes 23 auf.
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Unter Berücksichtigung des zeilenförmigen Abscannens des Bereiches 20, d. h. der entsprechenden Daten vom Scanner 10, und der zeitlichen Veränderung der Intensitätsverteilung des Fleckbildes 23 auf der Detektionsfläche 22 erzeugt das Steuergerät C ein Einzelbild der Probe. Dieses Einzelbild hat aufgrund der Übergänge 24 Streifen. 4 zeigt dies in einer Auftragung der Intensität in willkürlichen Einheiten entlang der y-Achse, also senkrecht zur Richtung der Zeilen 21a–21d. Die Zeilen 21–21d sind in der Schnittdarstellung zu erkennen. An den dazwischenliegenden Übergängen 24 ist, wie zuvor im allgemeinen Teil der Beschreibung bereits erläutert wurde, die Beleuchtungsintensität des Bereiches 22 und damit auch die Fluoreszenzintensität geringer. Mit anderen Worten, das vom Steuergerät C erzeugte Einzelbild hat Streifen, die z. B. an den Übergängen 24, d. h. längs der Richtung der Zeilen 21a–21d liegen.
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Um ein hochaufgelöstes Bild der Probe zu erzeugen, werden mehrere Einzelbilder des Bereichs 20 aufgenommen, wobei das zeilenförmige Abscannen vom Scanner 10 unter Ansteuerung durch das Steuergerät C so ausgeführt wird, dass die Übergänge 24 und damit die Streifen in den Einzelbildern verschiedene Lagen haben. Das Mikroskop 1 erzeugt somit einen Satz an Einzelbildern, die sich hinsichtlich der Lage der Streifen unterscheiden. Dieser Satz an Einzelbildern erlaubt es mittels der SIM-Technik, wie im allgemeinen Teil der Beschreibung ebenfalls bereits erläutert wurde, ein hochaufgelöstes Bild der Probe zu generieren. Werden die Streifen nur längs der y-Achse verschoben, ergibt sich auch nur in dieser Richtung eine Hochauflösung. Für manche Anwendungen genügt das.
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Für eine isotrope Hochauflösung, z. B. sowohl in y- als auch in x-Richtung in 2, weist das Mikroskop 1 in einer ersten Weiterbildung einen drehbaren Probentisch 25 (gestrichelt in 1 eingetragen) auf, der die Probe um die in 1 eingezeichnete optische Achse rotiert. Dadurch enthält der Satz an Einzelbildern nicht nur Bilder mit unterschiedlich parallel verschobenen Lagen der Streifen (Übergänge 24), sondern auch mit unterschiedlichen Drehlagen. Dies führt zu einem hochaufgelösten Bild in allen Richtungen x und y.
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Eine zweite Weiterbildung verschiebt die Übergänge 24 in den Einzelbildern lediglich längs der y-Achse und nutzt für eine Hochauflösung längs der x-Achse die Airy-Scan-Mikroskopie. In dieser Ausführungsform ist der Beleuchtungsfleck 14 längs der Zeilenrichtung, also der y-Richtung in 2, beugungsbegrenzt und wird auf ein ebenfalls beugungsbegrenztes Fleckbild abgebildet, so dass das Fleckbild in 3 ein Beugungsbild 23 ist. Die Beleuchtungslinie hat quer zu der Richtung, in welcher sie beugungsbegrenzt ist (also quer zur x-Richtung und damit längs der y-Richtung) eine Ausdehnung, die in Vielfaches der Beugungsgrenze, d. h. der Abmessung in der beugungsbegrenzten Richtung beträgt. Bevorzugt liegt das Vielfache zwischen zwei und sechs, besonders bevorzugt bei vier. Dieser Wert führt dazu, dass das beugungsbegrenzte Fleckbild 23 in beiden Richtungen mit ausreichender Ortsauflösung auf der Detektionsfläche 22 erfasst wird.
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So entsteht bei der nun beugungsbegrenzten Abbildung des mit dem Beleuchtungsfleck
14 beleuchteten Fleckes in der Fokalebene
29 in der zugeordneten konjugierten Detektionsebene
18 ein Beugungsbild
17. Gemäß der Mikroskopietechnik, wie sie in der
EP 2317362 A1 beschrieben ist, wird durch Überabtastung des Beugungsbildes
17 dessen Struktur analysiert, und im Zusammenhang mit den Scanpositionen, die eine Schrittweite haben, welche klein gegen die minimale Abmessung des Beleuchtungsflecks
14 ist, erfolgt eine Strukturaufklärung, die über die Auflösungsgrenze der beugungsbegrenzten Abbildung hinausgeht. Die Schrittweitenvorgabe der Scan-Positionen gilt natürlich nur für diejenige Richtung, in welcher der Beleuchtungsfleck
14 beugungsbegrenzt ist, also für die Zeilenrichtung (x-Richtung). Die Airy-Scan-Mikroskopie erzeugt dadurch aus einem Einzelbild des Bereichs
20 ein hochaufgelöstes Bild, das in x-Richtung, also in der Richtung, längs der die Beleuchtungszeile
14 beugungsbegrenzt ist, ein Bild mit über die Abbildungsgrenze gesteigerter Auflösung.
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Zur Erläuterung des dabei verwendeten Prinzips seien gedanklich zwei Stellen betrachtet, die in der Fokalebene 29 so eng beieinander liegen, dass sie mit der beugungsbegrenzten Auflösung nicht erfasst werden können. Beim x-Scannen der Beleuchtungsflecks 14 mit Schrittweiten, die klein gegen die x-Abmessung des Beleuchtungsflecks 14 sind, gelangt zuerst eine der beiden Stellen in den Beleuchtungsfleck. Die Strahlungsintensität im Beugungsbild 17 steigt, je mehr diese erste Stelle in den Beleuchtungsfleck 14 gerät. Der Beleuchtungsfleck 14 hat aufgrund seiner beugungsbegrenzten Eigenschaften eine Intensität, die zum Zentrum hin steigt. Somit steigt die Intensität der Strahlung im Beugungsbild 14 in dem Maß, in dem die betrachtete erste Stelle mehr und mehr ins Zentrum des Beleuchtungsflecks 14 rückt. Wenn das Zentrum des Beleuchtungsflecks 14 über die betrachtete Stelle hinweggewandert ist, nimmt die Intensität der Strahlung von dieser ersten Stelle wieder ab. Wäre die gedanklich angenommene zweite Stelle nicht benachbart, würde die Strahlungsintensität im Beugungsbild 17 sogleich wieder abklingen, wobei das Ansteigen und das Abnehmen der Strahlungsintensität im Beugungsbild 17 exakt mit dem Verlauf der Beleuchtungsintensität des Beleuchtungsflecks 14 (unter Berücksichtigung der Schrittweite und der Fluoreszenzempfindlichkeit der ersten Stelle) korreliert. Da nun aber eine zweite Stelle in enger Nachbarschaft vorhanden ist, beginnt diese zweite Stelle ebenfalls Fluoreszenzstrahlung zum Beugungsbild 17 beizusteuern, und zwar umso mehr, je näher ihr das Zentrum des Beleuchtungsflecks 14 rückt. Ansonsten gilt für die zweite Stelle natürlich genau das gleiche, wie für die erste Stelle. Im Ergebnis erhält man für die Schrittpositionen Beleuchtungsintensitäten im Beugungsbild 17, die anders sind, als wenn nur eine einzelne fluoreszierende Stelle vorhanden wäre. Durch die Auswertung der Daten des Flächendetektors 19 und Berücksichtigung der aktuellen Scanposition lässt sich damit mathematisch ermitteln, dass und auch in welchem Abstand zwei Stellen in der Fokalebene 29 fluoreszierten, obwohl diese zwei Stellen mit einer beugungsbegrenzten Auflösung für sich alleine nicht identifizierbar wären. In der dem Fachmann technisch bekannten Umsetzung wird zur Auswertung der Daten des Flächendetektors 19 für jede Scanposition eine Gleichung aufgestellt, die mehrere Unbekannte enthält, insbesondere Intensität und Abstand der Stellen in der Fokalebene 29. Durch die Vielzahl an Scanpositionen erhält man ein Gleichungssystem, das überbestimmt ist und es erlaubt, Strahlungsintensität und Abstand, d. h. damit auch die Lage, der fluoreszierenden Stellen zu ermitteln. Dies wird nachfolgend noch erläutert werden.
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Zur Erläuterung der mathematischen Analyse der Aufstellung des Gleichungssystems bezeichnet man mit O(r) das Objekt, mit E(r) die Punktbildverwaschungsfunktion (PSF) der Anregung und mit H(r) die PSF der Detektion. Dann erhält man als Signal D(r, p) für jeden Bildpunkt folgende Gleichung, wobei r den Abstand vom Ort p des Beleuchtungsflecks bezeichnet:
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Eine Fourier-Transformation von D(r, p) bezüglich des Ortes p liefert: D(r, ω) = O(ω)FTr,{E(r')H(r' + r)}
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Das Produkt im Realraum wird im Fourier-Raum die folgende Faltung:
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Führt man eine Trägerfunktion am Ort r ein: EH(r, ω) = FTr,{E(r')H(r' + r)} ergibt sich aus Gleichung (2) D(r, ω) = O(ω)EH(r, ω) (3)
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Unterschiedliche Orte r am Flächendetektor werden mittels eines Wiener-Filters (vgl.
http://en.wikipedia.org/wiki/Wiener_deconvolution) kombiniert
wobei 〈|O(ω)|
2〉 und 〈|n(ω)|
2〉 die entsprechenden spektralen Leistungsdichten des Signals (”O”) und des Rauschens (n) sind.
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Obige Gleichungen (1) und (4) gehen von sphärischen Koordinaten aus. In der kartesischen Schreibweise, die sich aufgrund des Zeilen-Scannens mit Zeilen, die sich längs der x-Achse erstrecken und unterschiedliche Lagen in y-Achse haben, anbietet, ergibt sich für die Gleichung (1)
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Dies lässt sich umschreiben in:
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Aufgrund des Scanvorgangs lässt sich E(x', y', z') = E
line (x', z') und damit Gleichung (6) wie folgt schreiben:
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Eine Fourier-Transformation dieser Gleichung für p
x und p
z ergibt:
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Fouriertransformiert man diese Gleichung für y, erhält man hingegen:
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Gibt man den Koordinaten in y-Richtung Indizes und betrachtet diese Gleichung für die Fokalebene
29, in der z = 0 gilt, erhält man
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Unterschiedliche y
i-Koordinaten werden wiederum mittels eines Wiener-Filters wie folgt kombiniert:
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Diese Gleichung (7) entspricht der Gleichung (4) in entsprechender Schreibweise für kartesische Koordinaten und bei Berücksichtigung der Punktbildverwaschungsfunktion für die linienförmige Beleuchtung.
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Mittels der oben geschilderten Auswertungsgrundsätze erzeugt das Steuergerät C ein hochaufgelöstes weiteres Bild der Probe, das in x-Richtung höher aufgelöst ist, als es die Auflösungsgrenze der verwendeten Optik zulässt. Dieses weitere hochaufgelöste Bild kann aus jedem der Einzelbilder des erzeugten Satzes an Einzelbildern gewonnen werden. Es wird mit dem hochaufgelösten Bild, das mittels SIM-Technik erzeugt wurde, und das eine Hochauflösung längs der y-Richtung hat, zu einem Gesamtbild kombiniert, das dann sowohl in x- als auch in y-Richtung eine Auflösung hat, die besser ist, als die Auflösungsgrenze der verwendeten Optik bei normalem SIM-Betrieb zulässt.
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Bei der Kombination zu einem Gesamtbild besteht eine erste Möglichkeit, die Verrechnungsschritte nacheinander auszuführen, d. h. zuerst die Einzelbilder zur Auflösungssteigerung in x-Richtung zu prozessieren und die damit erhaltenen Einzelbildern dann über den im Stand der Technik bekannten SIM-Algorithmus mit der Auflösungssteigerung in y-Richtung zu versehen. Die entsprechenden Berechnungsschritte sind bei dieser ersten Möglichkeit aufwandsgering durchzuführen. Eine zweite Möglichkeit, die einen vergleichsweise höheren Rechenaufwand zugleich aber eine schnellere Bildgewinnung mit sich bringt, besteht in einer gemeinsamen Verrechnung in der eine eingeschlossene Entfaltung in einem Schritt über alle Daten geschieht. Als Ergebnis ist die Anzahl der Bilder aufgrund des mit ausgeführten SIM-Algorithmus kleiner.
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Zusätzlich zum beschriebenen Betriebsmodus, in dem ein hochaufgelöstes Bild erzeugt wird, kann das Mikroskop 1 auch auf eine Art und Weise betrieben werden, die kein hochauflösendes Bild erzeugt.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 5867604 [0007]
- EP 1157297 B1 [0007]
- WO 2006127692 A1 [0008]
- DE 102006021317 A1 [0008]
- EP 2317362 A1 [0009, 0009, 0017, 0040]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Hell, ”Far-Field Optical Nanoscopy”., Science 316, 1153–1158, 2007 [0008]
- http://en.wikipedia.org/wiki/Wiener_deconvolution [0046]
