DE102020209889A1

DE102020209889A1 - Mikroskop und Verfahren zur mikroskopischen Bildaufnahme mit variabler Beleuchtung

Info

Publication number: DE102020209889A1
Application number: DE102020209889.1A
Authority: DE
Inventors: Tiemo Anhut; Daniel Schwedt; Yauheni Novikau
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2020-08-05
Filing date: 2020-08-05
Publication date: 2022-02-10
Also published as: US20220043246A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop (1) aufweisend einen Anregungsstrahlengang zur Führung von Anregungslicht mit einer Laserlichtquelle (2) zur Bereitstellung eines Laserlichtstrahls als Anregungslicht und einer Scanvorrichtung (6) zur Ausrichtung und Bewegung eines fokussierten Laserlichtstrahls in der Eintrittspupille (EP) eines Beleuchtungsobjektivs (8); wobei der Laserfokus (18) in einen zur optischen Achse (oA) des Beleuchtungsobjektivs (8) versetzten Eintrittsort gerichtet ist; sowie einen Detektionsstrahlengang zur Führung von Detektionslicht, umfassend ein Mikrolinsenarray (12) aufweisend eine Brennebene zur Erzeugung von Teilabbildungen und einen in der Brennebene des Mikrolinsenarrays (12) angeordneten Detektor (14) zur Erfassung der Teilabbildungen. Außerdem ist eine Auswerteeinheit (16) zur Auswertung der erfassten Bildsignale des Detektors (14) nach der Lichtfeldtechnologie vorhanden.Erfindungsgemäß ist im Anregungsstrahlengang zwischen Laserlichtquelle (2) und Scanvorrichtung (6) ein ansteuerbares Mittel zur Einstellung der Phasenverteilung (4) des Laserlichtstrahls und dessen Intensitätsverteilung in der Eintrittspupille (EP) angeordnet.Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur mikroskopischen Bildgebung.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie ein Verfahren zur mikroskopischen Bildaufnahme mit einstellbarer variabler Beleuchtung.
Die Lebenswissenschaften nehmen in den vergangenen Jahrzehnten zunehmend das Studium dicker Gewebestrukturen bis hin zu ganzen Tieren in den Fokus. Dies ist nicht zuletzt getrieben durch ein zunehmendes Altern unserer Gesellschaft und dem daraus resultierenden Anstieg der Häufigkeit zerebraler Erkrankungen wie Demenz und Parkinson und dem Interesse an deren Erforschung.
Um die zugrundeliegenden Mechanismen dieser Krankheiten zu verstehen, werden aktive Gehirne quasi beim „Denken“ beobachtet. Dabei werden große Volumina zerebralen Gewebes untersucht und die Wechselwirkung, Verknüpfung und Reizweiterleitung zwischen den Zellen eines neuronalen Netzwerkes studiert. Demzufolge müssen dreidimensional aufgelöste Bilddaten innerhalb kürzester Zeit aufgenommen werden, wobei die betrachteten Volumina Abmessungen von beispielsweise 1000 x 1000 x 100 µm oder sogar noch größer aufweisen. Um solche großen Volumina innerhalb einer kurzen Zeitdauer abbilden zu können, wird häufig auch eine geringere Auflösung in Kauf genommen.
Aus dem Stand der Technik bekannte Methoden der dreidimensionalen Bildgebung sind beispielsweise die konfokale Laserscanmikroskopie (LSM) und deren Abwandlungen. Bei diesen Methoden werden aufgrund des optischen Schneidens (sectioning) mittels der Raumfilterung an einer konfokalen Loch- oder Schlitzblende (Pinhole) sehr kontrastreiche Bildstapel mit hoher Hintergrundunterdrückung erzeugt. Allerdings resultiert die sequenziell abtastende Bildaufnahme in einer sehr geringen Bildrate. Die konfokale Mikroskopie erlaubt die Akquise von Proben mit einer Dicke von 100 µm und mehr.
Sollen noch dickere Proben untersucht werden, kann die Mehrphotonenanregung angewendet werden. Diese erlaubt aufgrund des reduzierten Streuquerschnittes des nahinfraroten Anregungslichtes auch in größeren Gewebetiefen noch die Ausbildung eines kompakten Fokus. Auch diese Methode tastet das Probenvolumen sequenziell ab, erschließt aber Gewebedicken bis ca. 1 mm.
Bei Anwendung der Spinning-Disc-Mikroskopie wird dagegen die Probe mit ca. 1000 Bildpunkten (Spots) gleichzeitig abgetastet, indem das durch eine rotierende Pinholescheibe fokussierte Anregungslicht in die Probe gerichtet wird. Eine in der Probe angeregte emittierte Fluoreszenz wird wiederum durch die Pinholes der Pinholescheibe auf eine Kamera abgebildet. Die Spinning-Disc-Mikroskopie neigt bei großen Probendicken (> 30 µm) zum Übersprechen benachbarter Pinholes, so dass bei dicken Proben die Qualität der Hintergrundunterdrückung abnimmt.
In der Lichtblattmikroskopie wird in der Regel eine mit zylindrischen Optiken erzeugte Linienbeleuchtung orthogonal zur Detektionsrichtung in die Probe eingestrahlt, so dass das Detektionsobjektiv auf eine beleuchtete Fläche in dessen Fokusebene schaut. Die Dicke des Lichtblattes bestimmt das optische Schneiden und somit die Hintergrundunterdrückung. Die Detektion ist eine reine Weitfeldanordnung. Die erreichbare Bildrate ist durch die Kamera bestimmt und die Volumenrate ist abhängig von der Geschwindigkeit, mit der die Probe durch die Fokusebene des Detektionsobjektives bewegt werden kann.
Inspiriert von der Lichtblattmikroskopie wird bei der Oblique Plane Microscopy (OPM; zum Beispiel US 9,638,909 B2 ) und bei der Swept Confocally Aligned Planar Excitation Microscopy (SCAPE; z. B. WO 2008/078 083 A1 ) das Lichtblatt im Randbereich eines als Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv dienenden Objektivs eingestrahlt. Bei dieser Variante der Mikroskopie wird nur ein Objektiv für die Beleuchtung und die Detektion benötigt, was eine grundsätzliche Verwendbarkeit für alle Proben eröffnet.
Bei dem SCAPE-Verfahren wird mittels einer nicht vergrößerten Abbildung der Fluoreszenz eine im Wesentlichen aberrationsfreie Kopie der Probe in einem Zwischenbild erzeugt. Mit einem weiteren Detektionsobjektiv wird orthogonal auf diese Kopie des inkliniert eingestrahlten Lichtblatts geschaut. Um einen z-Stapel zu erzeugen, wird das inklinierte Lichtblatt lateral durch die Probe gescannt. Auch dieses System kann prinzipiell große Probenvolumina mit hohen Geschwindigkeiten erfassen. Nachteilig ist jedoch der große gerätetechnische Aufwand einerseits und andererseits der Umstand, dass nicht die volle Numerische Apertur (NA) zur Detektion der Fluoreszenz genutzt werden kann. Es gehen damit wertvolle Fluoreszenzphotonen verloren. Zudem ist ein Objektivwechsel bei OPM und SCAPE nur sehr schwer möglich, da das Objektiv an der Probenebene und das Objektiv am Zwischenbild aufeinander abgestimmt oder gar identisch sein sollen.
Im Gegensatz zu den Verfahren OPM und SCAPE wird gemäß einer aus der WO 2015/124648 A1 bekannten Methode die volle Detektions-NA genutzt, indem die Detektion mittels kubischer Phasenmasken, Axicon-Linsen oder Mikrolinsenarrays (Anwendung der Lichtfeldtechnologie) mit einer vergrößerten Schärfentiefe (extended depth of field; EDOF) erfolgt. Beispielsweise wird in einem in der WO 2015/124648 A1 offenbarten Verfahren das inklinierte dünne Lichtblatt lateral gescannt. Unter Nutzung der Kenntnis von dessen Position wird ein dreidimensionales Modell der Probe berechnet. Dabei kann eine EDOF-Detektion genutzt werden, wie man sie beispielsweise mit einem Axicon im Detektionsstrahlengang umsetzen kann. Realisiert man hingegen die Detektion basierend auf einem Lichtfeldansatz, so kann man daraus algorithmisch ein dreidimensionales Volumen rekonstruieren. Zusätzlich kann die Position des eher dünnen Lichtblattes berücksichtigt werden, wodurch eine Erhöhung der axialen Auflösung und eine effektive Diskriminierung des Hintergrundes möglich ist.
Dagegen wird in einer als Selective Volume Imaging Microscopy (SVIM) bezeichneten Methode ein gegebenenfalls inkliniertes, jedoch dickes Lichtblatt erzeugt und verwendet, um lediglich außerfokalen Hintergrund zu unterdrücken. Das Probenvolumen wird im Wesentlichen instantan beleuchtet, so dass ein Scannen kaum mehr nötig ist. Die dreidimensionalen Bildinformationen werden über eine Lichtfeldverrechnung ermittelt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde eine Vorrichtung vorzuschlagen, mittels der neben der Erzeugung eines inklinierten Lichtblatts wahlweise verschiedene Beleuchtungsmodi umgesetzt werden können. Aufgabe der Erfindung ist es außerdem, ein Verfahren zur mikroskopischen Bildgebung vorzuschlagen, bei dem wahlweise verschiedene Beleuchtungsmodi erzeugt und angewendet werden können.
Die Aufgabe wird mit einem Mikroskop gemäß dem unabhängigen Anspruch 1 und einem Verfahren gemäß dem unabhängigen Anspruch 7 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Das Mikroskop weist einen Anregungsstrahlengang zur Führung von Anregungslicht auf. Der Anregungsstrahlengang umfasst eine Laserlichtquelle zur Bereitstellung eines Laserlichtstrahls als Anregungslicht sowie eine Scanvorrichtung zur Einstellung eines Einstrahlwinkels eines fokussierten Laserlichtstrahls in einen Laserfokus in der Objektivpupille, auch als Eintrittspupille bezeichnet, eines als Beleuchtungsobjektiv fungierenden Objektivs. Dabei ist der Laserfokus in einen radial zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs versetzten Eintrittsort gerichtet. Dies führt im Ergebnis zu einem schräg zur optischen Achse des Objektivs verlaufenden (inklinierten) Lichtstrahl. Die Schrägstellung hängt dabei wesentlich von der radialen Entfernung des Eintrittsortes von der optischen Achse ab. Die Richtung des inklinierten Lichtstrahls wird wesentlich durch die relative Winkellage des Eintrittsorts bestimmt. Um ein Lichtblatt zu erzeugen, kann der Einstrahlwinkel verändert, beispielsweise schnell innerhalb eines definierten Winkelbereichs hin und her bewegt (gescannt) werden. Alternativ wird er bereits in einer Ausprägung in die Eintrittspupille eingestrahlt, die objektseitig ein Lichtblatt bewirkt.
Weiterhin weist das Mikroskop einen Detektionsstrahlengang zur Führung von Detektionslicht auf. Dieser umfasst ein Mikrolinsenarray, das eine Brennebene besitzt. In die Brennebene wird durch Wirkung des Mikrolinsenarrays eine Mehrzahl von Teilabbildungen abgebildet, die mit einem dort angeordneten ortsaufgelösten Detektor erfasst werden können. Das Mikroskop weist außerdem eine Auswerteeinheit auf, die zur Auswertung der erfassten Bildsignale des Detektors nach der Lichtfeldtechnologie konfiguriert ist. Das heißt, die Auswertung erfolgt anhand und unter Berücksichtigung von Ortsinformationen und Winkelinformationen der je Detektorelement (Pixel) des Detektors erfassten Lichtstrahlen.
Erfindungsgemäß ist das Mikroskop dadurch gekennzeichnet, dass im Anregungsstrahlengang zwischen der Laserlichtquelle und dem Scanner ein ansteuerbares Mittel zur Einstellung der Intensitätsverteilung in einer Objektivpupille (fortan auch: Eintrittspupille) angeordnet ist. Dazu wird beispielsweise die Phasenverteilung des Laserlichts, also die Intensität und die, insbesondere transversale, Phase (Phasenverteilung), gesteuert beeinflusst. Infolge der Einstellbarkeit der Phasenverteilung kann eine daraus resultierende Intensitätsverteilung sowie ein jeweiliger Eintrittsort des Laserlichtstrahls in der Eintrittspupille eingestellt werden.
Kern der Erfindung ist die Schaffung einer Möglichkeit, mittels der im Anregungsstrahlengang das Anregungslicht gesteuert modifiziert werden kann und durch Wirkung des modifizierten Anregungslichts die räumliche und/oder zeitliche Ausprägung eines in die Probe einzustrahlenden Lichtstrahls oder Lichtblatts einstellbar ist. Dabei wirkt die Erzeugung mindestens eines inklinierten Lichtblatts mit der Auswertung des erfassten Detektionslichts nach den Prinzipien der Lichtfeldtechnologie vorteilhaft zusammen.
Das Mikrolinsenarray kann in einer Bildebene oder in einer zur Eintrittspupille des Detektionsobjektivs konjugierten Ebene (Fourier-Lichtfeldtechnologie) angeordnet sein.
In der (Fourier-)Lichtfeldtechnologie wird das Detektionslicht mittels des Mikrolinsenarrays in eine Vielzahl von Teilabbildungen aufgeteilt. Jede der Mikrolinsen wirkt optisch wie eine einzelne Subapertur und erzeugt dabei ein Abbild der Probe unter Verwendung eines ihr zugeordneten Teils des Winkelspektrums. Die Probe wird somit aus verschiedenen Blickrichtungen betrachtet. Die von den Subaperturen bewirkten Bildpunkte sind zu ihren benachbarten Bildpunkten verschieden und werden mittels der Detektorelemente des Detektors einzeln erfasst. Das hat den Vorteil einer Abbildung des Probenvolumens ohne Artefakte auf den Detektor. Im Anschluss erfolgt eine Verrechnung der Vielzahl von Bildpunkten, wobei die vielen einzelnen Informationen eine rechnerische Erstellung, wahlweise einer zweidimensionalen oder dreidimensionalen Abbildung, erlauben. Aus der resultierenden Parallaxe kann schließlich auf eine Abbildung des Probenvolumens zurückgerechnet werden.
Der Detektor kann einen zweidimensionalen Chip mit Detektorelementen, beispielsweise ein CCD-Chip, ein CMOS, ein sCMOS-Chip oder ein SPAD-array (single photon avalanche diode) aufweisen. Der Detektor kann ferner tauglich für die Durchführung von FLIM-Untersuchungen sein (Fluoreszenzlebensdauermikroskopie; fluorescence lifetime imaging microscopy). Ein erfindungsgemäßes Mikroskop kann mehrere Detektoren aufweisen, die in einem gemeinsamen oder in separaten Detektionskanälen angeordnet sein können. Es ist auch möglich, dass ein Detektor zum Erfassen unterschiedlicher Bilddaten, beispielsweise von Bilddaten, die von unterschiedlichen Orten oder Wellenlängen herrühren, ausgebildet ist. Beispielsweise kann die Detektionsfläche des Detektors physisch und/oder funktionell unterteilt sein, so dass die unterschiedlichen Bilddaten jeweils von einem dafür vorgesehenen Anteil der Detektorelemente (die Anteile sind ebenfalls als Detektionskanäle anzusehen) erfasst werden. Die Detektionskanäle können räumlich, zeitlich und/oder spektral unterschiedliche Bilddaten enthalten.
Das Detektionslicht wird insbesondere dadurch angeregt, dass die Probe mit Licht emittierenden Markern, insbesondere mit Fluoreszenzmarkern, versehen ist. Durch Wirkung des auf die jeweils anzuregenden Marker abgestimmten Wellenlänge beziehungsweise Wellenlängen des Anregungslichts werden die beleuchteten Marker zur Emission beispielsweise von Fluoreszenzstrahlung als Detektionslicht angeregt.
Von zentraler Bedeutung für die Erfindung ist das im Anregungsstrahlengang angeordnete ansteuerbare Mittel zur Einstellung der Phasenverteilung des Laserlichtstrahls und dessen Intensitätsverteilung in der Eintrittspupille. Dieses Mittel kann ein Lichtmodulator (spatial light modulator; SLM) beispielsweise in der Form eines Phasen-SLMs oder eines Flüssigkristalls auf einem Siliziumsubstrat (liquid cristal on silicon; LCOS) sein. Weiterhin kann das ansteuerbare Mittel nematische Flüssigkristalle umfassen, ein Mikrospiegelarray (digital (micro-)mirror device; DMD) oder ein mikro-elektro-mechanisches System (micro electro mechanical systems; MEMS) sein. Im Folgenden wird das Mittel zur Einstellung der Phasenverteilung des Laserlichtstrahls und dessen Intensitätsverteilung in der Eintrittspupille auch vereinfachend als SLM bezeichnet.
Die Manipulation der Phasenverteilung des Anregungslichtes und der Intensitätsverteilung in der Eintrittspupille bestimmt mindestens einen Parameter der Lichtverteilung in der Eintrittspupille, wie zum Beispiel die Position des Eintrittsorts des Anregungslichts, den Durchmesser und/oder die Querschnittsform des Strahlenbündels des Anregungslichts. Ebenfalls kann dadurch ein Aspektverhältnis der Lichtverteilung und/oder die Anzahl der simultan genutzten Eintrittsorte bestimmt werden.
Um die eingestellte Phasenverteilung auf die abzubildende Probe wirken lassen zu können, ist die Scanvorrichtung in einer Brennebene einer Abbildungsoptik angeordnet. Die Lichtverteilung auf der Scanvorrichtung, also in einer Scannerebene, wird durch die mittels des SLM eingestellten Phasenverteilung bewirkt. Der SLM und die Objektivpupille stehen über eine Fouriertransformation zueinander in Beziehung. Auf diese Weise lassen sich über Einstellung einer Phasenverteilung am SLM unterschiedliche Beleuchtungsmodalitäten und Intensitätsverteilungen in der Pupillenebene des Objektivs (Eintrittspupille) und damit auch in der Probe realisieren. Eine resultierende Intensitätsverteilung in der Eintrittspupille wird durch Wirkung des SLM oder durch eine Kombination der Wirkungen von SLM und Scanvorrichtung erreicht.
Das Mikroskop umfasst neben der Auswerteeinheit vorteilhaft eine Steuereinheit, die beide beispielsweise als je ein Rechner oder als Kompartimente eines Rechners ausgebildet sein können. Mittels der Steuereinheit werden Steuerbefehle generiert, mit denen beispielsweise der SLM und die Scanvorrichtung sowie optional der Detektor beziehungsweise die Detektoren angesteuert werden können. So wird beispielsweise mittels der Steuereinheit der Detektor auf die Beleuchtung, d.h. auf Scanvorrichtung und SLM, getriggert. Eine Änderung der Beleuchtungssituation, beispielsweise eine neue Ansteuerung des Scanners und/oder eine neue Einstellung der Phasenverteilung des SLM können eine neue Bildaufnahme bewirken. Mittels der entsprechend konfigurierten Auswerteeinheit werden die von der Kamera aufgenommenen Einzelbilder im Sinne der Lichtfeldtechnologie zu Bildstapeln verrechnet. Die Auswerteeinheit steht mit der Steuereinheit in einer zur Übertragung von Daten geeigneten Weise in Verbindung.
In einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskops dient ein vorhandenes Objektiv sowohl als Beleuchtungsobjektiv zur Beleuchtung einer abzubildenden Probe als auch als Detektionsobjektiv zur Erfassung von Detektionslicht. In einer solchen Gestaltung wird lediglich ein Objektiv benötigt und es wird neben den Kosten auch Bauraum eingespart. Die weiteren Erläuterungen der Erfindung beziehen sich beispielhaft auf ein solches Objektiv.
Wie oben erläutert, ermöglichen die einzelnen Winkelspektren der jeweiligen Mikrolinsen eine rechnerische zwei- und/oder dreidimensionale Rekonstruktion der Probe. Um dafür die volle Tiefeninformation zu erhalten, sollte der tatsächliche Ausleuchtungsdurchmesser in der Ebene des Mikrolinsenarrays an die Größe des Detektors angepasst sein. Die Größe des Kamerachips bestimmt daher den maximal nutzbaren Durchmesser der Ausleuchtung in der Ebene des Mikrolinsenarrays.
Das kann nach einem Wechsel des (Detektions-)Objektives bedeuten, dass der Vergrößerungsmaßstab der Abbildungsoptik, allgemeiner formuliert: des Detektionsstrahlengangs, angepasst werden muss, um eine zur Objektivpupille konjugierte Ebene zu erzeugen. Eine Anpassung kann in einer weiteren Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskops durch ein Mittel zur Einstellung eines Vergrößerungsmaßstabs beispielsweise des Detektionsobjektivs beziehungsweise des Objektivs im Detektionsstrahlengang erfolgen. Ein solches Mittel kann beispielsweise eine Zoomoptik oder ein Wechselteleskop sein. Ohne ein solches Mittel zur Einstellung eines Vergrößerungsmaßstabs wäre die optimale und verlustfreie Verwendung des Systems des Mikroskops auf eine Objektivklasse (z. B. 40x/NA 1,2; 20x/NA 0,6;...) mit konstantem Verhältnis von Vergrößerung und numerischer Apertur eingeschränkt.
Da mit einem Wechsel beispielsweise des Detektionsobjektivs eine axiale Verschiebung der Eintrittspupille einhergehen kann, ist in einer möglichen vorteilhaften Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskops eine brennweitenveränderliche Abbildungsoptik im Detektionsstrahlengang vorhanden, die zur Einstellung der Übertragungslänge der Abbildung der Eintrittspupille des Detektionsobjektives in die Ebene des Mikrolinsenarrays ausgebildet ist. Eine solche variable Optik dient daher zur Verschiebung der axialen Position einer zur Eintrittspupille konjugierten Ebene in die Position des Mikrolinsenarrays.
Die Erfindung kann mit mehreren Wellenlängen des Anregungslichts und des Detektionslichts verwendet werden. In einer möglichen Ausführung wird Anregungslicht mit zwei oder mehr Anregungswellenlängen unter jeweils verschiedenen Einstrahlwinkeln in die Eintrittspupille des Objektivs gerichtet, um eine farbselektive Detektion zu erreichen. Aufgrund der individuellen Einstrahlwinkel beleuchten die entstehenden Lichtstrahlen beziehungsweise die mit diesen erzeugten Lichtblätter räumlich separierte Probenbereiche. Nach der Erfassung zweidimensionaler Lichtfeldrohdaten der verschiedenen Lichtblätter wird aus diesen Rohdaten mathematisch ein dreidimensionaler Datensatz erzeugt. Auch wenn die Emission der mit den mindestens zwei Anregungswellenlängen anregbaren Markern in einigen Teilbildern der Lichtfeldrohdaten einander räumlich überlagert sein sollte, so ist das Detektionslicht im Endergebnis doch räumlich nach Markern separiert und kann daher einfach ausgeschnitten und in Datenstapel einsortiert werden, die den jeweiligen Markern zugeordnet sind. Optional kann ein Sperrfilter für rückgestreutes Anregungslicht im Detektionsstrahlengang angeordnet sein.
In einer möglichen Ausführung eines erfindungsgemäßen Mikroskops wird im Anregungsstrahlengang durch die entsprechend ausgebildete Laserlichtquelle Laserlicht mehrerer Wellenlängen bereitstellt. Alternativ können mindestens zwei Laserlichtquellen zur Bereitstellung von Laserlicht unterschiedlicher Wellenlänge vorhanden sein. Durch Wirkung des SLM wird Laserlicht der jeweiligen Wellenlängen mit jeweils verschiedenen Einstrahlwinkeln in den Laserfokus in der Eintrittspupille gerichtet. Im Detektionsstrahlengang wird durch Wirkung des Laserlichts der jeweiligen Wellenlängen hervorgerufenes und erfasstes Detektionslicht auf räumlich unterschiedlichen Detektorflächen eines Detektors oder auf mehreren Detektoren getrennt erfasst.
In alternativen Ausführungen kann im Detektionsstrahlengang wenigstens ein Mittel zur Aufteilung erfassten Detektionslichts auf mehrere Detektionskanäle vorhanden sein. In einer entsprechenden Ausführungsmöglichkeit kann das Detektionslicht beispielsweise mittels mindestens eines, gegebenenfalls zusätzlich zu einem Hauptfarbteiler vorhandenen, dichroitischen Teilers auf verschiedene Detektionsstrahlengänge (Detektionskanäle) aufgeteilt sein und durch jeweils separate Detektoren oder räumlich unterschiedliche Detektorflächen eines Detektors erfasst werden. Eine solche Ausführung hat den Vorteil, dass die Bilddeckung beider Kanäle ohne ein Überscannen des Bildfeldes gegeben ist. Solche Ausführungen können wieder mit Mikrolinsenarrays vor den jeweiligen Detektoren versehen sein. Alternative Ausführungen können auch ohne Mikrolinsenarray realisiert sein, indem die Farbteilung erst hinter dem in der zur Objektivpupille konjugiert angeordneten Mikrolinsenarray erfolgt und entsprechend auf die Detektoren beziehungsweise auf dafür vorgesehene Bereiche eines Detektors abgebildet wird.
Das ebenfalls zur Lösung der Aufgabe vorgeschlagene Verfahren zur mikroskopischen Bildgebung kann unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Mikroskops durchgeführt werden. Bei dem Verfahren wird Laserlicht mindestens einer Wellenlänge einer Laserlichtquelle als Anregungslicht entlang eines Anregungsstrahlengangs gerichtet und fokussiert. Mittels eines lichtlenkenden Elements, beispielsweise mittels einer Scanvorrichtung, wird der fokussierte Laserlichtstrahl in die Eintrittspupille (Objektivpupille) des Objektivs gerichtet. Dabei wird der Laserfokus in einen radial zur optischen Achse des Objektivs versetzten Eintrittsort in der Eintrittspupille gelenkt.
Aus einer mit dem Laserlicht beleuchteten Probe stammendes Detektionslicht wird gesammelt und entlang eines Detektionsstrahlengangs auf ein Mikrolinsenarray gerichtet. Dabei kann das Mikrolinsenarray in oder nahe einer zur Objektivpupille, beispielsweise eines Detektionsobjektivs, konjugierten Pupille angeordnet sein. In weiteren Ausführungen der Erfindung ist das Mikrolinsenarray in einer zum Objekt im Wesentlichen optisch konjugierten Zwischenbildebene angeordnet. Das Mikrolinsenarray weist eine Brennebene zur Erzeugung von Teilabbildungen auf, wie dies oben bereits ausgeführt ist. Die in der Brennebene erzeugten Teilabbildungen werden detektiert und anhand von Ortsinformationen und Winkelinformationen der je Detektionselement des Detektors erfassten Lichtstrahlen ausgewertet.
Gekennzeichnet ist das Verfahren dadurch, dass im Anregungsstrahlengang die Phasenverteilung des Laserlichtstrahls und eine daraus resultierende Intensitätsverteilung in der Eintrittspupille gesteuert beeinflusst wird, beziehungsweise das Vorliegen einer erforderlichen Beeinflussung der Phasenverteilung und der resultierenden Intensitätsverteilung geprüft wird.
Eine Prüfung kann zum Beispiel durchgeführt werden, wenn die bisherige Konfiguration der verwendeten optischen Vorrichtung, insbesondere eines Mikroskops, bekannt ist und die Konfiguration verändert wird. Beispielsweise können die verwendete Wellenlänge des Anregungslichts, ein Vergrößerungsmaßstab des Detektionsstrahlengangs und/oder ein Schema der Abtastung einer Probe durch das mittels des Beleuchtungsobjektivs geformten Anregungslichts verändert werden. Die Prüfung kann zusätzlich oder alternativ darauf gerichtet sein, die tatsächlich erzielte Wirkung der beeinflussten Phasenverteilung mit einer gewünschten Wirkung zu vergleichen. Ein Ergebnis der Prüfung kann zur Ansteuerung beispielsweise des die Phasenverteilung beeinflussenden Mittels im Sinne einer Feedback-Regelung genutzt werden.
Der außerhalb der optischen Achse in einen Eintrittspunkt in die Eintrittspupille gelenkte Anregungslichtstrahl tritt objektseitig schräg zur optischen Achse aus dem (Beleuchtungs-)Objektiv aus, sodass sein Strahlweg entsprechend schräg zur optischen Achse verläuft. Die Schrägstellung hängt davon ab, wie groß der radiale Abstand des Eintrittspunktes von der optischen Achse ist, an welcher Stelle der Einstrahlpunkt also auf einem, von der optische Achse zum Rand der Eintrittspupille gerichteten Radius liegt.
Um objektseitig ein inkliniertes Lichtblatt zu erzeugen, kann der Einstrahlwinkel des Laserstrahls im Wesentlichen senkrecht zum Radius verändert werden. Der Lichtstrahl wird infolgedessen unter gleichbleibender Schrägstellung in einer Richtung senkrecht zum Radius verschoben und der Beleuchtungsort in der Objektebene wird entsprechend verändert. Erfolgt der Wechsel des jeweiligen Einstrahlwinkels hinreichend schnell und vorzugsweise wiederholt, so wird objektseitig ein inkliniertes Lichtblatt erzeugt.
In einer alternativen Ausgestaltung des Verfahrens wird der Laserfokus in der Eintrittspupille als eine linienförmige Lichtverteilung eingestrahlt, so dass objektseitig des Objektivs ein zur optischen Achse des Objektivs schräggestelltes Lichtblatt erzeugt wird. Die linienförmige Lichtverteilung erstreckt sich im Wesentlichen entlang eines Abschnitts eines Radius der Eintrittspupille. Sollte die linienförmige Lichtverteilung eine längsovale Form aufweisen, liegt die größere der beiden Hauptachsen des Ovals im Wesentlichen entlang eines Radius. Vorteilhaft an dieser Ausgestaltung ist, dass keine Änderung des Einstrahlwinkels im Fokuspunkts in der Eintrittspupille erforderlich ist, um das inklinierte Lichtblatt zu erzeugen. Der Tastgrad (engl. duty cycle) der Beleuchtung wird dadurch deutlich verbessert.
Der Vorteil der Beleuchtung mit einem Lichtblatt ist die zu einem Zeitpunkt lediglich dünne beleuchtete Schicht der Probe und das damit einhergehend vermiedene Bleichen abseits des Lichtblatts. Um nun mit dem Lichtblatt sukzessive größere Bereiche der Probe erfassen zu können, kann zusätzlich zu einer Änderung des Einstrahlwinkels des Laserfokus in der Eintrittspupille quer zum Radius außerdem der Einstrahlwinkel in radialer Richtung verändert werden. Mittels einer entsprechenden Ansteuerung des SLM und einer dadurch bewirkten Änderung der Phasenlage des Laserlichts kann daher auch die Dicke eines Lichtblatts eingestellt werden. Je nach Ausgestaltung des Verfahrens kann auch die Position des Eintrittsorts des als linienförmige Lichtverteilung geformten Laserfokus in radialer Richtung verändert werden. Die Positionsänderungen erfolgen insbesondere schrittweise und nach Beendigung einer Bildaufnahme. Mittels eines erfindungsgemäßen Mikroskops kann daher die Dicke der erzeugten Lichtblätter an die gewünschte Anwendung angepasst werden. Die Dicke kann dabei der eines „klassischen“ dünnen Lichtblatts entsprechen. Es können auch Lichtblätter erzeugt werden, die dicker als übliche Lichtblätter sind und ein entsprechend großes Volumen ausleuchten.
In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens können in einer Beleuchtungssituation mehr als ein Laserfokus, insbesondere zwei Laserfoki, in der Eintrittspupille insbesondere als jeweils eine linienförmige Lichtverteilung (fortan auch: Linienbeleuchtung) eingestrahlt werden. Diese Mehrzahl eingestrahlter Laserfoki wird im Folgenden auch als „Einstrahlmuster“ bezeichnet. Im Ergebnis der Anwendung eines solchen Einstrahlmusters werden objektseitig des Objektivs eine entsprechende Anzahl zur optischen Achse des Objektivs schräggestellte Lichtblätter erzeugt. Überlagern sich diese Lichtblätter ganz oder teilweise, treten in den sich überlagernden Bereichen der Lichtblätter durch Interferenzen bedingte Intensitätsmodulationen oder Interferenzstrukturen (strukturierte Beleuchtungsmuster oder Beleuchtungspattern) auf.
Da das Mikrolinsenarray vor dem Detektor angeordnet ist, wird durch dessen Wirkung die Numerische Apertur des Detektionsobjektivs geteilt. Daher ist die laterale Auflösung der vorgeschlagenen Anordnung gegenüber einem Mikroskop zunächst deutlich reduziert. Der Abstand der beiden Linienbeleuchtungen in der Pupille wird nun so gewählt, dass die entstehende Intensitätsmodulation gerade noch detektiert werden kann.
Dies soll kurz für den Fall erläutert werden, in welchem das Mikrolinsenarray in einer Pupillenebene angeordnet ist. Eine Lichtfelddetektion erfolgt dadurch, dass die Pupille derart aufgeteilt wird, dass eine Vielzahl von Abbildungssystemen mit Subbildern entsteht, die die Probe unter einem jeweils anderen Winkel beobachten. Werden nun die Linienbeleuchtungen so in die Eintrittspupille eingestrahlt, dass das jeweils bewirkte Detektionslicht genau am Rand einer dieser Mikrolinsen in der Pupille ankommt, kann die Raumfrequenz der entstehenden Interferenzstruktur gerade noch in den Subbildern detektiert werden. Die Interferenzstruktur ist am Rande der Auflösungsgrenze für das betreffende Abbildungssystem, nicht aber für das Detektionsobjektiv selbst.
Optional kann durch Hinzunahme der nullten Ordnung auch eine Strukturierung in axialer Richtung eingeführt werden. Diese kann aufgrund des parallaktischen Blicks auf die Probe vorteilhaft zur Bestimmung der dreidimensionalen Strukturverteilung eingesetzt werden kann.
Das Einstrahlen eines Einstrahlmusters über einen gewissen Zeitraum stellt eine Beleuchtungssituation dar. Je Beleuchtungssituation können mindestens zwei, vorzugsweise drei, verschiedene Phasenverteilungen zur Beleuchtung verwendet werden. Je Phasenverteilung wird Detektionslicht als Bilddaten detektiert. Daher werden in einer solchen Verfahrensausgestaltung je Beleuchtungssituation mindestens zwei, vorzugsweise drei, Bilder erfasst. Beispielsweise wird durch Wirkung jeder der Phasenverteilungen ein anderer Eintrittsort angesprungen.
Dieses Vorgehen kann in weiteren Ausgestaltungen auf unterschiedliche Einstrahlmuster angewendet werden. Beispielsweise kann das Einstrahlmuster nach erfolgter Bildaufnahme mit drei unterschiedlichen Phasenverteilungen in der Eintrittspupille verändert, beispielsweise verschoben und/oder gedreht werden. Es können zeitlich nacheinander mehrere Beleuchtungssituationen eingestellt werden, wobei die relativen Lagen der linienförmigen Lichtverteilungen der unterschiedlichen Beleuchtungssituationen jeweils um einen Winkelbetrag verändert werden. So kann das Einstrahlmuster beispielsweis jeweils um ± 120° gedreht, das heißt auf einem Kreisbogen um den betreffenden Winkelbetrag verschoben werden. Das jeweils generierte Beleuchtungsmuster wird dadurch ebenfalls jeweils um 120° gedreht. Mit dieser Art der strukturierten Beleuchtung müssen zwar mindestens neun Bilder aufgenommen werden, allerdings kann ein um ungefähr einen Faktor 2 besser aufgelöstes Bild errechnet werden. Der Kompromiss hinsichtlich der reduzierten Auflösung kann auf diesem Weg abgemildert werden.
Alternativ können verschiedene Phasenverteilungen für die Beleuchtungslinien des Einstrahlmusters simultan erzeugt und eingestrahlt werden. Die Phasenverteilungen können durch eine entsprechende Ansteuerung des Mittels zur Einstellung der Intensitätsverteilung direkt eingestellt werden.
Wird eine strukturierte Beleuchtung beziehungsweise ein strukturiertes Beleuchtungsmuster erzeugt und angewendet, kann eine außerfokale Hintergrundstrahlung reduziert werden. Dazu muss die Strukturierung der Beleuchtung nicht unbedingt nahe der Grenzfrequenz der Abbildungsoptik erfolgen. Die beiden Beleuchtungsmuster der Linienbeleuchtungen können somit näher beieinander liegen. Zudem ist keine Drehung des Einstrahlmusters um 120° und -120° erforderlich, so dass die Hintergrundunterdrückung schon mit drei Bildaufnahmen erreicht werden kann. Diese Verfahrensausgestaltung ist aber bevorzugt bei besonders dicken Proben mit Dicken größer als der erweiterte Schärfentiefenbereich einer Subapertur anzuwenden. Auch eine kontinuierliche Modulation/Demodulation erzeugt einen äquivalenten Effekt. Bei den Verfahren zur strukturierten Beleuchtung ist die Triggerung der Kamera in der Art notwendig, dass die Phasenstrukturen klar aufgelöst werden können.
Es ist in einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens möglich, zwei oder mehr Bereiche in der Eintrittspupille auszuleuchten, sodass simultan lichtblattartige Beleuchtungen in verschiedenen Richtungen entstehen. Bei der Bildauswertung nach der Lichtfeldtechnologie können vorteilhaft alle Ansichten genutzt werden.
Bei einer Beleuchtung mit nur einem Lichtblatt ergibt sich der Effekt, dass diejenigen Linsen des Detektionsstrahlengangs, die in dem Pupillenbereich des Anregungsstrahlengangs liegen, in Richtung des Lichtblattes schauen und so einerseits, insbesondere bei einem eher dünnen Lichtblatt, nur entlang des Lichtblattquerschnittes ein Signal generiert wird und aber viel Rückstreulicht gesammelt wird.
In einem solchen Fall würde man eine Interferenz der verschiedenen Beleuchtungslichtverteilungen in der Probe allerdings vermeiden wollen. Werden beispielsweise zwei Lichtblättern dadurch erzeugt, dass Anregungslicht in zwei sich gegenüberliegende Laserfoki eingestrahlt wird, kann man Interferenz z. B. dadurch vermeiden, dass die Polarisationen der beiden Beleuchtungen so eingestellt werden, dass sie in der Probe senkrecht aufeinander stehen.
Es sei angemerkt, dass derartige Verfahren zum Beispiel mit SCAPE nicht nutzbar sind, da die Beleuchtung immer nur in einer Richtung erfolgen könnte. Neben den Möglichkeiten der Strukturierung kann auch eine Optimierung auf weitere Verfahren erfolgen. So können zum Beispiel auch Verfahren wie SOFI, STORM, dSTORM, PALM etc. mit dem vorgeschlagenen Mikroskop in einem Lichtfeldansatz durchgeführt werden. Für diese Verfahren ist ein möglichst schmales Lichtblatt notwendig, wobei dieses allerding nur einen relativ kleinen Bereich ausleuchten muss. Durch die Lokalisierung wird ebenfalls eine deutliche Erhöhung der Auflösung erzielt.
Mit dem vorgeschlagenen Mikroskop kann eine Vielzahl komplexer Beleuchtungsmuster für unterschiedlichste Anwendungen bewirkt werden. Insbesondere kann in der Eintrittsebene des Objektivs auch eine Apodisierung der Beleuchtungsintensitätsverteilung erfolgen, um zum Beispiel ein Lichtblatt ohne Nebenmaxima zu generieren.
Das Verfahren kann mit mehreren Farben gleichzeitig durchgeführt werden. Gegebenenfalls wird dann eine farbselektive Detektion ausgeführt. Weiterhin kann sowohl eine lineare als auch eine nichtlineare Erzeugung der Fluoreszenz mittels Mehrphotoneneffekt erfolgen.
Vorteile der Erfindung sind beispielsweise die Möglichkeiten, eine Vielzahl von Beleuchtungsmustern erzeugen zu können sowie auf eine Vielzahl von Objektiven adaptieren zu können. Dabei steht für die Detektion die gesamte Numerische Apertur zur Verfügung. Vorteilhaft sind daher eine flexible Einstellung der Beleuchtung der Probe, die eine Vielzahl verschiedener Detektionsstrategien ermöglicht. Das Verfahren ist mit einer Vielzahl weiterer etablierter Mikroskopieverfahren simultan beziehungsweise quasisimultan an einem Stativ, und optional ohne Objektiv, durchführbar.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Dabei zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops;
2 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops;
3 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
4 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
5 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
6a eine schematische Darstellung eines vierten Ausführungsbeispiels einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
6b eine schematische Darstellung des vierten Ausführungsbeispiels einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
7a eine schematische Darstellung eines fünften Ausführungsbeispiels einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
7b eine schematische Darstellung des fünften Ausführungsbeispiels einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
8a eine schematische Darstellung eines sechsten Ausführungsbeispiels einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
8b eine schematische Darstellung des sechsten Ausführungsbeispiels einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
8c eine schematische Darstellung des sechsten Ausführungsbeispiels einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens;

In einem ersten Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung in Form eines Mikroskops 1 sind in einem Anregungsstrahlengang eine Laserlichtquelle 2 zur Bereitstellung eines Laserlichts als Anregungslicht, ein Spiegel 3, ein ansteuerbares Mittel zur Einstellung der Phasenverteilung 4 (SLM 4), optische Linsen 5a, 5b, 5c, eine lichtlenkende Einrichtung 6 oder Scanvorrichtung 6 (auch: Scanner 6), ein Farbteiler 7 und ein als Beleuchtungsobjektiv fungierendes Objektiv 8 mit einer Eintrittspupille EP vorhanden (1). Das in den 1 und 2 verwendete kartesische Koordinatensystem gilt entsprechend auch für die Darstellungen der 3 bis 8c.
In einem Detektionsstrahlengang (durch unterbrochene Volllinien symbolisiert) sind ein Teleskop 11, ein Mikrolinsenarray 12 in einer zur Eintrittspupille EP konjugierten Ebene 13 und ein Detektor 14 in Form einer ortsauflösenden Kamera vorhanden. Der Detektor 14 steht mit einer Steuereinheit 15 in einer zum Austausch von Daten geeigneten Weise in Verbindung. Die Steuereinheit 15 ist ihrerseits mit einer Auswerteeinheit 16 verbunden. Mittels der Steuereinheit 15 können Steuerbefehle generiert werden, die zum Ansteuern des Mittels zur Einstellung der Phasenverteilung 4 (fortan auch kurz: Phasen-SLM 4 oder SLM 4) und der Scanvorrichtung 6 dienen. Die Steuereinheit 15 steht mit den anzusteuernden technischen Elementen in Verbindung. Die Auswerteeinheit 16 ist zur Auswertung und weiteren Aufbereitung der Bilddaten konfiguriert.
Beim Betrieb der erfindungsgemäßen Vorrichtung, insbesondere des Mikroskops 1, wird von der Laserlichtquelle 2 ausgesendetes Laserlicht mittels des Spiegels 3 auf den SLM 4 gelenkt. Im Bedarfsfall ist zwischen der Laserlichtquelle 2 und dem SLM 4 optional noch eine Strahlaufweitungsoptik (nicht gezeigt) vorhanden, um eine hinreichende Anzahl von SLM-Pixel zu beleuchten. Je nach Ansteuerungszustand des SLM 4 wird das auftreffende Laserlicht hinsichtlich seiner Phasenverteilung beeinflusst und als beeinflusstes Anregungslicht reflektiert. Das beeinflusste Anregungslicht (Laserlicht) wird mittels der optischen Linse 5a, die eine Fouriertransformation des Musters der dem Laserlicht aufgeprägten Phasenverteilung bewirkt, fokussiert. Das Laserlicht gelangt über einen oder mehrere weitere Spiegel 3 zu dem Scanner 6. Der durch die Steuereinheit 15 angesteuerte Scanner 6 lenkt das Laserlicht in einer x-Richtung x und/oder in einer y-Richtung y ab. Mit dem Scanner 6 kann der Einstrahlwinkel des Anregungslichtes in einem Eintrittsort in der Eintrittspupille EP (Objektivpupille) variiert werden. Der Eintrittsort wird über die Phasenverteilung bestimmt, die dem beeinflussten Anregungslicht durch Wirkung des SLM 4 aufgeprägt wurde. Der Scanner 6 ist zur Eintrittspupille EP konjugiert angeordnet. Der SLM 4 befindet sich in einer Ebene, die zu der Eintrittspupille EP und dem Scanner 6 in einer durch eine Fouriertransformation beschriebenen Beziehung steht.
Wie nachfolgend noch näher erläutert werden wird, wird das Anregungslicht nach Durchlaufen einer Scannerlinse 5b, einer Tubuslinse 5c und des dichroitischen Farbteilers 7 in einen Eintrittsort in der Eintrittspupille EP gerichtet, der abseits der optischen Achse oA des Objektivs 8 liegt. Im Ergebnis wird objektseitig durch das Objektiv 8 ein zur optischen Achse oA inkliniertes Lichtblatt 9 erzeugt. Befindet sich in einem Probenraum vor dem Objektiv 8 eine Probe 10, kann das Lichtblatt 9 in diese gerichtet werden.
Durch Wirkung des aus dem Anregungslicht gebildeten Lichtblatts 9 kann in der Probe Fluoreszenz angeregt und als Detektionslicht emittiert werden. Emittiertes Detektionslicht wird mit dem Objektiv 8, das sowohl als Beleuchtungsobjektiv als auch als Detektionsobjektiv dient, gesammelt. Durch Wirkung des Farbteilers 7 wird das gegenüber dem Anregungslicht längerwellige Detektionslicht in den weiteren Verlauf des Detektionsstrahlengangs reflektiert und gelangt über das Teleskop 11 zum Mikrolinsenarray 12. Die angedeutet gezeigten Mikrolinsen wirken jeweils als Subaperturen und können als einzelne Abbildungssysteme angesehen werden. Die von den einzelnen Subaperturen bewirkten Bildpunkte werden durch entsprechend positionierte Detektorelemente des Detektors 14 als Bilddaten erfasst und der Steuereinheit 15 und der Auswerteeinheit 16 zugeleitet.
In 2 ist ein zweites Ausführungsbeispiel des Mikroskops 1 gezeigt. Im Detektionsstrahlengang ist eine variable Optik 17 (brennweitenveränderliche Abbildungsoptik 17) angeordnet. Diese kann, wie in 2 schematisch gezeigt, eine Zoomoptik sein, mit der ein Vergrößerungsmaßstab des Detektionsstrahlengangs eingestellt werden kann. In einer weiteren Ausführung des Mikroskops 1 kann die variable Optik 17 eine Optik zur Einstellung der axialen Position einer zur Eintrittspupille EP konjugierten Ebene sein. Da bei einem Objektivwechsel die axiale Position der Eintrittspupille EP variieren kann, ist es vorteilhaft, die dazu konjugierte Ebene entsprechend in die Position des Mikrolinsenarrays 12 verschieben zu können.
In den 3 bis 8c wird jeweils das Objektiv 8, eine Draufsicht auf die Eintrittspupille EP sowie das durch die jeweilige Beleuchtungssituation bewirkte Lichtblatt 9 vereinfacht dargestellt. Neben dem Objektiv 8 sind (außer in 8b und 8c) jeweils Draufsichten auf die in der Probe 10 bewirkten Beleuchtungen in einer x-y-Ebene sowie erzeugte Lichtblätter 9 in einer x-z-Ebene gezeigt.
Die mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop 1 einstellbare Anwendung der Selective Volume Imaging Microscopy (SVIM) ist in 3 gezeigt. In der Eintrittspupille EP wird durch Wirkung des SLM 4 (siehe 1 und 2) Anregungslicht als kleiner Laserfokus 18 (Spot) in einen Eintrittsort abseits der optischen Achse oA eingestrahlt. Infolge der Positionierung dieses Laserfokus 18 am Rand der Eintrittspupille EP wird ein inklinierter Strahlweg des Laserlichts bewirkt. Außerdem ist die Lichtverteilung in der Probe 10 weit ausgedehnt. Wird der Einstrahlwinkel des Laserfokus 18 mittels des Scanners 6 schnell (gekennzeichnet mit: f) und wiederholt entlang der y-Richtung verändert, - und damit der inklinierte Strahlweg des Laserlichts quasi hin und her bewegt (gescannt) -, entsteht im zeitlichen Mittel ein Lichtblatt 9 (mit Volllinie umrandet). Wegen der ausgedehnten Lichtverteilung ist das Lichtblatt 9 entsprechend dick.
Um die gesamte interessierende Region der Probe 10 während der Integrationszeit des Detektors 14 oder in aufeinanderfolgenden, auf die Positionierung des Lichtblattes 9 getriggerten Einzelbildaufnahmen auszuleuchten, wird entsprechend in x-Richtung x ein Satz von Positionen angesprungen (gekennzeichnet mit: st). Dazu wird der Einstrahlwinkel des Laserfokus 18 in der Eintrittspupille EP entsprechend angepasst. Vorzugsweise sind die Positionen der erzeugten Lichtstrahlen beziehungsweise der erzeugten Lichtblätter 9 zueinander äquidistant, um eine gleichmäßige Ausleuchtung und einfache Auswertung der Bilddaten zu erlauben. Beispielhaft sind in 3 zwei weitere Beleuchtungssituationen durch die mit unterbrochenen Volllinien umrandeten Beleuchtungen beziehungsweise Lichtblätter 9 gezeigt. Unterschiedliche Positionierungen können auch erreicht werden, indem die Probe 10 entsprechend quer zur optischen Achse oA verschoben wird.
Die 4 gibt eine zweite Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wieder. Der Laserfokus 18 in der Eintrittspupille EP ist verhältnismäßig groß, wogegen das in die Probe 10 eingestrahlte Strahlenbündel entsprechend schmal ist. Die Erzeugung eines Lichtblatts 9 erfolgt wiederum durch einen schnellen Scan (Änderung des Einstrahlwinkels) entlang der y-Richtung. Die Anzahl der lateral (radial) anzuspringenden Positionen oder Stützstellen muss nun vergrößert werden, um eine vollständige Probenausleuchtung zu erreichen. Die für die Aufnahme der Bilddaten erforderliche Zeit nimmt daher zu. Dafür wird aber der Kontrast der Bilddaten verbessert, weil das schmalere Lichtblatt 9 eine bessere Hintergrundunterdrückung bewirkt. In der Regel erfolgt hierbei eine Triggerung des Detektors 14 (siehe 1 und 2) derart, dass bei Erreichen jeder lateralen Position des Lichtblattes 9 eine Aufnahme erfolgt. Ist das Lichtblatt 9 hinreichend dünn, kann eine weitere Erhöhung der Hintergrunddiskriminierung erreicht sein.
In den 3 und 4 sind jeweils mehrere Lichtblätter 9 im Probenraum gezeigt. Einerseits stellt dies dar, dass mittels des erfindungsgemäßen Mikroskops 1 zeitsequenziell mehrere Positionen des Lichtblatts 9 angefahren werden können. Auf der anderen Seite kann mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop 1 ein Stapel von Lichtblättern 9 in der in 5 gezeigten Art und Weise simultan erzeugt werden. Dazu wird in der Eintrittspupille EP Anregungslicht simultan unter mehreren Eintrittswinkeln eingestrahlt. Der große Durchmesser der Laserfoki 18 bewirkt in der x-y-Ebene je einen kleinen Beleuchtungsspot. Werden die Laserfoki 18 in y-Richtung gescannt, werden in der x-z-Ebene entsprechend schmale Lichtblätter 9 erhalten.
Diese Verfahrensausgestaltung hat den Vorteil, dass durch die Kombination des 3D-Effektes in der Detektion mit einer jeweils lokal begrenzten Anregung gut definierte 3D-Punktbildfunktionen (point spread function; PSF) erhalten werden. Ist die abzubildende Probe 10 optisch zu dick oder zu stark streuend, so muss die Anzahl der simultan erzeugten Lichtblätter 9 reduziert und im Grenzfall auf ein gescanntes Lichtblatt 9 beschränkt werden.
Infolge der inklinierten Beleuchtung kann es zu einer über das Sehfeld variierenden Ausleuchtung der Probe 10 kommen. Dies lässt sich reduzieren, indem mehrere Bilder mit unterschiedlicher Beleuchtungsgeometrie aufgenommen und miteinander verrechnet werden. In den 6a und 6b ist diese Vorgehensweise beispielhaft gezeigt. In 6a sind Beleuchtungssituationen gezeigt, wie diese zu 4 beschrieben ist. Es sind zeitsequenziell mehrere mit dem Lichtblatt 9 beleuchtete Bereiche der Probe 10 erzeugt. Die Positionierungen erfolgen derart, dass sich die beleuchteten Bereiche nicht überschneiden.
Die Beleuchtungsgeometrie kann beispielsweise wie in 6b gezeigt verändert werden. Der Laserfokus 18 ist gegenüber der Position in 6a auf einem Kreisbogen um 90° verschoben. Wiederum werden mehrere Eintrittswinkel des Laserfokus 18 eingestellt und es wird jeweils ein Bild erfasst.
Gegebenenfalls muss bei diesem Vorgehen die Scangeometrie dahingehend angepasst werden, als dass die Veränderung der Eintrittswinkel durch andere Spiegel und/oder durch Nutzung anderer Schwenkachsen realisiert werden müssen.
Ein fünftes Ausführungsbeispiels einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in den 7a und 7b veranschaulicht. Die Phasenverteilung wird durch den SLM 4 gesteuert so eingestellt, dass eine linienförmige Lichtverteilung 18_lin in der Eintrittspupille EP erzeugt wird (7a). Im Ergebnis wird objektseitig ein Lichtblatt 9 erzeugt, ohne dass es dafür einer Scanbewegung bedarf. Die Nutzung einer linienförmigen Lichtverteilung 18_lin kann mit der zu den 6a und 6b beschriebenen Änderung der Beleuchtungssituationen kombiniert werden (7b).
Eine Modulation der Intensitäten des Beleuchtungsmusters kann gemäß eines sechsten Ausführungsbeispiels bewirkt werden. Dazu werden zwei linienförmige und in y-Richtung y nah zueinander beabstandete Lichtverteilungen 18_lin in die Eintrittspupille EP eingestrahlt. Infolge dieses Einstrahlmusters werden zwei Lichtblätter 9 erzeugt, die sich mindestens in Abschnitten ihrer Ausdehnung überlagern. In den sich überlagernden Bereichen der Lichtblätter 9 treten Interferenzen auf, die zu Intensitätsmodulationen führen beziehungsweise führen können (8a; Interferenzen durch Strichmuster der Beleuchtungen in der x-y-Ebene symbolisiert).
Jede Phasenverteilung, die zu einem derart strukturierten Lichtblatt 9 führt, stellt eine Beleuchtungssituation dar. In der 8a sind die zwei linienförmigen Lichtverteilungen 18_lin in Eintrittsorte mit einer Winkellage von etwa 270° in die Eintrittspupille EP gerichtet. Wie bereits beschrieben, können durch eine gesteuerte Einstellung der Phasenverteilung weitere Positionen angesprungen werden, bei denen in der x-y-Ebene bei jeder der Phasen- beziehungsweise Intensitätsverteilungen (bezeichnet mit: 3P) wieder strukturierte Lichtblätter 9 erzeugt werden. Im Ergebnis der so eingestellten verschiedenen Phasenverteilungen 3P wird eine Streifenstruktur der Lichtblätter 9 erzeugt (Streifenstrukturen und deren Ausrichtungen sind lediglich symbolisch). Im Beispiel der 8a sind in den Darstellungen der x-y-Ebene sowie der x-z-Ebene drei Beleuchtungssituationen zusammengefasst.
In den 8b und 8c ist die gleiche Vorgehensweise wie zu 8a gezeigt. Lediglich die Eintrittsorte der linienförmigen Lichtverteilungen 18_lin sind hinsichtlich ihrer Winkellage um jeweils etwa 120° auf einem Kreisbogen verschoben. Aus den insgesamt neun Beleuchtungssituationen kann eine verbesserte dreidimensionale Abbildung der Probe 10 berechnet werden.
Alternativ kann die Phasendifferenz zwischen den jeweils zwei linienförmigen Lichtverteilungen 18_lin auch über den SLM direkt eingestellt werden.
Bezugszeichenliste

1: Mikroskop
2: Laserlichtquelle
3: Spiegel
4: Mittel zu Einstellung der Phasenverteilung (z. B. SLM)
5a: optische Linse, Fouriertransformationslinse
5b: Scannerlinse
5c: Tubuslinse
6: Scanvorrichtung; Scanner
7: Strahlteiler
8: Objektiv
9: Lichtblatt
10: Probe
11: Teleskop
12: Mikrolinsenarray
13: konjugierte Ebene
14: Detektor
15: Steuereinheit
16: Auswerteeinheit
17: variable Optik/brennweitenveränderliche Abbildungsoptik
18: Laserfokus
18lin: linienförmige Lichtverteilung
oA: optische Achse
EP: Eintrittspupille (des Objektivs 8)
3P: drei Phasen
x, y, z: Richtung

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 9638909 B2 [0008]
WO 2008/078083 A1 [0008]
WO 2015/124648 A1 [0010]

Claims

Mikroskop (1) aufweisend einen Anregungsstrahlengang zur Führung von Anregungslicht mit - einer Laserlichtquelle (2) zur Bereitstellung eines Laserlichtstrahls als Anregungslicht; - einer Scanvorrichtung (6) zur Einstellung eines Einstrahlwinkels eines fokussierten Laserlichtstrahls in einen Laserfokus (18) in der Eintrittspupille (EP) eines Beleuchtungsobjektivs (8); wobei der Laserfokus (18) in einen radial zur optischen Achse (oA) des Beleuchtungsobjektivs (8) versetzten Eintrittsort gerichtet ist; sowie einen Detektionsstrahlengang zur Führung von Detektionslicht, umfassend - ein Mikrolinsenarray (12) aufweisend eine Brennebene, in die durch Wirkung des Mikrolinsenarrays (12) eine Mehrzahl von Teilabbildungen abgebildet wird und; - einen in der Brennebene des Mikrolinsenarrays (12) angeordneten ortsaufgelösten Detektor (14) zur Erfassung der Teilabbildungen, und eine Auswerteeinheit (16), die zur Auswertung der erfassten Bildsignale des Detektors (14) anhand von Ortsinformationen und Winkelinformationen der je Detektionselement des Detektors erfassten Lichtstrahlen konfiguriert ist, dadurch gekennzeichnet, dass - im Anregungsstrahlengang zwischen Laserlichtquelle (2) und Scanvorrichtung (6) ein ansteuerbares Mittel zur Einstellung der Phasenverteilung (4) des Laserlichtstrahls und einer daraus resultierenden Intensitätsverteilung in der Eintrittspupille (EP) angeordnet ist und - ein jeweiliger Eintrittsort des Laserlichtstrahls mittels des ansteuerbaren Mittels zur Einstellung der Phasenverteilung (4) anhand der jeweils eingestellten Phasenverteilung ausgewählt ist beziehungsweise ausgewählt werden kann.
Mikroskop (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein vorhandenes Objektiv (8) sowohl als Beleuchtungsobjektiv zur Beleuchtung einer abzubildenden Probe (10) als auch als Detektionsobjektiv zur Erfassung von Detektionslicht dient.
Mikroskop (1) nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Detektionsstrahlengang ein Mittel zur Einstellung eines Vergrößerungsmaßstabs des Detektionsstrahlengangs vorhanden ist.
Mikroskop (1) nach einem der Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet durch eine brennweitenveränderliche Abbildungsoptik (17) im Detektionsstrahlengang zur Einstellung der Übertragungslänge der Abbildung der Eintrittspupille (EP) des Detektionsobjektives (8) in die Ebene des Mikrolinsenarrays.
Mikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Anregungsstrahlengang die Laserlichtquelle (2) Laserlicht mehrerer Wellenlängen bereitstellt oder mindestens zwei Laserlichtquellen (2) zur Bereitstellung von Laserlicht unterschiedlicher Wellenlänge vorhanden sind und im Detektionsstrahlengang wenigstens ein Mittel zur Aufteilung erfassten Detektionslichts auf mehrere Detektionskanäle vorhanden ist.
Mikroskop (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Anregungsstrahlengang die Laserlichtquelle (2) Laserlicht mehrerer Wellenlängen bereitstellt oder mindestens zwei Laserlichtquellen (2) zur Bereitstellung von Laserlicht unterschiedlicher Wellenlänge vorhanden sind und durch Wirkung des ansteuerbaren Mittels zur Einstellung der Intensitätsverteilung (4) Laserlicht der jeweiligen Wellenlängen mit voneinander verschiedenen Einstrahlwinkeln in den Laserfokus (18) gerichtet ist, so dass durch Wirkung des Laserlichts der jeweiligen Wellenlängen hervorgerufenes und erfasstes Detektionslicht auf räumlich unterschiedlichen Detektorflächen eines oder mehrerer Detektoren (14) trifft und getrennt erfasst wird beziehungsweise erfasst werden kann.
Verfahren zur mikroskopischen Bildgebung, bei dem - Laserlicht mindestens einer Wellenlänge einer Laserlichtquelle (2) als Anregungslicht entlang eines Anregungsstrahlengangs gerichtet, fokussiert und mittels einer Scanvorrichtung (6) der fokussierte Laserlichtstrahl in die Eintrittspupille (EP) eines Objektivs (8) gerichtet wird; wobei der Laserfokus (18) in einen radial zur optischen Achse (oA) des Objektivs (8) versetzten Eintrittsort gerichtet wird; - Detektionslicht aus einer mit dem Laserlicht beleuchteten Probe (10) erfasst und entlang eines Detektionsstrahlengangs auf ein Mikrolinsenarray (12) gerichtet wird, wobei das Mikrolinsenarray (13) eine Brennebene aufweist, in die eine Mehrzahl von Teilabbildungen abgebildet wird und - die in der Brennebene erzeugten Teilabbildungen mittels mindestens eines Detektors (14) erfasst werden, und - anhand von Ortsinformationen und Winkelinformationen der je Detektionselement (Pixel) des Detektors (14) erfassten Lichtstrahlen ausgewertet werden, dadurch gekennzeichnet, dass - im Anregungsstrahlengang die Phasenverteilung des Laserlichtstrahls und eine daraus resultierenden Intensitätsverteilung in der Eintrittspupille (EP) gesteuert beeinflusst wird beziehungsweise das Vorliegen einer erforderlichen Beeinflussung der Phasenverteilung und der resultierenden Intensitätsverteilung geprüft wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Einstrahlwinkel des Laserfokuses (18) in der Eintrittspupille (EP) entlang einer Richtung senkrecht zum radialen Versatz des Eintrittsortes zur optischen Achse (oA) des Detektionsobjektivs (8) wiederholt verändert wird, so dass objektseitig des Objektivs (8) ein zur optischen Achse (oA) des Objektivs (8) schräggestelltes Lichtblatt (9) erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Laserfokus (18) in der Eintrittspupille (EP) als eine linienförmige Lichtverteilung (18_lin) eingestrahlt wird, so dass objektseitig des Objektivs (8) ein zur optischen Achse (oA) des Objektivs (8) schräggestelltes Lichtblatt (9) erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die radiale Position des Eintrittsorts verändert wird beziehungsweise die radiale Position des Eintrittsorts der linienförmigen Lichtverteilung (18_lin) verändert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Beleuchtungssituation mehr als ein Laserfokus (18), insbesondere zwei Laserfoki (18), in der Eintrittspupille (EP) als jeweils eine linienförmige Lichtverteilung (18_lin) eingestrahlt werden, so dass objektseitig des Objektivs (8) mindestens zwei zur optischen Achse (oA) des Objektivs (8) schräggestellte Lichtblätter (9) erzeugt werden, wobei in den sich überlagernden Bereichen der Lichtblätter (9) durch Interferenzen bedingte Intensitätsmodulationen auftreten.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass je Beleuchtungssituation mindestens zwei verschiedene Phasenverteilungen zur Beleuchtung verwendet werden und bei verschiedenen Phasenverteilungen Detektionslicht detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass zeitlich nacheinander mehrere Beleuchtungssituationen eingestellt werden, wobei die relativen Lagen der linienförmigen Lichtverteilungen 18_lin) der unterschiedlichen Beleuchtungssituationen jeweils um einen Winkelbetrag verändert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass Laserlicht mindestens zweier voneinander verschiedener Wellenlängen unter je einem Einstrahlwinkel in die Eintrittspupille (EP) eingestrahlt wird, wobei sich die Einstrahlwinkel der Wellenlängen voneinander unterscheiden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass Bilddaten von mindestens zwei unterschiedlichen Beleuchtungssituationen erfasst und miteinander verrechnet werden, um eine im Wesentlichen vollständige Ausleuchtung einer Objektebene zu erzielen.