DE102022114984A1

DE102022114984A1 - Vorrichtung und verfahren zur lichtfeldmikroskopie

Info

Publication number: DE102022114984A1
Application number: DE102022114984.6A
Authority: DE
Inventors: Tiemo Anhut; Daniel Schwedt; Jörg Steinert; Matthias Wald
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2022-06-14
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2023-12-14
Also published as: WO2023242073A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Lichtfeldmikroskopie mit einer Lichtquelle zum Aussenden von Anregungslicht, mit einem Beleuchtungsstrahlengang zum Leiten des Anregungslichts auf oder in eine Probe, mit einem zweidimensional ortsauflösenden Detektor zum Nachweis von von der Probe abgestrahltem Licht, mit einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Mikroskopobjektiv und mit mindestens einem Multilinsenarray zum Abbilden des von der Probe abgestrahlten Lichts auf den Detektor, wobei das Multilinsenarray in einer zur hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs optisch konjugierten Ebene oder in der Nähe einer solchen Ebene angeordnet ist, und mit einer Steuer- und Auswerteeinheit zum Ansteuern des Detektors und zum Auswerten der Messdaten des Detektors. Die Vorrichtung ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass zum Abbilden der hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs in die Ebene, in der das Multilinsenarray angeordnet ist oder in die Nähe dieser Ebene eine einstellbare Relay-Optik vorhanden ist. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Lichtfeldmikroskopie.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Gesichtspunkt eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 zur Lichtfeldmikroskopie und in einem zweiten Gesichtspunkt ein Verfahren zur Lichtfeldmikroskopie nach dem Oberbegriff des Anspruchs 30.
Eine gattungsgemäße Vorrichtung zur Lichtfeldmikroskopie weist folgende Komponenten auf: eine Lichtquelle zum Aussenden von Anregungslicht, einen Beleuchtungsstrahlengang zum Leiten des Anregungslichts auf oder in eine Probe, einen zweidimensional ortsauflösenden Detektor zum Nachweis von von der Probe abgestrahltem Licht und einen Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Mikroskopobjektiv und mit mindestens einem Multilinsenarray zum Abbilden des von der Probe abgestrahlten Lichts auf den Detektor. Das Multilinsenarray ist in einer zur hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs optisch konjugierten Ebene oder in der Nähe einer solchen Ebene angeordnet. Schließlich ist eine Steuer- und Auswerteeinheit vorhanden mindestens zum Ansteuern des Detektors und zum Auswerten der Messdaten des Detektors.
Bei einem gattungsgemäßen Verfahren zur Lichtfeldmikroskopie werden folgende Schritte durchgeführt: Eine Probe wird mit Anregungslicht bestrahlt und von der Probe abgestrahltes Licht wird über ein Mikroskopobjektiv und ein Multilinsenarray auf einen zweidimensional ortsauflösenden Detektor abgebildet. Das Multilinsenarray ist in einer zur hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs optisch konjugierten Ebene oder in der Nähe einer solchen Ebene angeordnet. Aus einem mit dem Detektor aufgenommenen Bild wird schließlich ein dreidimensionales Bild der Probe rekonstruiert.
Eine gattungsgemäße Vorrichtung und ein gattungsgemäßes Verfahren sind beschrieben in Vol. 27, No. 18 / 2 September 2019 / Optics Express 25573.
In der modernen biomedizinischen Forschung werden zunehmend Prozesse in lebenden Proben mikroskopisch untersucht. Diese erfordern eine simultane Aufnahme der Signale in allen drei Dimensionen der Probe. Häufig ist dabei auch von Interesse, die Größe des beobachteten Feldes zu verändern und die Vergrößerung des Mikroskops entsprechend anzupassen. Für die simultane dreidimensionale Fluoreszenzmikroskopie wurde in den vergangenen Jahren zunehmend die Lichtfeldmikroskopie diskutiert. Hierbei werden mittels eines Multilinsenarrays vor der Kamera gleichzeitig Orts- und Winkelinformationen mit einem einzigen Kamerabild erfasst, so dass aus diesen Daten auf die Volumeninformation geschlossen werden kann.
Dabei kann grundsätzlich das gesamte vom Objektiv übertragene Sehfeld verwendet werden. Aufgrund der quasi vierdimensionalen (zwei lineare Koordinaten, zwei Winkelkoordinaten) Aufteilung des Kamerachips ist die Auflösungsfähigkeit eines Lichtfeldmikroskops jedoch reduziert. Daher kann es vorteilhaft sein, durch einen Wechsel des Mikroskopobjektivs eine Veränderung der Auflösung herbeizuführen. Als eine für die Mikroskopie bevorzugte Variante der Lichtfelddetektion hat sich die sogenannte Fourier-LichtfeldMikroskopie herausgestellt. Hierbei wird das Multilinsenarray in eine zur rückseitigen Brennebene des Mikroskopobjektivs konjugierten Ebene eingebracht. Auf dem Kamerachip entstehen dann eine Vielzahl realer Bilder, die jeweils einer anderen Blickrichtung auf die Probe entsprechen. Die objektseitige numerische Apertur (NA) in jedem einzelnen Teilbild ist entsprechend der Anzahl der Linsen des Multilinsenarrays reduziert, wodurch die Schärfentiefe des Mikroskops vergrößert, die Auflösung aber reduziert wird. Bei einem Wechsel des Mikroskopobjektivs wird in aller Regel jedoch die axiale Lage der Bezugsebene, nämlich die der rückseitigen Brennebene des Mikroskopobjektivs, im System geändert. Außerdem ändert sich in der Regel der Durchmesser der Pupillenberandung. Das kann eine veränderte Ausleuchtung des Multilinsenarrays zur Folge haben, wodurch am Pupillenrand gelegene Linsen des Multilinsenarrays eventuell nicht mehr vollständig ausgeleuchtet werden, mit anderen Worten Beschnitt erfahren. Dadurch werden deren Punktverwaschungsfunktionen (Point Spread Function, PSF) möglicherweise stark beeinträchtigt, so dass die zugehörigen Messdaten gegebenenfalls nicht verwendbar sind.
Als eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung kann angesehen werden, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Lichtfeldmikroskopie der oben angegebenen Art zu schaffen, die ein Einstellen einer Vergrößerung und ein Optimieren der Auflösung eines Lichtfeldmikroskops ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch die Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 30 gelöst.
Die Vorrichtung der oben angegebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass zum Abbilden der hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs in die Ebene, in der das Multilinsenarray angeordnet ist, oder in die Nähe dieser Ebene eine einstellbare Relay-Optikvorhanden ist.
Das Verfahren der oben angegebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass die hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs mit einer einstellbaren Relay-Optik mit variabler Vergrößerung in die Ebene, in der das Multilinsenarray angeordnet ist, oder in die Nähe dieser Ebene abgebildet wird.
Vorteilhafte Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Vorrichtung und bevorzugte Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im Folgenden, insbesondere im Zusammenhang mit den abhängigen Ansprüchen und der beigefügten Figur erläutert.
Als eine wesentliche Idee der vorliegenden Erfindung kann angesehen werden, zum Abbilden einer hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs in die Ebene, in der das Multilinsenarray angeordnet ist, eine variable Optik vorzusehen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Lichtfeldmikroskopie kann so sowohl mit unterschiedlichen Mikroskopobjektiven als auch, bei Verwendung von ein und demselben Mikroskopobjektiv, in unterschiedlichen Verfahrensvarianten betrieben werden.
Die vorliegende Erfindung erlaubt somit erhebliche Erweiterungen der Funktionalität der Vorrichtung zur Lichtfeldmikroskopie. Aberrationen durch fehlerhafte Ausleuchtung des Linsenarrays können bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren vermieden werden.
Das Anregungslicht ist elektromagnetische Strahlung, insbesondere im sichtbaren Spektralbereich und angrenzenden Bereichen. An das kontrastgebende Prinzip ist für die vorliegende Erfindung nur insoweit eine Anforderung gestellt, als die Probe infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht Emissionslicht abstrahlt und/oder das Anregungslicht ablenkt, streut oder zurückstrahlt. Typischerweise ist das Emissionslicht Fluoreszenzlicht, welches die Probe, insbesondere dort vorhandene Farbstoffmoleküle, infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht abstrahlt oder abstrahlen.
Zum Bereitstellen des Anregungslichts ist mindestens eine Lichtquelle, beispielsweise ein Laser, vorhanden. Die spektrale Zusammensetzung des Anregungslichts kann, insbesondere zwischen zwei oder mehr Farben, einstellbar sein. Das Anregungslicht kann auch simultan polychromatisch sein, beispielsweise wenn gleichzeitig unterschiedliche Farbstoffe nachgewiesen werden sollen.
Mit dem Begriff des Beleuchtungsstrahlengangs werden alle optischen strahlführenden und strahlverändernden Komponenten bezeichnet, beispielsweise Linsen, Spiegel, Prismen, Gitter, Filter, Blenden, Strahlteiler, Modulatoren, z.B. Spatial-Light Modulators (SLM), mit denen und über welche das Anregungslicht der Lichtquelle bis auf die zu untersuchende Probe geleitet wird.
Von der zu untersuchenden Probe infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht ausgesandtes und/oder abgelenktes, beispielsweise gestreutes, allgemein abgestrahltes Licht kann als Emissionslicht bezeichnet werden und gelangt über den Detektionsstrahlengang auf die Kamera. Mit dem Begriff des Detektionsstrahlengangs werden alle strahlführenden und strahlverändernden optischen Komponenten, beispielsweise Linsen, Spiegel, Prismen, Gitter, Filter, Blenden, Strahlteiler, Modulatoren, z.B. Spatial-Light Modulatoren (SLM), bezeichnet, mit denen und über welche das Emissionslicht von der zu untersuchenden Probe bis auf den Detektor geleitet wird. Insbesondere sind das Mikroskopobjektiv und das Multilinsenarray Teil des Detektionsstrahlengangs.
Mit dem Begriff der Punktverwaschungsfunktion einer Linse, beispielsweise einer Linse des Multilinsenarrays, ist diejenige Intensitätsverteilung des Lichts gemeint, in welche die Linse ein einlaufendes paralleles, den effektiven Durchmesser der Linse füllendes Strahlenbündel überführt. Für diese Funktion sind auch die Begriffe Punktverteilungsfunktion, Punktbildfunktion oder der englische Begriff Point-Spread-Function (PSF) geläufig.
Der Detektor ist ein hinreichend schneller optischer Detektor mit einer zweidimensional ortsauflösenden Sensorfläche. Der Detektor kann insbesondere eine Kamera, insbesondere mit einem CCD-, CMOS-, sCMOS- oder SPAD-Kamera-Chip sein.
Das Multilinsenarray dient dazu, von einer Probe abgestrahltes Licht auf den Detektor abzubilden. Die Linsen des Multilinsenarrays können insbesondere Mikrolinsen sein und das Multilinsenarray kann auch als Mikrolinsenarray bezeichnet werden.
Die Linsen des Mikrolinsenarrays müssen nicht notwendig alle in derselben Ebene angeordnet sein, sondern sie können auch in etwas unterschiedlichen Ebenen angebracht sein. Eine gewisse Defokusssierung ist zudem tolerierbar.
Der Detektor kann bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung und bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in einer Brennebene mindestens einer Linse des Multilinsenarrays oder in der Nähe der Brennebene mindestens einer Linse des Multilinsenarrays angeordnet sein. Bei besonders bevorzugten Varianten der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Detektor in einer Brennebene von mehreren, insbesondere von allen, Linsen des Multilinsenarrays oder in der Nähe dieser Brennebenen angeordnet.
Zwar ist es bevorzugt, dass der Detektor in einer Brennebene der Linsen des Multilinsenarrays oder jedenfalls in der Nähe dieser Brennebene angeordnet ist. Zur Verwirklichung der vorliegenden Erfindung ist das aber nicht unbedingt notwendig. Notwendig ist nur, dass das Multilinsenarray in einer definierten und bekannten Position relativ zu dem zweidimensional ortsauflösenden Detektor angeordnet ist.
Mit dem Begriff der Steuer- und Auswerteeinheit werden alle Hardware- und Softwarekomponenten bezeichnet, die mit den Komponenten des erfindungsgemäßen Mikroskops zu dessen bestimmungsgemäßer Funktion zusammenwirken. Insbesondere kann die Steuereinheit eine Recheneinrichtung, beispielsweise einen PC, und eine Kamerasteuerung aufweisen, die zum schnellen Auslesen von Messsignalen in der Lage ist. Die Rechnerressourcen der Steuer- und Auswerteeinheit können auf mehrere Rechner und gegebenenfalls auf ein Rechnernetz, insbesondere auch über das Internet, verteilt sein. Die Steuer- und Auswerteeinheit kann insbesondere übliche Bedienungs- und Peripheriegeräte aufweisen, wie Maus, Tastatur, Bildschirm, Speichermedien, Joystick, Internetverbindung. Die Steuer und Auswerteeinheit kann insbesondere die Bilddaten von dem Detektor einlesen.
Die Steuer- und Auswerteeinheit kann auch zum Ansteuern der Lichtquelle dienen und eingerichtet sein.
Die Rekonstruktion der dreidimensionalen Bilder der untersuchten Probe aus einem aufgenommenen Bild unter Verwendung von Parametern der Lichtfeldanordnung, wie numerische Apertur des Mikroskopobjektivs, Anzahl der ausgeleuchteten Linsen des Multilinsenarrays, optische Parameter des Multilinsenarrays, Einstellungen der einstellbaren Relay-Optik, kann durch die Steuer- und Auswerteeinheit, grundsätzlich aber auch durch eine andere Recheneinheit ausgeführt werden.
Die hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs und dazu optisch konjugierte Ebenen werden auch als Pupillenebenen bezeichnet.
An das Mikroskopobjektiv oder die Mikroskopobjektive ist keine besondere Anforderung gestellt. Insbesondere können Immersionsobjektive verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung eignen sich grundsätzlich für jede Art von Proben, die zugänglich sind für die Untersuchung mit Lichtfeldmikroskopie.
Bevorzugt ist bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung die einstellbare Relay-Optik einstellbar hinsichtlich mindestens eines der folgenden Parameter:

• Vergrößerung, mit welcher die hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs in die Ebene, in der das Multilinsenarray angeordnet ist, oder in die Nähe dieser Ebene abgebildet wird;
• axiale Lage der in Richtung des Multilinsenarrays abzubildenden hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs.

Beispielsweise kann bei der einstellbaren Relay-Optik mindestens einer der Parameter:

• Vergrößerung, mit welcher die hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs in die Ebene, in der das Multilinsenarray angeordnet ist, oder in die Nähe dieser Ebene abgebildet wird;
• axiale Lage der in Richtung des Multilinsenarrays abzubildenden hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs

Im Hinblick auf die Ausgestaltung der einstellbaren Relay-Optik im Einzelnen besteht Gestaltungsfreiheit. Beispielsweise kann die einstellbare Relay-Optik mindestens eine, insbesondere kontinuierlich, brennweitenveränderliche Optikkomponente, insbesondere eine brennweitenveränderliche Optikgruppe, aufweisen.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel weist die brennweitenveränderliche Optikkomponente eine Wechseloptik auf oder ist als Wechseloptik gebildet, mit welcher mehrere verschiedene diskrete Werte der Vergrößerung der einstellbaren Relay-Optik einstellbar sind. Die Komponenten der Wechseloptik können bevorzugt so dimensioniert sein, dass für das verwendete Mikroskopobjektiv oder die verwendeten Mikroskopobjektive gerade die geeigneten Vergrößerungen eingestellt werden können.
6 Flexiblere Anpassungen der Vergrößerung sind möglich, wenn bei der einstellbaren Relay-Optik eine Vergrößerung kontinuierlich variierbar ist. Dieses wird beispielsweise erreicht, wenn die brennweitenveränderliche Optikgruppe mindestens eine Zoom-Optik aufweist oder durch mindestens eine Zoomoptik gebildet ist. Bei der brennweitenveränderlichen Optikgruppe kann es sich auch um eine einzelne Komponente mit veränderlicher Brennweite handeln.
Bei einer besonders bevorzugten Variante der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die einstellbare Relay-Optik gebildet aus einer Linse oder einer Linsengruppe und einer brennweitenveränderlichen Optikgruppe, beispielsweise einer Zoomoptik. Bei der Linse kann es sich vorteilhaft um eine ohnehin an einem Mikroskopstativ vorhandene Tubuslinse handeln. Die brennweitenveränderliche Optikgruppe, z.B. die Zoomoptik, kann mit einem Kameraflansch verbunden sein. Die Zoomoptik kann insbesondere zusammen mit dem Multilinsenarray und der Kamera zu einer Baugruppe zusammengefasst sein. Es ist aber auch möglich, dass die Tubuslinse durch die brennweitenveränderliche Optikgruppe, insbesondere eine Zoomoptik, ersetzt wird, die dann mit einer weiteren, im Detektionsstrahlengang strahlabwärts angeordneten Linse oder Linsengruppe die einstellbare Relay-Optik bildet.
Bei einem Ausführungsbeispiel, bei dem die einstellbare Relay-Optik gebildet ist aus der Tubuslinse des Mikroskopstativs und einer brennweitenveränderlichen Optikgruppe ist diese brennweitenveränderliche Optikgruppe Teil von mehreren Abbildungssystemen.
Das erste Abbildungssystem kann als Pupillen-Abbildungssystems bezeichnet werden. Es handelt sich dabei um die erfindungsgemäß vorhandene einstellbare Relay-Optik. Mit dem ersten Abbildungssystems wird die hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs in die Ebene, in der das Multilinsenarray angeordnet ist oder in die Nähe dieser Ebene abgebildet.
Sodann gibt es eine der Anzahl der ausgeleuchteten Linsen des Multilinsenarray entsprechende Anzahl von Bild-Abbildungssystemen, die jeweils gebildet werden aus der brennweitenveränderlichen Optikgruppe und jeweils einer Linse des Multilinsenarrays. Mit diesem Bild-Abbildungssystemen wird die Zwischenbildebene, die sich zwischen der Tubuslinse und der brennweitenveränderlichen Optikgruppe befindet, auf jeweils eines der Teilbilder in der Ebene des Detektors der Kamera abgebildet durch Zusammenwirken der brennweitenveränderlichen Optikgruppe mit einer der Linsen des Multilinsenarrays.
Für den Fall, dass die einstellbare Relay-Optik gebildet ist aus der Tubuslinse des Mikroskopstativs und einer brennweitenveränderlichen Optikgruppe, beispielsweise einer Zoomoptik, gilt für die jeweiligen Vergrößerungen Folgendes: Bei einer Änderung der Einstellung der einstellbaren Relay-Optik, beispielsweise der Zoomoptik, ändern sich verschiedene Parameter der Lichtfeldaufnahme. Zunächst ist die Abbildung von der Objektebene in der Probe auf den Detektor, mithin den Kamerachip, gekennzeichnet durch die Vergrößerung $M_{g e s} = M_{1} * M_{2}$
Hierbei ist M₁ der Nominalwert der Vergrößerung des Mikroskopobjektivs bei Nutzung der korrekten Brennweite der Tubuslinse und entspricht dann genau der Vergrößerung von der Objektebene in der Probe in eine Zwischenbildebene strahlabwärts von der Tubuslinse. M₂ ergibt sich aus einer Brennweite f_OG der brennweitenveränderlichen Optikgruppe, die Teil der erfindungsgemäß vorhandenen einstellbaren Relay-Optik ist, und der Brennweite f_MLA der Linsen oder einer Linse des Multilinsenarrays: $M_{2} = f_{M L A} / f_{O G}$
Ein wesentlicher Befund ist, dass bei einer Nutzung des Zooms die Nyquistabtastung strahlabwärts von jeder Linse des Multilinsenarrays erhalten bleibt. Damit ist gemeint, dass sich das Verhältnis zwischen einem lateralen Abstand der Pixel des Kamerachips und der lateralen Ausdehnung eines Airy-Scheibchens der PSF der Linsen des Multilinsenarrays nicht in Abhängigkeit einer Einstellung der Zoomoptik ändert. Somit ist der Faktor des Kamerapixelabstands zur Nyquistgrenze unabhängig von der Zoomstellung immer gleich.
Allerdings wird durch die veränderte Vergrößerung in die Probe der dort abtastbare Abstand und die erzielbare laterale Auflösung entsprechend verändert. Gleichzeitig ändern sich die abgebildete Feldgröße, die Schärfentiefe, also der Tiefenbereich der Lichtfeldbildgebung, und die erreichbare Auflösung in der Probe.
Die Feldgröße FoV in der Probe kann berechnet werden, indem man den Nutzbereich der Kamera hinter einer Linse des Multilinsenarrays mittels der Gesamtvergrößerung M_ges abbildet gemäß: $F o V = D_{K a m e r a} / (N * M_{g e s})$
Dabei ist D_Kamera eine lineare Ausdehnung des genutzten Bereichs vom Detektor, mithin des Kamerachips, und N ist die Anzahl der Linsen des Multilinsenarrays entlang eines Durchmessers des ausgeleuchteten Bereichs des Multilinsenarrays. Eine Änderung einer Einstellung der einstellbaren Relay-Optik, beispielsweise eine Änderung einer Einstellung der Zoomoptik, führt zu einer Änderung von M_ges und damit der abgebildeten Feldgröße. Beispielsweise führt eine Verkleinerung von f_relay bei einem gegebenen Mikroskopobjektiv zu einer Vergrößerung von M_ges und damit zu einem kleineren abgebildeten Bereich der Probe.
Die Variationsmöglichkeit der Zoomeinstellung und damit der Abbildung der hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs auf das Multilinsenarray kann dann dazu genutzt werden, bei gegebenem Mikroskopobjektiv und somit gegebenem Durchmesser der hinteren Brennebene die Anzahl der genutzten Linsen des Multilinsenarrays zu verändern und einzustellen. Die Anzahl der ausgeleuchteten Linsen des Multilinsenarrays entlang eines Durchmessers des Multilinsenarrays sei N. Dann ist die laterale Auflösung der Lichtfeldabbildung in der Nähe der Fokalebene um den Faktor N verschlechtert im Vergleich zur nominalen Auflösung, die durch die numerische Apertur NA_objektjv des Mikroskopobjektivs gegeben ist und die man ohne Verwendung des Multilinsenarrays erhalten würde.
Die axiale Auflösung δ_ZOP in der Probenebene (Object Plane = OP) kann man unter Verwendung der Brechzahl n des Probenmediums, beispielsweise eines Einbettmediums, in welchem die Probe eingebettet ist, und der Wellenlänge A des von der Probe abgestrahlten Lichts abschätzen zu $δ z_{O P} \approx \frac{n λ}{N A_{O b j e c t i v}^{2}} = \frac{N}{2} = \frac{N}{2} δ z_{O b j e c t i v}$
Hier ist δ_ZObjektiv die axiale Auflösung, welche man mit dem Mikroskopobjektiv ohne Verwendung des Multilinsenarrays erhalten würde.
Die axiale Auflösung δ_ZOP ist also ebenfalls proportional zur Anzahl N der ausgeleuchteten Linsen des Multilinsenarrays entlang von einem Durchmesser des Bilds der hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs in der Ebene des Multilinsenarrays.
Die axiale Tiefe, bis zu der aus einem mit einer Lichtfeldanordnung gemessenen Bild ein dreidimensionales Bild der untersuchten Probe sinnvoll rekonstruiert werden kann, hängt ab von der objektseitigen numerischen Apertur der einzelnen Linsen des Multilinsenarrays. Nimmt man an, dass man die gesamte Apertur des Mikroskopobjektivs lateral auf N Linsen verteilt, so gilt für die axiale Tiefe des rekonstruierbaren Volumens näherungsweise $D O F \approx \frac{n π}{N A_{O b j e c t i v}^{2}} N^{2}$
Eine Änderung der Einstellung der einstellbaren Relay-Optik, beispielsweise der Zoomoptik, führt somit zu einer Änderung der wesentlichen Parameter der Abbildungseigenschaft des Lichtfeldmikroskops. Eine Anpassung an eine Probe und die Wahl einer vorteilhaften Einstellung für eine gewünschte Auflösung oder eine gewünschte Volumengröße ist somit in Grenzen möglich. Gegebenenfalls können auch verschiedene Aufnahmen ein und derselben Probe kombiniert werden, die mit jeweils verschiedenen Einstellungen der einstellbaren Relay-Optik gewonnen wurden.
Bei einer weiteren Variante wird die Probe zwischen den einzelnen Aufnahmen mit unterschiedlichen Einstellungen der einstellbaren Relay-Optik verschoben. Damit kann zum Beispiel innerhalb eines größeren Volumens mit moderater Auflösung ein kleineres Volumen mit höherer Auflösung über die Methode der Lichtfeldmikroskopie aufgenommen werden und die mit unterschiedlichen Einstellungen der einstellbaren Relay-Optik und unterschiedlichen Positionen der Probe aufgenommenen Messdaten können fusioniert werden. Die Steuer- und Auswerteeinheit kann vorteilhaft genutzt werden, um die Skalierung der aufgenommenen Messdaten zu gewährleisten.
Bei vorteilhaften Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die einstellbare Relay-Optik so eingestellt, dass das Multilinsenarray überstrahlt wird. Damit ist gemeint, dass das Bild der Pupille des Mikroskopobjektivs in der Ebene des Multilinsenarrays größer ist als die laterale Ausdehnung des Multilinsenarrays, sodass Anteile des über den Detektionsstrahlengang propagierten Lichts in der Ebene des Multilinsenarrays radial außerhalb des Bereichs auftreffen, in dem sich Linsen befinden. Für diese Zwecke ist bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung die einstellbare Relay-Optik vorteilhaft so dimensioniert, dass ihre Vergrößerung so eingestellt werden kann, dass das Multilinsenarray, insbesondere unterschiedlich stark, überstrahlt wird.
Beispielsweise kann es erwünscht sein, die Ausleuchtung des Multilinsenarrays so zu optimieren, dass auch am Pupillenrand gelegene Linsen des Multilinsenarrays über den gesamten nutzbaren axialen Tiefenbereich eine nicht wesentlich aberrierte Punktverwaschungsfunktion (PSF) aufweisen, mit anderen Worten keine wesentliche Vignettierung erleiden. Dazu ist es von Vorteil, wenn eine leichte Überstrahlung des Multilinsenarrays, beispielsweise um 5% bis 10%, mit der einstellbaren Relay-Optik eingestellt wird.
Bei anderen Einsatzmöglichkeiten kann eine deutlichere Überstrahlung des Multilinsenarrays gewünscht sein. In einer solchen Situation gelangt nur noch Licht aus einem Teil der gesamten numerischen Apertur des Mikroskopobjektivs auf das Multilinsenarray, mithin nur noch ein Teil der numerischen Apertur des Mikroskopobjektivs genutzt wird. Das hat zur Folge, dass die objektseitige numerische Apertur der einzelnen Linsen des Multilinsenarrays reduziert wird, wodurch wiederum die Schärfentiefe, die ohnehin wegen der kleinen numerischen Apertur der Linsen nicht klein ist, weiter gesteigert wird. So lässt sich die rekonstruierbare Feldtiefe vergrößern, sodass gegebenenfalls auch ohne einen Wechsel des Mikroskopobjektivs dickere Proben ohne Korrektur der Fokuslage gemessen werden können. Allerdings sinkt mit der reduzierten objektseitigen numerischen Apertur auch die laterale und die axiale Auflösung.
Andererseits kann es auch zweckmäßig sein, die Ausleuchtung des Multilinsenarrays zu reduzieren, das Multilinsenarray mit anderen Worten zu unterstrahlen. Damit ist gemeint, dass das Bild der Pupille des Mikroskopobjektivs kleiner ist als die laterale Ausdehnung des Multilinsenarrays, sodass in der Ebene des Multilinsenarrays außenliegende Linsen nicht mehr ausgeleuchtet werden. Dieses kann erwünscht sein, wenn die zu untersuchende Probe dünner ist als eine eingestellte rekonstruierbare Feldtiefe. Durch Reduzieren der Vergrößerung der einstellbaren Relay-Optik dergestalt, dass die Anzahl der ausgeleuchteten Linsen des Multilinsenarrays reduziert wird, wird der Anteil der objektseitigen numerischen Apertur, der auf jede der ausgeleuchteten Linsen entfällt, vergrößert. Dadurch werden die Schärfentiefe und die rekonstruierbare Feldgröße axial und lateral verkleinert bei gleichzeitiger Steigerung der lateralen und axialen Auflösung.
Bei diesen bevorzugten Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden also eine laterale und eine axiale Auflösung verändert durch Variieren einer Überstrahlung oder Unterstrahlung des Multilinsenarrays durch Einstellen eines Vergrößerungsfaktors durch die einstellbare Relay-Optik. Mit einer Steigerung der Auflösung geht jeweils eine Reduzierung der rekonstruierbaren Feldgröße und der Schärfentiefe einher und mit einer Reduzierung der Auflösung geht jeweils eine Steigerung der rekonstruierbaren Feldgröße und der Schärfentiefe einher. Mit der einstellbaren Relay-Optik, insbesondere mit der Zoomoptik, kann die Vorrichtung zur Lichtfeldmikroskopie somit an die zu untersuchende Probe angepasst werden.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Vergrö-ßerung M_ZO der einstellbaren Relay-Optik aufteilbar in das Produkt einer festen Referenzvergrößerung M₀ und einer variablen Vergrößerung M_v derart, dass $M_{O} = M_{O} * M_{v} .$
Der variable Anteil der Vergrößerung M_v kann nun bevorzugt variierbar sein in einem Bereich von 1x bis 2x, bevorzugt von 0,5x bis 4x. Der Variationsbereich von 1x bis 2x reicht jedenfalls aus, um die Variation des Pupillendurchmessers von gängigen Mikroskopobjektiven abzudecken. Mit einem Variationsbereich von 0.5x bis 4x können darüber hinaus die Auflösung und die rekonstruierbare Feldtiefe eingestellt werden.
Grundsätzlich werden bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Lichtfeldmikroskopie durch die einstellbare Relay-Optik die oben beschriebenen Funktionserweiterungen erreicht, wenn nur ein einziges Mikroskopobjektiv vorhanden ist. Vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeichnen sich aber dadurch aus, dass mehrere verschiedene auswechselbare Mikroskopobjektive vorhanden sind. Bevorzugt kann dann eine, insbesondere motorisierte, Wechseleinrichtung, beispielsweise mit einem Revolver und/oder einem Linearschieber, zum Wechseln der Mikroskopobjektive vorhanden sein.
Die Wechseleinrichtung kann insbesondere durch die Steuer- und Auswerteeinheit ansteuerbar sein.
Bei einem Wechsel des Mikroskopobjektivs ändert sich im Allgemeinen auch die axiale Lage der hinteren Brennebene des jeweils im Detektionsstrahlengang befindlichen Mikroskopobjektivs und damit auch die axiale Lage von Ebenen, die zu dieser hinteren Brennebene optisch konjugiert sind. Bei vorteilhaften Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist mit der einstellbaren Relay-Optik auch eine axiale Lage der zur rückseitigen Brennebene des Mikroskopobjektivs optisch konjugierten Ebene, insbesondere kontinuierlich, einstellbar.
Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die axiale Lage der zur rückseitigen Brennebene des Mikroskopobjektivs optisch konjugierten Ebene mit der einstellbaren Relay-Optik unabhängig von der Vergrößerung der einstellbaren Relay-Optik einstellbar ist.
Die einstellbare Relay-Optik kann insbesondere ansteuerbar sein, d. h., dass die Vergrö-ßerung und/oder die axiale Lage der zur hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs optisch konjugierten Ebene ansteuerbar ist. Für diese Zwecke kann die einstellbare Relay-Optik geeignete Stellaktoren aufweisen. Vorteilhaft kann die Steuer- und Auswerteeinheit zum Ansteuern der einstellbaren Relay-Optik eingerichtet sein.
Bei bevorzugten Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden entsprechend die Vergrößerung, mit der die hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs in die optisch konjugierten Ebene abgebildet wird, und/oder die axiale Lage dieser optisch konjugierten Ebene durch Ansteuerung der einstellbaren Relay-Optik eingestellt.
Die axiale Lage des Multilinsenarrays kann so vorteilhaft mit der axialen Lage der zur hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs konjugierten Ebene abgestimmt werden und es kann eine homogene und zentrierte Ausleuchtung des Multilinsenarrays erreicht werden.
Die einstellbare Relay-Optik kann insbesondere eine telezentrische Relay-Optik sein. Dieses hat den Vorteil, dass das Design der Relay-Optik nicht geändert werden muss, wenn sie axial geringfügig verschoben werden muss.
Ergänzend oder alternativ ist es auch möglich, bei einer nach Wechsel des Mikroskopobjektivs veränderten axialen Lage einer Pupillenebene das Multilinsenarray und den Detektor axial zu verschieben. Zu diesem Zweck können vorteilhaft das Multilinsenarray und der Detektor in einer Baugruppe zusammengefasst sein, die entlang der optischen Achse des Detektionsstrahlengangs verschiebbar ist. Zum Verschieben dieser Baugruppe kann vorteilhaft ein ansteuerbarer Antrieb vorhanden sein.
Der Beleuchtungsstrahlengang kann zur Weitfeldbeleuchtung der Probe eingerichtet sein. Die dafür notwendigen Komponenten sind grundsätzlich bekannt und werden hier nicht im Einzelnen abgehandelt.
Ergänzend oder alternativ kann bei einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Beleuchtungsstrahlengang für eine scannende Beleuchtung der Probe, insbesondere mit einem relativ zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs geneigten Lichtblatt, eingerichtet sein.
Die Beleuchtung der Probe kann über eine Optik, insbesondere ein Mikroskopobjektiv, erfolgen, welche nicht Teil des Detektionsstrahlengangs ist. Dies kann zum Beispiel ein Kondensor sein oder auch eine lichtblattartige Beleuchtung, deren Ausbreitungsrichtung entweder senkrecht auf der optischen Achse des Detektionsobjektivs steht oder in einem Winkel dazu verläuft. Im Extremfall kann das Lichtblatt auch parallel zur optischen Achse des Detektionsobjektivs verlaufen. In diesem Fall verläuft das Lichtblatt jedoch typischerweise in einem Winkel zur Blickrichtung der äußeren Linsen vom Multilinsenarray.
Alternativ kann die Beleuchtung der Probe über dasselbe Mikroskopobjektiv erfolgen, welches auch Teil des Detektionsstrahlengangs ist.
Für diese Situationen ist vorteilhaft zum Trennen von Anregungslicht und von Detektionslicht mindestens ein, insbesondere dichroitischer, Strahlteiler vorhanden. Dieser Strahlteiler kann als Hauptstrahlteiler bezeichnet werden. Vorteilhaft können mehrere verschiedene und auswechselbare Strahlteiler vorhanden sein. Das ist insbesondere zweckmäßig, wenn es möglich sein soll, unterschiedliche Farbstoffe mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionsspektren zu untersuchen. In grundsätzlich bekannter Weise kann dafür eine, insbesondere motorisierte, Wechseleinrichtung beispielsweise mit einem Revolver und/oder einem Linearschieber, zum Wechseln der Strahlteiler vorhanden sein. Vorteilhaft können auch dichroitische Strahlteiler mit mehreren Anregungs- und Detektionsbändern zum Einsatz kommen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Steuer- und Auswerteeinheit dazu eingerichtet, eine zeitliche und/oder räumlich strukturierte Beleuchtung mit einer Ansteuerung des Detektors zu synchronisieren. Beispielsweise kann die Steuer- und Auswerteeinheit die scannende Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt mit der Integrationszeit des Detektors synchronisieren.
Die Linsen des Multilinsenarrays können grundsätzlich beliebig verteilt oder auf einem Raster, beispielsweise auf einem hexagonalen oder rechtwinkligen Raster, angeordnet sein. Ein rechtwinkliges Raster kann auch als kartesisches Raster bezeichnet werden.
Grundsätzlich können die Linsen des Multilinsenarrays jeweils die gleiche Brennweite aufweisen. Es kann aber auch vorteilhaft sein, wenn das Multilinsenarray unterschiedliche Linsen aufweist. Beispielsweise können sich mindestens zwei der Linsen des Multilinsenarrays in mindestens einem der Parameter Brennweite, Durchmesser und numerische Apertur unterscheiden.
Das Multilinsenarray kann beispielsweise mehrere Gruppen von Linsen aufweisen, wobei die Linsen einer Gruppe gleiche Eigenschaften, insbesondere die gleiche Brennweite, den gleichen Durchmesser und/oder die gleiche numerische Apertur aufweisen können.
Beispielsweise können die Linsen einer ersten Gruppe eine erste Brennweite und/oder eine erste numerische Apertur aufweisen und die Linsen einer zweiten Gruppe können eine zweite Brennweite und/oder eine zweite numerische Apertur aufweisen, die von der ersten Brennweite beziehungsweise der ersten numerischen Apertur verschieden ist.
Bevorzugt kann außerdem sein, wenn das Multilinsenarray eine Linse aufweist, deren numerische Apertur größer ist als die numerische Apertur von weiteren Linsen des Multilinsenarrays. Zweckmäßig kann das Multilinsenarray so gestaltet sein, dass die numerische Apertur einer zentralen Linse größer ist als die numerische Apertur der weiteren Linsen des Multilinsenarrays. Die weiteren Linsen des Multilinsenarrays können beispielsweise in Ringen um die zentrale Linse angeordnet sein.
Möglich ist beispielsweise ein Multilinsenarray, bei dem die Linsen verschiedene Durchmesser, mithin unterschiedliche numerische Aperturen, aber gleiche Brennweite aufweisen. Geht man davon aus, dass es zukünftig Kamerasensoren mit beispielsweise 100 Megapixel und mehr auch im Bereich der wissenschaftlichen Bildgebung geben wird, so kann man es zum Beispiel so einrichten, dass die zentrale Linse mit einem eher großen Durchmesser gewählt wird, sodass dahinter z.B. 2000 mal 2000 Pixel zur Verfügung stehen. Die Größe der Pixel kann bevorzugt so gewählt sein, dass die PSF der zentralen Linse ungefähr am Nyquist-Limit abgetastet wird. Wird die einstellbare Relay-Optik dann so eingestellt, dass die Objektivpupille ausschließlich auf diese zentrale Linse abgebildet wird, kann man mit der Vorrichtung normale Weitfeldbildgebung mit sehr guter Auflösung aber geringer Schärfentiefe und ohne 3D-Information durchführen. Es wird also nur eine einzige Probenebene abgebildet.
Diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist also dadurch gekennzeichnet, dass die einstellbare Relay-Optik und/oder eine variable Blendeneinrichtung so eingestellt wird oder werden, dass nur eine Linse, insbesondere eine zentrale Linse, des Multilinsenarrays ausgeleuchtet wird. Damit wird eine Weitfeldmikroskopie verwirklicht. Zweckmäßig kann hierfür ein Multilinsenarray zum Einsatz kommen, bei dem eine, insbesondere die zentrale Linse, eine numerische Apertur aufweist, die größer ist als die numerische Apertur der weiteren Linsen.
Verstellt man die einstellbare Relay-Optik aber so, dass auch Linsen des Multilinsenarrays ausgeleuchtet werden, die relativ zur zentralen Linse radial weiter außen liegen und beispielsweise ringförmig angeordnet sind, so kommt man zu einer simultanen 3D-Abbildung im Sinn der Fourierlichtfeldtechnologie. Die zu einzelnen ausgeleuchteten Linsen gehörenden Subbilder oder Teilbilder können dann je nach numerischer Apertur der jeweiligen Linse eine unterschiedliche Auflösung und eine Schärfentiefe aufweisen, können aber in gewissen Grenzen trotzdem zu einem 3D-Bild verrechnet werden. Optional kann man die größeren Linsen so abblenden, dass alle Subaperturen die gleiche Auflösung aufweisen. Weil sich die abgebildeten Felder dabei unterschiedlich stark in Abhängigkeit von den Größen der Mikrolinsen überlappen, ist es dann zweckmäßig, wenn mindestens eine variable Feldblende vorhanden ist, die in Abhängigkeit einer Einstellung der einstellbaren Relay-Optik eingestellt werden kann. Konkret hängt der Durchmesser, auf welchen die einstellbare Zellblende eingestellt werden sollte, ab von der Einstellung der einstellbaren Relay-Optik, beispielsweise der Zoomstellung, und dem aktuellen Aufnahmemodus. Dabei wird es sich auch die Größe des propagierten Felds (FoV) ändern. Hierbei muss man allerdings einen Lichtverlust am Multilinsenarray aufgrund der Feldblende oder Feldblenden akzeptieren.
Diese Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeichnen sich dadurch aus, dass im Detektionsstrahlengang strahlaufwärts vor dem Multilinsenarray eine variable Blendeneinrichtung vorhanden ist zum Einstellen einer effektiven numerischen Apertur von ausgeleuchteten Linsen des Multilinsenarrays. Beispielsweise kann die Blendeneinrichtung eine ansteuerbare Flüssigkristall-Einrichtung aufweisen.
Bei einer vorteilhaften Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine effektive numerische Apertur der Linsen des Multilinsenarrays für mindestens eine Linse, insbesondere eine zentrale Linse, individuell mit einer variablen Blendeneinrichtung eingestellt.
Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, bei denen mit der variablen Blendeneinrichtung die effektive numerische Apertur für mehrere oder für jede Linse des Multilinsenarrays, individuell eingestellt werden kann.
Bei einer weiteren bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die effektiven numerischen Aperturen der Linsen des Multilinsenarrays mit der variablen Blendeneinrichtung so eingestellt, dass mindestens einige der Linsen, insbesondere alle Linsen, die gleiche effektive numerische Apertur aufweisen. Das bedeutet, dass die zu den Linsen gehörenden Teilbilder jeweils dieselbe Auflösung und Schärfentiefe aufweisen. Dieses kann im Hinblick auf die Rekonstruktion der dreidimensionalen Volumeninformation von Vorteil sein. Eine Änderung der Brennweite der Übertragungsoptik führt bei gleicher beobachteter Feldgröße im Objekt zu einer Änderung der sensorseitigen Bildgröße DKamera, einzel $D_{K a m e r a, e i n e l} = F o V * M_{g e s} = F o V * M_{1} * f_{M L A} / f_{O G}$
Das heißt, dass bei einer Verkürzung der Brennweite der einstellbaren Relay-Optik, sodass letztlich z.B. nur die zentrale Linse ausgeleuchtet wird, sich der ausgeleuchtete Teil des Kamerasensors entsprechend vergrößert. Aus diesem Grund erscheint es sinnvoll, eine z.B. mit dem Zoom der einstellbaren Relayoptik änderbare Feldblende zu nutzen, um einerseits ein Überstrahlen bei Nutzung mehrerer Linsen oder zu starke Randaberrationen bei Nutzung der Zentrallinse allein zu vermeiden. Diese Feldblende kann durch die Steuereinheit mit gestellt werden. Im Falle der Abbildung der Objektivpupille auf beispielsweise nur die zentrale Linse erhöhter Apertur folgt allerdings mit dem Gesagten auch, dass viel mehr Pixel als nur die unmittelbar hinter der zentralen Linse angeordneten Pixel genutzt werden können. Beispielsweise können 2000 x 2000 oder auch deutlich mehr Pixel genutzt werden. Wichtig ist, dass sich durch das Herunterzoomen auf die zentrale Linse des Multilinsenarrays die Anzahl der beleuchteten Sensorpixel im Wesentlichen nicht ändert. Im Extremfall bildet die zentrale Linse dann ein bestimmtes Sehfeld auf den ganzen Sensor ab; also z.B. auf 10.000 mal 10.000 Pixel, wenn man von einem quadratischen 100 Megapixel-Sensor ausgehen würde.
Die konkreten Eigenschaften des Multilinsenarrays im Hinblick auf die Anordnung der einzelnen Linsen und deren Brennweite fließen als Parameter in die jeweils für die Rekonstruktion der dreidimensionalen Bilder zu verwendenden Algorithmen ein.
Ein weiterer Vorteil der einstellbaren Relay-Optik ist, dass durch Aufnahme von mehreren Bildern bei jeweils unterschiedlicher Einstellung der Vergrößerung der einstellbaren Relay-Optik die Abtastung der Probe im Raum der Ortsfrequenzen gesteigert werden kann.
Die Positionen der Linsen des Multilinsenarrays in der Pupillenebene definieren die Ortsfrequenzen, bei denen die zu untersuchende Probe abgetastet wird. Aufgrund der endlichen Zahl der Linsen und somit der endlichen Anzahl von parallaktischen Ansichten, die auf dem Kamerachip angeordnet werden können, ist die Abtastung im Raum der Ortsfrequenzen lückenhaft. Je besser die laterale Auflösung gewählt wird, beispielsweise durch Reduzieren der Anzahl der ausgeleuchteten Linsen des Multilinsenarrays (Unterstrahlung), desto schlechter ist die Winkelabtastung, also die Abtastung im Raum der Ortsfrequenzen. Bei schlechter Winkelabtastung neigen entfaltungsbasierte Algorithmen zur Rekonstruktion der dreidimensionalen Volumenbilder zur Produktion von Artefakten.
Durch Variation der Vergrößerung, mit welcher die hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs in die Ebene, in der das Multilinsenarray angeordnet ist, abgebildet wird, kann die Abtastung im Raum der Ortsfrequenzen variiert werden. Beispielsweise kann die Probe bei einer ersten Vergrößerung mit einem ersten Raster von Ortsfrequenzen und bei einer zweiten Vergrößerung mit einem zweiten Raster von Ortsfrequenzen abgetastet werden, wobei die Vergrößerungen zweckmäßig so gewählt werden, dass das erste Raster und dass zweite Raster (abgesehen eventuell vom Ursprung des Koordinatensystems, der zu einer zentralen Linse des Multilinsenarrays gehört) keine gemeinsamen Punkte aufweisen. Die Lücken in der Winkelabtastung können zwar nicht vollständig geschlossen werden, jedoch ist eine Vergrößerung der Abtastfrequenz durch Nutzen von verschiedenen Einstellungen der einstellbaren Relay-Optik bei wiederholten Bildaufnahmen möglich. Weil die Bilder nacheinander aufgenommen werden müssen, sinkt dabei die Volumenbildrate.
Bei einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden also nacheinander Bilder mit unterschiedlichen Einstellungen der einstellbaren Relay-Optik, insbesondere mit unterschiedlichen Vergrößerungen, aufgenommen und die in den Bildern jeweils enthaltene Bildinformation wird zu einem einzigen dreidimensionalen Bild rekonstruiert. Auf diese Weise kann die Abtastung im Raum der Ortsfrequenzen gesteigert werden.
Ergänzend oder alternativ kann die Abtastung im Raum der Ortsfrequenzen gesteigert werden, indem nacheinander Bilder der Probe aufgenommen werden, wobei bei der Aufnahme der verschiedenen Bilder das im Detektionsstrahlengang propagierte Lichtfeld jeweils unterschiedlich weit quer, insbesondere senkrecht, zur optischen Achse verschoben ist. Besonders bevorzugt wird das Lichtfeld dabei im Detektionsstrahlengang in zwei zueinander senkrechten Richtungen jeweils quer, insbesondere senkrecht, zur optischen Achse verschoben.
Zu diesem Zweck kann bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorteilhaft eine, bevorzugt ansteuerbare, insbesondere durch die Steuer- und Auswerteeinheit ansteuerbare, Verschiebeeinrichtung vorhanden sein zum Verschieben des in dem Detektionsstrahlengang propagierten Lichtfelds quer zur optischen Achse.
Beispielsweise kann in den Detektionsstrahlengang als Verschiebeeinrichtung ein optisches Element eingebracht werden, mit dem man das Lichtfeld relativ zur optischen Achse und damit relativ zu dem Multilinsenarray lateral verschieben kann. Damit kann erreicht werden, dass man auch Zwischenwinkel erfassen kann, die durch ein fest angeordnetes Multilinsenarray ansonsten nicht erfasst werden könnten. Je mehr Winkel gemessen werden können, umso besser können bestimmte Artefakte, die durch eine diskret und schlecht abgetastete Winkelkoordinate entstehen, unterdrückt werden. Da hierfür aber wiederum nacheinander mehrere Bilder aufgenommen werden müssen, führt auch dieses zu einer verlängerten Aufnahme- und auch Verrechnungszeit und damit zu einer reduzierten Volumenbildrate.
Die Verschiebeeinrichtung kann beispielsweise eine planparallele Platte aufweisen, die drehbar ist um eine Achse, die quer, insbesondere senkrecht, zur optischen Achse liegt, oder drehbar ist um zwei zueinander quer, insbesondere senkrecht, orientierte Achsen, die jeweils quer insbesondere senkrecht, zur optischen Achse liegen.
Ergänzend oder alternativ kann die Verschiebeeinrichtung zum Verschieben mindestens einer der Linsen, bevorzugt der im Detektionsstrahlengang am weitesten strahlabwärts angeordneten Linse, der einstellbaren Relay-Optik eingerichtet sein.
Die Verschiebeeinrichtung weist zweckmäßig mindestens einen linearen mechanischen Aktor, beispielsweise einen Piezo-Aktor und/oder mindestens einen Dreh-Aktor, auf, der bevorzugt von der Steuer- und Auswerteeinheit angesteuert werden kann. Die zu bewerkstelligenden Verschiebungen müssen dabei nicht größer sein als der halbe Abstand der Linsen im Multilinsenarray.
Anstelle oder ergänzend zur Verschiebung des Lichtfelds quer zur optischen Achse wäre es auch möglich, eine Baugruppe bestehend aus dem Multilinsenarray und dem Detektor quer zur optischen Achse zu verschieben. Beispielsweise könnte die Verschiebeeinrichtung für das Lichtfeld in einer ersten Koordinatenrichtung wirken und die Baugruppe mit dem Multilinsenarray und dem Detektor könnte in der dazu senkrechten Koordinatenrichtung, beispielsweise mit einem ansteuerbaren Piezo-Aktor, verschoben werden.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Steuer- und Auswerteeinheit dazu eingerichtet, Einstellungen der einstellbaren Relay-Optik, die bei der Aufnahme eines Bilds bestehen, insbesondere die Brennweite, die Vergrößerung und/oder die axiale Lage der zur hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs optisch konjugierten Ebene, beispielsweise in Tabellen (Lookup-Tables) abzuspeichern. Diese Einstellungen können dann als Parameter in die für die Rekonstruktion eines dreidimensionalen Bilds aus dem aufgenommenen Bild verwendeten Algorithmen einfließen.
Grundsätzlich können zu diesem Zweck die jeweiligen Ansteuerdaten der einstellbaren Relay-Optik abgespeichert werden. Es ist aber auch möglich, dass bei der einstellbaren Relay-Optik die jeweils aktuell bestehenden Einstellungen, beispielsweise von der Steuer- und Auswerteeinheit, ausgelesen werden können.
Ergänzend oder alternativ kann bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Steuer- und Auswerteeinheit dazu eingerichtet sein, in Abhängigkeit der Ausleuchtung des Multilinsenarrays, eine bei der Aufnahme eines Bilds einer Probe gültige objektseitige numerische Apertur der einzelnen Linsen des Multilinsenarrays zu bestimmen und abzuspeichern. Die jeweils gültige objektseitige numerische Apertur ist eindeutig definiert durch den Grad der Ausleuchtung, also die Unterstrahlung, oder den Grad der Überstrahlung des Multilinsenarrays, die numerische Apertur des jeweils verwendeten Mikroskopobjektivs, die geometrische Anordnung der Linsen des Multilinsenarrays und die nominalen numerischen Aperturen der Linsen des Multilinsenarrays.
Schließlich kann es bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung auch von Vorteil sein, wenn die Steuer- und Auswerteeinheit dazu eingerichtet ist, eine Anzahl von Linsen des Multilinsenarrays, die bei der Aufnahme eines Bilds einer Probe vollständig ausgeleuchtet sind, zu bestimmen und abzuspeichern.
Die objektseitigen numerischen Aperturen der Linsen des Multilinsenarrays und die Anzahl der vollständig ausgeleuchteten Linsen fließen wiederum ein in die Algorithmen, die für die Rekonstruktion eines dreidimensionalen Bilds der Probe aus dem aufgenommenen Bild verwendet werden.
Bei einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Steuer- und Auswerteeinheit dazu eingerichtet, bei einem Wechsel des Mikroskopobjektivs die einstellbare Relay-Optik auf Werte für die Brennweite, die Vergrößerung und/oder die axiale Lage der zur hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs optisch konjugierten Ebene einzustellen, die für das jeweils im Strahlengang befindliche Mikroskopobjektiv geeignet sind. Anstatt die jeweiligen Einstellungen bei der einstellbaren Relay-Optik unmittelbar vorzunehmen, kann die Steuer- und Auswerteeinheit einem Benutzer vorteilhafte Einstellungen zur Auswahl vorschlagen.
Die Vergrößerung der einstellbaren Relay-Optik kann beispielsweise standardmäßig so eingestellt werden, dass das Multilinsenarray geringfügig überstrahlt wird und mithin alle Linsen des Multilinsenarrays vollständig ausgeleuchtet werden. Die axiale Lage der zur hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs optisch konjugierten Ebene kann dann zweckmäßig so eingestellt werden, dass diese in der Ebene des Multilinsenarrays liegt.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden im Zusammenhang mit der Figur erläutert.

1: zeigt ein schematisches Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
2: ein Multilinsenarray in drei verschiedene Beleuchtungssituationen;
3: ein Ausführungsbeispiel eines Multilinsenarrays mit unterschiedlichen Linsen;
4: dass Multilinsenarray aus 3 in einer ersten Beleuchtungssituation;
5: das Multilinsenarray aus 3 in einer zweiten Beleuchtungssituation;
6: das Multilinsenarray aus 3 in einer dritten Beleuchtungssituation;
7: das Multilinsenarray aus 3 in einer vierten Beleuchtungssituation unter Verwendung einer variablen Blendeneinrichtung; und
8: das Multilinsenarray aus 3 in einer fünften Beleuchtungssituation unter Verwendung der variablen Blendeneinrichtung.

Als wesentliche Komponenten beinhaltet die in 1 gezeigte Vorrichtung 100 zur Lichtfeldmikroskopie eine Lichtquelle 1 zum Aussenden von Anregungslicht, einen Beleuchtungsstrahlengang 2 zum Leiten des Anregungslichts auf oder in eine Probe 5, einen zweidimensional ortsauflösenden Detektor 13 zum Nachweisen von von der Probe 5 abgestrahltem Licht und einen Detektionsstrahlengang mit einem Mikroskopobjektiv 4a und einem Multilinsenarray 12 zum Abbilden des von der Probe 5 abgestrahlten Lichts auf den Detektor 13.
Das Multilinsenarray 12 ist in einer zur hinteren Brennebene 15 des Mikroskopobjektivs 4a optisch konjugierten Ebene 11 oder in der Nähe einer solchen Ebene 11 angeordnet. Der Detektor 13 ist in einer Brennebene des Multilinsenarrays 12 angeordnet.
Zum Ansteuern der Lichtquelle 1 und des Detektors 13 und zum Auswerten der Messdaten des Detektors 13 ist eine Steuer- und Auswerteeinheit 14, beispielsweise ein PC, vorhanden. Schließlich ist erfindungsgemäß zum Abbilden der hinteren Brennebene 15 des Mikroskopobjektivs 4a in die Ebene, in der das Multilinsenarray 12 angeordnet ist, oder in die Nähe dieser Ebene eine einstellbare Relay-Optik vorhanden. In dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel ist die einstellbare Relay-Optik gebildet durch eine Tubuslinse 7 des Detektionsstrahlengangs und eine schematisch dargestelltes Optiksystem 10 mit einstellbarer Brennweite, welches im gezeigten Beispiel ebenfalls über die Steuer- und Auswerteeinheit 14 angesteuert werden kann. Das Optiksystem 10 ist eine brennweitenveränderliche Optikgruppe. Schließlich ist ein nicht im Einzelnen dargestellter motorisch angetriebener Objektivrevolver vorhanden mit einer Rotationsachse 3, mit dem verschiedene Mikroskopobjektive 4a, 4b im Beleuchtungsstrahlengang 2 und Detektionsstrahlengang 8 positioniert werden können. Der Objektivrevolver kann ebenfalls über die Steuer- und Auswerteeinheit 14 angesteuert werden.
Im gezeigten Ausführungsbeispiel wird die Probe 5 über dasselbe Mikroskopobjektiv 4a beleuchtet, welches auch Teil des Detektionsstrahlengangs 8 ist. Um von der Probe 5 zurückgestrahltes Anregungslicht zu trennen von gegenüber dem Anregungslicht spektral rotverschobenem Fluoreszenzlicht ist im Beispiel der 1 ein dichroitischer Strahlteiler 6 vorhanden.
Die Lichtquelle 1 stellt das zur Beleuchtung der Probe 5 nötige Anregungslicht entlang des Beleuchtungsstrahlengangs 2 zur Verfügung. Dabei kann die Lichtquelle 1 eine Weitfeldbeleuchtung bereitstellen. Es können aber auch Anordnungen bevorzugt sein, bei denen Laserlicht entweder fokussiert oder als beispielsweise relativ zur optischen Achse verkipptes Lichtblatt über die Probe 5 gescannt wird. Das von der Probe 5, sei es durch Streuung und/oder Fluoreszenzemission, abgestrahlte Licht wird dann mit dem Mikroskopobjektiv 4a kollimiert und über den dichroitischen Strahlteiler 6 in den Detektionsstrahlengang 8 geleitet.
Die Tubuslinse 7 erzeugt ein Bild der Probe 5 in einer Zwischenbildebene 9 in der Nähe eines in 1 nicht dargestellten Kameraflansches des Mikroskops. Das Optiksystem mit einstellbarer Brennweite 10, das beispielsweise ein Zoomsystem sein kann, erzeugt dann eine zur rückseitigen Brennebene 15 des Mikroskopobjektivs 4a optisch konjugierte Ebene 11. Das Multilinsenarray 12 befindet sich in dieser optisch konjugierten Ebene 11 oder jedenfalls in der Nähe dieser Ebene 11. Über die Steuer- und Auswerteeinheit 14 kann ein Wechsel des Mikroskopobjektivs 4a, 4b veranlasst werden und, insbesondere automatisiert, kann eine auf den Wechsel des Mikroskopobjektivs abgestimmte Einstellung des brennweitenveränderlichen Optiksystems 10, mithin des Zoomsystems, erfolgen. Bei Beleuchtung der Probe 5 kann dann ein Bild mit dem Detektor 13 aufgenommen werden und die Bilddaten können mit der Steuer- und Auswerteeinheit 14 aufgenommen und gegebenenfalls weiterverarbeitet werden. Bei einer Beleuchtung der Probe 5 mit einem Lichtblatt kann eine Steuerung des Lichtblattscans synchronisiert mit der Belichtungszeit des Detektors 13 ebenfalls von der Steuer- und Auswerteeinheit 14 übernommen werden. Dieses ist grundsätzlich bekannt und wird hier nicht im Einzelnen beschrieben.
Gegebenenfalls kann die Steuer- und Auswerteeinheit 14 auch die Rekonstruktion der dreidimensionalen Bilder der Probe 5 aus den mit dem Detektor 13 gemessenen Bildern durchführen. Dieses kann aber auch in einer nicht dargestellten und insbesondere an einem anderen Ort befindlichen leistungsfähigen Recheneinheit durchgeführt werden.
In der 2 ist bei a), b) und c) jeweils ein hexagonales Raster eines Multilinsenarrays 12 mit 37 hexagonalen Zellen dargestellt. In jeder einzelnen der hexagonalen Zellen befindet sich jeweils eine Linse. Die 37 Linsen können beispielsweise alle identisch sein.
Mit dem Bezugszeichen 16 ist jeweils die äußere Begrenzung des über den Detektionsstrahlengang beleuchteten Bereichs des Multilinsenarrays 12 dargestellt. Wie ersichtlich, wird der beleuchtete Bereich 16 von a) bis c) immer kleiner. Dieses wird erreicht durch jeweils unterschiedliche Einstellungen der erfindungsgemäß vorhandenen einstellbaren Relay-Optik.
Im Einzelnen sind im Teilbild a) alle hexagonalen Zellen komplett ausgeleuchtet. Das Multilinsenarray 12 wird geringfügig überstrahlt, sodass ein Teil des Lichts verlorengeht. Die Lichteffizienz ist also nicht optimal.
Teilbild b) zeigt eine Situation, bei der das von dem Mikroskopobjektiv 4a kommende Licht nahezu vollständig auf das Multilinsenarray 12 trifft. Die Lichteffizienz ist hier also nahezu optimal.
Im Teilbild c) ist eine Situation dargestellt, bei der das vom Mikroskopobjektiv 4a kommende Licht vollständig auf das Multilinsenarray 12 trifft. Auch hier ist deshalb die Lichteffizienz maximal. Allerdings werden einige Linsen 17 am Rand des Multilinsenarrays 12 unvollständig ausgeleuchtet, nämlich nur mit etwa 25 % des Lichts, welches auf die vollständig ausgeleuchteten innenliegenden Linsen trifft. Die zu diesen nicht vollständig ausgeleuchteten Linsen 17 zugehörige Punktverwaschungsfunktionen erhält dadurch einen elliptischen Querschnitt.
3 zeigt schematisch ein Beispiel eines Multilinsenarrays 12, bei dem die Linsen nicht alle identisch sind. Konkret ist zunächst eine zentrale Linse 20 vorhanden mit einem vergleichsweise großen Durchmesser und einer großen numerischen Apertur. Um die zentrale Teillinse 20 herum sind auf einem ersten Ring acht identische mittlere Linsen 21 angeordnet, deren Durchmesser etwa halb so groß ist wie derjenige, der zentralen Linse 20. Auf einem äußeren Ring sind sodann jeweils identische äußere Linsen 22 angeordnet, deren Durchmesser wiederum etwa halb so groß ist wie derjenige der mittleren Linsen 21. Vorteilhaft weisen alle Linsen 20, 21 und 22 dieselbe Brennweite auf. Die numerische Apertur der äußeren Linsen 22 ist kleiner als diejenige der mittleren Linsen 21. Die numerische Apertur der mittleren Linsen 21 ist kleiner als diejenige der zentralen Linse 20.
Durch unterschiedliche Einstellungen der erfindungsgemäß vorhandenen einstellbaren Relay-Optik, mithin durch Variation des ausgeleuchteten Bereichs des Multilinsenarray 12 können verschieden viele Linsenringe ausgeleuchtet werden, beispielsweise nur die zentrale Linse 20, die zentrale Linse 20 zusammen mit den mittleren Linsen 21 oder alle Linsen 20, 21 und 22. Damit können eine normale Weitfeldbildgebung und unterschiedliche Varianten der Fourierlichtfeldbildgebung verwirklicht werden. Beispiele hierfür werden im Zusammenhang mit den 4 bis 8 erläutert.
Bei der in 4 dargestellten Situation wird nur die innenliegende Linse 20 ausgeleuchtet, d. h. die Pupille des Mikroskopobjektivs 4a wird nur auf die zentrale Linse 20 abgebildet. Dadurch wird eine normale Weitfeldbildgebung verwirklicht.
Im Beispiel der 5 wird die einstellbare Relay-Optik so eingestellt, dass die zentrale Linse 20 und die mittleren Linsen 21 ausgeleuchtet werden. Damit wird eine Fourierlichtfeldbildgebung mit einer gewissen Schärfentiefe und optischen Auflösung verwirklicht. Zu berücksichtigen ist dabei, dass bei dem Teilbild, welches zu der zentralen Linse 20 gehört, wegen deren größerer numerischer Apertur die Schärfentiefe kleiner, die optische Auflösung, aber größer ist im Vergleich zu den Teilbildern, die zu den mittleren Linsen 21 gehören. Die unterschiedlichen Parameter der zentralen Linse 20 im Vergleich zu denjenigen der mittleren Linsen 21 müssen bei der Rekonstruktion der dreidimensionalen Volumeninformation aus den insgesamt neun Teilbildern berücksichtigt werden.
In der Situation der 6 schließlich wird die einstellbare Relay-Optik so eingestellt, dass die zentrale Linse 20, die mittleren Linsen 21 und die äußeren Linsen 22 ausgeleuchtet werden. Auch hier wird eine Fourierlichtfeldbildgebung verwirklicht, mit einer im Vergleich zur Situation der 5 erhöhten Schärfentiefe jedoch verschlechterter optischer Auflösung. Grund hierfür ist, dass die auf die einzelnen Linsen 20, 21, 22 jeweils entfallenden Anteile der Gesamtapertur des Mikroskopobjektivs 4a bei der Situation der 6 kleiner sind als bei der Situation der 5. Die detektionsseitigen Aperturen für jede Linse 20, 21 22 ist somit geringer als bei der Ausleuchtungssituation der 5.
Die Situation der 7 unterscheidet sich von derjenigen der 6 dadurch, dass die Ausleuchtung der zentralen Linse 20 und der mittleren Linsen 21 mithilfe einer (nicht in den Figuren dargestellten) variablen Blendeneinrichtung, beispielsweise einer Flüssigkristall-Einrichtung, dergestalt beschränkt wird, dass alle mindestens teilweise ausgeleuchteten Linsen jeweils dieselbe effektive detektionsseitige numerische Apertur aufweisen. Die ausgeleuchteten Bereiche der inneren Linse 20 und der mittleren Linsen 21 werden also so eingestellt, dass sie genauso groß sind wie bei den äußeren Linsen 22. Auf diese Weise wird eine Fourierlichtfeldbildgebung verwirklicht, bei der alle Teilbilder die gleiche optische Auflösung und die gleiche Schärfentiefe aufweisen. Dieses hat im Hinblick auf die Rekonstruktion der dreidimensionalen Volumeninformation Vorteile. Dieser Vorteil geht allerdings einher mit dem Verlust des abgeblendeten Lichts. Hier sind auch andere Varianten möglich, beispielsweise dergestalt, dass die äußeren Linsen 22 eine kleinere detektionsseitige Apertur aufweisen als die zentrale Linse 21 und/oder die mittleren Linsen 21.
Letzteres ist in der 8 gezeigt, bei der mithilfe der variablen Blendenvorrichtung nur die Apertur der zentralen Linse 20 dergestalt beschnitten wird, dass die zentrale Linse 20 und die mittleren Linsen 21 dieselbe detektionsseitige Apertur aufweisen. Das bedeutet, dass die zur zentralen Linse 20 und den mittleren Linsen 21 gehörenden Teilbilder dieselbe optische Auflösung und dieselbe Schärfentiefe aufweisen. Im Vergleich dazu ist bei den Teilbildern, die zu den äußeren Linsen 22 gehören, wegen deren im Vergleich zur zentralen Linse 20 und den mittleren Linsen 21 reduzierten detektionsseitigen Apertur, die Schärfentiefe höher, die optische Auflösung aber kleiner.
Bezugszeichenliste

1: Lichtquelle
2: Beleuchtungsstrahlengang
3: Drehachse eines Objektivrevolvers
4a: Mikroskopobjektiv
4b: Mikroskopobjektiv
5: Probe
6: dichroitischer Strahlteiler
7: Tubuslinse
8: Detektionsstrahlengang
10: Zoomoptik, brennweitenveränderliche Optikgruppe
11: zur hinteren Brennebene 15 des Mikroskopobjektivs 4a, 4b optisch konjugierte Ebene
12: Multilinsenarray
13: Detektor
14: Steuer- und Auswerteeinheit
15: hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs 4a, 4b
16: Begrenzung des beleuchteten Bereichs des Multilinsenarrays 12
17: nicht vollständig ausgeleuchtete Linsen 17 des Multilinsenarrays 12
20: zentrale Linse des Multilinsenarrays 12
21: mittlere Linsen des Multilinsenarrays 12
22: äußere Linsen des Multilinsenarrays 12
30: abgeblendeter Bereich der Linse 20 des Multilinsenarrays 12
31: abgeblendeter Bereich der Linse 21 des Multilinsenarrays 12
100: erfindungsgemäße Vorrichtung

Claims

Vorrichtung zur Lichtfeldmikroskopie mit einer Lichtquelle (1) zum Aussenden von Anregungslicht, mit einem Beleuchtungsstrahlengang (2) zum Leiten des Anregungslichts auf oder in eine Probe (5), mit einem zweidimensional ortsauflösenden Detektor (13) zum Nachweis von von der Probe (5) abgestrahltem Licht, mit einem Detektionsstrahlengang (8) mit mindestens einem Mikroskopobjektiv (4a, 4b) und mit mindestens einem Multilinsenarray (12) zum Abbilden des von der Probe (5) abgestrahlten Lichts auf den Detektor (13), wobei das Multilinsenarray (12) in einer zur hinteren Brennebene (15) des Mikroskopobjektivs (4a, 4b) optisch konjugierten Ebene (11) oder in der Nähe einer solchen Ebene (11) angeordnet ist, und mit einer Steuer- und Auswerteeinheit (14) zum Ansteuern des Detektors (13) und zum Auswerten der Messdaten des Detektors (13), dadurch gekennzeichnet, dass zum Abbilden der hinteren Brennebene (15) des Mikroskopobjektivs (4a, 4b) in die Ebene, in der das Multilinsenarray (12) angeordnet ist, oder in die Nähe dieser Ebene eine einstellbare Relay-Optik (7, 10) vorhanden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (13) in einer Brennebene mindestens einer Linse des Multilinsenarrays (12) oder in der Nähe der Brennebene mindestens einer Linse des Multilinsenarrays (12) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die einstellbare Relay-Optik (7, 10) einstellbar ist hinsichtlich mindestens eines der folgenden Parameter: • Vergrößerung, mit welcher die hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs (4a, 4b) in die Ebene, in der das Multilinsenarray (12) angeordnet ist, oder in die Nähe dieser Ebene abgebildet wird; • axiale Lage der in Richtung des Multilinsenarrays (12) abzubildenden hinteren Brennebene des Mikroskopobjektivs (4a, 4b).
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die einstellbare Relay-Optik (7, 10) mindestens eine, insbesondere kontinuierlich, brennweitenveränderliche Optikkomponente, insbesondere eine brennweitenveränderliche Optikgruppe (10), aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die brennweitenveränderliche Optikkomponente eine Wechseloptik aufweist oder ist, mit welcher mehrere verschiedene diskrete Werte der Vergrößerung der einstellbaren Relay-Optik (7, 10) einstellbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die brennweitenveränderliche Optikgruppe (10) mindestens eine Zoom-Optik (10) aufweist oder durch mindestens eine Zoomoptik (10) gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die einstellbare Relay-Optik gebildet ist aus einer Linse oder einer Linsengruppe, insbesondere einer Tubuslinse (7), und einer brennweitenveränderlichen Optikgruppe, insbesondere einer Zoomoptik (10).
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vergrößerung der einstellbaren Relay-Optik (7, 10) dergestalt einstellbar ist, dass das Multilinsenarray (12) überstrahlt oder unterstrahlt wird.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein variabler Anteil (M_v) der Vergrößerung (M_ZO) der einstellbaren Relay-Optik (7, 10) variierbar ist in einem Bereich von 1x bis 2x, bevorzugt von 0,5x bis 4x.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die axiale Lage der zur rückseitigen Brennebene (15) des Mikroskopobjektivs (4a, 4b) optisch konjugierten Ebene (11) mit der einstellbaren Relay-Optik (7, 10) unabhängig von der Vergrößerung der einstellbaren Relay-Optik (7, 10) einstellbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die einstellbare Relay-Optik eine telezentrische Relay-Optik (7, 10) ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine aus dem Detektor (13) und dem Multilinsenarray (12) gebildete Baugruppe entlang der optischen Achse des Detektionsstrahlengangs (8) verschiebbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungsstrahlengang (2) zur Weitfeldbeleuchtung der Probe (5) eingerichtet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungsstrahlengang (2) für eine scannende Beleuchtung der Probe (5), insbesondere mit einem relativ zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs (2) geneigten Lichtblatt, eingerichtet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass zum Trennen von Anregungslicht und von Detektionslicht mindestens ein, insbesondere dichroitischer, Strahlteiler (6) vorhanden ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuer- und Auswerteeinheit (14) dazu eingerichtet ist, eine zeitliche und/oder räumlich strukturierte Beleuchtung mit einer Ansteuerung des Detektors (13) zu synchronisieren.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere verschiedene auswechselbare Mikroskopobjektive (4a, 4b) vorhanden sind.
Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass eine, insbesondere motorisierte und bevorzugt ansteuerbare, Wechseleinrichtung zum Wechseln der Mikroskopobjektive (4a, 4b) vorhanden .
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Linsen des Multilinsenarrays (12) auf einem hexagonalen oder rechtwinkligen Raster angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verschiebeeinrichtung vorhanden ist zum Verschieben quer zur optischen Achse des in dem Detektionsstrahlengang (8) propagierten Lichtfelds.
Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Verschiebeeinrichtung eine planparallele Platte aufweist, die drehbar ist um eine Achse, die quer, insbesondere senkrecht, zur optischen Achse liegt, oder drehbar ist um zwei zueinander quer, insbesondere senkrecht, orientierte Achsen, die jeweils quer insbesondere senkrecht, zur optischen Achse liegen.
Vorrichtung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Verschiebeeinrichtung zum Verschieben mindestens einer der Linsen, insbesondere der im Detektionsstrahlengang am weitesten strahlabwärts angeordneten Linse, der einstellbaren Relay-Optik (7, 10) eingerichtet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Verschiebeeinrichtung mindestens einen linearen mechanischen Aktor, beispielsweise einen Piezo-Aktor und/oder mindestens einen Dreh-Aktor, aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuer- und Auswerteeinheit (14) dazu eingerichtet ist, Einstellungen der einstellbaren Relay-Optik (7, 10), die bei der Aufnahme eines Bilds bestehen, insbesondere die Vergrößerung und/oder die axiale Lage der zur hinteren Brennebene (15) des Mikroskopobjektivs (4a, 4b) optisch konjugierten Ebene (11), abzuspeichern.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuer- und Auswerteeinheit (14) dazu eingerichtet ist, in Abhängigkeit der Ausleuchtung des Multilinsenarrays (12), eine bei der Aufnahme eines Bilds einer Probe (5) gültige objektseitige numerische Apertur der einzelnen Linsen des Multilinsenarrays (12) zu bestimmen und abzuspeichern.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuer- und Auswerteeinheit (14) dazu eingerichtet ist, eine Anzahl von Linsen des Multilinsenarrays (12), die bei der Aufnahme eines Bilds einer Probe (5) vollständig ausgeleuchtet sind, zu bestimmen und abzuspeichern.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuer- und Auswerteeinheit (14) dazu eingerichtet ist, bei einem Wechsel des Mikroskopobjektivs (4a, 4b) die einstellbare Relay-Optik (7, 10) auf Werte für die Vergrößerung und/oder die axiale Lage der zur hinteren Brennebene (15) des Mikroskopobjektivs optisch konjugierten Ebene (11) einzustellen, die für das jeweils im Strahlengang befindliche Mikroskopobjektiv (4a, 4b) geeignet sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Multilinsenarray (12) unterschiedliche Linsen (20, 21, 22) aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass im Detektionsstrahlengang strahlaufwärts vor dem Multilinsenarray (12) eine variable Blendeneinrichtung vorhanden ist zum Einstellen einer effektiven numerischen Apertur von ausgeleuchteten Linsen des Multilinsenarrays (12).
Verfahren zur Lichtfeldmikroskopie, bei dem eine Probe (5) mit Anregungslicht bestrahlt wird, von der Probe (5) abgestrahltes Licht über ein Mikroskopobjektiv (4a, 4b) und ein Multilinsenarray (12) auf einen zweidimensional ortsauflösenden Detektor (13) abgebildet wird, wobei das Multilinsenarray (12) in einer zur hinteren Brennebene (15) des Mikroskopobjektivs (4a, 4b) optisch konjugierten Ebene (11) oder in der Nähe einer solchen Ebene (11) angeordnet ist, und bei dem aus einem mit dem Detektor (13) aufgenommenen Bild ein dreidimensionales Bild der Probe (5) rekonstruiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die hintere Brennebene (15) des Mikroskopobjektivs (4a, 4b) mit einer einstellbaren Relay-Optik (7, 10) mit variabler Vergrößerung in die Ebene, in der das Multilinsenarray (12) angeordnet ist, oder in die Nähe dieser Ebene abgebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass eine laterale Auflösung, eine axiale Auflösung, eine rekonstruierbare Feldgröße und eine Schärfentiefe eingestellt wird durch Einstellen einer Vergrößerung der einstellbaren Relay-Optik (7, 10).
Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, dass die einstellbare Relay-Optik so eingestellt wird, dass das Multilinsenarray (12) überstrahlt wird.
Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, dass die einstellbare Relay-Optik (7, 10) so eingestellt wird, dass das Multilinsenarray (12) unterstrahlt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass nacheinander Bilder mit unterschiedlichen Einstellungen der einstellbaren Relay-Optik (7, 10), insbesondere mit unterschiedlichen Vergrößerungen, aufgenommen werden und dass die in den Bildern jeweils enthaltene Bildinformation zu einem einzigen dreidimensionalen Bild rekonstruiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass zur Steigerung der Abtastung der Probe (5) im Raum der Ortsfrequenzen nacheinander Bilder der Probe (5) aufgenommen werden, wobei bei der Aufnahme der verschiedenen Bilder das im Detektionsstrahlengang propagierte Lichtfeld jeweils unterschiedlich weit quer, insbesondere senkrecht, zur optischen Achse verschoben ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass bei einem Wechsel des Mikroskopobjektivs (4a, 4b) bei der einstellbaren Relay-Optik (7, 10) Werte für die Vergrößerung und/oder die axiale Lage der zur hinteren Brennebene (15) des Mikroskopobjektivs (4a, 4b) optisch konjugierten Ebene (11) einem Benutzer zur Auswahl angeboten und/oder automatisch eingestellt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass eine effektive numerische Apertur der Linsen des Multilinsenarrays (12) für mindestens eine Linse, insbesondere eine zentrale Linse (20), individuell mit einer variablen Blendeneinrichtung eingestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass die effektiven numerischen Aperturen der Linsen das Multilinsenarrays (12) mit der variablen Blendeneinrichtung so eingestellt werden, dass mindestens einige der Linsen, insbesondere alle Linsen, die gleiche effektive numerische Apertur aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass die einstellbare Relay-Optik (7, 10) und/oder die variable Blendeneinrichtung so eingestellt wird, dass nur eine Linse, insbesondere eine zentrale Linse (20), des Multilinsenarrays (12) ausgeleuchtet wird.