WO2020001938A1 - Verfahren zum erzeugen eines übersichtsbilds unter verwendung eines hochaperturigen objektivs - Google Patents

Verfahren zum erzeugen eines übersichtsbilds unter verwendung eines hochaperturigen objektivs Download PDF

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WO2020001938A1
WO2020001938A1 PCT/EP2019/064521 EP2019064521W WO2020001938A1 WO 2020001938 A1 WO2020001938 A1 WO 2020001938A1 EP 2019064521 W EP2019064521 W EP 2019064521W WO 2020001938 A1 WO2020001938 A1 WO 2020001938A1
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image
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PCT/EP2019/064521
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Jakob Haarstrich
Jörg SIEBENMORGEN
Helge Eggert
Martin Beck
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Carl Zeiss Microscopy Gmbh
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Publication date
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    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison

Definitions

  • the invention relates to a method for generating an overview image using a high-aperture lens.
  • Microscopy methods are usually used to examine small sections of larger objects. In order to find a suitable section for the examinations and observations to be carried out, so-called overview images are often created.
  • a user is able to define a section of the sample (region of interest, ROI) suitable for the examination.
  • This can e.g. B. be a specific cell of a cell assembly or biological tissue, which can then be observed and imaged with a lens with high magnification and high resolution.
  • Depth of field are light-sheet microscopes.
  • a thin sheet of light is directed into a sample volume to be imaged and an image of the sample plane illuminated in this way is captured by means of a lens of a detection beam path on the basis of a detected detection radiation.
  • the light sheet can, for example, as a static light sheet by means of a cylindrical lens in the
  • Light beam (dynamic light sheet) are generated.
  • Detection radiation can be detected, is limited by the thin light sheet in addition to the limited depth of field of the lens.
  • Light-sheet microscopes are usually used for three-dimensional images of biological samples. For example, if you want to use three-dimensional light sheets
  • the invention is based on the object of proposing a method by means of which two and three-dimensional overview images of a sample volume can be created quickly and without changing the objective of the detection beam path.
  • the method according to the invention serves to generate and optionally to provide one
  • the lenses can be designed as immersion lenses.
  • Immersion medium is, for example, water.
  • the method comprises the following steps, which are carried out in the order specified, intermediate steps not specified here being possible in further refinements of the method.
  • An optical detection beam path is provided with the objective.
  • Detection beam path can be present in a microscope, for example, and provided with it.
  • the detection beam path can have two operating states, which can be set manually or automatically in a controlled manner. In a first
  • the detection beam path In the operating state, the detection beam path has a first numerical aperture and has a first depth of field in a focal plane of the detection beam path.
  • an image of a detection radiation with the first depth of field and with a lateral image field is captured.
  • several images can be captured with the first depth of field.
  • the detection radiation is brought about by directing at least one light sheet along an illumination axis into a sample volume to be imaged in the sample space.
  • an adjustable lighting device is preferably used to generate the light sheet or the light sheets.
  • the thickness of the light sheet or sheets can deviate from the depth of field of the detection objective in the first operating state.
  • the depth of field of the detection objective in the first operating state.
  • Light sheet thickness (-n) preferably the same.
  • the detection beam path is converted into a second one
  • a detection radiation is detected which comes from a sample space, in particular from a sample volume to be examined.
  • Detection radiation is collected by means of the objective, guided along the detection beam path and recorded as an image with a lateral image field by means of at least one detector sensitive to the detection radiation in an image plane.
  • the lateral image fields in the first and second operating states are largely the same.
  • the depth of field indicates the distance range in front of the lens from which the outgoing detection radiation, which is imaged in an image plane of the detection beam path, results in a detailed, sharp image.
  • a second depth of field is therefore higher than a first depth of field characterized by a larger absolute distance range.
  • the middle positions of the distance areas of the first and second depths of field can be the same.
  • the depth of field can be determined, in particular calculated, in a known manner.
  • the wave-optical depth of field is used.
  • L is the wavelength
  • n the refractive index
  • u the aperture angle.
  • 1.67 * 1 * h / NA 2 can also be used to approximate the half-value width in the direction of the Z axis.
  • the second depth of field is increased compared to the first depth of field by at least a factor of two, but advantageously by a factor from a range from two to ten, for example from a range from four to nine.
  • the depth of field can be increased with different measures.
  • a diaphragm in particular a hole or slit diaphragm, can be introduced in a pupil plane of the detection beam path, through the effect of which the numerical aperture of the
  • the diaphragm can be swiveled or pushed into the detection beam path.
  • a controllable diaphragm element that is present in the detection beam path can also be used.
  • an LCD element Liquid Cristal Display
  • An aperture can also be arranged in the detection beam path, the opening width of which can be adjusted mechanically.
  • the adjustable diaphragms can be used both in the first operating state and when generating the second operating state. It is also possible for an adjustable diaphragm to enter the detection beam path
  • Another option for increasing the second depth of field is the principle of the increased depth of focus (Extended Depth of Focus; EDoF).
  • EDoF Extended Depth of Focus
  • various measures are known which can be used in the method according to the invention.
  • a phase mask can be introduced into the detection beam path, as described in King et al. (King, S.V. et al. (2015), Spatial light modulator phase mask
  • Detection beam path is generated a PSF, which has the shape of an Airy beam.
  • This PSF has a greatly increased axial extent and thus enables imaging with a greatly increased depth of field.
  • an axicon and possibly a pair of convex optical lenses it is possible for an axicon and possibly a pair of convex optical lenses to be arranged in the detection beam path
  • the focal length can also be increased by introducing a ring diaphragm into a pupil plane of the detection beam path.
  • the detection radiation can be reflected illumination radiation or spectral components of an illumination radiation.
  • the sample to be imaged or components thereof can also be excited to emit detection radiation.
  • suitable molecules can be used with an excitation radiation as illuminating radiation for the emission of
  • Fluorescence radiation can be excited as detection radiation.
  • detection radiation of several object planes lying parallel to one another is recorded simultaneously.
  • several sheets of light can be generated and used in the different object levels, i.e. levels in the sample volume.
  • a sample volume it is possible to illuminate a sample volume to be imaged with a first light sheet and at least one further light sheet arranged parallel to the first light sheet along each illumination axis, the light sheets lying one behind the other along a detection axis of the lens perpendicular to the direction of illumination and at most partially overlapping one another (US 2012 / 0224034 Al).
  • a sample volume to be imaged can be illuminated with a first light sheet and at least one further light sheet arranged parallel to the first light sheet in one illumination direction and along one illumination axis each.
  • the detection radiation caused by the respective light sheets is detected along a detection axis.
  • Each additional light sheet is generated shifted both in the detection direction, that is, along the detection axis, and in the illumination direction to the first light sheet.
  • the detection radiation of all light sheets is recorded simultaneously (WO 2016/189012 Al).
  • detection radiation of different object planes can be detected with an increased depth of field by introducing a grating into a Fourier plane of the detection beam path, by means of which a detection radiation comprising several wavelengths is split up into portions according to their diffraction orders and the portions of the
  • Diffraction orders can be directed simultaneously to different areas of an image plane.
  • the proportions of the individual diffraction orders can be detected separately in the image plane by means of a suitable detector, as is known from WO 2013/106731 A1.
  • the method according to the invention advantageously also enables a three-dimensional overview image to be created quickly. For this purpose, after the acquisition of an image of the sample volume in the second operating state with a first position of the light sheet, the light sheet becomes relative to the sample volume. Despite the relative movement of the light sheet and
  • the light sheets are offset by increments in which there is little or no overlap of the individual light sheets.
  • the individual light sheets do not overlap by more than 50%, but preferably by no more than 40%, for example 30%, 25%, 10% or 0% of their thickness.
  • the extension of the light sheets in the area of the lateral image field is referred to.
  • the acquisition speed is illustrated using a numerical example:
  • Detection beam path NA 1.0 (with water immersion), the half width FWHM x, y (full width at half maximum) is approx. 250 nm and the half width in the z direction FWHM Z
  • Step size 300 nm an image can be recorded.
  • an image must be taken every 3-4 pm (step size 3-4 pm).
  • a light sheet with a thickness that corresponds to at least the second depth of field is required, advantageously equal to the second depth of field.
  • the design options of the method according to the invention presented above relate primarily to applications in which the detection axis is directed essentially perpendicularly to the sample volume to be imaged and, for example, perpendicularly strikes a currently generated light sheet.
  • the proposed method can also be used in situations in which the detection axis is not directed perpendicularly to the sample or to a light sheet. Significant advantages are already achieved here for 2D overview images.
  • An example is the creation of an overview image of a sample or a sample volume in a standard sample holder such as petri dishes, multi-well plates or flat sample holders made of glass or plastic on an inverse light microscope.
  • the samples rest on these sample carriers and are of low height in relation to their spread on the sample carrier.
  • biological cells with a sample thickness H of approx. 10 - 30 pm and show a lateral expansion down to the millimeter range.
  • other organisms such as zebra fish or worms usually lie flat on the sample holder.
  • a light sheet can be directed into the sample volume in the second operating state.
  • the sample lies on a surface of the sample carrier which serves as a support surface.
  • Sample volume is therefore limited in one direction by the contact surface.
  • the lighting axis includes an angle a of less than 90 ° with the contact surface
  • the contact surface and the sample volume are thus illuminated at an angle with the light sheet.
  • the detection axis is perpendicular to the light sheet and thus also obliquely to the contact surface.
  • Detection beam path reduced.
  • the extension of the light sheet in the direction of the detection axis is increased so that it coincides at least with the second depth of field.
  • a number of images can be acquired, the light sheet being offset relative to the sample volume for each image acquisition, which advantageously corresponds at most to the second depth of field.
  • the 3-D information must then be transformed into a level that is as easy as possible for the user to use.
  • this is usually a plane parallel to the support surface of the sample holder.
  • This transformation can be a projection, for example.
  • a 3D overview can also be displayed.
  • the projection ideally takes place in the direction of the detection axis of the lens, as a result of which the highest possible resolution of the lens can be used.
  • the image data are computed with only a slight deterioration due to the geometry factor to be applied in the plane of the
  • the method according to the invention can also be used for systems with a lens changing device.
  • a lens change can be avoided, for example
  • Figure 1 is a schematic representation of a first embodiment of a microscope with a detection beam path and a pivotable optical element.
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of a second exemplary embodiment of a microscope with a detection beam path and a pivotable optical element
  • FIG. 3 shows a schematic illustration of a third exemplary embodiment of a microscope with a detection beam path and a pivotable optical element
  • FIG. 4 shows a schematic illustration of a microscope with a detection beam path and a closable optical element
  • 5 shows a schematic illustration of a microscope with an additional refractive element in the detection beam path between the objective and the sample volume;
  • FIG. 6 shows a schematic illustration of a microscope with a scanner
  • FIG. 7 shows a schematic illustration of a microscope with a detection beam path and an illumination beam path for the simultaneous generation of at least two light sheets along the detection axis and for detection of detection radiation from both light sheets;
  • Fig. 8 is a schematic representation of a first embodiment of the invention
  • Fig. 10 is a schematic representation of the implementation of the second embodiment of the method according to the invention.
  • FIG. 1 to 7 schematically show exemplary embodiments of microscopes 1 which contain modifications to carry out the method according to the invention.
  • the relevant beam paths and technical components are highlighted and no further technical components are shown for a better overview.
  • the same reference numerals designate the same technical elements unless expressly stated otherwise.
  • a detection beam path 2 is present in the microscope 1, in which a lens 4 for detecting a.
  • a detection axis 3 is present in the microscope 1, in which a lens 4 for detecting a.
  • a detection axis 3 is present in the microscope 1, in which a lens 4 for detecting a.
  • Detection radiation at least one optical lens 5, for example a tube lens, and a detector 7 are arranged in an image plane 6.
  • the detection axis 3 is directed into a sample space, not shown, in which a sample to be imaged with a sample volume 8 is placed.
  • control unit 9 and drive 10 by means of which an optical element 11 can be introduced into a pupil plane 12 of the detection beam path 2 in a controlled manner and removed from it again (symbolized by the double arrow).
  • the control unit 9 is connected to the detector 7, the drive 10 and a lighting device in a manner suitable for exchanging data.
  • the control unit 9 is also connected to a display or a screen 24 on which the captured image data of the operating states 1
  • Overview image and or raw image data can be displayed.
  • an illuminating beam path 13 of the illuminating device of which only one illuminating objective 14 is shown, with which illuminating radiation is shaped into a light sheet 16 and directed into the sample volume 8 along an illuminating axis 15.
  • the plane of the light sheet 16 determines a sample plane 17 which is currently to be imaged.
  • the light sheet 16 illuminates the sample plane 17 and generates detection radiation by reflections and / or by excitation of light emissions, in particular fluorescent radiation.
  • Detection radiation can be partially collected by the objective 4, which functions as a detection objective, and guided along the detection axis 3 to the detector 7 in the detection beam path 2, where it can be recorded or imaged as an image of the detection radiation.
  • the optical element 11 is an aperture which is pivoted out of the detection beam path 2.
  • Detection beam path 2 has a first numerical in this first operating state
  • the extent of the lateral image field is the same as that in the first operating state.
  • the first or the second operating state can additionally or alternatively also be manually adjustable.
  • a light sheet 16 is generated in the illumination beam path 15, the extent of which in the direction of the detection axis 3 - also referred to as thickness - is at least as large as the second depth of field ST2 and is in the region of the second depth of field ST2.
  • the sample volume 18 can be scanned faster with the light sheets 17 of increased thickness than with a light sheet 16, the thickness of which is designed for high-resolution image acquisition.
  • the optical element 11 can be used in other versions of the microscope and others
  • the optical element 11 can be designed in the form of a ring diaphragm in the pupil plane 12.
  • the optical element 11 can also comprise several elements and can be formed, for example, by an axicon and a convex lens arranged downstream of the axicon, as is symbolically shown in the image insert in FIG. 1.
  • the numerical aperture of the detection beam path 2 is not changed or is only changed optionally.
  • the optical element 11 can be a spatial light modulator (SLM), as this is shown in simplified form in FIG. 2 (see also King, SV et al. (2015), spatial light modulator phase mask implementation of wavefront encoded 3D computational-optical microscopy; Applied Optics 54: 8587-8595).
  • the optical element has a mirror M1, a spatial light modulator SLM (spatial light modulator) and a mirror M2.
  • the mirror M1 reflects the light onto the spatial light modulator SLM and from there via the mirror M2 back onto the detection axis 3. The numerical aperture is retained.
  • a transmitting SLM can alternatively also be used. This is placed in the beam path and controlled accordingly.
  • the mirrors Ml, M2 can be omitted.
  • the optical element 11 is realized by an arrangement of several elements, by the effect of which different diffraction orders of the collected detection radiation are separated and focused on different areas of the detector 7 (FIG. 3).
  • the detection radiation arrives after an intermediate image plane 19 into the pupil plane 12, which is also a Fourier plane.
  • a multifocal grating 20 is arranged in the pupil plane 12, the effect of which separates the different diffraction orders of the detection radiation.
  • Each diffraction order corresponds to a different sample plane 17.
  • the light sheet 16 contains several sample planes 17.
  • a chromatic correction grating 21, a prism 22 and a lens 52 are arranged downstream of the multifocal grating 20.
  • the chromatic correction grating 21 and the prism 22 correct the chromatic dispersion of the detection radiation which occurs due to the effect of the multifocal grating 20.
  • the lens 52 focuses the diffraction orders on the different areas of the detector 7.
  • the optical element 11 remains in the pupil plane 12 (FIG. 4).
  • the optical element 11 can be controlled by means of the control unit 9 and the drive 10 and can, for example, as an aperture with an adjustable hole diameter, with an adjustable one
  • Rectangular cutout or with adjustable slot width Rectangular cutout or with adjustable slot width.
  • a diaphragm based on a liquid crystal element can also be used as the adjustable optical element 11. Depending on its control, the resulting aperture can be adjusted.
  • the EDoF principle can be implemented in a further embodiment of the microscope 1 and the method for generating the second depth of field ST2 by an optical element 11 in the form of a refractive element, for example a body made of a for the, between the objective 4 and the sample volume 8 Detection radiation transparent material, is arranged (Fig. 5).
  • 3 shows the second operating state in which the optical element 11 has been pivoted into the detection beam path 2.
  • the optical effect of the optical element 11 designed and arranged in this way extends the point image washing function in the direction of the detection axis 3.
  • the thickness of the light sheet 16 is in turn adapted to the first or second operating state and the respective depths of field ST1 or ST2.
  • a thin light sheet 16 can also be used, which is scanned along the optical axis 3 of the detection beam path 2 during the detection period of the detector 7, for example the exposure time of a camera.
  • a scanner 18 is arranged in the illumination beam path 3 for the controlled generation of the scanning movement of the illumination radiation.
  • the scanner 18 can be controlled by means of the control unit 9. Since the
  • Integrated detector 7 over the detection period in the case of a camera over the exposure time, an effect is achieved with this embodiment which corresponds to the use of a thick sheet of light.
  • Such a scanning movement along the optical axis 3 is symbolized in FIG. 6 by a double arrow in the illumination objective 14.
  • the second depth of field ST2 can also be brought about by simultaneously at least two light sheets 16, for example a first light sheet 16.1 and a second light sheet 16.2, being directed into the sample volume 8.
  • one of the light sheets 16 is aligned on one side of the sample plane 17 and parallel to it.
  • the light sheets 16 adjoin each other in the sample plane 17 (shown for better clarity with markedly thick light sheets 16.1, 16.2).
  • At least two light sheets 16 are arranged offset along the detection axis 3 and perpendicular to this (not shown).
  • the detection axis 3 is directed perpendicular to the sample volume 8.
  • the sample lies on a support surface 23.1 of a sample holder 23.
  • the sample volume 8 is limited by the contact surface 23.1 in one direction with regard to its possible expansion.
  • a Cartesian coordinate system is used, the x-axis and y-axis of which run orthogonally to one another and in each case parallel to the contact surface 23.1, while the detection axis 3 runs in the direction of the z-axis.
  • the sample volume 8 has a height H.
  • the light sheet 16 is shown at a first position PI, which it assumes, for example, during the first operating state.
  • the light sheet 16 is generated parallel to the support surface 23.1 in an x-y plane, so that only lateral cross sections of the light sheet 16 can be seen in FIGS. 8 to 10.
  • the associated point image washing function PSFi.o is shown schematically as an oval next to the sample volume 8 in FIG. 8 with respect to its lateral (x-y plane) and axial (direction of the z axis) and indicates the first depth of field ST1.
  • NA1 1.0
  • a first step size SW1 would be necessary, with which the light sheet 16 is relative to the axial direction
  • Sample volume 8 would be shifted to a second position P2i , o, for example.
  • the point spread function is PSFi.o and specifies the second depth of field ST2.
  • a second step size SW2 would be possible, which is larger than the first step size SW1.
  • the first step size SW1 and the second step size SW2 each represent maximum values of step sizes that allow a seamless scanning of the sample volume 8 by means of the light sheet 16. Smaller step sizes can also be selected, with more images then having to be acquired for a complete scan.
  • FIG. 9 again shows a sample with a sample volume 8 on a support surface 23.1 of a sample carrier 23.
  • the detection axis 3, along which the detection radiation is collected and guided, is directed obliquely at the sample volume 8.
  • the first depth of field ST1 is an assumed first one
  • the light sheet 16 is to be shifted again with the step sizes SW1 or SW2.
  • the captured image data are converted into this xy plane and can then be displayed on a display or a screen 24.
  • a three-dimensional representation is possible.
  • the light sheet 16 is shown as an example at the first position PI.
  • Detection beam path 2 is in the second operating state and has a second one
  • Point image washing function PSFo 3 on. After detection of the detection radiation at the first position PI, the light sheet 16 becomes parallel to the contact surface 23.1 by the second
  • Increment SW2 shifted to the second position P2o , 3 and detection radiation again detected.
  • the point image washing functions PSFo, 3 at both positions PI and P2o , 3 are directly adjacent to one another, so that despite the large second step size SW2, seamless sampling of the sample volume 8 is made possible.
  • the sections of the sample volume 8 which are detected at the positions PI or P2o , 3 are delimited by broken solid lines.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen eines Übersichtsbilds unter Verwendung eines hochaperturigen Objektivs (4) mit den Schritten: Bereitstellen eines optischen Detektionsstrahlengangs (2) mit dem Objektiv (4), wobei der Detektionsstrahlengang (2) in einem ersten Betriebszustand eine erste Numerische Apertur (NA1) aufweist und eine erste Schärfentiefe (ST1) besitzt, die im Wesentlichen in einer Fokalebene des Detektionsstrahlengangs (2) liegt und in dem ersten Betriebszustand ein Bild einer Detektionsstrahlung mit der ersten Schärfentiefe (ST1) und mit einem lateralen Bildfeld erfasst wird oder erfasst werden kann, wobei die Detektionsstrahlung bewirkt wird, indem mindestens ein Lichtblatt (16) entlang einer Beleuchtungsachse (15) in ein im Probenraum befindliches abzubildendes Probenvolumen (8) gerichtet wird; Überführen des Detektionsstrahlengangs (2) in einen zweiten Betriebszustand, indem die erste Schärfentiefe (ST1) auf eine zweite Schärfentiefe (ST2) erhöht wird, wobei das hochaperturige Objektiv (4) im Detektionsstrahlengang (2) verbleibt, im zweiten Betriebszustand Erfassen einer Detektionsstrahlung, wobei die aus einem Probenraum kommende Detektionsstrahlung mittels des Objektivs (2) gesammelt, entlang des Detektionsstrahlengangs (2) geführt und mittels mindestens eines für die Detektionsstrahlung empfindlichen Detektors (7) als ein Bild mit einem lateralen Bildfeld erfasst wird, wobei die lateralen Bildfelder in dem ersten und zweiten Betriebszustand gleich sind.

Description

Verfahren zum Erzeugen eines Übersichtsbilds unter Verwendung eines hochaperturigen Objektivs
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen eines Übersichtsbilds unter Verwendung eines hochaperturigen Objektivs.
Mit Verfahren der Mikroskopie werden üblicherweise kleine Abschnitte größerer Objekte untersucht. Um einen geeigneten Abschnitt für die auszuführenden Untersuchungen und Beobachtungen zu finden, werden oft sogenannte Übersichtsbilder erstellt.
An üblichen (Weitfeld-) Mikroskopen und Laser-Scanning-Mikroskopen (LSM) wird das Übersichtsbild meist mit einem Objektiv erfasst, dessen Vergrößerung geringer als die Vergrößerung eines für die eigentliche Untersuchung verwendeten Objektivs ist. Eine geringere Vergrößerung geht mit einer Vergrößerung des Sehfelds einher, so dass große Bereiche einer Probe sehr schnell abgebildet werden können. Die Reduzierung der Vergrößerung führt in der Regel allerdings auch zu einer Reduzierung der Numerischen Apertur (NA) und somit zu einer Verringerung der lateralen und axialen Auflösung des Detektionssystems. Für ein Übersichtsbild kann jedoch auf eine hohe
Auflösung verzichtet werden.
Auf Basis dieser Übersichtsbilder ist ein Anwender in der Lage, einen für die Untersuchung geeigneten Abschnitt der Probe (Region of Interest, ROI) zu definieren. Dies kann z. B. eine bestimmte Zelle eines Zellverbands oder biologischen Gewebes sein, die anschließend mit einem Objektiv mit hoher Vergrößerung und hoher Auflösung beobachtet und abgebildet werden kann.
Kann in einem Mikroskopsystem nicht oder nicht ohne größere Nachteile zwischen Objektiven unterschiedlicher Vergrößerung gewechselt werden, ist der Benutzer auf das jeweils vorhandene Objektiv angewiesen. Solche Systeme ohne Möglichkeit eines einfachen Wechsels zwischen unterschiedlichen Objektiven besitzen beispielsweise aus Kostengründen keine Wechseleinheit oder es müssen besonders anspruchsvolle Toleranzen bei der Justage des jeweiligen Objektivs eingehalten werden.
Ist ein Mikroskop auf die Verwendung eines vorhandenen Objektivs mit einer insbesondere hohen Vergrößerung festgelegt, können Übersichtsbilder nur sehr langsam aufgenommen werden, da kleine Abschnitte der Probe mit einer hohen Datendichte erfasst werden.
Ein Beispiel für Mikroskopsysteme, bei denen ein Objektivwechsel zumindest nur aufwändig möglich ist und deren üblicherweise eingesetztes Objektiv eine hohe Vergrößerung und eine geringe
Schärfentiefe aufweist, sind Lichtblattmikroskope. Bei diesen wird ein dünnes Lichtblatt in ein abzubildendes Probenvolumen gerichtet und mittels eines Objektivs eines Detektionsstrahlengangs anhand einer erfassten Detektionsstrahlung ein Bild der so beleuchteten Probenebene erfasst. Das Lichtblatt kann beispielsweise als ein statisches Lichtblatt mittels einer Zylinderlinse im
Beleuchtungsstrahlengang oder mittels eines in der Lichtblattebene bewegten (gescannten)
Lichtstrahls (dynamisches Lichtblatt) erzeugt werden. Der Tiefenbereich, aus dem
Detektionsstrahlung erfasst werden kann, wird noch zusätzlich zur begrenzten Tiefenschärfe des Objektivs durch das dünne Lichtblatt eingeschränkt.
Lichtblattmikroskope werden in der Regel für dreidimensionale Aufnahmen von biologischen Proben verwendet. Soll unter Verwendung von Lichtblättern beispielsweise ein dreidimensionales
Übersichtsbild erstellt werden, ist eine große Anzahl einzelner Aufnahmen erforderlich, was einen hohen Zeitbedarf bedingt und eine hohe Rechenleistung erfordert. Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde ein Verfahren vorzuschlagen, mittels dem zwei- und dreidimensionale Übersichtsbilder eines Probenvolumens schnell und ohne dazu das Objektiv des Detektionsstrahlengangs zu wechseln erstellt werden können.
Die Aufgabe wird mit einem Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Erzeugen und optional zum Bereitstellen eines
Übersichtsbilds unter Verwendung eines hochaperturigen Objektivs. Ein hochaperturiges Objektiv weist beispielsweise eine Numerische Apertur von NA = 0,5; 0,6; 0,75 und mehr, beispielsweise 1,0 auf. Die Objektive können als Immersionsobjektive ausgebildet sein. Ein geeignetes
Immersionsmedium ist beispielsweise Wasser.
Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte, die in der angegebenen Reihenfolge ausgeführt werden, wobei in weiteren Ausgestaltungen des Verfahrens hier nicht angegebene Zwischenschritte möglich sind.
Es wird ein optischer Detektionsstrahlengang mit dem Objektiv bereitgestellt. Der
Detektionsstrahlengang kann beispielsweise in einem Mikroskop vorhanden sein und mit diesem bereitgestellt werden. Der Detektionsstrahlengang kann zwei Betriebszustände aufweisen, wobei diese manuell oder automatisch gesteuert eingestellt werden können. In einem ersten
Betriebszustand weist der Detektionsstrahlengang eine erste Numerische Apertur auf und besitzt eine erste Schärfentiefe in einer Fokalebene des Detektionsstrahlengangs. Mit dem in dem ersten Betriebszustand befindlichen Detektionsstrahlengang wird ein Bild einer Detektionsstrahlung mit der ersten Schärfentiefe und mit einem lateralen Bildfeld erfasst. Optional können auch mehrere Bilder mit der ersten Schärfentiefe erfasst werden. Die Detektionsstrahlung wird bewirkt, indem mindestens ein Lichtblatt entlang einer Beleuchtungsachse in ein im Probenraum befindliches abzubildendes Probenvolumen gerichtet wird.
Damit das Lichtblatt, insbesondere dessen Ausdehnung (Dicke) in Richtung einer Detektionsachse des Objektivs, an die zweite Schärfentiefe angepasst werden kann, wird vorzugsweise eine einstellbare Beleuchtungsvorrichtung zur Erzeugung des Lichtblatts oder der Lichtblätter verwendet.
Die Dicke des Lichtblatts beziehungsweise der Lichtblätter kann im ersten Betriebszustand von der Schärfentiefe des Detektionsobjektivs abweichen. Insbesondere kann die Schärfentiefe des
Detektionsobjektivs kleiner als die Dicke(-n) des Lichtblatts beziehungsweise der Lichtblätter sein. Im zweiten Betriebszustand sind dagegen die Schärfentiefe des Detektionsobjektivs und die
Lichtblattdicke(-n) vorzugsweise gleich.
Der Detektionsstrahlengang wird in einem weiteren Verfahrensschritt in einen zweiten
Betriebszustand überführt, indem die erste Schärfentiefe auf eine zweite Schärfentiefe erhöht wird. Das hochaperturige Objektiv verbleibt dabei im Detektionsstrahlengang.
Ist der zweite Betriebszustand hergestellt, wird eine Detektionsstrahlung erfasst, die aus einem Probenraum, insbesondere aus einem zu untersuchenden Probenvolumen, kommt. Die
Detektionsstrahlung wird mittels des Objektivs gesammelt, entlang des Detektionsstrahlengangs geführt und mittels mindestens eines für die Detektionsstrahlung empfindlichen Detektors in einer Bildebene als ein Bild mit einem lateralen Bildfeld erfasst. Die lateralen Bildfelder in dem ersten und zweiten Betriebszustand sind weitestgehend gleich.
Die Schärfentiefe gibt denjenigen Entfernungsbereich vor dem Objektiv an, aus dem ausgehende und in einer Bildebene des Detektionsstrahlengangs abgebildete Detektionsstrahlung ein detailreiches, scharfes Bild ergibt. Eine gegenüber einer ersten Schärfentiefe erhöhte zweite Schärfentiefe ist also durch einen größeren absoluten Entfernungsbereich gekennzeichnet. Die mittleren Lagen der Entfernungsbereiche der ersten und zweiten Schärfentiefe können gleich sein.
Der Begriff der Numerischen Apertur wird in dieser Beschreibung auf den Detektionsstrahlengang bezogen, falls dies nicht ausdrücklich anders angegeben ist.
Die Schärfentiefe kann in bekannter Weise ermittelt, insbesondere berechnet werden. Es wird dabei die wellenoptische Schärfentiefe verwendet. Eine Berechnung kann mittels der allgemeinen Formel d = l /(2* n*sin(u)2) erfolgen. Dabei sind l die Wellenlänge, n die Brechzahl und u der Aperturwinkel. Zur Approximation der Halbwertsbreite in Richtung der Z-Achse kann beispielsweise auch 1,67* l*h/NA2 verwendet werden.
Eine Erhöhung der zweiten Schärfentiefe gegenüber der ersten Schärfentiefe erfolgt mindestens mit einem Faktor Zwei, vorteilhaft aber mit einem Faktor aus einem Bereich von Zwei bis Zehn, beispielsweise aus einem Bereich von Vier bis Neun. Die Erhöhung der Schärfentiefe kann mit unterschiedlichen Maßnahmen erreicht werden.
Eine Möglichkeit besteht darin, die Numerische Apertur des Detektionsstrahlengangs zu verringern. Dazu kann in einer Pupillenebene des Detektionsstrahlengangs eine Blende, insbesondere eine Loch oder Schlitzblende eingebracht werden, durch deren Wirkung die Numerische Apertur des
Detektionsstrahlengangs verringert wird.
Die Blende kann in den Detektionsstrahlengang eingeschwenkt oder eingeschoben werden. In weiteren Ausgestaltungen kann auch ein in dem Detektionsstrahlengang vorhandenes ansteuerbares Blendenelement verwendet werden. Beispielsweise kann ein LCD-Element (Liquid-Cristal-Display) in dem Detektionsstrahlengang vorhanden oder eingebracht werden. Je nach Bedarf wird das
Blendenelement mittels einer Steuereinheit angesteuert und eine jeweils gewünschte Öffnungsweite und Form der Öffnung eingestellt. Es kann auch eine Blende im Detektionsstrahlengang angeordnet sein, deren Öffnungsweite mechanisch einstellbar ist. Die einstellbaren Blenden können sowohl im ersten Betriebszustand als auch bei der Erzeugung des zweiten Betriebszustands verwendet werden. Es ist auch möglich, dass eine einstellbare Blende in den Detektionsstrahlengang ein
beziehungsweise ausgeschwenkt oder ein- beziehungsweise ausgeschoben wird.
Vorteilhaft wird die Numerische Apertur des ersten Betriebszustands um einen Faktor von 0,5 oder weniger, beispielsweise 0,3, verringert. Dadurch wird eine hinreichend große Erhöhung der zweiten Schärfentiefe um etwa das Vier- beziehungsweise das Neunfache erreicht. Beispielsweise erlaubt ein Absenken der Numerischen Apertur von NA = 1,0 auf NA = 0,3 (= Faktor 0,3) und eine Anpassung der Schrittweiten der Detektion eine etwa zehnfach schnellere Erstellung des Übersichtsbildes, wie dies weiter unten noch näher erläutert wird.
Eine weitere Möglichkeit zur Erhöhung der zweiten Schärfentiefe ist unter Anwendung des Prinzips der vergrößerten Fokuslänge (Extended Depth of Focus; EDoF) möglich. Dazu sind unterschiedliche Maßnahmen bekannt, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können.
Beispielsweis kann in den Detektionsstrahlengang eine Phasenmaske eingebracht werden, wie dies in King et al. beschrieben ist (King, S. V. et al. (2015), Spatial light modulator phase mask
Implementation of wavefront encoded 3D computational-optical microscopy; Applied Optics 54:
8587 - 8595). Durch Einbringen einer kubischen Phasenmaske in die Pupille des
Detektionsstrahlengangs wird eine PSF erzeugt, die die Form eines Airy-Strahls aufweist. Diese PSF hat eine stark erhöhte axiale Ausdehnung und ermöglicht damit eine Abbildung mit stark erhöhter Tiefenschärfe. Es ist in einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens möglich, dass ein Axicon und gegebenenfalls ein Paar konvexer optischer Linsen in dem Detektionsstrahlengang angeordnet werden
(US 9,494,785 B2).
Die Fokuslänge kann auch vergrößert werden, indem eine Ringblende in eine Pupillenebene des Detektionsstrahlengangs eingebracht wird.
Ferner ist es möglich, in dem Detektionsstrahlengang ein zusätzliches refraktives optisches Element zur axialen Verlängerung der Punktbildverwaschungsfunktion (Point-spread-function; PSF) einzubringen, wie dies aus der WO 2017/075275 Al bekannt ist. Dabei werden mittels eines zwischen dem Objektiv und der abzubildenden Probe eingebrachten refraktiven optischen Elements gezielt sphärische Aberrationen erzeugt, die zu einer verlängerten PSF in Richtung der
Detektionsachse des Objektivs führen.
Die Detektionsstrahlung kann eine reflektierte Beleuchtungsstrahlung oder spektrale Anteile einer Beleuchtungsstrahlung sein. Die abzubildende Probe beziehungsweise Bestandteile dieser können auch zur Emission einer Detektionsstrahlung angeregt werden. Insbesondere können geeignete Moleküle mit einer Anregungsstrahlung als Beleuchtungsstrahlung zur Emission von
Fluoreszenzstrahlung als Detektionsstrahlung angeregt werden.
In einer weiteren möglichen Herangehensweise zur Erhöhung der Schärfentiefe wird simultan Detektionsstrahlung mehrerer zueinander parallel liegender Objektebenen erfasst. Dazu können mehrere Lichtblätter in den unterschiedlichen Objektebenen, also Ebenen im Probenvolumen, erzeugt und genutzt werden.
So ist es beispielsweise möglich ein abzubildendes Probenvolumen mit einem ersten Lichtblatt und mindestens einem parallel zum ersten Lichtblatt angeordneten weiteren Lichtblatt entlang je einer Beleuchtungsachse zu beleuchten, wobei die Lichtblätter entlang einer zur Beleuchtungsrichtung senkrechten Detektionsachse des Objektivs hintereinander liegen und einander höchstens anteilig überlappen (US 2012/0224034 Al).
Alternativ kann ein abzubildendes Probenvolumen mit einem ersten Lichtblatt und mindestens einem parallel zum ersten Lichtblatt angeordneten weiteren Lichtblatt in einer Beleuchtungsrichtung und entlang je einer Beleuchtungsachse beleuchtet werden. Entlang einer Detektionsachse wird die durch die jeweiligen Lichtblätter bewirkte Detektionsstrahlung erfasst. Jedes weitere Lichtblatt ist sowohl in Detektionsrichtung, also entlang der Detektionsachse, als auch in Beleuchtungsrichtung zum ersten Lichtblatt verschoben erzeugt. Die Detektionsstrahlung aller Lichtblätter wird gleichzeitig erfasst (WO 2016/189012 Al).
Ohne Lichtblätter kann Detektionsstrahlung verschiedener Objektebenen mit einer erhöhten Schärfentiefe erfasst werden, indem in eine Fourierebene des Detektionsstrahlengangs ein Gitter eingebracht wird, mittels dem eine mehrere Wellenlängen umfassende Detektionsstrahlung in Anteile entsprechend ihrer Beugungsordnungen aufgespalten wird und die Anteile der
Beugungsordnungen gleichzeitig auf unterschiedliche Bereiche einer Bildebene gerichtet werden. In der Bildebene können die Anteile der einzelnen Beugungsordnungen mittels eines geeigneten Detektors separat erfasst werden, wie dies aus der WO 2013/106731 Al bekannt ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht neben einer zweidimensionalen Darstellung vorteilhaft auch eine schnelle Erstellung eines dreidimensionalen Übersichtsbilds. Dazu wird nach der Erfassung eines Bildes des Probenvolumens im zweiten Betriebszustand mit einer ersten Lage des Lichtblatts das Lichtblatt relativ zum Probenvolumen. Trotz der Relativbewegung von Lichtblatt und
Probenvolumen verbleibt das Lichtblatt in der Fokusebene des Objektivs. Die Bilder der derart versetzten Lichtblätter können gespeichert und mittels eines Rechners zu einem dreidimensionalen Übersichtsbild zusammengefügt werden.
Um eine hohe Geschwindigkeit bei der Erfassung der einzelnen Bilder und der Erstellung des Übersichtsbilds zu erreichen, werden die Lichtblätter jeweils um Schrittweiten versetzt, bei denen keine oder nur eine geringe Überlappung der einzelnen Lichtblätter auftritt. Beispielsweise überlappen die einzelnen Lichtblätter nicht mehr als 50%, vorzugsweise aber um nicht mehr als 40%, beispielsweise 30%, 25%, 10% oder 0% ihrer Dicke. Dabei wird auf die Ausdehnung der Lichtblätter im Bereich des lateralen Bildfelds Bezug genommen.
Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erreichte vorteilhafte Verbesserung der
Erfassungsgeschwindigkeit wird an einem Zahlenbeispiel verdeutlicht:
Bei einem System mit einem Objektiv lOx und mit einer Numerischen Apertur des
Detektionsstrahlengangs NA = 1.0 (mit Wasser-Immersion), beträgt die Halbwertsbreite FWHMx,y (Full Width at Half Maximum) ca. 250 nm und die Halbwertsbreite in z-Richtung FWHMZ
(^Schärfentiefe) etwa 1000 nm. Bei einem üblichen Vorgehen muss also etwa alle 300 nm
(Schrittweite 300 nm) ein Bild aufgenommen werden.
Bei der Erzeugung eines Übersichtsbilds ist es üblich, Einschränkungen bezüglich der lateralen Auflösung zu akzeptieren. So beträgt z. B. bei einem Übersichtsbild mit einem Objektiv lOx und NA = 0.3 die laterale Halbwertsbreite FWHMx,y ca. 900 nm und in z-Richtung FWHMZ sogar 10-14 pm, je nach verwendetem Immersionsmedium. Bei einem üblichen Vorgehen bei der Erfassung
(sampling) von Bildern muss alle 3-4 pm (Schrittweite 3-4 pm) ein Bild aufgenommen werden.
Weist der Detektionsstrahlengang eine Numerische Apertur NA = 0,3 auf, sind demnach etwa lOx weniger Bilder zu erfassen als bei einer Verwendung eines Detektionsstrahlengangs mit einer NA = 1,0.
Um die erhöhte zweite Schärfentiefe bei verringerter Numerischer Apertur ausnutzen zu können, ist ein Lichtblatt mit einer Dicke erforderlich, die mindestens der zweiten Schärfentiefe entspricht, vorteilhaft gleich der zweiten Schärfentiefe ist. Durch eine Reduktion der Numerischen Apertur des Detektionsobjektivs von beispielsweise NA = 1,0 auf NA = 0,3 mithilfe einer Pupillenblende und einer Erhöhung der Lichtblattdicke kann also bei Akzeptanz einer reduzierten axialen und lateralen Auflösung eine Erhöhung der Schärfentiefe von etwa Faktor 10 erreicht werden. Dreidimensionale Übersichtsbilder können entsprechend zehnfach so schnell erfasst und bereitgestellt werden. Bei noch geringeren Auflösungsanforderungen sind noch größere Faktoren möglich. Das laterale Bildfeld wird beibehalten.
Die bisher vorgestellten Ausgestaltungsmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens betreffen in erster Linie Anwendungen, in denen die Detektionsachse im Wesentlichen senkrecht auf das abzubildende Probenvolumen gerichtet ist und beispielsweise senkrecht auf ein aktuell erzeugtes Lichtblatt trifft.
Das vorgeschlagene Verfahren ist auch in Situationen anwendbar, in denen die Detektionsachse nicht senkrecht auf die Probe beziehungsweise auf ein Lichtblatt gerichtet ist. Hier werden schon für 2D- Übersichtsbilder wesentliche Vorteile erreicht.
Ein Beispiel ist die Erstellung eines Übersichtsbildes einer Probe oder eines Probenvolumens in einem Standard-Probenträger wie zum Beispiel Petrischalen, Multi-Well-Platten oder flachen Probenträgern aus Glas oder Kunststoff an einem inversen Lichtblattmikroskop. Auf diesen Probenträgern liegen die Proben in aller Regel auf und sind im Verhältnis zu ihrer Ausbreitung auf dem Probenträger von geringer Höhe. Beispiele dafür sind biologische Zellen, die eine Probendicke H von ca. 10 - 30 pm und eine laterale Ausdehnung bis in den Millimeterbereich zeigen. Aber auch andere Organismen wie zum Beispiel Zebrafische oder Würmer liegen meist flach auf dem Probenträger auf.
Aus diesem Grund möchte der Nutzer ein Übersichtsbild erhalten, anhand dessen er sich parallel zum Probenträger orientieren und die dort nebeneinander liegenden Zellstrukturen, Zellorganellen, die Zellen selbst oder Abschnitte der Organismen zu überblicken und einen Abschnitt (ROI) für eine hochauflösende Bilderfassung auszuwählen. Ein solches laterales Übersichtsbild soll schnell aufgenommen werden können.
Dazu kann in dem zweiten Betriebszustand ein Lichtblatt in das Probenvolumen gerichtet werden.
Die Probe liegt auf einer als Auflagefläche dienenden Oberfläche des Probenträgers auf. Das
Probenvolumen wird daher durch die Auflagefläche in einer Richtung begrenzt.
Die Beleuchtungsachse schließt mit der Auflagefläche einen Winkel a kleiner 90° ein, die
Auflagefläche und das Probenvolumen werden also mit dem Lichtblatt schräg beleuchtet. Die Detektionsachse ist senkrecht auf das Lichtblatt und somit ebenfalls schräg zur Auflagefläche gerichtet.
Um die zweite Schärfentiefe zu bewirken wird beispielsweise die Numerische Apertur des
Detektionsstrahlengangs verringert. Zugleich wird die Ausdehnung des Lichtblatts in Richtung der Detektionsachse so vergrößert, dass diese mindestens mit der zweiten Schärfentiefe zusammenfällt. Es kann eine Anzahl von Bildern erfasst werden, wobei das Lichtblatt für jede Bilderfassung relativ zum Probenvolumen versetzt wird, die vorteilhaft höchstens der zweiten Schärfentiefe entspricht.
Um ein 2-D-Übersichtsbild zu erhalten, muss anschließend eine Transformation der 3-D-lnformation in eine für den Nutzer möglichst leicht zu handhabende Ebene stattfinden. Dies ist im Falle des inversen Lichtblattmikroskops üblicherweise eine Ebene parallel zur Auflagefläche des Probenträgers. Diese Transformation kann beispielsweise eine Projektion sein. Alternativ kann auch wie schon zuvor im orthogonalen fall beschrieben eine 3D-Übersicht angezeigt werden.
Die Projektion erfolgt idealerweise in Richtung der Detektionsachse des Objektivs, wodurch eine höchstmögliche Auflösung des Objektivs nutzbar ist. Die Bilddaten werden rechnerisch mit nur geringer Verschlechterung infolge des anzuwendenden Geometrie-Faktors in die Ebene der
Auflagefläche projiziert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch für Systeme mit einer Objektivwechseleinrichtung verwendet werden. So kann ein Objektivwechsel vermieden werden, um beispielsweise
Positionierungstoleranzen zu umgehen oder auch um den Arbeitsablauf zu erleichtern. Der Nachteil des gleichbleibenden Bildfelds wird dabei in Kauf genommen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines Mikroskops mit einem Detektionsstrahlengang und einem einschwenkbaren optischen Element;
Fig. 2 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines Mikroskops mit einem Detektionsstrahlengang und einem einschwenkbaren optischen Element;
Fig. 3 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels eines Mikroskops mit einem Detektionsstrahlengang und einem einschwenkbaren optischen Element;
Fig. 4 eine schematische Darstellung eines Mikroskops mit einem Detektionsstrahlengang und einem verschließbaren optischen Element; Fig. 5 eine schematische Darstellung eines Mikroskops mit einem zusätzlichen refraktiven Element im Detektionsstrahlengang zwischen Objektiv und Probenvolumen;
Fig. 6 eine schematische Darstellung eines Mikroskops mit einem Scanner;
Fig. 7 eine schematische Darstellung eines Mikroskops mit einem Detektionsstrahlengang und einem Beleuchtungsstrahlengang zur simultanen Erzeugung mindestens zweier Lichtblätter entlang der Detektionsachse und zur Erfassung von Detektionsstrahlung beider Lichtblätter;
Fig. 8 eine schematische Darstellung einer ersten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Verfahrens;
Fig. 9 eine schematische Darstellung einer zweiten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens und
Fig. 10 eine schematische Darstellung der Durchführung der zweiten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
In den Fig. 1 bis 7 werden schematisch Ausführungsbeispiele von Mikroskopen 1 dargestellt, die Modifikationen zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhalten. Dabei wird auf die relevanten Strahlengänge und technischen Bauteile abgehoben und auf eine Darstellung vorhandener weiterer technischer Bauteile zur besseren Übersicht verzichtet. Gleiche Bezugszeichen kennzeichnen gleiche technische Elemente, wenn dies nicht ausdrücklich anders angegeben ist.
In einem ersten Ausführungsbeispiel (Fig. 1) ist in dem Mikroskop 1 ein Detektionsstrahlengang 2 vorhanden, bei dem entlang einer Detektionsachse 3 ein Objektiv 4 zur Erfassung einer
Detektionsstrahlung, wenigstens eine optische Linse 5, beispielsweise eine Tubuslinse, und in einer Bildebene 6 ein Detektor 7 angeordnet sind. Die Detektionsachse 3 ist in einen nicht näher gezeigten Probenraum gerichtet, in dem eine abzubildende Probe mit einem Probenvolumen 8 platziert ist.
Es sind weiterhin eine Steuereinheit 9 und Antrieb 10 vorhanden, mittels denen ein optisches Element 11 in eine Pupillenebene 12 des Detektionsstrahlengangs 2 gesteuert eingebracht und wieder aus diesem entfernt werden kann (durch den Doppelpfeil symbolisiert). Die Steuereinheit 9 ist mit dem Detektor 7, dem Antrieb 10 und einer Beleuchtungsvorrichtung in einer zum Austausch von Daten geeigneten Weise verbunden. Die Steuereinheit 9 ist außerdem mit einer Anzeige oder einem Bildschirm 24 verbunden, auf dem die erfassten Bilddaten der Betriebszustände, ein
Übersichtsbild und oder Rohbilddaten angezeigt werden können.
Ferner ist ein Beleuchtungsstrahlengang 13 der Beleuchtungsvorrichtung vorhanden, von der lediglich ein Beleuchtungsobjektiv 14 gezeigt ist, mit dem eine Beleuchtungsstrahlung zu einem Lichtblatt 16 geformt und entlang einer Beleuchtungsachse 15 in das Probenvolumen 8 gerichtet ist. Die Ebene des Lichtblatts 16 bestimmt eine aktuell abzubildende Probenebene 17. Das Lichtblatt 16 beleuchtet die Probenebene 17 und erzeugt durch Reflektionen und/oder durch eine Anregung von Lichtemissionen, insbesondere von Fluoreszenzstrahlung, eine Detektionsstrahlung. Diese
Detektionsstrahlung kann anteilig durch das Objektiv 4, das als Detektionsobjektiv fungiert, gesammelt und entlang der Detektionsachse 3 zu dem Detektor 7 im Detektionsstrahlengang 2 geführt und dort als ein Bild der Detektionsstrahlung erfasst oder abgebildet werden.
Die Fig. 1 zeigt den Detektionsstrahlengang 2 in einem ersten Betriebszustand. Das optische Element 11 ist eine Blende, die aus dem Detektionsstrahlengang 2 ausgeschwenkt ist. Der
Detektionsstrahlengang 2 besitzt in diesem ersten Betriebszustand eine erste Numerische
Apertur NA1 (NA1 = 1,0). Aufgrund dieser ersten Numerischen Apertur NA1 wird das Bild mit einer ersten Schärfentiefe ST1 und einem lateralen Bildfeld erfasst. Das Lichtblatt 16 liegt im Bereich der ersten Schärfentiefe ST1.
Um einen zweiten Betriebszustand des Detektionsstrahlengangs 2 zu bewirken, erzeugt die
Steuereinheit 9 einen Steuerbefehl und gibt diesen an den Antrieb 10 aus, der seinerseits das optische Element 11 in den Detektionsstrahlengang 2 einschiebt (mit unterbrochener Volllinie dargestellt). Durch Wirkung des optischen Elements 11 besitzt der Detektionsstrahlengang 2 nun eine zweite Numerische Apertur NA2, die geringer (NA2 = 0,3) als die erste Numerische Apertur NA1 ist. Diese verringerte zweite Numerische Apertur NA2 bewirkt eine Erhöhung der Schärfentiefe, sodass der Detektionsstrahlengang 2 nun eine zweite Schärfentiefe ST2 besitzt. Die Ausdehnung des lateralen Bildfelds ist dabei gleich derjenigen im ersten Betriebszustand. Der erste beziehungsweise der zweite Betriebszustand kann in weiteren Ausführungen der Erfindung auch zusätzlich oder alternativ manuell einstellbar sein.
Zugleich wird im Beleuchtungsstrahlengang 15 ein Lichtblatt 16 erzeugt, dessen Ausdehnung in Richtung der Detektionsachse 3 - auch als Dicke bezeichnet - wenigstens so groß wie die zweite Schärfentiefe ST2 ist und das im Bereich der zweiten Schärfentiefe ST2 liegt.
Es ist nun möglich das Lichtblatt 16 in einer Relativbewegung zum Probenvolumen 8 mit
Schrittweiten (siehe Fig. 8 bis 10) an Positionen zu verschieben, bei denen einander kaum überlappende oder aneinander angrenzende Probenebenen 17 beleuchtet werden und jeweils Bilder der Probenebenen 17 erfasst werden können. Das Probenvolumen 18 ist mit den Lichtblättern 17 erhöhter Dicke schneller abtastbar als mit einem Lichtblatt 16, dessen Dicke auf eine hochauflösende Bilderfassung ausgelegt ist.
Das optische Element 11 kann in weiteren Ausführungen des Mikroskops und weiteren
Ausgestaltungen des Verfahrens statt einer Lochblende auch eine Schlitzblende oder eine
Rechteckblende sein.
Soll ein Wechsel der Schärfentiefe unter Anwendung des EDoF-Prinzips erfolgen, kann das optische Element 11 in Form einer Ringblende in der Pupillenebene 12 ausgebildet sein. Zur Umsetzung des EDoF-Prinzips kann das optische Element 11 auch mehrere Elemente umfassen und beispielsweise durch ein Axicon und eine dem Axicon nachgeordnete konvexe Linse gebildet sein, wie dies in Fig. 1 symbolisch in dem Bildeinschub gezeigt ist. Bei einer Anwendung des EDoF-Prinzips wird die Numerische Apertur des Detektionsstrahlengangs 2 nicht oder nur optional verändert.
Das optische Element 11 kann in einer weiteren Ausführungsmöglichkeit ein Spatial Light Modulator (SLM) sein, wie diese in Fig. 2 vereinfacht dargestellt ist (siehe auch King, S. V. et al. (2015), Spatial light modulator phase mask Implementation of wavefront encoded 3D computational-optical microscopy; Applied Optics 54: 8587 - 8595). Das optische Element weist einen Spiegel Ml, einen räumlichen Lichtmodulator SLM (spatial light modulator) und einen Spiegel M2 auf. Der Spiegel Ml reflektiert das Licht auf den räumlichen Lichtmodulator SLM und von dort über den Spiegel M2 wieder auf die Detektionsachse 3. Die Numerische Apertur bleibt erhalten.
Anstatt einen reflektierenden SLM, beispielsweise einen LCOS-SLM (LCOS = liquid crystal on Silicon) zu verwenden, kann alternativ auch ein transmittierender SLM eingesetzt werden. Dieser wird in den Strahlengang gestellt und entsprechend angesteuert. Die Spiegel Ml, M2 können entfallen.
In einer weiteren möglichen Ausführung des Mikroskops 1 und einer Ausgestaltung des Verfahrens ist das optische Element 11 durch eine Anordnung mehrere Elemente realisiert, durch deren Wirkung unterschiedliche Beugungsordnungen der gesammelten Detektionsstrahlung separiert und auf verschiedene Bereiche des Detektors 7 fokussiert werden (Fig. 3). Die Detektionsstrahlung gelangt nach einer Zwischenbildebene 19 in die Pupillenebene 12, die zugleich eine Fourierebene ist. In der Pupillenebene 12 ist ein multifokales Gitter 20 (multifocal grating) angeordnet, durch deren Wirkung die unterschiedlichen Beugungsordnungen der Detektionsstrahlung aufgetrennt werden. Dabei entspricht jede Beugungsordnung einer anderen Probenebene 17. Das Lichtblatt 16 beinhaltet in dieser Ausgestaltung des Verfahrens mehrere Probenebenen 17.
Dem multifokalen Gitter 20 nachgeordnet sind ein chromatisches Korrekturgitter 21, ein Prisma 22 und eine Linse 52. Das chromatische Korrekturgitter 21 und das Prisma 22 korrigieren die chromatische Dispersion der Detektionsstrahlung, die durch Wirkung des multifokalen Gitters 20 auftreten. Die Linse 52 fokussiert die Beugungsordnungen auf die verschiedenen Bereiche des Detektors 7.
In einem vierten Ausführungsbeispiel verbleibt das optische Element 11 in der Pupillenebene 12 (Fig. 4). Das optische Element 11 ist mittels der Steuereinheit 9 und dem Antrieb 10 ansteuerbar und kann beispielsweise als eine Blende mit verstellbarem Lochdurchmesser, mit verstellbarem
Rechteckausschnitt oder mit verstellbarer Schlitzbreite sein. Als einstellbares optisches Element 11 kann auch eine Blende auf Basis eines Flüssigkristallelements verwendet sein. Je nach dessen Ansteuerung kann die resultierende Blendenöffnung eingestellt werden.
Mit den genannten Ausführungen kann zwischen der ersten Schärfentiefe ST1 und der zweiten Schärfentiefe ST2 beziehungsweise einer weiteren Schärfentiefe durch Änderung der Numerischen Apertur des Detektionsstrahlengangs 2 gewechselt werden.
Das EDoF-Prinzip kann in einer weiteren Ausführung des Mikroskops 1 und des Verfahrens zur Erzeugung der zweiten Schärfentiefe ST2 realisiert werden, indem zwischen das Objektiv 4 und das Probenvolumen 8 ein optisches Element 11 in Form eines refraktiven Elements, beispielsweise eines Körpers aus einem für die Detektionsstrahlung transparenten Material, angeordnet wird (Fig. 5). Das refraktive Element kann dabei beispielsweise eine Brechzahl in einem Bereich von n = 1,0 bis 2,0 und eine Dicke in Richtung der Detektionsachse zwischen 5 und 100 mm aufweisen (aus
WO 2017/075275 Al). In einer möglichen Ausführung der Erfindung wird ein dünnes Glasplättchen als refraktives Element verwendet, dessen Brechzahl beispielsweise n = 1,5 und dessen Dicke beispielsweise d = 0,15 bis 1 mm beträgt. In der Fig. 3 ist der zweite Betriebszustand gezeigt, in dem das optische Element 11 in den Detektionsstrahlengang 2 eingeschwenkt ist. Durch die optische Wirkung des derart ausgeführten und angeordneten optischen Elements 11 wird eine Verlängerung der Punktbildverwaschungsfunktion in Richtung der Detektionsachse 3 erzielt. Die Dicke des Lichtblatts 16 wird wiederum an den ersten beziehungsweise zweiten Betriebszustand und die jeweiligen Schärfentiefen ST1 beziehungsweise ST2 angepasst.
Anstatt zwei Lichtblätter 16.1, 16.2 oder ein dickes Lichtblatt 16 zu verwenden, um den
Tiefenschärfebereich auszuleuchten, kann auch ein dünnes Lichtblatt 16 verwendet werden, welches während der Erfassungsdauer des Detektors 7, beispielsweise der Belichtungszeit einer Kamera, entlang der optischen Achse 3 des Detektionsstrahlengangs 2 gescannt wird. Zur gesteuerten Erzeugung der Scanbewegung der Beleuchtungsstrahlung ist im Beleuchtungsstrahlengang 3 ein Scanner 18 angeordnet. Der Scanner 18 ist mittels der Steuereinheit 9 ansteuerbar. Da der
Detektor 7 über die Erfassungsdauer, im Falle einer Kamera über die Belichtungszeit, integriert, ist mit dieser Ausführungsform eine Wirkung erreicht, die der Verwendung eines dicken Lichtblatts entspricht. In der Fig. 6 ist eine solche Scanbewegung entlang der optischen Achse 3 durch einen Doppelpfeil im Beleuchtungsobjektiv 14 symbolisiert.
Die zweite Schärfentiefe ST2 kann in weiteren Ausgestaltungen des Verfahrens auch bewirkt werden, indem simultan mindestens zwei Lichtblätter 16, beispielsweise ein erstes Lichtblatt 16.1 und ein zweites Lichtblatt 16.2, in das Probenvolumen 8 gerichtet werden. In der in Fig. 7 vereinfacht dargestellten Ausgestaltung ist je eines der Lichtblätter 16 auf einer Seite der Probenebene 17 und parallel zu dieser ausgerichtet. Die Lichtblätter 16 grenzen in der Probenebene 17 aneinander an (zur besseren Übersicht mit betont dicken Lichtblättern 16.1, 16.2 dargestellt).
In einer weiteren möglichen Ausgestaltung sind mindestens zwei Lichtblätter 16 entlang der Detektionsachse 3 und senkrecht zu dieser gegeneinander versetzt angeordnet (nicht dargestellt).
Das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens ist anhand der Fig. 8 bis 10 nochmals erläutert. In einer ersten Ausgestaltung des Verfahrens gemäß der Fig. 8 ist die Detektionsachse 3 senkrecht auf das Probenvolumen 8 gerichtet.
Die Probe liegt auf einer Auflagefläche 23.1 eines Probenträgers 23 auf. Das Probenvolumen 8 ist durch die Auflagefläche 23.1 in einer Richtung hinsichtlich seiner möglichen Ausdehnung begrenzt. Zur weiteren Erläuterung wird ein kartesisches Koordinatensystem verwendet, dessen x-Achse und y- Achse orthogonal zueinander und jeweils parallel zur Auflagefläche 23.1 verlaufen, während die Detektionsachse 3 in Richtung der z-Achse verläuft. Das Probenvolumen 8 hat eine Höhe H. Das Lichtblatt 16 ist an einer ersten Position PI gezeigt, die es beispielsweise während des ersten Betriebszustands einnimmt. Das Lichtblatt 16 wird parallel zur Auflagefläche 23.1 in einer x-y-Ebene erzeugt, so dass in den Fig. 8 bis 10 lediglich seitliche Querschnitte des Lichtblatts 16 zu sehen sind. Der Detektionsstrahlengang 2 weist eine erste Numerische Apertur NA1 = 1,0 auf. Die zugehörige Punktbildverwaschungsfunktion PSFi.o ist in Fig. 8 hinsichtlich ihrer lateralen (x-y-Ebene) und axialen (Richtung der z-Achse) Ausdehnung schematisch als Oval neben dem Probenvolumen 8 dargestellt und gibt die erste Schärfentiefe ST1 an. Um mit der ersten Numerischen Apertur NA1 das
Probenvolumen 8 in Richtung der Detektionsachse 3 vollständig abzutasten, wäre eine erste Schrittweite SW1 erforderlich, mit der das Lichtblatt 16 in axialer Richtung relativ zum
Probenvolumen 8 beispielsweise in eine zweite Position P2i,o zu verschieben wäre.
Wird dagegen der zweite Betriebszustand hergestellt und der Detektionsstrahlengang 2 mit einer zweiten Numerischen Apertur NA2 = 0,3 betrieben, ergibt sich eine
Punktbildverwaschungsfunktion PSFo,3, die in axialer Richtung erheblich länger als die
Punktbildverwaschungsfunktion PSFi.o ist und die zweite Schärfentiefe ST2 angibt.
Um das Probenvolumen 8 in Richtung der Detektionsachse 3 vollständig abzutasten, wäre eine zweite Schrittweite SW2 möglich, die größer als die erste Schrittweite SW1 ist. Die Reduzierung der erforderlichen Anzahl von Bilderfassungen und Auswertungen ermöglicht eine schnelle Bereitstellung eines Übersichtsbilds des Probenvolumens 8.
Die erste Schrittweite SW1 und die zweite Schrittweite SW2 stellen jeweils Höchstwerte von Schrittweiten dar, die eine lückenlose Abtastung des Probenvolumens 8 mittels des Lichtblatts 16 erlauben. Es könne auch geringere Schrittweiten gewählt werden, wobei dann für eine vollständige Abtastung mehr Bilder erfasst werden müssen.
In der Fig. 9 ist wieder eine Probe mit einem Probenvolumen 8 auf einer Auflagefläche 23.1 eines Probenträgers 23 dargestellt. Die Detektionsachse 3, entlang der die Detektionsstrahlung gesammelt und geführt wird, ist schräg auf das Probenvolumen 8 gerichtet. Die Detektionsachse 3 und die Auflagefläche 23.1 schließen einen Winkel a ein, der im Ausführungsbeispiel a = 60° beträgt. Wie bereits zu Fig. 8 beschrieben ist die erste Schärfentiefe ST1 bei einer angenommenen ersten
Numerischen Apertur NA1 = 1,0 kleiner als die zweite Schärfentiefe ST2 bei einer angenommenen zweiten Numerischen Apertur NA2 = 0,3 in einem zweiten Betriebszustand. Um das
Probenvolumen 8 vollständig abzutasten, ist das Lichtblatt 16 wieder mit den Schrittweiten SW1 beziehungsweise SW2 zu verschieben. Um einem Nutzer des Mikroskops 1 und Anwender des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Übersichtsbild in einer x-y-Ebene parallel zur Auflagefläche 23.1 darstellen zu können, werden die erfassten Bilddaten in diese x-y-Ebene umgerechnet und können dann auf einer Anzeige oder einem Bildschirm 24 angezeigt werden. Alternativ ist eine dreidimensionale Darstellung möglich.
In der Fig. 10 ist exemplarisch das Lichtblatt 16 an der ersten Position PI gezeigt. Der
Detektionsstrahlengang 2 befindet sich im zweiten Betriebszustand und weist eine zweite
Schärfentiefe ST2, eine Numerische Apertur NA = 0,3 und eine entsprechende
Punktbildverwaschungsfunktion PSFo,3 auf. Nach einer Erfassung der Detektionsstrahlung an der ersten Position PI wird das Lichtblatt 16 parallel zur Auflagefläche 23.1 um die zweite
Schrittweite SW2 auf die zweite Position P2o,3 verschoben und erneut Detektionsstrahlung erfasst. Die Punktbildverwaschungsfunktionen PSFo,3 an beiden Positionen PI und P2o,3 grenzen unmittelbar aneinander an, sodass trotz der großen zweiten Schrittweite SW2 eine lückenlose Abtastung des Probenvolumens 8 ermöglicht ist. Zur Veranschaulichung sind mit unterbrochenen Volllinien die Abschnitte des Probenvolumens 8 begrenzt, die an den Positionen PI beziehungsweise P2o,3 erfasst werden.
Die Verschiebung des Lichtblatts 16 zwischen den einzelnen Positionen PI und P2o,3 entlang der Detektionsachse 3 und parallel zur Auflagefläche 23,1 führt zu nebeneinander angeordneten „Scheiben" von Bilddaten, die mit geringem Rechenaufwand in die x-y-Ebene projiziert oder dreidimensional dargestellt werden können.
Bezugszeichen
1 Mikroskop
2 Detektionsstrahlengang
3 Detektionsachse
4 Objektiv
5 optische Linse
6 Bildebene
7 Detektor
8 Probenvolumen
9 Steuereinheit
10 Antrieb
11 optisches Element
12 Pupillenebene / Fourierebene
13 Beleuchtungsstrahlengang
14 Beleuchtungsobjektiv
15 Beleuchtungsachse
16 Lichtblatt 16.1 erstes Lichtblatt
16.2 zweites Lichtblatt
17 Probenebene
18 Scanner
19 Zwischenbildebene
20 multifokales Gitter
21 chromatisches Korrekturgitter
22 Prisma
23 Probenträger
23.1 Auflagefläche
24 Bildschirm
52 optische Linse
BS Strahlteiler
H Probenhöhe
M Spiegel
PI erste Position des Lichtblatts
P2 zweite Position des Lichtblatts
PSF Punktbildverwaschungsfunktion
SLM räumlicher Lichtmodulator
ST1 erste Schärfentiefe
ST2 zweite Schärfentiefe
SW Schrittweite
a Winkel (zwischen Detektionsachse 3 und Auflagefläche 23.1)

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Erzeugen eines Übersichtsbilds unter Verwendung eines hochaperturigen
Objektivs (4) mit den Schritten:
Bereitstellen eines optischen Detektionsstrahlengangs (2) mit dem Objektiv (4), wobei der Detektionsstrahlengang (2) in einem ersten Betriebszustand eine erste Numerische
Apertur (NA1) aufweist und eine erste Schärfentiefe (ST1) besitzt, die im Wesentlichen in einer Fokalebene des Detektionsstrahlengangs (2) liegt und in dem ersten Betriebszustand ein Bild einer Detektionsstrahlung mit der ersten Schärfentiefe (ST1) und mit einem lateralen Bildfeld erfasst wird oder erfasst werden kann, wobei die Detektionsstrahlung bewirkt wird, indem mindestens ein Lichtblatt (16) entlang einer Beleuchtungsachse (15) in ein im
Probenraum befindliches abzubildendes Probenvolumen (8) gerichtet wird;
Überführen des Detektionsstrahlengangs (2) in einen zweiten Betriebszustand, indem die erste Schärfentiefe (ST1) auf eine zweite Schärfentiefe (ST2) erhöht wird, wobei das hochaperturige Objektiv (4) im Detektionsstrahlengang (2) verbleibt,
im zweiten Betriebszustand Erfassen einer Detektionsstrahlung, wobei die aus einem Probenraum kommende Detektionsstrahlung mittels des Objektivs (2) gesammelt, entlang des Detektionsstrahlengangs (2) geführt und mittels mindestens eines für die
Detektionsstrahlung empfindlichen Detektors (7) als ein Bild mit einem lateralen Bildfeld erfasst wird, wobei die lateralen Bildfelder in dem ersten und zweiten Betriebszustand gleich sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Schärfentiefe (ST2) bewirkt wird, indem die erste Numerische Apertur (NA1) des Detektionsstrahlengangs (2) auf eine zweite Numerische Apertur (NA2) verringert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Pupillenebene (12) des Detektionsstrahlengangs (2) ein optisches Element (11) in Form einer Loch-, Schlitz- oder
Rechteckblende eingebracht wird, durch deren Wirkung die zweite Numerische Apertur (NA2) des Detektionsstrahlengangs (2) bewirkt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Schärfentiefe (ST2) nach dem Prinzip der vergrößerten Fokuslänge bewirkt wird, indem in den Detektionsstrahlengang (2) als optisches Element (11) eine Phasenmaske, ein Axicon, eine Ringblende in einer Pupillenebene oder ein zusätzliches refraktives optisches Element zur axialen Verlängerung der
Punktbildverwaschungsfunktion eingebracht werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Schärfentiefe (ST2) bewirkt wird, indem simultan Detektionsstrahlung mehrerer zueinander parallel liegender
Probenebenen (17) erfasst wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein abzubildendes Probenvolumen (8) mit einem ersten Lichtblatt (16.1) und mindestens einem parallel zum ersten Lichtblatt (16.1) angeordneten weiteren Lichtblatt (16.2) entlang je einer Beleuchtungsachse (15) beleuchtet wird, wobei die Lichtblätter (16.1, 16.2) entlang einer zur Beleuchtungsachse (15) senkrechten Detektionsachse (3) hintereinander liegen und einander höchstens anteilig überlappen; oder
in eine Pupillenebene (12) ein multifokales Gitter (20) eingebracht wird, eine mehrere Wellenlängen umfassende Detektionsstrahlung in Anteile entsprechend ihrer
Beugungsordnungen aufgespalten wird und die Anteile der Beugungsordnungen gleichzeitig auf unterschiedliche Bereiche einer Bildebene (6) gerichtet werden; oder
ein abzubildendes Probenvolumen (8) mit einem ersten Lichtblatt (16.1) und mindestens einem parallel zum ersten Lichtblatt (16.1) angeordneten weiteren Lichtblatt (16.2) in einer Beleuchtungsrichtung und entlang je einer Beleuchtungsachse (15) beleuchtet und entlang einer Detektionsachse (3) durch die jeweiligen Lichtblätter (16.1, 16.2) bewirkte
Detektionsstrahlung erfasst wird, wobei die Beleuchtungsachsen (15) und die
Detektionsachse (3) je einen von Null verschiedenen Winkel einschließen, und jedes weitere Lichtblatt (16.2) in Detektionsrichtung, also entlang der Detektionsachse (3), wie auch in Beleuchtungsrichtung zum ersten Lichtblatt (16.1) verschoben ist und die
Detektionsstrahlung gleichzeitig erfasst wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Erfassung eines Bildes des Probenvolumens (8) im zweiten Betriebszustand mit einer ersten Lage des Lichtblatts (16) das Lichtblatt (16) relativ zum Probenvolumen (8) versetzt und ein weiteres Bild erfasst wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Probenvolumen (8) in einer Richtung durch eine Auflagefläche (23.1) eines Probenträgers '(23) begrenzt ist und nach der Erfassung eines Bildes des Probenvolumens (8) mit einer ersten Lage des Lichtblatts (16) das Lichtblatt (16) relativ zum Probenvolumen (8) und parallel zur Auflagefläche (23.1) versetzt und ein weiteres Bild erfasst wird.
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