WO2018234582A2 - Mikroskopsystem mit lichtblattmikroskopischer funktionseinheit - Google Patents

Mikroskopsystem mit lichtblattmikroskopischer funktionseinheit Download PDF

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WO2018234582A2
WO2018234582A2 PCT/EP2018/066943 EP2018066943W WO2018234582A2 WO 2018234582 A2 WO2018234582 A2 WO 2018234582A2 EP 2018066943 W EP2018066943 W EP 2018066943W WO 2018234582 A2 WO2018234582 A2 WO 2018234582A2
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functional unit
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Werner Knebel
Florian Fahrbach
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Leica Microsystems Cms Gmbh
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    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison

Definitions

  • the invention relates to a microscope system which comprises a light-sheet microscopic functional unit whose illumination objective is formed by a first objective and whose detection objective is formed by a separate second objective, and at least one further light-microscopic functional unit.
  • light-sheet microscopes are used, in which only a thin layer is illuminated in the sample.
  • light-sheet microscopes thus enable higher resolution and lower light exposure, thereby avoiding unwanted effects due to bleaching or light-induced stress in biological samples.
  • Light sheet microscopes are therefore particularly useful for fluorescence studies on living organisms.
  • Light-sheet microscopes are known in the prior art in which the illumination objective and the detection objective face away from the above-mentioned right-angled arrangement along the vertical axis of the microscope stand.
  • An example of this is the document DE 10 2011 054 914 AI disclosed.
  • the illuminating light bundle passing through the illumination objective along the vertical tripod axis is directed onto a mirror system which deflects the illuminating light bundle at a right angle in order to place the sample in the horizontally lying focal plane of the light source To illuminate the detection lens with a light sheet.
  • the target area of the sample lying in the focal plane is then imaged onto a camera sensor by the detection objective.
  • the invention solves this problem by a microscope system, comprising a light sheet microscopic functional unit whose illumination objective by a first lens and the detection lens is formed by a separate second lens, and at least one further light microscopic functional unit, said further light microscopic functional unit having a detection objective, which is formed by the second lens.
  • the invention provides a microscope system through which a light sheet microscopic functional unit and another light microscopic, e.g. Confocal microscopic functional unit are combined with each other such that both functional units receive the originating from the sample to be imaged detection light with one and the same detection lens.
  • a single detection objective makes it possible to image the sample using different microscopy methods, without a sample transfer being necessary when changing from one method to the other. This considerably facilitates the handling of the microscope system. It is thus made possible by a microscope system according to the invention to carry out correlative microscopy for light-sheet microscopy and a further light-microscopic method in a particularly simple and error-minimizing manner.
  • the microscope system according to the invention can be used in particular in such a way that the sample is first gently and quickly examined by light sheet microscopy and then imaged to obtain additional image data by the further light microscopic functional unit.
  • a further recording of the sample for example, allows a higher resolution of interesting sample regions.
  • the microscope system has an evaluation unit for correlated image analysis on the basis of detection light, which receive the light sheet microscopic functional unit and the further light microscopic functional unit in each case via the shared detection lens formed by the second lens.
  • This advantageous correlated Image evaluation is made possible by the fact that the two microscopic functional units each receive the detection light from one and the same sample plane, which is defined by the focal plane of the detection objective that is jointly assigned to the two functional units.
  • Correlated image evaluation in the context of the present invention is an evaluation of the image data using both image data obtained by means of the light-sheet microscopic functional unit and image data obtained by means of the further light-microscopic functional unit.
  • a correlated image analysis may include a billing of two or more images or partial images of the two functional units with one another to form at least one resulting image, for example by addition (superimposition) or subtraction or other mathematical operations.
  • the further light-microscopic functional unit preferably has an illumination objective, which is formed by the second objective.
  • the detection objective shared by both microscopic functional units simultaneously represents the illumination objective of the further light-microscopic functional unit.
  • the other (first) objective is then assigned solely to the light-sheet microscopic functional unit, namely as the illumination objective.
  • the microscope system has a microscope stand, which is composed of a first stand part, on which the first lens is held, and a second stand part, on which the second lens is held opposite the first lens.
  • the aforementioned microscope stand is to be understood as meaning a microscope body which has a number of connections (ports) which provide mechanical interfaces, in particular for the purpose of supplying light and removing light. Via these interfaces, for example, cameras, eyepieces, scanners and manipulators can be attached to the Attach microscope stand.
  • the above-mentioned stand parts are to be understood as a microscope sub-body of which the microscope stand or the microscope body is composed.
  • the two stand parts are functionally separated from each other by a microscope stage having a sample chamber for receiving the sample to be imaged.
  • the aforementioned functional separation of the stand parts means that the illumination and detection components associated with the lower stand part operate from below the microscope stage be while the upper tripod part associated lighting and detection components from above the microscope stage are effective.
  • the microscope system according to the invention can be embodied both as an upright microscope and as an inverted microscope.
  • an upright microscope is understood to mean an arrangement in which the common detection objective is arranged above the microscope stage.
  • the common detection lens is in an inverted microscope design below the sample table.
  • the microscope system preferably has a light deflection device which deflects an illumination focus generated by the light-sheet-microscopic functional unit through the first objective into a focal plane of the second objective.
  • a light deflection device makes it possible, even in an arrangement in which the two objectives of the microscope system face each other, that the light sheet can be generated coplanar with the focal plane of the detection objective.
  • the light deflection device preferably has at least one mirror element which deflects the illumination focus perpendicular to the optical axis of the second objective. This mirror element is preferably attached to the first lens or to the second lens, but it is also conceivable attachment to other elements of the microscope system, such as the cover glass or one of the two parts of the stand. In a preferred embodiment, two mirror elements are provided on both sides of the optical axis.
  • the light-sheet microscopic functional unit has an area sensor arranged in the second stand part for detecting the detection light received by the second objective.
  • the surface sensor is designed for example as a CCD or CMOS camera.
  • the further light-microscopic functional unit comprises an illumination module assigned to the second stand part for spot-scanning sample illumination and / or for far-field sample illumination. It should be expressed by the term "assigned" to express that the aforementioned illumination module can be arranged both within the second stand part and coupled via a suitable interface to the second stand part.
  • the lighting module includes a scanner for spot scanning sample illumination.
  • a scanner for spot scanning sample illumination.
  • Such a scanner can be embodied, for example, in the form of a mirror scanner known per se, as used in a conventional confocal microscope.
  • the illumination module in a special embodiment has a point sensor which forms a so-called descanned detector for the detection light received by the second objective.
  • descanned detector receives the point sensor of the detection light after its return to the scanner as a stationary light beam.
  • a light source which provides light for the illumination module, can be integrated into the illumination module or else coupled, for example via an optical fiber.
  • the light source itself may comprise a plurality of individual light sources, for example a plurality of lasers and / or laser diodes (in particular of different wavelengths).
  • the area sensor of the light-sheet microscopic functional unit can at the same time form a non-descanned detector associated with the further light-microscopic functional unit for the detection light received by the second objective.
  • the detection light received by the further light-microscopic functional unit is not (or not exclusively) returned to the point-by-point scanning scanner, but passed directly to the area sensor, which allows a direct comparison of the image data captured by the two microscopic functional units.
  • the first stand part also comprises a detector, preferably a non-descanned detector, which allows additional or alternative detection via the first stand part.
  • the light sheet microscopic functional unit comprises a light sheet generator which is associated with the first stand part.
  • a light sheet generator includes, for example, a light source and a downstream of the light source scanner through which the illumination focus is moved so that a quasi-static light sheet is constructed.
  • the scanner it is also possible to provide a light-emitting device, for example a cylindrical lens.
  • the light source for example, one or more lasers
  • the light source need not be part of the light sheet generator, but can only be connected to this, for example via an optical fiber.
  • the light sources of the light sheet generator (the light sheet microscope functional unit) and the lighting module (the other light microscopic functional unit) are housed in the same housing or even at least partially identical, so for example, a laser for both light sources is used.
  • the microscope system has an adjusting device for adjusting the second stand part or at least parts (subunits) of the second stand part relative to the first stand part or relative to at least parts (subunits) of the first stand part.
  • an adjustment device only one or more subunits, such as a lens holder (lens mount), the second stand part relative to the first stand part (or at least subunits thereof) adjusted, but also that the adjustment device, the second stand part relative to the first stand part (or at least a subunit thereof) adjusted as a whole.
  • an adjustment is meant, in particular, a movement that may involve a displacement and / or a pivoting and / or a rotation.
  • a drive unit or mechanism could, for example, move the first stand part relative to the reference system of the room in which the microscope is located, but alternatively or additionally also the second stand part, for adjusting the second stand part relative to the first stand part ("relative adjustment")
  • an adjustment device may in particular comprise a slide unit which is formed, the second stand part and / or at least one subunit of the second stand part (such as a lens holder) in a plane of displacement perpendicular to the optical axis of the second Lens is to move at least in one direction relative to the first stand part (or at least subunits thereof) .
  • This lateral displacement There are a number of advantages, such as an enlargement of the detectable sample space.
  • the illumination objective in the central area and not at the edge of the illumination field during image acquisition (ie to position the mirror element in the central area of the illumination objective), which leads to an increase in the optical performance (imaging performance), in particular to a reduction of the lateral chromatic aberrations , It is also possible to use an illumination objective with a higher magnification and thus (with the same diameter of the entrance pupil) of a higher numerical aperture.
  • the possibility of using the illumination objective in the central region of the illumination image field also simplifies the sliding of the illumination focus along the optical axis provided in special light sheet applications.
  • a sliding unit can also be designed so that, alternatively or in addition to the functionality described above, a displacement of the second stand part and / or at least one subunit of the second stand part is made possible parallel to the optical axis of the first and / or second objective.
  • a displacement of the objective connection of the second stand part parallel to the optical axis of the second objective is conceivable.
  • the adjusting device may also include an optionally further sliding unit, which allows a displacement of the first stand part and / or at least one subunit of the first stand part parallel to the optical axis of the first and / or second lens.
  • the adjusting device comprises a pivoting unit, which is formed, the second stand part and / or at least one subunit of the second stand part about a pivot axis which is perpendicular to the optical axis of the first lens and / or perpendicular to the optical axis of the second lens to pivot relative to the first stand part (or at least subunits thereof).
  • the adjusting device comprises a rotation unit, which is formed, the second stand part and / or at least one subunit of the second stand part about an axis of rotation which is parallel to the optical axis of the first lens and / or parallel to the optical axis of the second lens to rotate relative to the first stand part (or at least subunits thereof).
  • the sliding unit is designed to displace a subunit of the second stand part in the plane of displacement parallel to a focal plane of the second objective relative to the first stand part.
  • the pivot unit is designed to pivot the second stand part in its entirety about the pivot axis relative to the first stand part. This possibility of a coupled sliding / pivoting movement offers a multitude of setting options, which can be freely selected depending on the application.
  • the further light microscopic functional unit is assigned in its entirety to the second stand part. This allows a particularly compact design of the microscope system.
  • the further light microscopic functional unit forms a pointwise imaging microscope, in particular a scanning microscope.
  • the aforementioned scanning microscope is, for example, a confocal microscope.
  • image data can be obtained from one and the same sample area and correlated with one another using different microscopy methods. For example, an overview image of a sample area is first recorded using the light-sheet microscope. If, within this overview image, a position is to be imaged, for example, with a higher resolution, then the light-sheet microscope switches over to the confocal microscope.
  • the scanning microscope can be a multiphoton microscope.
  • the microscope system has a lighting module that includes a multiphoton laser and a scanner.
  • the detection of the photons excited in the illuminated sample area can be done in descanned mode by returning the detection light to the scanner and then passing it to a point sensor.
  • a detection via a non-descanned mode is also conceivable, in this case the detection light is coupled out, for example, in front of the scanner and fed to a detector.
  • the scanning microscope can also be a STED (STED: stimulated emission depletion) microscope or a RESOLFT microscope (RESOLFT: revesible saturable optical fluorescence depletion).
  • the scanning microscope may also be designed as a CARS / SRS microscope (CARS: coherent anti-Stokes Raman scattering; SRS: stimulated Raman scattering).
  • CARS coherent anti-Stokes Raman scattering
  • SRS stimulated Raman scattering
  • the scanning microscope can also be a microscope for performing fluorescence lifetime imaging (FLIM: fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM microscope) or for performing Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) or a spectral microscope.
  • FLIM fluorescence lifetime imaging microscopy
  • FCS Fluorescence correlation spectroscopy
  • a spectral microscope is understood as meaning a microscope which offers the possibility of simultaneously or sequentially detecting a plurality of spectral regions from the emission spectrum of the fluorescence markers used. Basically, a spectral microscope is suitable for measuring the spectrum of the detected light.
  • the detection light can alternatively be conducted directly onto a surface sensor in non-descanned mode become, which forms at the same time the detector of the Lichtblattmikroskops.
  • the detection light on the area sensor performs a scanning movement corresponding to the scanning movement of the illumination light on the sample caused by the scanner.
  • the further light microscopic functional unit provided in addition to the light-sheet microscopic functional unit can also form a wide-field microscope, in particular a localization microscope.
  • a method for microscopically imaging a sample using a microscope system comprising a light-sheet microscopic functional unit whose illumination objective is formed by a first objective and its detection objective by a separate second objective and at least one further light-microscopic functional unit in which the second objective is used both for imaging the sample by means of the light-microscopic functional unit and for imaging the sample using the further light-microscopic functional unit as a common detection objective.
  • Fig. 1 shows the schematic structure of a microscope system as
  • FIG. 2 shows an illustration of the two lenses provided in the microscope system according to FIG. 1;
  • FIG. 3 shows a modification of the microscope system;
  • FIG. 6 shows a representation of the two objectives provided in the microscope system according to FIG. 5;
  • Fig. 10 is a block diagram of the microscope system.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of a microscope system 10, which represents an embodiment of the present invention.
  • the microscope system 10 has a microscope stand, generally designated 12, formed of a lower stand portion 14 and an upper stand portion 16 mounted thereon.
  • a first lens 20 is attached via an objective connection 18.
  • a second objective 24 is attached to the upper stand part 16 via an objective connection 22.
  • the two objectives 20 and 24, which are again shown in isolation in Figure 2, are opposite to each other along an optical axis O, which runs parallel to the z-axis with reference to the xyz coordinate system of Figure 1.
  • the objectives 20 and 24 are thus arranged on both sides of a microscope stage 26, which has a sample chamber, not explicitly shown in FIGS. 1 and 2, which is designed, for example, in the form of a petri dish provided with a glass bottom.
  • a light sheet generator 30 is coupled via a connection 28.
  • the light sheet generator 30 is used to generate a light sheet-like illumination light distribution, which is coupled for example via a mirror or a dichroic beam splitter 32 in the first lens 20.
  • the light sheet generator 30 has per se known, not shown in Figure 1, light-generating components such as a light source and a scanner, which puts the light emitted from the light source illuminating light in a scanning movement.
  • an illumination focus produced by the first objective 20, which is denoted by 34 in FIG. 2 generates the light sheet serving for the sample illumination.
  • two mirror elements 36, 38 arranged on both sides of the optical axis O are mounted on the second objective 24 facing the first objective 20, which illuminance 34 emanating parallel to the optical axis O from the first objective 20 is perpendicular to the optical axis O deflect in a focal plane of the second lens 24.
  • the light sheet generated by the deflected illumination focus 34 is thus arranged coplanar with the focal plane of the second objective 24.
  • the arranged on the lower stand portion 14 first lens 20 is used in the embodiment of Figure 1 as an illumination objective that illuminates the sample to be imaged in the focal plane of the second lens 24 with the light sheet.
  • the first objective 20 will therefore also be referred to below as the light-sheet illumination objective.
  • FIG. 1 shows a connection 40 which serves to couple another light source which emits illuminating light in the direction of the dichroic beam splitter 32. Further, eyepieces 42 are attached to the lower stand part 14.
  • the objective 24 opposite the light-sheet illumination objective 20 serves, on the one hand, to detect the detection light which originates from the specimen illuminated with the light sheet.
  • the second objective 24 directs the detection light via a tube optical system 44 onto an area sensor 46, which is designed, for example, as a CCD or CMOS camera.
  • the objective 24 is functionally assigned to a confocal illumination module 48, which is coupled to the upper stand part 16 via a connection 50.
  • the objective 24 serves both as an illumination objective in which illumination light, which is generated by a light source (not shown) contained in the confocal illumination module 48 and passed through a confocal scanner 52 also contained in the confocal illumination module 48, is applied to the sample to be imaged conducts, as well as a detection lens, in which it passes detection light generated by the confocal sample illumination back into the upper stand part 16 in the confocal illumination module 48, wherein the detection light is detected by a point sensor 54. Since the detection light in the confocal Scanner 52 is returned, the point sensor 54 operates in a conventional manner as a so-called descanned sensor. Because of the above-described double function of the second objective 24, this is also referred to below as a common illumination / detection objective.
  • the upper stand portion 16 is also provided with a series of terminals defining interfaces for coupling external components to the stand portion 16.
  • the stand part 16 has a connection 56 for coupling the surface sensor 46 and a connection 58 for coupling an LED lamp 62.
  • the two terminals 50 and 58 define two parallel interface planes Ei, E 2 , which have a well-defined (in particular conjugate) position relative to the image-side focal plane and / or the object-side focal plane of the common illumination / detection objective 24.
  • the terminals 50 and 58 themselves have a well-defined (in particular known) position, for example with respect to the common illumination / detection objective 24 and / or relative to the image-side and / or the object-side focal plane.
  • the interface plane E 2 defines a so-called incident light axis, along which light emitted by the LED lamp 62 is directed onto the common illumination / detection objective 24.
  • eyepieces 60 are also arranged.
  • the upper stand part 16 contains in addition to the previously mentioned, the surface sensor 46 upstream tube optics 44 arranged in the first interface plane Ei beam splitter mirror 64 (this may, depending on the application, for example, a (optionally flexibly be introduced into the beam path) beam splitter or mirror act , which can also be supplemented by other filters) and a filter cube 66 and a dichroic beam splitter 68, in the second interface plane E 2 and thus on the Auflichtachse are arranged.
  • the aforementioned optical components 64, 66 and 68 are positioned in a conventional manner depending on the application on the optical axis 0 of the common illumination / detection objective 24 to influence the illumination light and the detection light within the upper support member 16 in the desired manner.
  • a splitting according to the type of illumination confocal illumination or illumination by a light sheet
  • a parallel detection of the detection light of both types of illumination can be achieved by a correspondingly selected beam splitter as beam splitter 64 (when using suitable dyes).
  • a splitting according to polarization directions when using a corresponding beam splitter (or in combination with polarizing filters) is conceivable.
  • the microscope system 10 represents a modular arrangement of different functional units which can be used individually or together for imaging.
  • the microscope system 10 includes a light sheet microscopic functional unit whose essential functional components are given with respect to the illumination by the light sheet generator 30 and the light sheet illumination objective 20 and with respect to the detection by the common illumination / detection objective 24 and the surface sensor 46.
  • the microscope system 10 comprises a further, confocal microscopic functional unit whose essential components are given both with regard to the illumination and with regard to the detection by the confocal illumination module 48 and the common illumination / detection objective 24.
  • the confocal microscopic functional unit detects the detection light originating from the sample after its return to the confocal scanner 52 by means of the dot sensor 54 in the so-called descanned mode.
  • the detection light in the so-called non-Descanned mode directly on the To conduct surface sensor 46.
  • the detection light on the area sensor 46 performs a scanning movement corresponding to the scanning movement of the illumination light on the sample caused by the confocal scanner 52.
  • the microscope system 10 according to FIG. 1 furthermore has a slide unit 70, which makes it possible to move the upper stand part 16 in the xy plane, ie perpendicular to the optical axis 0, relative to the lower stand part 14.
  • This possibility of a lateral displacement makes it possible, in particular, to use the light-sheet illumination objective 20 in the central region of the image field and not at its edge, which, inter alia, enables a higher optical imaging performance (in particular lower lateral chromatic aberration).
  • FIGs 3 to 9 show a number of modifications of the microscope system 10 according to the invention of Figure 1, wherein for simplicity of description those components of these modifications, which correspond in any case in their basic function to the components shown in Figure 1, provided with the reference numerals used in Figure 1 are.
  • the modified embodiment according to FIG. 3 differs from the exemplary embodiment according to FIG. 1 essentially in that the first interface plane Ei is omitted and the confocal illumination module 48 is coupled in the second interface plane E 2 , ie in the incident light axis.
  • the modified embodiment of Figure 4 differs from the embodiment of Figure 3 by omitting the eyepieces 60th
  • FIG. 5 shows an embodiment which differs from the exemplary embodiment according to FIG. 1 in that the light-sheet generation takes place via the upper stand part 16, while the light-sheet detection as well as the confocal illumination and detection are realized in the lower stand part 14.
  • the Light sheet generator 30 coupled in the embodiment of Figure 5 in the first interface plane Ei to the upper stand part 16.
  • the confocal illumination module 48 is attached to the lower stand part 14.
  • the embodiment shown in FIG. 5 has a further area detector 72, for example in the form of a CCD or CMOS camera, in the lower stand part 14. The further area detector 72 detects the detection light originating from the sample illuminated with the light sheet.
  • the arrangement of the light sheet illuminating objective 20 and the common illuminating / detecting objective 24 are reversed, i. the light sheet / illumination lens 20 is located on the upper stand portion 16 while the common illumination / detection lens 24 is disposed on the lower stand portion 14. Accordingly, as shown in FIG. 6, the two mirror elements 36, 38 mounted on the light sheet illuminating objective 20 are located below the microscope stage 26.
  • the embodiment shown in FIG. 7 corresponds, as far as is relevant to the present invention, essentially to the exemplary embodiment according to FIG. 3, except that the light sheet generator 30 is coupled via an optical fiber 102 to a multicolor light source 74.
  • the multicolor light source 74 includes a plurality of monochrome light sources 76, 78, 80, 82, which supply illumination light of different colors to the light sheet generator 30 via a plurality of dichroic mirrors 84, 86, 88, 90.
  • the multicolor light source 74 may be comprised of or include a white-light laser that provides or provides a continuous broad spectrum of wavelengths.
  • a combination of white light laser and monochrome light sources is conceivable.
  • the multicolor light source 74 is also connected to the confocal illumination module 48 via another optical fiber 102 and also serves as the light source for the upper support part 16.
  • the lower stand part 14 further reduced to the lens port 18 and the light sheet generator 30 and in particular omitted eyepieces 42 for the lower stand part 14.
  • the objective connection 18 (the objective connection 18 is a subunit of the lower stand part 14) can be displaced by means of the sliding unit 70 both parallel to the optical axis of the light sheet / illumination objective 20 and in a plane perpendicular to the optical axis of the light sheet / illumination objective 20.
  • the objective connection 22 (the objective connection 22 forms a subunit of the upper stand part 16) can also be moved parallel to the optical axis of the illumination / detection objective 24 by a further slide unit 98.
  • the adjusting device thus eliminates two sliding units 70, 98.
  • the multicolor light source 74 may in this case be connected via an optical switch 104 to the optical fibers 102 which serve to couple to the light sheet generator 30 and the confocal illumination module 48.
  • the optical switch 104 may in this case be an optical component with the function of a switch which either supplies the light completely to the light sheet generator 30 or the confocal lighting module 48, so that the two functional units (the light sheet microscopy and the light microscopy) sequentially illuminate the sample.
  • the optical switch 104 may also be an optical component with the function of a divider, which supplies a first portion of the light of the light sheet microscope functional unit and a second portion of the light of the confocal microscopic functional unit, so that they simultaneously illuminate the sample.
  • the optical switch 104 may in this case comprise, for example, a switchable mirror, an acousto-optical component, such as, for example, an acousto-optical modulator (AOM) or an acousto-optical deflector (AOD), or an electro-optical modulator (EOM).
  • AOM acousto-optical modulator
  • AOD acousto-optical deflector
  • EOM electro-optical modulator
  • Figure 8 substantially corresponds to the arrangement shown in Figure 7, except that the confocal illumination module 48 is not as in Figure 7 in the interface plane Ei, but in the interface plane E 2 , that is arranged in the incident light axis.
  • FIG. 9 shows an embodiment of the microscope system 10 which is based on the exemplary embodiment according to FIG.
  • the sliding unit 70 has the function of not the upper stand part 16 as a whole but only a subunit of the upper stand part 18, designated 94 in FIG. 9, on which the common illumination / Detektions Acceptiv 24 is held to move laterally in the xy plane.
  • the microscope system 10 according to FIG. 9 has a pivoting unit 96 with which the upper stand part 16 as a whole can be pivoted about a pivot axis S parallel to the x-axis. In this way, the lens 24 can be adjusted in a coupled sliding / pivoting movement relative to the lens 20.
  • the two objectives 20 and 24, the light-leaf generator 30 and the confocal illumination module 48 are shown functionally on the functional unit forming the light-sheet microscope and the confocal microscope and spatially on the two stand portions 14 , 16 are assigned.
  • the aforementioned functional units are shown in dashed lines in FIG.
  • FIG. 10 shows a control / evaluation unit 100 which controls the overall operation of the microscope system 10.
  • the control unit / evaluation unit 100 is in particular designed to evaluate image data in such a way that those data which are obtained by the confocal microscope are correlated to image data generated by the light-sheet microscope.
  • the further light microscopic functional unit according to the invention forms a confocal microscope.
  • this functional unit can also represent a pointwise imaging microscope of another type, for example a multiphoton microscope, a STED microscope, a RESOLFT microscope or a CARS / SRS microscope.
  • the functional unit can also be designed as a wide-field microscope, in particular as a localization microscope.
  • Sliding unit further surface detector
  • Swivel unit further sliding unit0 Control / evaluation unit2 optical fiber

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Abstract

Beschrieben ist ein Mikroskopsystem (10), das eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit (20, 24, 30), deren Beleuchtungsobjektiv durch ein erstes Objektiv (20) und deren Detektionsobjektiv durch ein separates zweites Objektiv (24) gebildet ist, und mindestens eine weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit (24, 48) umfasst. Die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit (24, 48) weist ein Detektionsobjektiv auf, das durch das zweite Objektiv (24) gebildet ist.

Description

Mikroskopsystem mit lichtblattmikroskopischer Funktionseinheit
Die Erfindung betrifft ein Mikroskopsystem, das eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit, deren Beleuchtungsobjektiv durch ein erstes Objektiv und deren Detektionsobjektiv durch ein separates zweites Objektiv gebildet ist, und mindestens eine weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit umfasst.
In jüngerer Vergangenheit kommen insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie sogenannte Lichtblatt- oder Lichtscheibenmikroskope zur Anwendung, bei denen nur eine dünne Schicht in der Probe beleuchtet wird. Verglichen mit herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopen ermöglichen Lichtblattmikroskope so eine höhere Auflösung und eine geringere Lichtbelastung, wodurch unerwünschte Effekte durch Bleichen oder lichtinduzierten Stress in biologischen Proben vermieden werden. Lichtblattmikroskope sind deshalb besonders gewinnbringend für Fluoreszenzuntersuchungen an lebenden Organismen einsetzbar.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedenartige optische Anordnungen zur Realisierung eines Lichtblattmikroskops bekannt. Im Kontext der vorliegenden Erfindung sind hierbei insbesondere Anordnungen zu nennen, bei denen Beleuchtung und Detektion über zwei separate Objektive erfolgen. Dabei sind das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv üblicherweise senkrecht zueinander angeordnet. Diese senkrechte Anordnung der Objektive hat jedoch insbesondere den Nachteil, dass sie sich nur schwer in schon bestehende Mikroskopsysteme, z.B. Konfokalsysteme, integrieren lässt.
Aus dem Stand der Technik sind Lichtblattmikroskope bekannt, bei denen sich das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv in Abkehr von der vorgenannten rechtwinkligen Anordnung längs der vertikalen Achse des Mikroskopstativs gegenüberstehen. Ein Beispiel hierfür ist in dem Dokument DE 10 2011 054 914 AI offenbart. Um auch in einer solchen Anordnung ein senkrecht zur Detektionsachse liegendes Lichtblatt erzeugen zu können, wird das längs der vertikalen Stativachse durch das Beleuchtungsobjektiv tretende Beleuchtungslichtbündel auf ein Spiegelsystem gerichtet, welches das Beleuchtungslichtbündel in einem rechten Winkel ablenkt, um die Probe in der horizontal liegenden Fokusebene des Detektionsobjektivs mit einem Lichtblatt zu beleuchten. Der in der Fokusebene liegende Zielbereich der Probe wird dann durch das Detektionsobjektiv auf einen Kamerasensor abgebildet. Aus dem Dokument US 9 057 879 B2 ist ein Mikroskopsystem bekannt, das eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit mit einer konfokalmikroskopischen Funktionseinheit kombiniert. Bei diesem System erfolgen die Lichtblattbeleuchtung sowie die konfokale Beleuchtung und Detektion über ein- und dasselbe Mikroskopobjektiv. Für die Lichtblattdetektion ist dagegen ein separates Objektiv vorgesehen.
Da in dem vorgenannten Mikroskopsystem die lichtblattmikroskopische Funktionseinheit und die konfokalmikroskopische Funktionseinheit mit verschiedenen Detektionsobjektiven arbeiten, ist es nicht ohne weiteres möglich, dass die nach den beiden unterschiedlichen Mikroskopieanwendungen gewonnenen Bilddaten in Bezug zueinander, d.h. miteinander korreliert werden können.
Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein aus einer lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit und einer weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit gebildetes Mikroskopsystem so weiterzubilden, dass eine einfache und präzise Auswertung der mit den beiden Funktionseinheiten gewonnenen Bilddaten möglich wird.
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch ein Mikroskopsystem, umfassend eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit, deren Beleuchtungsobjektiv durch ein erstes Objektiv und deren Detektionsobjektiv durch ein separates zweites Objektiv gebildet ist, und mindestens eine weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit, wobei diese weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit ein Detektionsobjektiv aufweist, das durch das zweite Objektiv gebildet ist.
Die Erfindung sieht also ein Mikroskopsystem vor, durch das eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit und eine weitere lichtmikroskopische, z.B. konfokalmikroskopische Funktionseinheit derart miteinander kombiniert sind, dass beide Funktionseinheiten das aus der abzubildenden Probe stammende Detektionslicht mit ein- und demselben Detektionsobjektiv empfangen. Die Verwendung eines einzigen Detektionsobjektivs ermöglicht es, die Probe unter Anwendung unterschiedlicher Mikroskopiemethoden abzubilden, ohne dass bei einem Wechsel von der einen zu der anderen Methode ein Probentransfer erforderlich ist. Dies erleichtert die Handhabung des Mikroskopsystems erheblich. Es wird durch ein erfindungsgemäßes Mikroskopsystem also ermöglicht, korrelative Mikroskopie für Lichtblattmikroskopie und ein weiteres lichtmikroskopisches Verfahren auf eine besonders einfache und fehlerminimierende Weise durchzuführen.
Das erfindungsgemäße Mikroskopsystem kann insbesondere in der Weise eingesetzt werden, dass die Probe zunächst schonend und schnell lichtblattmikroskopisch untersucht und anschließend zur Gewinnung zusätzlicher Bilddaten durch die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit abgebildet wird. Hier ist denkbar, dass eine solche weitere Aufnahme der Probe beispielsweise eine höhere Auflösung interessierender Probenregionen ermöglicht.
In einer bevorzugten Ausführung hat das Mikroskopsystem eine Auswerteeinheit zur korrelierten Bildauswertung auf Grundlage von Detektionslicht, das die lichtblattmikroskopische Funktionseinheit und die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit jeweils über das durch das zweite Objektiv gebildete, gemeinsam genutzte Detektionsobjektiv empfangen. Diese vorteilhafte korrelierte Bildauswertung wird dadurch ermöglicht, dass die beiden mikroskopischen Funktionseinheiten das Detektionslicht jeweils aus ein- und derselben Probenebene empfangen, die durch die Fokusebene des den beiden Funktionseinheiten gemeinsam zugeordneten Detektionsobjektivs definiert ist. Unter einer korrelierten Bildauswertung im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Auswertung der Bilddaten zu verstehen, bei der sowohl Bilddaten benutzt werden, die mittels der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit gewonnen worden sind, als auch Bilddaten, die mittels der weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit gewonnen worden sind. Insbesondere kann eine korrelierte Bildauswertung eine Verrechnung von zwei oder mehr Bildern oder Teilbildern der beiden Funktionseinheiten miteinander zu mindestens einem resultierenden Bild beinhalten, beispielsweise durch Addition (Überlagern) oder Subtraktion oder andere mathematische Operationen. Vorzugsweise weist die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit ein Beleuchtungsobjektiv auf, das durch das zweite Objektiv gebildet ist. In dieser Ausführungsform stellt also das von beiden mikroskopischen Funktionseinheiten gemeinsam genutzte Detektionsobjektiv zugleich das Beleuchtungsobjektiv der weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit dar. Das andere (erste) Objektiv ist dann allein der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit zugeordnet, nämlich als Beleuchtungsobjektiv.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hat das Mikroskopsystem ein Mikroskopstativ, das aus einem ersten Stativteil, an dem das erste Objektiv gehalten ist, und einem zweiten Stativteil, an dem das zweite Objektiv dem ersten Objektiv gegenüberliegend gehalten ist, zusammengesetzt ist. Unter dem vorgenannten Mikroskopstativ ist dabei ein Mikroskopkörper zu verstehen, der eine Reihe von Anschlüssen (Ports) aufweist, die mechanische Schnittstellen insbesondere zum Zwecke der Lichtzufuhr und Lichtabfuhr bereitstellen. Über diese Schnittstellen lassen sich beispielsweise Kameras, Okulare, Scanner und Manipulatoren an dem Mikroskopstativ anbringen. Dementsprechend sind die vorgenannten Stativteile als Mikroskopteilkörper aufzufassen, aus denen das Mikroskopstativ bzw. der Mikroskopkörper zusammengesetzt ist. Im Kontext der vorliegenden Erfindung sind die beiden Stativteile in funktionaler Hinsicht durch einen Mikroskoptisch, der eine Probenkammer zur Aufnahme der abzubildenden Probe aufweist, voneinander separiert. Nimmt man beispielhaft an, dass einer der beiden Stativteile in Gebrauchslage des Mikroskopsystems ein unterer Stativteil und der andere ein oberer Stativteil ist, so bedeutet die vorgenannte funktionale Separierung der Stativteile, dass die dem unteren Stativteil zugeordneten Beleuchtungs- und Detektionskomponenten von unterhalb des Mikroskoptisches her wirksam werden, während die dem oberen Stativteil zugeordneten Beleuchtungs- und Detektionskomponenten von oberhalb des Mikroskoptisches her wirksam werden. In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, dass das erfindungsgemäße Mikroskopsystem sowohl als aufrechtes Mikroskop als auch als inverses Mikroskop ausgeführt sein kann. Dabei wird vorliegend unter einem aufrechten Mikroskop eine Anordnung verstanden, bei der das gemeinsame Detektionsobjektiv oberhalb des Mikroskoptisches angeordnet ist. Demgegenüber befindet sich das gemeinsame Detektionsobjektiv bei einer inversen Mikroskopausführung unterhalb des Probentisches.
Vorzugsweise weist das Mikroskopsystem eine Lichtumlenkvorrichtung auf, die einen von der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit durch das erste Objektiv erzeugten Beleuchtungsfokus in eine Fokusebene des zweiten Objektivs umlenkt. Eine solche Lichtumlenkvorrichtung ermöglicht es, dass auch in einer Anordnung, in der die beiden Objektive des Mikroskopsystems einander gegenüberstehen, das Lichtblatt koplanar zur Fokusebene des Detektionsobjektivs erzeugt werden kann. Vorzugsweise weist die Lichtumlenkvorrichtung mindestens ein Spiegelelement auf, das den Beleuchtungsfokus senkrecht zur optischen Achse des zweiten Objektivs umlenkt. Dieses Spiegelelement ist vorzugsweise an dem ersten Objektiv oder an dem zweiten Objektiv angebracht, denkbar ist aber auch eine Anbringung an anderen Elementen des Mikroskopsystems, beispielsweise dem Deckglas oder einem der beiden Stativteile. In einer bevorzugten Ausführung sind beiderseits der optischen Achse zwei Spiegelelemente vorgesehen.
In einer speziellen Ausgestaltung weist die lichtblattmikroskopische Funktionseinheit einen in dem zweiten Stativteil angeordneten Flächensensor zur Detektion des durch das zweite Objektiv empfangenen Detektionslichtes auf. Der Flächensensor ist beispielsweise als CCD- oder CMOS-Kamera ausgeführt.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit ein dem zweiten Stativteil zugeordnetes Beleuchtungsmodul zur punktweise abtastenden Probenbeleuchtung und/oder zur Weitfeld- Probenbeleuchtung. Dabei soll durch die Formulierung„zugeordnet" zum Ausdruck gebracht werden, dass das vorgenannte Beleuchtungsmodul sowohl innerhalb des zweiten Stativteils angeordnet als auch über eine geeignete Schnittstelle an dem zweiten Stativteil angekoppelt werden kann.
In einer beispielhaften Ausführung enthält das Beleuchtungsmodul einen Scanner zur punktweise abtastenden Probenbeleuchtung. Ein solcher Scanner kann beispielsweise in Form eines an sich bekannten Spiegelscanners ausgeführt sein, wie er bei einem herkömmlichen Konfokalmikroskop eingesetzt wird.
Im vorgenannten Fall weist das Beleuchtungsmodul in einer speziellen Ausführung einen Punktsensor auf, der einen sogenannten Descanned-Detektor für das durch das zweite Objektiv empfangene Detektionslicht bildet. Als Descanned-Detektor empfängt der Punktsensor des Detektionslicht nach dessen Rückführung auf den Scanner als ortsfestes Lichtbündel.
Eine Lichtquelle, die Licht für das Beleuchtungsmodul zur Verfügung stellt, kann in das Beleuchtungsmodul integriert oder aber auch, beispielweise über eine Lichtleitfaser, angekoppelt sein. Hierbei kann die Lichtquelle selbst mehrere einzelne Lichtquellen, beispielsweise mehrere Laser und/oder Laserdioden (insbesondere unterschiedlicher Wellenlängen), umfassen. Zusätzlich oder alternativ kann der Flächensensor der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit zugleich einen der weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit zugeordneten Non-Descanned-Detektor für das durch das zweite Objektiv empfangene Detektionslicht bilden. In diesem Fall wird das von der weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit empfangene Detektionslicht nicht (bzw. nicht ausschließlich) auf den punktweise abtastenden Scanner zurückgeführt, sondern direkt auf den Flächensensor geleitet, was einen direkten Vergleich der von den beiden mikroskopischen Funktionseinheiten erfassten Bilddaten ermöglicht.
In einer Ausführungsform umfasst der erste Stativteil ebenfalls einen Detektor, vorzugsweise einen Non-Descanned-Detektor, der eine zusätzliche oder alternative Detektion über den ersten Stativteil ermöglicht.
In einer bevorzugten Ausführung umfasst die lichtblattmikroskopische Funktionseinheit einen Lichtblattgenerator, der dem ersten Stativteil zugeordnet ist. Ein solcher Lichtblattgenerator enthält beispielsweise eine Lichtquelle und einen der Lichtquelle nachgeordneten Scanner, durch den der Beleuchtungsfokus so bewegt wird, dass ein quasi-statisches Lichtblatt aufgebaut wird. In einer alternativen Ausführungsform kann anstelle des Scanners auch eine lichtblatterzeugende Optik, z.B. eine Zylinderlinse vorgesehen sein. Die Lichtquelle (beispielsweise ein oder mehrere Laser) muss allerdings nicht Teil des Lichtblattgenerators sein, sondern kann mit diesem auch nur verbunden sein, beispielsweise über eine Lichtleitfaser. Hierbei ist es denkbar, dass die Lichtquellen des Lichtblattgenerators (der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit) und das Beleuchtungsmodul (der weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit) in demselben Gehäuse untergebracht sind oder sogar zumindest teilweise identisch sind, also beispielsweise ein Laser für beide Lichtquellen Verwendung findet.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung hat das Mikroskopsystem eine Versteilvorrichtung zum Verstellen des zweiten Stativteils oder zumindest Teilen (Untereinheiten) des zweiten Stativteils relativ zu dem ersten Stativteil oder relativ zu zumindest Teilen (Untereinheiten) des ersten Stativteils. Denkbar ist folglich, dass eine solche Versteilvorrichtung nur ein oder mehrere Untereinheiten, wie beispielsweise einen Objektivhalter (Objektivanschluss), des zweiten Stativteils relativ zu dem ersten Stativteil (oder zumindest Untereinheiten desselben) verstellt, aber auch, dass die Versteilvorrichtung den zweiten Stativteil relativ zu dem ersten Stativteil (oder zu zumindest einer Untereinheit desselben) als Ganzes verstellt. Unter einem Verstellen ist insbesondere ein Bewegen zu verstehen, dass ein Verschieben und/oder ein Schwenken und/oder ein Rotieren beinhalten kann. Eine Antriebseinheit oder Mechanik könnte für ein Verstellen des zweiten Stativteils relativ zum ersten Stativteil („relatives Verstellen") beispielsweise den ersten Stativteil relativ zum Bezugssystem des Raumes, in dem sich das Mikroskop befindet, bewegen, aber alternativ oder zusätzlich auch den zweiten Stativteil. Äquivalentes gilt für die Untereinheiten der Stativteile. Eine solche Versteilvorrichtung kann folglich insbesondere eine Schiebeeinheit umfassen, die ausgebildet ist, den zweiten Stativteil und/oder zumindest eine Untereinheit des zweiten Stativteils (wie beispielsweise einen Objektivhalter) in einer Verschiebeebene, die senkrecht zur optischen Achse des zweiten Objektivs liegt, zumindest in eine Richtung relativ zu dem ersten Stativteil (oder zumindest Untereinheiten desselben) zu verschieben. Durch diese laterale Verschiebbarkeit ergibt sich eine Reihe von Vorteilen, wie z.B. eine Vergrößerung des detektierbaren Probenraums. Insbesondere wenn zur Lichtblatterzeugung beiderseits der optischen Achse zwei Spiegelelemente in einem vergleichsweise großen Abstand voneinander angeordnet sind und das Beleuchtungsbildfeld so klein ist, dass die Spiegelelemente durch das Beleuchtungsobjektiv nicht mehr ausreichend beleuchtet werden können (also diese das Beleuchtungsfokus nicht mehr ausreichend umlenken), kann durch laterales Verschieben einer der beiden Stativteile nach Bedarf eines der Spiegelelemente angefahren, d.h. beleuchtet werden. Außerdem ist es möglich, während der Bildaufnahme das Beleuchtungsobjektiv im Zentralbereich und nicht am Rand des Beleuchtungsbildfeldes einzusetzen (also das Spiegelelement im Zentralbereich des Beleuchtungsobjektives zu positionieren), was zu einer Steigerung der optischen Leistung (Abbildungsleistung), insbesondere zu einer Verringerung der Farbquerfehler, führt. Auch kann ein Beleuchtungsobjektiv mit höherer Vergrößerung und damit (bei gleichem Durchmesser der Eintrittspupille) höherer numerischer Apertur eingesetzt werden. Die Möglichkeit, das Beleuchtungsobjektiv im Zentralbereich des Beleuchtungsbildfeldes einzusetzen, vereinfacht zudem das in speziellen Lichtblattanwendungen vorgesehene Schieben des Beleuchtungsfokus längs der optischen Achse. Eine Schiebeinheit kann auch so ausgebildet sein, dass alternativ oder zusätzlich zu der oben beschriebenen Funktionalität eine Verschiebung des zweiten Stativteils und/oder zumindest einer Untereinheit des zweiten Stativteils parallel zur optischen Achse des ersten und/oder zweiten Objektivs ermöglicht wird. Beispielsweise ist eine Verschiebung des Objektivanschlusses des zweiten Stativteils parallel zur optischen Achse des zweiten Objektivs denkbar. Alternativ oder zusätzlich kann die Versteilvorrichtung auch eine gegebenenfalls weitere Schiebeeinheit umfassen, die eine Verschiebung des ersten Stativteils und/oder zumindest einer Untereinheit des ersten Stativteils parallel zur optischen Achse des ersten und/oder zweiten Objektivs ermöglicht. In einer weiteren vorteilhaften Ausführung umfasst die Versteilvorrichtung eine Schwenkeinheit, die ausgebildet ist, den zweiten Stativteil und/oder zumindest eine Untereinheit des zweiten Stativteils um eine Schwenkachse, die senkrecht zur optischen Achse des ersten Objektivs und/oder senkrecht zur optischen Achse des zweiten Objektivs liegt, relativ zu dem ersten Stativteil (oder zumindest Untereinheiten desselben) zu verschwenken.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführung umfasst die Versteilvorrichtung eine Rotationseinheit, die ausgebildet ist, den zweiten Stativteil und/oder zumindest eine Untereinheit des zweiten Stativteils um eine Rotationsachse, die parallel zur optischen Achse des ersten Objektivs und/oder parallel zur optischen Achse des zweiten Objektivs liegt, relativ zu dem ersten Stativteil (oder zumindest Untereinheiten desselben) zu rotieren. In einer weiteren Ausführung ist die Schiebeeinheit ausgebildet, eine Untereinheit des zweiten Stativteils in der parallel zu einer Fokusebene des zweiten Objektivs liegenden Verschiebeebene relativ zu dem ersten Stativteil zu verschieben. Ferner ist die Schwenkeinheit ausgebildet, den zweiten Stativteil in seiner Gesamtheit um die Schwenkachse relativ zu dem ersten Stativteil zu verschwenken. Diese Möglichkeit einer gekoppelten Schiebe-/Schwenkbewegung bietet eine Vielzahl von Einstellmöglichkeiten, die sich je nach Anwendung frei wählen lassen.
Vorzugsweise ist die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit in ihrer Gesamtheit dem zweiten Stativteil zugeordnet. Dies ermöglicht einen besonders kompakten Aufbau des Mikroskopsystems.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung bildet die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit ein punktweise abbildendes Mikroskop, insbesondere ein Rastermikroskop. Das vorgenannte Rastermikroskop ist beispielsweise ein Konfokalmikroskop. Durch die Kombination eines Lichtblattmikroskops und eines Konfokalmikroskops, die als Schnittstelle das gemeinsame Detektionsobjektiv aufweisen, können unter Anwendung unterschiedlicher Mikroskopiemethoden Bilddaten aus ein- und demselben Probenbereich gewonnen und miteinander korreliert werden. Beispielsweise wird zunächst mit Hilfe des Lichtblattmikroskops ein Übersichtsbild eines Probenbereichs aufgenommen. Findet man innerhalb dieses Übersichtsbilds eine Stelle, die beispielsweise mit höherer Auflösung abgebildet werden soll, so wird von dem Lichtblattmikroskop auf das Konfokalmikroskop umgeschaltet.
Das Rastermikroskop kann in einer weiteren Ausführungsform ein Multiphotonenmikroskop sein. Hierzu verfügt das Mikroskopsystem über ein Beleuchtungsmodul, das einen Multiphotonenlaser und einen Scanner umfasst. Die Detektion der in dem beleuchteten Probenbereich angeregten Photonen kann im Descanned-Modus erfolgen, indem das Detektionslicht auf den Scanner zurückgeführt und dann auf einen Punktsensor geleitet wird. Eine Detektion über einen Non- Descanned-Modus ist auch denkbar, hierbei wird das Detektionslicht beispielsweise vor dem Scanner ausgekoppelt und einem Detektor zugeführt. In weiteren Ausführungsformen kann das Rastermikroskop auch ein STED-Mikroskop (STED: stimulated emission depletion) oder ein RESOLFT-Mikroskop (RESOLFT: revesible saturable optical fluorescence depletion) sein.
In einer anderen Ausführung kann das Rastermikroskop auch als ein CARS/SRS- Mikroskop ausgeführt sein (CARS: coherent anti-Stokes Raman scattering; SRS: stimulated Raman scattering).
In weiteren anderen Ausführungen kann das Rastermikroskop auch ein Mikroskop zur Durchführung von Fluoreszenzlebensdauer-Messungen (FLIM : fluorescence lifetime imaging microscopy; FLIM-Mikroskop) oder zur Durchführung von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS: fluorescence correlation spectroscopy; FCS-Mikroskop) oder ein spektrales Mikroskop sein. Unter einenn spektralen Mikroskop versteht man ein Mikroskop, das die Möglichkeit bietet, mehrere spektrale Bereiche aus dem Emissionspektrum der verwendeten Fluoreszenzmarker gleichzeitig oder sequentiell zu detektieren. Grundsätzlich ist ein spektrales Mikroskop geeignet, das Spektrum des detektierten Lichts zu messen.
Im Fall eines Rastermikroskops (beispielsweise Konfokalmikroskop, Multiphotonenmikroskop, STED-Mikroskop, CARS/SRS-Mikroskop, FLIM-Mikroskop, FCS-Mikroskop, spektrales Mikroskop) als lichtmikroskopische Funktionseinheit kann alternativ das Detektionslicht im Non-Descanned-Modus auch direkt auf einen Flächensensor geleitet werden, der zugleich den Detektor des Lichtblattmikroskops bildet. In diesem Fall führt das Detektionslicht auf dem Flächensensor eine Abtastbewegung aus, die der durch den Scanner verursachten Abtastbewegung des Beleuchtungslichts auf der Probe entspricht.
Die neben der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit vorgesehene weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit kann auch ein Weitfeldmikroskop bilden, insbesondere ein Lokalisationsmikroskop.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe unter Verwendung eines Mikroskopsystems vorgesehen, das eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit, deren Beleuchtungsobjektiv durch ein erstes Objektiv und deren Detektionsobjektiv durch ein separates zweites Objektiv gebildet ist, und mindestens eine weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit umfasst, wobei das zweite Objektiv sowohl für die Abbildung der Probe mittels der lichtmikroskopischen Funktionseinheit als auch für die Abbildung der Probe unter Verwendung der weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit als gemeinsames Detektionsobjektiv genutzt wird. Die Erfindung wird im Folgenden an Hand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Darin zeigen :
Fig. 1 den schematischen Aufbau eines Mikroskopsystems als
Ausführungsbeispiel;
Fig. 2 eine Darstellung der beiden in dem Mikroskopsystem nach Fig. 1 vorgesehenen Objektive; Fig. 3 eine Abwandlung des Mikroskopsystems;
Fig. 4 eine weitere Abwandlung des Mikroskopsystems;
Fig. 5 eine weitere Abwandlung des Mikroskopsystems;
Fig. 6 eine Darstellung der beiden in dem Mikroskopsystem nach Fig. 5 vorgesehenen Objektive;
Fig. 7 eine weitere Abwandlung des Mikroskopsystems;
Fig. 8 eine weitere Abwandlung des Mikroskopsystems;
Fig. 9 eine weitere Abwandlung des Mikroskopsystems; und Fig. 10 ein Blockdiagramm des Mikroskopsystems.
Fig. 1 zeigt in schematischer Darstellung ein Mikroskopsystem 10, das ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung darstellt. Das Mikroskopsystem 10 hat ein allgemein mit 12 bezeichnetes Mikroskopstativ, das aus einem unteren Stativteil 14 und einem darauf aufgesetzten oberen Stativteil 16 gebildet ist. An dem unteren Stativteil 14 ist über einen Objektivanschluss 18 ein erstes Objektiv 20 angebracht. Entsprechend ist an dem oberen Stativteil 16 über einen Objektivanschluss 22 ein zweites Objektiv 24 angebracht. Die beiden Objektive 20 und 24, die in Figur 2 noch einmal in Alleinstellung gezeigt sind, liegen einander längs einer optischen Achse 0 gegenüber, die unter Bezugnahme auf das xyz-Koordinatensystem gemäß Figur 1 parallel zur z-Achse verläuft. Die Objektive 20 und 24 sind somit beiderseits eines Mikroskoptisches 26 angeordnet, der eine in den Figuren 1 und 2 nicht explizit gezeigte Probenkammer aufweist, die beispielsweise in Form einer mit einem Glasboden versehenen Petrischale ausgebildet ist.
An dem unteren Stativteil 14 ist über einen Anschluss 28 ein Lichtblattgenerator 30 angekoppelt. Der Lichtblattgenerator 30 dient der Erzeugung einer lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung, die beispielsweise über einen Spiegel oder einen dichroitischen Strahlteiler 32 in das erste Objektiv 20 eingekoppelt wird. Hierzu verfügt der Lichtblattgenerator 30 über an sich bekannte, in Figur 1 nicht gezeigte lichtblatterzeugende Komponenten wie eine Lichtquelle und einen Scanner, der das von der Lichtquelle emittierte Beleuchtungslicht in eine abtastende Bewegung versetzt. Infolge dieser abtastenden Bewegung generiert ein durch das erste Objektiv 20 erzeugter Beleuchtungsfokus, der in Figur 2 mit 34 bezeichnet ist, das der Probenbeleuchtung dienende Lichtblatt.
Wie ferner in Figur 2 gezeigt, sind an dem dem ersten Objektiv 20 zugewandten zweiten Objektiv 24 zwei beiderseits der optischen Achse O angeordnete Spiegelelemente 36, 38 angebracht, die den parallel zur optischen Achse O aus dem ersten Objektiv 20 austretenden Beleuchtungsfokus 34 senkrecht zur optischen Achse O in eine Fokusebene des zweiten Objektivs 24 umlenken. Das durch den umgelenkten Beleuchtungsfokus 34 generierte Lichtblatt ist somit koplanar zur Fokusebene des zweiten Objektivs 24 angeordnet. Wie aus vorstehender Erläuterung deutlich wird, dient das an dem unteren Stativteil 14 angeordnete erste Objektiv 20 in dem Ausführungsbeispiel nach Figur 1 als Beleuchtungsobjektiv, das die abzubildende Probe in der Fokusebene des zweiten Objektivs 24 mit dem Lichtblatt beleuchtet. Das erste Objektiv 20 wird deshalb im Weiteren auch als Lichtblatt-Beleuchtungsobjektiv bezeichnet.
An dem unteren Stativteil 14 befinden sich ferner weitere Anschlüsse, die Schnittstellen zur Ankopplung von Mikroskopkomponenten bilden, die insbesondere der Zufuhr von Licht in den unteren Stativteil 14 oder der Abfuhr von Licht aus dem unteren Stativteil 14 dienen. Beispielhaft ist in Figur 1 ein Anschluss 40 gezeigt, der der Ankopplung einer weiteren Lichtquelle dient, die Beleuchtungslicht in Richtung des dichroitischen Strahlteilers 32 emittiert. Ferner sind an dem unteren Stativteil 14 Okulare 42 angebracht.
Das dem Lichtblatt-Beleuchtungsobjektiv 20 gegenüberliegende Objektiv 24 dient in dem Ausführungsbeispiel nach Figur 1 zum einen der Erfassung des Detektionslichtes, das aus der mit dem Lichtblatt beleuchteten Probe stammt. Hierzu leitet das zweite Objektiv 24 das Detektionslicht über eine Tubusoptik 44 auf einen Flächensensor 46, der beispielsweise als CCD- oder CMOS-Kamera ausgeführt ist. Zum anderen ist das Objektiv 24 funktionsmäßig einem konfokalen Beleuchtungsmodul 48 zugeordnet, das über einen Anschluss 50 an dem oberen Stativteil 16 angekoppelt ist. In dieser Funktion dient das Objektiv 24 sowohl als Beleuchtungsobjektiv, in dem es Beleuchtungslicht, das von einer in dem konfokalen Beleuchtungsmodul 48 enthaltenen, nicht eingezeichneten Lichtquelle erzeugt und über einen ebenfalls im konfokalen Beleuchtungsmodul 48 enthaltenen Konfokal-Scanner 52 geleitet wird, auf die abzubildende Probe leitet, als auch als Detektionsobjektiv, in dem es durch die konfokale Probenbeleuchtung generiertes Detektionslicht zurück in den oberen Stativteil 16 in das konfokale Beleuchtungsmodul 48 leitet, worin das Detektionslicht von einem Punktsensor 54 erfasst wird. Da das Detektionslicht in den Konfokal- Scanner 52 zurückgeführt wird, arbeitet der Punktsensor 54 in an sich bekannter Weise als sogenannter Descanned-Sensor. Wegen der vorstehend erläuterten Doppelfunktion des zweiten Objektivs 24 wird dieses im Weiteren auch als gemeinsames Beleuchtungs-/Detektionsobjektiv bezeichnet.
Wie der untere Stativteil 14 ist auch der obere Stativteil 16 mit einer Reihe von Anschlüssen versehen, die Schnittstellen zur Ankopplung externer Komponenten an den Stativteil 16 definieren. Neben dem schon genannten Anschluss 50, an dem das konfokale Beleuchtungsmodul 48 angebracht wird, weist der Stativteil 16 einen Anschluss 56 zur Ankopplung des Flächensensors 46 und einen Anschluss 58 zur Ankopplung einer LED-Lampe 62 auf. Dabei definieren die beiden Anschlüsse 50 und 58 zwei parallele Schnittstellenebenen Ei, E2, die eine wohldefinierte (insbesondere konjugierte) Lage relativ zur bildseitigen Fokusebene und/oder zur objektseitigen Fokusebene des gemeinsamen Beleuchtungs-/Detektionsobjektivs 24 aufweisen. Vorteilhafterweise weisen auch die Anschlüsse 50 und 58 selbst eine wohldefinierte (insbesondere bekannte) Lage auf, beispielsweise in Bezug auf das gemeinsame Beleuchtungs-/Detektionsobjektiv 24 und/oder relativ zur bildseitigen und/oder zur objektseitigen Fokusebene. Die Schnittstellenebene E2 definiert in dem Ausführungsbeispiel nach Figur 1 eine sogenannte Auflichtachse, längs der Licht, das von der LED-Lampe 62 emittiert wird, auf das gemeinsame Beleuchtungs- /Detektionsobjektiv 24 geleitet wird. An dem oberen Stativteil 16 sind ferner Okulare 60 angeordnet.
Der obere Stativteil 16 enthält neben der zuvor schon zuvor erwähnten, dem Flächensensor 46 vorgeordneten Tubusoptik 44 einen in der ersten Schnittstellenebene Ei angeordneten Strahlteilerspiegel 64 (hierbei kann es sich je nach Anwendung beispielsweise um einen (gegebenenfalls flexibel in den Strahlengang einbringbaren) Strahlteiler oder Spiegel handeln, der auch durch weitere Filter ergänzt werden kann) sowie einen Filterwürfel 66 und einen dichroitischen Strahlteiler 68, die in der zweiten Schnittstellenebene E2 und damit auf der Auflichtachse angeordnet sind. Die vorgenannten optischen Konnponenten 64, 66 und 68 werden in an sich bekannter Weise je nach Anwendung auf der optischen Achse 0 des gemeinsamen Beleuchtungs-/Detektionsobjektivs 24 positioniert, um das Beleuchtungslicht und das Detektionslicht innerhalb des oberen Stativteils 16 in der gewünschten Weise zu beeinflussen. Insbesondere kann durch einen entsprechend gewählten Strahlteiler als Strahlteilerspiegel 64 (bei Einsatz von passenden Farbstoffen) eine Aufspaltung entsprechend der Art des Beleuchtung (konfokale Beleuchtung oder Beleuchtung durch ein Lichtblatt) und damit eine parallele Detektion des Detektionslichts beider Arten der Beleuchtung erreicht werden. Auch eine Aufspaltung nach Polarisationsrichtungen bei Einsatz eines entsprechenden Strahlteilers (oder bei Kombination mit Polarisationsfiltern) ist denkbar.
Das Mikroskopsystem 10 nach Figur 1 stellt eine modulare Anordnung verschiedener Funktionseinheiten dar, die einzeln, aber auch gemeinsam zur Bildgebung eingesetzt werden können. Insbesondere enthält das Mikroskopsystem 10 eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit, deren wesentliche Funktionskomponenten im Hinblick auf die Beleuchtung durch den Lichtblattgenerator 30 und das Lichtblatt- Beleuchtungsobjektiv 20 und im Hinblick auf die Detektion durch das gemeinsame Beleuchtungs-/Detektionsobjektiv 24 und den Flächensensor 46 gegeben sind. Ferner umfasst das Mikroskopsystem 10 eine weitere, konfokalmikroskopische Funktionseinheit, deren wesentliche Komponenten sowohl im Hinblick auf die Beleuchtung als auch im Hinblick auf die Detektion durch das konfokale Beleuchtungsmodul 48 und das gemeinsame Beleuchtungs-/Detektionsobjektiv 24 gegeben sind.
In dem vorstehend erläuterten Ausführungsbeispiel nach Figur 1 erfasst die konfokalmikroskopische Funktionseinheit das aus der Probe stammende Detektionslicht nach dessen Rückführung auf den Konfokal-Scanner 52 mittels des Punktsensors 54 im sogenannten Descanned-Modus. Es ist jedoch ebenso möglich, das Detektionslicht im sogenannten Non-Descanned-Modus direkt auf den Flächensensor 46 zu leiten. In diesem Fall führt das Detektionslicht auf dem Flächensensor 46 eine Abtastbewegung aus, die der durch den Konfokal-Scanner 52 verursachten Abtastbewegung des Beleuchtungslichts auf der Probe entspricht. Das Mikroskopsystem 10 nach Figur 1 weist ferner eine Schiebeeinheit 70 auf, die es ermöglicht, den oberen Stativteil 16 in der x-y-Ebene, d.h. senkrecht zur optischen Achse 0, relativ zu dem unteren Stativteil 14 zu bewegen. Diese Möglichkeit einer lateralen Verschiebung erlaubt es insbesondere, das Lichtblatt-Beleuchtungsobjektiv 20 im Zentralbereich des Bildfeldes und nicht an dessen Rand zu nutzen, was unter anderem eine höhere optische Abbildungsleistung (insbesondere geringere Farbquerfehler) ermöglicht.
Die Figuren 3 bis 9 zeigen eine Reihe von Abwandlungen des erfindungsgemäßen Mikroskopsystems 10 nach Figur 1, wobei zur Vereinfachung der Beschreibung diejenigen Komponenten dieser Abwandlungen, die jedenfalls in ihrer grundlegenden Funktion den in Figur 1 gezeigten Komponenten entsprechen, mit den in Figur 1 verwendeten Bezugszeichen versehen sind.
Die abgewandelte Ausführungsform nach Figur 3 unterscheidet sich von dem Ausführungsbeispiel nach Figur 1 im Wesentlichen dadurch, dass die erste Schnittstellenebene Ei weggelassen und das konfokale Beleuchtungsmodul 48 in der zweiten Schnittstellenebene E2, d.h. in der Auflichtachse angekoppelt ist.
Die abgewandelte Ausführungsfigur nach Figur 4 unterscheidet sich von der Ausführungsform nach Figur 3 durch das Weglassen der Okulare 60.
Figur 5 zeigt eine Ausführungsform, die sich von dem Ausführungsbeispiel nach Figur 1 dadurch unterscheidet, dass die Lichtblatterzeugung über den oberen Stativteil 16 erfolgt, während die Lichtblattdetektion sowie die konfokale Beleuchtung und Detektion in dem unteren Stativteil 14 realisiert sind. Dementsprechend ist der Lichtblattgenerator 30 bei der Ausführungsform nach Figur 5 in der ersten Schnittstellenebene Ei an dem oberen Stativteil 16 angekoppelt. Ferner ist das konfokale Beleuchtungsmodul 48 an dem unteren Stativteil 14 angebracht. Zudem weist die in Figur 5 gezeigte Ausführungsform einen weiteren Flächendetektor 72, z.B. in Form einer CCD- oder CMOS-Kamera, in dem unteren Stativteil 14 auf. Der weitere Flächendetektor 72 erfasst das Detektionslicht, das aus der mit dem Lichtblatt beleuchteten Probe stammt.
Gegenüber der Ausführungsform nach Figur 1 ist in der in Figur 5 dargestellten Ausführungsform die Anordnung des Lichtblatt-Beleuchtungsobjektivs 20 und des gemeinsamen Beleuchtungs-/Detektionsobjektivs 24 vertauscht, d.h. das Lichtblatt- /Beleuchtungsobjektiv 20 befindet sich an dem oberen Stativteil 16, während das gemeinsame Beleuchtungs-/Detektionsobjektiv 24 an dem unteren Stativteil 14 angeordnet ist. Dementsprechend befinden sich, wie in Figur 6 gezeigt, die beiden an dem Lichtblatt-Beleuchtungsobjektiv 20 angebrachten Spiegelelemente 36, 38 unterhalb des Mikroskoptisches 26.
Die in Figur 7 dargestellte Ausführungsform entspricht, soweit für die vorliegende Erfindung von Belang, im Wesentlichen dem Ausführungsbeispiel nach Figur 3, abgesehen davon, dass der Lichtblattgenerator 30 über eine Lichtleitfaser 102 an eine Mehrfarben-Lichtquelle 74 gekoppelt ist. Die Mehrfarben-Lichtquelle 74 enthält mehrere monochrome Lichtquellen 76, 78, 80, 82, die dem Lichtblattgenerator 30 über mehrere dichroitische Spiegel 84, 86, 88, 90 Beleuchtungslicht unterschiedlicher Farben zuführen. Die Mehrfarben-Lichtquelle 74 kann alternativ auch aus einem Weißlichtlaser bestehen, der ein kontinuierliches breites Spektrum an Wellenlängen liefert, oder einen solchen umfassen. Insbesondere ist auch eine Kombination aus Weißlichtlaser und monochromen Lichtquellen denkbar. Gleichzeitig ist die Mehrfarben-Lichtquelle 74 auch über eine weitere Lichtleitfaser 102 mit dem konfokalen Beleuchtungsmodul 48 verbunden und dient auch dem oberen Stativteil 16 als Lichtquelle. Im Gegensatz zu den vorherigen Ausführungsformen wurde das untere Stativteil 14 des Weiteren auf den Objektivanschluss 18 und den Lichtblattgenerator 30 reduziert und insbesondere auf Okulare 42 für den unteren Stativteil 14 verzichtet. Hierbei kann der Objektivanschluss 18 (der Objektivanschluss 18 ist eine Untereinheit des unteren Stativteils 14) mittels der Schiebeeinheit 70 sowohl parallel zur optischen Achse des Lichtblatt-/Beleuchtungsobjektivs 20 als auch in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Lichtblatt-/Beleuchtungsobjektivs 20 verschoben werden. Des Weiteren kann durch eine weitere Schiebeeinheit 98 auch der Objektivanschluss 22 (der Objektivanschluss 22 bildet eine Untereinheit des oberen Stativteils 16) parallel zur optischen Achse des Beleuchtungs- /Detektionsobjektivs 24 bewegt werden. Die Versteilvorrichtung unnfasst in diesenn Fall also zwei Schiebeeinheiten 70, 98.
Die Mehrfarben-Lichtquelle 74 kann hierbei über eine optische Weiche 104 mit den Lichtleitfasern 102, die der Ankopplung an den Lichtblattgenerator 30 und dem konfokalen Beleuchtungsmodul 48 dienen, verbunden sein. Die optische Weiche 104 kann hierbei ein optisches Bauteil mit der Funktion eines Schalters sein, der das Licht entweder jeweils vollständig dem Lichtblattgenerator 30 oder dem konfokalen Beleuchtungsmodul 48 zuführt, so dass die beiden Funktionseinheiten (die lichtblattmikroskopische und die lichtmikroskopische) die Probe sequentiell beleuchten. Alternativ kann die optische Weiche 104 auch ein optisches Bauteil mit der Funktion eines Teilers sein, der einen ersten Anteil des Lichts der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit und einen zweiten Anteil des Lichts der konfokalmikroskopischen Funktionseinheit zuführt, so dass diese zeitgleich die Probe beleuchten. Die optische Weiche 104 kann hierbei beispielsweise einen schaltbaren Spiegel, ein akustooptisches Bauelement, wie zum Beispiel einen akustooptischen Modulator (AOM) oder einen akustooptischen Deflektor (AOD), oder einen elektro- optischen Modulator (EOM) umfassen.
Die Ausführungsform nach Figur 8 entspricht im Wesentlichen der in Figur 7 gezeigten Anordnung, abgesehen davon, dass das konfokale Beleuchtungsmodul 48 nicht wie in Figur 7 in der Schnittstellenebene Ei, sondern in der Schnittstellenebene E2, d.h. in der Auflichtachse angeordnet ist.
Figur 9 zeigt eine Ausführungsform des Mikroskopsystems 10, die auf dem Ausführungsbeispiel nach Figur 3 basiert. Im Unterschied zu der in Figur 3 dargestellten Ausführungsform hat bei der Anordnung nach Figur 9 die Schiebeeinheit 70 die Funktion, nicht den oberen Stativteil 16 als Ganzes, sondern nur eine in Figur 9 mit 94 bezeichnete Untereinheit des oberen Stativteils 18, an der das gemeinsame Beleuchtungs-/Detektionsobjektiv 24 gehalten ist, lateral in der x-y-Ebene zu verschieben. Zusätzlich hat das Mikroskopsystem 10 nach Figur 9 eine Schwenkeinheit 96, mit der sich der obere Stativteil 16 als Ganzes um eine zur x-Achse parallele Schwenkachse S verschwenken lässt. Auf diese Weise lässt sich das Objektiv 24 in einer gekoppelten Schiebe-/Schwenkbewegung relativ zu dem Objektiv 20 verstellen. In dem Blockdiagramm nach Figur 10 ist schließlich rein schematisch noch einmal veranschaulicht, wie die beiden Objektive 20 und 24, der Lichtblattgenerator 30 und das konfokale Beleuchtungsmodul 48 zum einen funktional den beiden das Lichtblattmikroskop und das Konfokalmikroskop bildenden Funktionseinheit und zum anderen räumlich den beiden Stativteilen 14, 16 zugeordnet sind. Die vorgenannten Funktionseinheiten sind in Figur 10 gestrichelt dargestellt.
Ferner zeigt Figur 10 eine Steuer-/Auswerteinheit 100, die den Gesamtbetrieb des Mikroskopsystems 10 steuert. Dabei ist die Steuereinheit-/Auswerteinheit 100 insbesondere ausgebildet, Bilddaten in einer Weise auszuwerten, dass diejenigen Daten, die durch das Konfokalmikroskop gewonnen werden, in Korrelation zu von dem Lichtblattmikroskop generierten Bilddaten gesetzt werden.
Die vorstehend erläuterten Ausführungsformen sind lediglich beispielhaft zu verstehen. So ist insbesondere darauf hinzuweisen, dass sich einzelne Aspekte verschiedener Ausführungsformen ohne Weiteres miteinander kombinieren lassen. In den beschriebenen Ausführungsformen bildet die erfindungsgennäße weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit ein Konfokalmikroskop. Es versteht sich von selbst, dass diese Funktionseinheit auch ein punktweise abbildendes Mikroskop anderer Art darstellen kann, z.B. ein Multiphotonenmikroskop, ein STED-Mikroskop, ein RESOLFT-Mikroskop oder ein CARS/SRS-Mikroskop. Ferner kann die Funktionseinheit auch als Weitfeld-Mikroskop, insbesondere als Lokalisationsmikroskop ausgeführt sein.
Bezugszeichenliste
Mikroskopsystem
Mikroskopstativ
unterer Stativteil
oberer Stativteil
Objektivanschluss
Objektiv
Objektivanschluss
Objektiv
Mikroskoptisch
Anschluss
Lichtblattgenerator
dichroitischer Strahlteiler
Beleuchtungsfokus
Spiegelelemente
Anschluss
Okular
Tubusoptik
Flächensensor
konfokales Beleuchtungsmodul
Anschluss
Konfokal-Scanner
Punktsensor
Anschluss
Anschluss
Okular
LED-Lampe
Strahlteilerspiegel
Fluoreszenzwürfel dichroitischer Strahlteiler
Schiebeeinheit weiterer Flächendetektor
Mehrfarben-Lichtquelle-82 Lichtquellen
-90 dichroitische Spiegel
Untereinheit
Schwenkeinheit weitere Schiebeeinheit0 Steuer-/Auswerteeinheit2 Lichtleitfaser
4 optische Weiche

Claims

Ansprüche
Mikroskopsystem (10), umfassend:
eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit (20, 24, 30), deren
Beleuchtungsobjektiv durch ein erstes Objektiv (20) und deren
Detektionsobjektiv durch ein separates zweites Objektiv gebildet (24) ist, und mindestens eine weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit (24, 48), dadurch gekennzeichnet, dass die weitere lichtmikroskopische
Funktionseinheit (24, 48) ein Detektionsobjektiv aufweist, das durch das zweite Objektiv (24) gebildet ist.
2. Mikroskopsystem (10) nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine
Auswerteeinheit (100) zur korrelierten Bildauswertung auf Grundlage von Detektionslicht, das die lichtblattmikroskopische Funktionseinheit (20, 24,
30) und die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit (24, 48) jeweils über das durch das zweite Objektiv (24) gebildete, gemeinsam genutzte Detektionsobjektiv empfangen.
Mikroskopsystem (10) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit (24, 48) ein
Beleuchtungsobjektiv aufweist, das durch das zweite Objektiv (24) gebildet ist.
Mikroskopsystem (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Mikroskopstativ (12), das aus einem ersten Stativteil (14), an dem das erste Objektiv (20) gehalten ist, und einem zweiten Stativteil (16), an dem das zweite Objektiv (24) dem ersten Objektiv (20) gegenüberliegend gehalten ist, zusammengesetzt ist.
5. Mikroskopsystem (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Lichtumlenkvorrichtung (36, 38), die einen von der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit (20, 24, 30) durch das erste Objektiv (20) erzeugten Beleuchtungsfokus (34) in eine Fokusebene des zweiten Objektivs (24) umlenkt.
6. Mikroskopsystem (10) nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtumlenkvorrichtung (36) mindestens ein Spiegelelement aufweist, das den Beleuchtungsfokus (34) senkrecht zur optischen Achse (O) des zweiten Objektivs (24) umlenkt, wobei dieses Spiegelelement vorzugsweise an dem ersten Objektiv (20) oder an dem zweiten Objektiv (24) angebracht ist.
7. Mikroskopsystem (10) nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, dass die lichtblattmikroskopische Funktionseinheit (20, 24, 30) einen in dem zweiten Stativteil (16) angeordneten Flächensensor (46) zur Detektion des durch das zweite Objektiv (24) empfangenen Detektionslichtes aufweist.
8. Mikroskopsystem (10) nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, dass die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit (24, 48) ein dem zweiten Stativteil (16) zugeordnetes Beleuchtungsmodul (48) zur punktweise abtastenden Probenbeleuchtung und/ oder zur Weitfeld- Probenbeleuchtung umfasst.
9. Mikroskopsystem (10) nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungsmodul (48) einen Scanner (52) zur punktweise abtastenden Probenbeleuchtung enthält.
10. Mikroskop nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das
Beleuchtungsmodul (48) einen Punktsensor (54) aufweist, der einen Descanned-Detektor für das durch das zweite Objektiv (24) empfangene Detektionslicht bildet.
11. Mikroskopsystem (10) nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, dass der Flächensensor (46) der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit (20, 34, 30) zugleich einen der weiteren
lichtmikroskopischen Funktionseinheit (24, 48) zugeordneten Non- Descanned-Detektor für das durch das zweite Objektiv (24) empfangene Detektionslicht bildet.
12. Mikroskopsystem (10) nach einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, dass die lichtblattmikroskopische Funktionseinheit (20, 24, 30) einen Lichtblattgenerator (30) umfasst, der dem ersten Stativteil (14) zugeordnet ist.
13. Mikroskopsystem (10) nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, dass das Mikroskopsystem (10) eine Versteilvorrichtung (70, 96) zum Verstellen des zweiten Stativteils (16) oder einer Untereinheit (22, 94) des zweiten Stativteils (16) relativ zu dem ersten Stativteil (14) oder relativ zu einer Untereinheit (18) des ersten Stativteils (14) umfasst.
14. Mikroskopsystem (10) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Versteilvorrichtung (70, 96) eine Schiebeeinheit (70) umfasst, die ausgebildet ist, den zweiten Stativteil (16) oder die eine Untereinheit (22, 94) des zweiten Stativteils (16) in einer Verschiebeebene, die senkrecht zur optischen Achse (O) des ersten Objektivs (20) und senkrecht zur optischen Achse (O) des zweiten Objektivs (24) liegt, relativ zu dem ersten Stativteil (14) oder relativ zu der einen Untereinheit (18) des ersten Stativteils (14) zu verschieben. Mikroskopsystem (10) nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Versteilvorrichtung eine Schwenkeinheit (96) umfasst, die
ausgebildet ist, den zweiten Stativteil (16) oder die eine Untereinheit (22, 94) des zweiten Stativteils (16) um eine Schwenkachse (S), die senkrecht zur optischen Achse (0) des ersten Objektivs (20) und senkrecht zur optischen Achse (0) des zweiten Objektivs (24) liegt, relativ zu dem ersten Stativteil (14) oder relativ zu der einen Untereinheit (16) des ersten Stativteils (14) zu verschwenken.
Mikroskopsystem (10) nach den Ansprüchen 14 und 15, dadurch
gekennzeichnet, dass die Schiebeeinheit (70) ausgebildet ist, die eine
Untereinheit (94) des zweiten Stativteils (16) in der parallel zu einer
Fokusebene des zweiten Objektivs (24) liegenden Verschiebeebene relativ zu dem ersten Stativteil (14) zu verschieben, und die Schwenkeinheit (96) ausgebildet ist, den zweiten Stativteil (16) in seiner Gesamtheit um die Schwenkachse (S) relativ zu dem ersten Stativteil (14) zu verschwenken.
Mikroskopsystem (10) nach einem der Ansprüche 6 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit (24, 48) in ihrer Gesamtheit dem zweiten Stativteil (16) zugeordnet ist.
Mikroskopsystem (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit (24, 48) ein punktweise abbildendes Mikroskop, insbesondere ein
Rastermikroskop bildet.
19. Mikroskopystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das
Rastermikroskop ein Konfokalmikroskop, ein Multiphotonenmikroskop, ein STED-Mikroskop, ein RESOLFT-Mikroskop, ein FCS-Mikroskop, ein spektrales Mikroskop, ein FLIM-Mikroskop oder ein CARS/SRS-Mikroskop ist.
20. Mikroskopsystem (10) nach einenn der Ansprüche 1 bis 17, dadurch
gekennzeichnet, dass die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit (24, 48) ein Weitfeldmikroskop, insbesondere ein Lokalisationsmikroskop ist.
21. Mikroskopsystem (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Gebrauchslage des Mikroskopsystems (10) einer der beiden Stativteile (14, 16) ein unterer Stativteil und der andere Stativteil ein oberer Stativteil ist.
22. Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe unter Verwendung eines Mikroskopsystems (10), das eine lichtblattmikroskopische
Funktionseinheit (20, 24, 30), deren Beleuchtungsobjektiv durch ein erstes Objektiv (20) und deren Detektionsobjektiv durch ein separates zweites Objektiv (24) gebildet ist, und mindestens eine weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit (24, 48) umfasst,
dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Objektiv (24) sowohl für die Abbildung der Probe mittels der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit (20, 24, 30) als auch für die Abbildung der Probe mittels der weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit (24, 48) als gemeinsames
Detektionsobjektiv genutzt wird.
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