-
Die Erfindung betrifft ein Mikroskopiersystem zur Erfassung von Mikroskopbildern mithilfe eines Konfokalmikroskops.
-
Aus dem Stand der Technik ist eine Vielzahl von Mikroskopiersystemen mit einem automatisch gesteuerten Konfokalmikroskop bekannt. Um Bilder von fluoreszierend gefärbten Proben zu erhalten, wird oft konfokale Mikroskopie verwendet. Der Vorteil der konfokalen Mikroskopie gegenüber der Weitfeldfluoreszenzmikroskopie liegt in der Bereitstellung eines optischen Schnitts, die tiefenaufgelöste Aufnahmen ermöglicht.
-
Herkömmliche kommerzielle Konfokalmikroskope scannen die Probe mit einem fokussierten Laserstrahl durch das Objektiv. Im Beispiel eines Fluoreszenzmikroskops wird für jede Strahlposition (d.h. jedes Pixel) die Fluoreszenz an dieser Position mit einem Punktdetektor aufgezeichnet. Pixel für Pixel wird ein gescanntes Bild im Computer zusammengesetzt. Um Bilder in mehreren Farben zu erhalten, kann die Probe mit mehreren fluoreszierenden Farbstoffen gefärbt werden, die unterschiedliche Wellenlängen absorbieren und / oder emittieren. In diesem Fall wird die Fluoreszenz mit mehreren Detektoren in unterschiedlichen Spektralfenstern detektiert und / oder die Probe mit mehreren Laserstrahlen unterschiedlicher Wellenlänge abgetastet. Wenn die spektrale Trennung der verwendeten Farbstoffe groß ist, kann eine Erfassung mehrerer Farben gleichzeitig erfolgen (z. B. Farbstoff 1 bei 488 nm angeregt, bei 500 - 550 nm nachgewiesen, Farbstoff 2 bei 633 nm angeregt, bei 650 - 700 nm nachgewiesen). Wenn die Spektren der Farbstoffe ähnlich sind, wird eine aufeinanderfolgende Bilderfassung verwendet, um eine bessere Trennung der Farbkanäle zu erhalten.
-
Nahezu alle handelsüblichen Konfokalmikroskope verfügen zusätzlich über Möglichkeiten der Weitfeldmikroskopie, die hauptsächlich zur Lokalisierung der Probe verwendet wird: Eine Lampe („Weitfeldlichtquelle“) wird verwendet, um die gesamte Probe (nicht nur einen Punkt wie beim Scannen) mit einem einzigen Lichtbündel zu beleuchten. Die Probe wird mit dem Auge oder einer Kamera im Durchlicht beobachtet. Dabei ist es nicht einfach (und nicht beabsichtigt), diese Bilder genau mit den gescannten Fluoreszenzbildern zu überlagern.
-
Für die Überlagerung von Durchlichtbildern mit Fluoreszenzbildern bieten die meisten Firmen eine zusätzliches Transmissionslicht-Variante („PMT-Kanal“) an: Anstelle der Lampe (oder mit dieser austauschbar) wird auf der Kondensorseite ein großflächiger Detektor montiert, der für jede Scanposition (also für jedes Pixel) misst, wie viel des Laserlichts (das hauptsächlich für die Fluoreszenzanregung verwendet wird) transmittiert wird. Auf diese Weise wird ein gescanntes Durchlichtbild erhalten.
-
Man beachte, dass dies aufgrund der Großflächendetektion kein konfokales Bild („optischer Schnitt“) liefert. Da sowohl das Fluoreszenz- als auch das Durchlichtbild mit dem gleichen Scanner gescannt werden, können sie perfekt überlagert werden. Die Durchlichtoption ist jedoch in der Regel eine separat zu erwerbende Zusatzoption zur Standardausstattung.
-
Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Konfokal-Mikroskopiersystem bereitzustellen.
-
Die der Erfindung zugrunde liegenden Aufgaben werden jeweils mit den Merkmalen der unabhängigen Schutzansprüche gelöst. Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Schutzansprüche.
-
In der vorliegenden Offenbarung werden die folgenden Begriffe im nachfolgend beschriebenen Sinne verwendet:
- - Ein „Konfokalmikroskop“ oder kurz „Mikroskop“ ist ein beliebiges herkömmliches, aktuelles oder zukünftiges Mikroskop, welches zur gerasterten Erfassung eines Mikroskopbildes zumindest eines Teils einer Objektebene („optischer Schnitt“) unter Anwendung des Prinzips ausgebildet ist, dass die optischen Signale aus Bereichen außerhalb der Objektebene mithilfe einer in einer Zwischenbildebene installierten Blende („pinhole“) unterdrückt werden („Konfokalprinzip“). Beispielhafte Konfokalmikroskopie-Technologien umfassen, ohne Einschränkung auf das Genannte, konfokale Tandem-Scanning-Mikroskope (TSM), Laser-Scanning-Mikroskope (CLSM, LSCM), Punktscanner, Zeilenscanner, Nipkow-Scheiben-Systeme („Spinning Disk“), Fluoreszenzmikroskope, einschließlich 3D-SIM-Mikroskopen und Lokalisationsmikroskopen, und RESOLFT-Mikroskope, einschließlich STED-, GSD-, SPEM-, SSIM-Mikroskopen, Mikroskopen mit schaltbaren Proteinen oder schaltbaren organischen Farbstoffen und 4Pi-Mikroskopen.
- - Eine „Objektebene“ oder Schärfeebene ist ein durch Zusammenwirkung zumindest einer Lichtquelle, eines Objektivs und einer Pinhole-Blende eines Konfokalmikroskops definiertes Volumen der konstanten axialen Ausdehnung (bezüglich einer in z-Richtung verlaufenden optischen Achse) von einer axialen Halbwertsbreite (FWHMaxial) einer durch diese optischen Elemente und das von der Lichtquelle abgestrahlte Licht festgelegten Punktspreizfunktion.
- - Eine „Konfokallichtquelle“ ist eine punktförmige Lichtquelle, beispielsweise eine Glühlampe hinter einer Lochblende, ein oder mehrere Laser, oder ein durchleuchteter Lichtwellenleiter. Licht aus der Konfokallichtquelle kann zur Beleuchtung eines scharf begrenzten Punktes in der Objektebene verwendet werden.
- - Eine „Weitfeldlichtquelle“ ist eine Lichtquelle, die im Gegensatz zur punktförmigen Konfokallichtquelle zur Ausleuchtung des gesamten durch die Apertur des Konfokalmikroskops abbildbaren Bereichs der Objektebene ausgebildet ist, beispielsweise eine offene oder in einer Kondensoroptik eingebaute Glühlampe, ein LED- oder OLED-Display oder eine Punktlichtquelle, etwa eine Leuchtdiode, in Kombination mit einer strahlaufweitenden Optik.
- - Ein „Detektor“ kann ein spektral breit- oder schmalbandiger optischer Punkt-, Zeilen- oder Matrixdetektor sein und aus einer einzelnen Detektoreinheit oder mehreren in verschiedenen Spektralbereichen empfindlichen Detektoreinheiten bestehen. Beispielsweise kann es sich bei jeder Detektoreinheit um einen Photomultiplier (PMT), eine Avalanche-Photodiode (APD), einen Hybrid-Photodetektor oder einen halbleiterbasierten Zeilen- oder Matrixsensor, etwa in CCD- oder CMOS-Technologie, handeln. Der Detektor kann weitere integrierte optische Elemente wie z.B. fest installierte oder austauschbare Prismen, Linsen, Spiegel, Spektralfilter usw. aufweisen. Der Detektor verfügt über eine Schnittstelle zu einer nachgeschalteten Datenverarbeitungseinheit, beispielsweise einer internen oder externen Elektronik des Mikroskopiersystems oder einer dafür bestimmten Elektronikeinheit der Steuereinheit. Der Detektor kann einen oder mehrere Detektorkanäle aufweisen und wird in letztem Fall als „Multikanaldetektor“ bezeichnet. Dabei kann jeder Detektorkanal in einem spezifischen Spektralbereich empfindlich sein und durch eine eigene Detektoreinheit implementiert sein. Beispielsweise kann der Detektor drei Detektorkanäle aufweisen, die die drei Farbkanäle des RGB-Farbraums kodieren. In einem anderen Beispiel kann der Detektor 32 Detektorkanäle aufweisen, die sich wahlfrei einem bestimmten Spektralbereich zuordnen lassen, der jeweils einem bestimmten Fluoreszenzfarbstoff entspricht.
- - Eine „Steuereinheit“ ist eine elektronische Logikschaltung mit einem Prozessor und kommunikativen Schnittstellen zu allen steuerbaren Elementen und Funktionen eines Konfokalmikroskops, einschließlich elektrischer, optischer und elektromechanischer Elemente. Dazu gehören beispielsweise die Fähigkeit der Steuerung, ohne Einschränkung auf das Genannte, von Stellmotoren für die optischen Elemente des Mikroskops (z.B. zur Positionierung und Ausrichtung von Linsen und Spiegeln) sowie der Intensität, Beleuchtungsdauer und Wellenlänge der Konfokal- und / oder der Weitfeldlichtquelle. Die Steuereinheit kann auch einen erweiterten Funktionsumfang besitzen, etwa einen Speicher und eine oder mehrere universelle Prozessoren (CPUs) oder Grafikprozessoren (GPUs), insbesondere FPGAs zur Verarbeitung der durch den Detektor erzeugten Bilddaten, sowie weitere Schnittstellen etwa für Anzeigegeräte oder weitere nachgeschaltete Datenverarbeitungseinheiten, wie etwa eine Netzwerkschnittstelle.
- - Ein „Bild“ ist ein Datensatz, der aus einzelnen, durch den Detektor aus der Objektebene des Mikroskops empfangenen optischen Signalen so zusammengesetzt ist, dass er als visuelles Bild auf einer Anzeigevorrichtung dargestellt und durch grafikverarbeitende Vorrichtungen (Grafikprozessoren) verarbeitet werden kann. Ein mithilfe von Licht aus der Konfokallichtquelle unter Anwendung des Konfokalprinzips erzeugtes Bild wird hierin als „Konfokalbild“ bezeichnet, während ein mithilfe von durch die Objektebene transmittiertem Licht aus der Weitfeldlichtquelle erzeugtes Bild hierin als „nicht-konfokales Transmissionsbild“ bezeichnet wird. Ein Bild kann einen oder mehrere Bildkanäle enthalten, welche verschiedenen, semantisch verbundenen Datensätzen auf einem identischen Bildraster entsprechen und überlagert darstellbar sind. Verschiedene Bildkanäle können verschiedenen Spektralbereichen (Farbkanälen) bzw. verschiedenen Detektorkanälen entsprechen.
-
Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Mikroskopiersystem, welches Folgendes aufweist:
- ein Konfokalmikroskop für ein in einer Objektebene des Konfokalmikroskops anordenbares Präparat, wobei das Konfokalmikroskop eine Konfokallichtquelle zum Erzeugen eines Lichtstrahls mit einem Brennpunkt in der Objektebene, eine Weitfeldlichtquelle zum Durchleuchten der Objektebene sowie einen Detektor zum Erfassen eines optischen Signals aus der Objektebene aufweist; und
- eine Steuereinheit, wobei die Steuereinheit dazu ausgebildet ist, das Konfokalmikroskop mithilfe von mit der Konfokallichtquelle erzeugtem Licht zur Aufnahme eines Konfokalbildes zumindest eines Teils der Objektebene durch den Detektor sowie mithilfe von mit der Weitfeldlichtquelle erzeugtem Licht zur Aufnahme eines nicht-konfokalen Transmissionsbildes zumindest eines Teils der Objektebene durch den Detektor zu steuern.
-
Ausführungsformen des Mikroskopiersystems könnten zahlreiche Vorteile bieten. Beispielsweise könnte das System zur Aufnahme eines insbesondere hochauflösenden, überlagerungsfähigen, nicht-konfokalen Transmissionsbildes verwendet werden, ohne dass dazu ein zusätzlicher Detektor benötigt würde. Das Konfokalbild und das nicht-konfokale Transmissionsbild werden mit Licht aus zwei verschiedenen Lichtquellen erzeugt und durch denselben Detektor aufgenommen.
-
Ein weiterer Vorteil könnte sein, dass Absorption in einem einzelnen Scan in verschiedenen Wellenlängenkanälen gleichzeitig gemessen werden kann. Dies ist beispielsweise bei vielen konfokalen Fluoreszenzmikroskopen der Fall, die mit einem Fluoreszenzdetektor mit mehreren in verschiedenen Spektralbereichen empfindlichen Detektoreinheiten arbeiten, die gleichzeitig verwendet werden können.
-
Außerdem könnte die für die Absorptionsmessung verwendete Wellenlänge flexibler eingestellt werden als bei der PMT-Konfiguration. In dem PMT-Fall sind die Wellenlängenwahlmöglichkeiten auf die Laser beschränkt, die für die Fluoreszenzanregung verfügbar sind. Pro Scan kann nur eine Wellenlänge aufgenommen werden. Erfindungsgemäß könnte jedoch die Wellenlänge z.B. durch ein Fluoreszenzdetektionsfenster ausgewählt werden, das oft mehr Auswahlmöglichkeiten bietet.
-
Einige konfokale Mikroskope bieten zudem spektral aufgelöste Fluoreszenzdetektion. Mit Ausführungsformen der Erfindung könnte dieser spektral aufgelöste Detektor zum spektralen Auflösen der nicht-konfokalen Absorption verwendet werden.
-
Ausführungsformen dieser Erfindung könnten ohne Hardwareänderungen implementiert werden, insbesondere wenn das Konfokalbild und das nicht-konfokale Transmissionsbild aufeinanderfolgend erfasst werden. Es braucht nur während der Durchführung eines Scans die Weitfeldlichtquelle eingeschaltet und die Konfokallichtquelle ausgeschaltet werden. Falls gleichzeitig gescannt wird, könnte es etwa bei einem Fluoreszenzmikroskop erforderlich sein, einen zusätzlichen Filter in die Weitfeldlichtquelle einzusetzen. Dies erfordert jedoch normalerweise keine Hardware-Modifikationen, da die meisten Weitfeldlichtquellen bereits standardmäßig eine oder mehrere Aufnahmevorrichtungen für kleine optische Elemente wie Filter, Phasenkontrast-Optiken usw. besitzen.
-
Gemäß einer Ausführungsform ist die Steuereinheit zur Steuerung des Konfokalmikroskops in einem sequenziellen Aufnahmemodus ausgebildet, wobei im sequenziellen Aufnahmemodus die Aufnahme des Konfokalbildes und des Transmissionsbildes sequenziell erfolgt. Eine sequenzielle Aufnahme könnte, für ein gegebenes Präparat, eine Verwendung von überlappenden Spektralbereichen zur Aufnahme des Konfokalbildes und des nicht-konfokalen Transmissionsbildes ermöglichen.
-
Gemäß einer Ausführungsform weist die Weitfeldlichtquelle zusätzlich ein schaltbares Lichtblockierelement zum Abschirmen zumindest eines Teils der Weitfeldlichtquelle von mit der Konfokallichtquelle erzeugtem Licht auf, wobei die Steuereinheit zur Steuerung des Konfokalmikroskops ausgebildet ist, sodass die Aufnahme des Konfokalbildes nur dann möglich ist, wenn der abschirmbare Teil der Weitfeldlichtquelle durch das Lichtblockierelement abgeschirmt ist und dass die Aufnahme des Transmissionsbildes nur möglich ist, wenn die Abschirmung aufgehoben ist.
-
Bei einem Lichtblockierelement handelt es sich z.B. um ein optisches Element, welches zumindest einen Teil der Weitfeldlichtquelle vor unerwünschten Lichteinflüssen, etwa hochintensivem Laserlicht, schützt. Dabei kann es sich beispielsweise um einen Spiegel, einen Absorber oder einen optischen Filter handeln. Durch die Schaltbarkeit eines solchen Lichtblockierelements könnte ein effektiver Schutz der Weitfeldlichtquelle vor Beschädigung erzielt werden, ohne dass dafür eine Beeinträchtigung der Aufnahme des nicht-konfokalen Transmissionsbildes in Kauf genommen werden müsste.
-
Gemäß einer Ausführungsform ist die Steuereinheit zur Steuerung des Konfokalmikroskops in einem synchronen Aufnahmemodus ausgebildet, wobei im synchronen Aufnahmemodus die Aufnahme des Konfokalbildes und des Transmissionsbildes synchron erfolgt. Eine synchrone Aufnahme könnte, für ein gegebenes Präparat, eine zeitlich effizientere Erfassung von Mikroskopbildern ermöglichen. Insbesondere könnten Proben oder Präparate mit zeitlich veränderlichen Eigenschaften gleichzeitig konfokal und nicht-konfokal mikroskopiert werden, wodurch eine bessere Vergleichbarkeit der resultierenden Bilder ermöglicht würde. Auch könnte durch wiederholte synchrone Aufnahmen eines gegebenen zeitlich veränderlichen Präparats ein zeitlicher Verlauf der zwei Bildgebungsmodi erfasst werden. Beispielsweise könnte eine Reihe mehrerer Vergleichs- oder Überlagerungsbilder eines Präparats in einem oder mehreren spektralen Fluoreszenzemissionskanälen und einem oder mehreren dazu gleichzeitig aufgenommenen spektralen Transmissionskanälen eine Analyse der zeitlichen Entwicklung des Zustands des Präparats durch voneinander unabhängige, jedoch zu jedem erfassten Zeitpunkt untereinander vergleichbare, Beobachtung von Veränderungen der Transmissions- und Fluoreszenzeigenschaften des Präparats ermöglichen.
-
Gemäß einer Ausführungsform weist der Detektor einen Multikanaldetektor auf, wobei die Steuereinheit zur Steuerung des Konfokalmikroskops ausgebildet ist, sodass das Konfokalbild mit einem ersten Detektorkanal aufgenommen wird und das Transmissionsbild mit einem zweiten Detektorkanal aufgenommen wird, wobei der erste und der zweite Detektorkanal zum Erfassen des optischen Signals in verschiedenen spektralen Empfindlichkeitsbereichen ausgebildet sind. Auf diese Weise könnte das nicht-konfokale Transmissionsbild als von dem ersten (konfokalen) Bildkanal verschiedener zweiter Bildkanal desselben Bildes aufgenommen werden. Somit könnte eine aufwandsarme Darstellung des Konfokalbildes und des nicht-konfokalen Transmissionsbildes als Überlagerungsbild ermöglicht werden. Diese Ausführungsform könnte insbesondere im synchronen Aufnahmemodus den Vorteil haben, dass die gleichzeitig aus den zwei verschiedenen Lichtquellen erfassten optischen Signale voneinander getrennt aufgenommen würden. Bei Fluoreszenzmikroskopie könnte ein Nutzer beispielsweise für die Aufnahme des nicht-konfokalen Transmissionsbildes einen Kanal festlegen, der keinem aktuell verwendeten Fluoreszenzmarker entspricht. Somit könnte einer Verfälschung des Fluoreszenzbildes durch das optische Signal aus der Weitfeldlichtquelle vorgebeugt und die Flexibilität des Mikroskopiersystems erhöht werden.
-
Gemäß einer Ausführungsform weist die Weitfeldlichtquelle zusätzlich einen optischen Filter auf, wobei der optische Filter im spektralen Empfindlichkeitsbereich des ersten Detektorkanals des Detektors lichtundurchlässig und im spektralen Empfindlichkeitsbereich des zweiten Detektorkanals des Detektors lichtdurchlässig ist. Dies könnte den Vorteil haben, dass sich das optische Signal für das nicht-konfokale Transmissionsbild in einem von dem optischen Signal für das Konfokalbild getrennten Spektralbereich ausbreitet. Somit könnten Verfälschungen erwünschter optischer Signale unterdrückt werden, wie diese sonst in überlappenden Spektralbereichen beispielsweise durch gemeinsame Anregung von Fluoreszenzübergängen oder durch Addition der Lichtintensitäten des Fluoreszenslichtes und des Transmissionslichtes der Weitfeldlichtquelle zu erwarten wären.
-
Nach einer Ausführungsform der Erfindung weist der der Multikanaldetektor eine Vielzahl von Detektorkanälen auf, wobei der erste Detektorkanal Teil eines ersten Satzes der Vielzahl der Detektorkanäle ist und/oder der zweite Detektorkanal Teil eines zweiten Satzes der Vielzahl der Detektorkanäle ist, und der erste Satz der Detektorkanäle dazu ausgebildet ist, das Konfokalbild spektral aufzulösen und/oder der zweite Satz der Detektorkanäle dazu ausgebildet ist, das nicht-konfokale Transmissionsbild spektral aufzulösen. „Spektral auflösen“ ist dem Fachmann allgemein verständlich und meint insbesondere, dass ankommendes Licht in mindestens zwei spektral getrennten Wellenlängenbereichen detektiert werden kann.
-
Nach einer Ausführungsform der Erfindung ist der optische Filter im spektralen Empfindlichkeitsbereich des ersten Satzes der Detektorkanäle lichtundurchlässig und im spektralen Empfindlichkeitsbereich des zweiten Satzes der Detektorkanäle lichtdurchlässig.
-
Gemäß einer Ausführungsform weist der Detektor eines aus der folgenden Gruppe auf: einen Photomultiplier, eine Avalanche-Photodiode, einen Hybrid-Photodetektor, und eine Kombination davon.
-
Auf diese Weise könnte die Aufnahme des Konfokalbildes und des nicht-konfokalen Transmissionsbildes mit hoher Empfindlichkeit durchgeführt werden. Die genannten Detektortechnologien können beispielsweise mit einem Prisma oder Gitter und einem Satz entsprechender Vorfilter miteinander kombiniert werden, sodass für jeden gefilterten Spektralbereich eine dedizierte Detektoreinheit mit für den jeweiligen Spektralbereich optimierten Eigenschaften zur Verfügung stünde.
-
Gemäß einer Ausführungsform ist das Mikroskopiersystem für die Aufnahme des Konfokalbildes und des Transmissionsbildes durch eines aus der folgenden Gruppe ausgebildet: Verschwenkung eines Scanspiegels des Konfokalmikroskops, Verschiebung des Präparats, und Verschiebung eines Objektivs des Konfokalmikroskops.
-
Gemäß einer Ausführungsform ist das Konfokalmikroskop als eines aus der folgenden Gruppe ausgebildet: ein Punktscanner, ein Laser-Scanning-Mikroskop, ein Zeilenscanner, und ein Nipkow-Scheiben-System.
-
Die genannten Rasterungsverfahren bzw. Mikroskoptechnologien könnten anwendungsspezifische Vorteile besitzen, z.B. in Abhängigkeit von der Größe, Form, dem Material, Gewicht und / oder den optischen Eigenschaften eines bestimmten Präparats, einem gewünschten Beobachtungsmodus, der Verfügbarkeit von in-situ-Experimenten usw.
-
Gemäß einer Ausführungsform ist das Konfokalmikroskop ein Fluoreszenzmikroskop. Hiermit könnte eine vorteilhafte Möglichkeit bereitgestellt werden, um das nicht-konfokale Transmissionsbild mit einem fluoreszenzmikroskopischen Konfokalbild zu vergleichen.
-
Gemäß einer Ausführungsform ist das Konfokalmikroskop ein Auflichtmikroskop oder ein Durchlichtmikroskop. Auf diese Weise könnte eine Vergleichbarkeit des nicht-konfokalen Transmissionsbildes mit einem konfokalen Auflicht- oder Durchlichtbild bereitgestellt werden.
-
Im Weiteren werden Ausführungsformen der Erfindung mit Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Es zeigt:
- 1 ein schematisches Diagramm einer Anordnung von optischen Elementen eines Konfokalmikroskops.
-
Elemente der nachfolgenden Ausführungsformen, die einander gleichen oder einander entsprechen, sind jeweils mit identischen Bezugszeichen gekennzeichnet.
-
1 zeigt schematisch eine Anordnung optischer Elemente im Strahlengang eines Konfokalmikroskops 100. Rein illustrativ und ohne Beschränkung der Allgemeinheit zeigt 1 den grundsätzlichen Aufbau eines Laser-Scanning-Konfokalmikroskops. Implementierungen der vorliegenden Erfindung sind jedoch mit Konfokalmikroskopen beliebiger anderer Bauweise möglich. Ferner dient die 1 lediglich der Illustration der grundsätzlichen Funktionsweise eines Konfokalmikroskops, weshalb zugunsten einer besseren Übersichtlichkeit auf die Darstellung mancher Komponenten verzichtet wurde.
-
Insbesondere kann das Konfokalmikroskop 100 weitere Linsen oder Linsensysteme, Prismen, Spiegel, faseroptische Komponenten, Strahlteiler, Filter und dergleichen enthalten. Beispielsweise kann das Konfokalmikroskop 100 ein auch als „Teleskop“ bekanntes Linsensystem aufwiesen, das im Strahlengang zwischen dem Scanspiegel 112 und dem Objektiv 110 angeordnet ist, um eine Abbildung beispielsweise des mit der Konfokallichtquelle erzeugten Lichts auf die Rückapertur des Objektivs 110 bereitzustellen.
-
Außerdem nicht dargestellt sind Leitungen und Schnittstellen, die eine Kommunikation, Steuerung, Datenübertragung und dergleichen mit der Steuereinheit, einer internen Datenverarbeitungseinheit des Mikroskopiersystems und / oder einer externen Datenverarbeitungseinheit bereitstellen. Das Konfokalmikroskop 100 weist zumindest eine Schnittstelle zur Übertragung eines Ausgangssignals des Detektors 130 an eine Datenverarbeitungseinheit (z. B. Speicher, Prozessoren) sowie Schnittstellen zur Steuerung verschiedener verstellbarer, schaltbarer, beweglicher optischer Elemente und / oder diesen zugeordneter Antriebe auf.
-
Des Weiteren sind die in 1 dargestellten Einheiten grundsätzlich als funktional zu verstehen, d. h. ein gegebenes optisches Element kann eine Vielzahl von Untereinheiten und / oder Unterelementen aufweisen, welche zur Bereitstellung der gezeigten Funktion zusammenwirken, und / oder es kann sich um ein alternatives Bauelement oder eine alternative Baugruppe handeln, welche dieselbe Funktion wie das gezeigte Element bereitstellt. Beispielsweise kann eine dargestellte Linse auch als Linsensystem oder als Hohl- oder Wölbspiegel implementiert werden, welche für sich oder in Kombination miteinander die gezeigte Wirkung auf darauf eintreffendes Licht entfalten, oder es kann etwa der Detektor 130 ein Prisma, ein Linsensystem sowie eine Vielzahl von Detektoruntereinheiten mit verschiedenen spektralen Empfindlichkeitsbereichen aufweisen. Derartige alternative oder ergänzende Ausführungen der gezeigten optischen Elemente sind der Fachwelt aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt und grundsätzlich als alternative Implementierungen der vorliegenden Erfindung zu verstehen, ohne dass hierin näher darauf eingegangen wird.
-
Die Wechselwirkung eines beliebigen optischen Elements mit der Steuereinheit beschreibende Formulierungen, wie etwa „Ansteuerung eines optischen Elements durch die Steuereinheit“ oder „Die Lampe ist mit der Steuereinheit über eine Schnittstelle kommunikativ verbunden“, schließen immer mit dem genannten Element mechanisch verbundene und durch die Steuereinheit steuerbare, mechanisch auf das genannte optische Element wirkende Bauelemente mit ein, ohne dass diese explizit genannt werden. Beispielsweise ist die Formulierung „Steuerung der Lampe durch die Steuereinheit“ so zu verstehen, dass die Steuereinheit zur Steuerung beispielsweise sowohl der Helligkeit der Lampe als auch ihrer räumliche Position und Orientierung mittels geeigneter Antriebe (z.B. Stellmotoren) ausgebildet ist und entsprechend kommunikativ, beispielsweise durch ein Kabel oder einen Lichtleiter, mit allen steuerbaren Unterelementen verbunden ist.
-
In dem in 1 dargestellten Laser-Scanning-Fluoreszenz-Konfokalmikroskop 100 handelt es sich bei der Konfokallichtquelle um eine Laserlichtquelle 120, die einen einzelnen Laser oder eine Vielzahl von Lasern aufweist, welche zur Abstrahlung von Licht verschiedener Wellenlängen ausgebildet sind. Die Laserlichtquelle 120 ist kommunikativ mit der Steuereinheit verbunden, sodass ihre Lichtemission von der Steuereinheit gesteuert werden kann.
-
Das Laserlicht trifft auf einen Strahlteiler 122, der es in Richtung des Scanspiegels 112 umlenkt. Der Strahlteiler 122 kann beispielsweise ein optisches Gitter, ein halbdurchlässiger Spiegel, eine halbdurchlässige Folie oder dergleichen sein, er kann aber auch Filtereigenschaften besitzen, die bewirken, dass das Laserlicht in Richtung des Scanspiegels 112 abgelenkt wird, jedoch von einem Präparat längs des Lichtweges zurückkehrendes Licht zum Detektor 130 transmittiert wird.
-
Der Scanspiegel 112 ist ein von der Steuereinheit um zwei Achsen unabhängig voneinander verkippbarer Spiegel, z.B. Hohlspiegel oder Planspiegel, der das Laserlicht in Richtung des Objektivs 110 umlenkt bzw. vom Präparat durch das Objektiv 110 zurückkehrendes Licht in Richtung des Strahlteilers 122 umlenkt. Durch geeignete Verkippung des Scanspiegels 112 und Fokussierung des Laserlichts durch das Objektiv 110 wird das Licht in einem Brennpunkt gebündelt, welcher sich an einer vorgegebenen, von der Ausrichtung des Scanspiegels 112 festgelegten Position (x, y) in einer senkrecht zur optischen Achse verlaufenden Objektebene 108 befindet.
-
Es sei angemerkt, dass anstatt der Bewegung des Scanspiegels 112 auch die Probe (d.h. das Präparat) selbst bewegt werden kann.
-
Bei Anregung eines Fluoreszenzübergangs in der Objektebene 108 tritt Fluoreszenzlicht durch das Objektiv 110 und wird durch den Scanspiegel 112 zurück in Richtung des Strahlteilers 122 umgelenkt. Analog tritt bei einem nicht auf Fluoreszenzmikroskopie spezialisierten Konfokalmikroskop beispielsweise ein in der Objektebene 108 zurückgestreuter oder reflektierter Anteil des Laserlichts durch das Objektiv 110 und wird durch den Scanspiegel 112 zurück in Richtung des Strahlteilers 122 gelenkt.
-
Das den Strahlteiler 122 passierende, aus der Objektebene 108 stammende Licht trifft nun auf einen Filter 124, der einen Wellenlängenbereich auswählt, der mit dem Detektor 130 aufgenommen werden soll. Dabei kann es sich beispielsweise um einen Fluoreszenzfilter handeln, der in einem Wellenlängenbereich durchlässig ist, in welchem die mit dem Laserstrahl angeregte Fluoreszenzemission stattfindet. Der Filter 124 ist ein fakultatives Bauteil, das nicht benötigt wird, wenn beispielsweise der Detektor 130 selbst selektiv für einen bestimmten gewünschten Spektralbereich ist. Insbesondere bei einem Fluoreszenzmikroskop ist der Filter 124 undurchlässig für das Anregungslicht, d. h. im vorliegenden Fall, das von der Laserlichtquelle 120 abgestrahlte Laserlicht. Der Filter 124 kann beispielsweise ein gefärbtes Glas oder ein Interferenzfilter wie beispielsweise ein dichroitischer Spiegel sein.
-
Auf dem Weg zum Detektor 130 passiert das Licht außerdem eine Linse 126, welche den Strahl in eine Zwischenbildebene abbildet, in welcher sich eine Lochblende 128 befindet. Auf diese Weise wird das Zwischenbild einer Tiefenselektion (d. h. in Richtung der z-Achse) unterzogen, sodass der den Detektor 130 erreichende Anteil des Lichts aus dem Tiefenbereich der Objektebene 108 emittiert wurde, während optische Signale aus über- bzw. unterhalb der Objektebene 108 liegenden Schichten in die von der Blende 128 abgeschattete Umgebung der Blendenöffnung („Pinhole“) abgebildet und somit unterdrückt werden (Konfokalprinzip).
-
Bei dem Detektor 130 handelt es sich typischerweise um einen Photomultiplier (PMT), eine Avalanche-Photodiode (APD) oder einen Hybrid-Photodetektor (HPD). Bei Linien- oder Zeilenscanner-Konfokalmikroskopen wird typischerweise ein Zeilen-CCD-Sensor oder ein Matrix-Halbleitersensor mit beweglichem Spiegel verwendet; für Mikroskope mit Nipkow-Scheibe wird typischerweise ein Matrixsensor (Kamerasensor) verwendet. Der Detektor 130 kann grundsätzlich ein Einzel- oder Multikanal-Detektor sein, der optische Signale aus der Objektebene 108 mit einem bzw. mehreren verschiedenen spektralen Empfindlichkeitsbereichen empfängt. Der Multikanal-Detektor kann als breitbandiger Detektor mit Vorfilter, als eine Vielzahl schmalbandiger Detektoreinheiten mit vorgeschaltetem Prisma oder Gitter oder auch als integrierter Multikanal-Detektor implementiert sein. Der Detektor 130 verfügt über eine Schnittstelle zur Übermittlung des Ausgangssignals an eine nachgelagerte Datenverarbeitungseinheit (Speicher und / oder Prozessor einer dedizierten internen oder externen Rechnereinheit oder einer in die Steuereinheit integrierten Elektronik oder Logik).
-
1 zeigt ferner einen manuell oder durch die Steuereinheit steuerbaren Klappspiegel 114, der aufgrund einer Ansteuerung durch die Steuereinheit in den Strahlengang verschwenkt werden kann, sodass durch den Scanspiegel 112 in Richtung Strahlteiler 122 reflektiertes Licht in Richtung einer Okularvorrichtung 118 mit vorgeschalteter Linse 116 umgelenkt wird. In der Okularvorrichtung 118 kann sich beispielsweise ein Okular zur Beobachtung eines in der Objektebene 108 gehaltenen Präparats und / oder eine Kamera zur Aufnahme eines Bildes des Präparats mit einer von dem Konfokalbild abweichenden Auflösung befinden.
-
Auf der von dem Objektiv 110 abgewandten Seite der Objektebene 108 zeigt die 1 eine Weitfeldlichtquelle 101 (Kondensorlampe) mit einer Lampe 102, einem Filter 104 und einer Linse 106 (Kondensorlinse). Die Weitfeldlichtquelle 101 erzeugt typischerweise, beispielsweise mithilfe eines nicht dargestellten Hohlspiegels, ein paralleles, großflächiges Lichtbündel, welches typischerweise den gesamten mittels der Konfokaloptik (110, 112, 120 - 130) abbildbaren Bereich der Objektebene 108 gleichmäßig ausleuchtet.
-
Der optische Filter 104 ist typischerweise ein auswechselbares Element und beispielsweise in einen nicht für die Aufnahme des Konfokalbildes genutzten Detektorausgangskanal eines Multikanal-Detektors durchlässig oder, bei Verwendung eines breitbandigen Detektors, durchlässig in einem Spektralbereich, der nicht mit etwaigen Fluoreszenzemissionen und / oder dem Anregungslicht der Konfokallichtquelle 120 überlappt. Die Weitfeldlichtquelle 101 kann auch ohne den Filter 104, etwa als Weißlichtquelle, betrieben werden.
-
Die Lampe 102 der Weitfeldlichtquelle 101 ist kommunikativ mit der Steuereinheit verbunden, sodass diese von der Steuereinheit geschaltet, geregelt, gedimmt, moduliert oder anderweitig angesteuert werden kann. In die Weitfeldlichtquelle 101 integriert oder dieser zwischen Linse 106 und Objektebene 108 vorgelagert können weitere optische Elemente vorhanden sein, insbesondere solche zur Beeinflussung des Strahlengangs (z. B. Blende) oder zur Abschirmung der Weitfeldlichtquelle 101 vor unerwünschten Lichteinflüssen, beispielsweise ein Lichtblockierelement (Spiegel, Absorber), welches undurchlässig beispielsweise für das Licht der Anregungslichtquelle (Laserlichtquelle 120, Konfokallichtquelle) ist. Derlei Lichtbeeinflussungs- und -blockierelemente sind vorzugsweise kommunikativ mit der Steuereinheit verbunden, sodass diese von der Steuereinheit angesteuert (geschaltet, moduliert, reguliert usw.) werden können.
-
Insbesondere ist es wünschenswert, dass die Steuereinheit ein Lichtblockierelement in den Strahlengang einführen kann (beispielsweise durch entsprechende Ansteuerung eines elektrischen Klappmechanismus oder Stellmotors), sodass die Weitfeldlichtquelle 101 bei Betrieb der Konfokallichtquelle vor dem von der Konfokallichtquelle erzeugten Licht geschützt ist, und dass jedoch der Strahlengang der Weitfeldlichtquelle 101 bei Betrieb der Weitfeldlichtquelle 101 freigemacht wird, um die Aufnahme eines Transmissionsbildes mithilfe von mit der Weitfeldlichtquelle 101 erzeugtem Licht zu ermöglichen.
-
Auch die Weitfeldlichtquelle 101 kann auf eine beliebige hiervon abweichende Weise implementiert sein. Beispielsweise könnte ein weiß oder in einer bestimmten Farbe leuchtendes LED-Matrix-Display, ein OLED-Display, eine großformatige OLED oder dergleichen anstelle der herkömmlichen Lichtquelle 102 oder der gesamten Weitfeldlichtquelle 101 verwendet werden. Bei Verwendung einer Kondensorlichtquelle als Weitfeldlichtquelle 101 kann jedoch typischerweise eine Glühlampe mit einem Hohlspiegel auf der von der Kondensorlinse 106 abgewandten Seite zum Einsatz kommen.
-
Nicht in 1 dargestellt ist eine Haltevorrichtung für ein Präparat bzw. ein zur Aufnahme eines Präparats ausgebildetes Trägerelement. Typischerweise handelt es sich bei einer solchen Haltevorrichtung um einen fest montierten oder einen verschiebbaren, insbesondere durch die Steuereinheit steuerbar verschiebbaren Objekttisch, auf dem ein Objektträger mit dem Präparat und einem optionalen Deckglas befestigt werden kann. Die Haltevorrichtung ist dabei relativ zum Objektiv 110 so positioniert, dass die Objektebene 108 durch das befestigte Präparat verläuft. Je nach Anwendungsfall kann die Haltevorrichtung auf eine beliebige andere Weise ausgeführt sein, beispielsweise so, dass eine glasfreie Positionierung eines Präparats ermöglicht wird.
-
Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung grundsätzlich mit einem beliebigen, aus dem Stand der Technik bekannten Konfokalmikroskop implementiert werden kann. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sollten jedoch mit einem beliebigen Konfokalmikroskop einer zukünftigen Generation implementierbar sein. Die Erfindung ist sowohl mit Auflicht- als auch Durchlicht-Konfokalmikroskopen implementierbar. Es wird davon ausgegangen, dass die Erfindung mit einem beliebigen Konfokalmikroskop implementierbar ist, dessen Funktionsweise auf dem weiter oben geschilderten Konfokalprinzip beruht und welches zur gerasterten Aufnahme eines Konfokalbildes aus der Objektebene 108 durch Anwendung des Konfokalprinzips ausgebildet ist.
-
Obwohl die 1 optische Komponenten eines Auflicht-Konfokalmikroskops zeigt, ist die Erfindung ohne bauartspezifische Anpassungen des Strahlengangs gleichermaßen mit einem Durchlicht-Konfokalmikroskop implementierbar. Bei einem Durchlicht-Konfokalmikroskop sind die Weitfeldlichtquelle 101 und die Detektorbaugruppe 131 miteinander vertauscht. Auf diese Weise lassen sich mit einem Durchlicht-Konfokalmikroskop ein Konfokalbild, d. h. eine konfokale Abbildung der Objektebene 108 in Transmission unter Verwendung von mit der Konfokallichtquelle erzeugtem Licht, sowie ein nicht-konfokales Transmissionsbild der Objektebene 108 unter Verwendung von mit der Weitfeldlichtquelle 101 erzeugtem Licht aufnehmen. Dabei erfolgt die Steuerung des Konfokalmikroskops durch die Steuereinheit auf ähnliche Weise wie beim Auflicht-Konfokalmikroskop, lediglich die Weitfeldlichtquelle 101 und die Detektorbaugruppe 131 sind vertauscht und statt der Bewegung des Spiegels 112 zum Scannen der Probe wird z.B. die Probe selbst verschoben, sodass der Konfokallichtquellenfokus und der gewünschte Detektionspunkt der Probe konfokal sind.
-
Zur Aufnahme eines Konfokalbildes steuert die Steuereinheit die Laserlichtquelle 120 an, sodass diese Licht in Richtung des Strahlteilers 122 emittiert. Der Klappspiegel 114 ist aus dem Strahlengang herausgeklappt, sodass der von dem Strahlteiler 122 in Richtung des Scanspiegels 112 reflektierte Teil des Laserlichts sich ungehindert zum Scanspiegel 112 ausbreiten kann. Die Steuereinheit stellt zudem die Verkippung des Scanspiegels 112 so ein, dass der sich von der Laserlichtquelle 120 ausbreitende Lichtstrahl von dem Objektiv 110 auf einen vorgegebenen Punkt (x, y) in der Objektebene 108 fokussiert wird. Befindet sich in der Objektebene 108 beispielsweise ein Präparat mit einem durch das Licht der Laserlichtquelle 120 anregbaren Fluoreszenzmarker an der Position (x, y), so breitet sich daraufhin ein Anteil von Fluoreszenzlicht in die der Objektebene 108 zugewandte Apertur des Objektives 110 aus und wird auf dem umgekehrten Lichtweg zurück in die Richtung des Strahlteilers 122 umgelenkt. Ein den Strahlteiler 122 passierender Anteil des Fluoreszenzlichts passiert auch den Fluoreszenzfilter 124 und wird durch die Linse 126 auf eine Zwischenbildebene fokussiert, in der sich die Lochblende 128 befindet. Der die Öffnung („Pinhole“) der Lochblende 128 passierende Anteil des Fluoreszenzlichts entstammt aus dem konfokalen Volumen an der Position (x, y) der Objektebene 108 und wird von einem geeigneten spektralen Kanal des Detektors 130 empfangen. Das entsprechende Ausgangssignal des Detektors 130 wird nachgelagert als Bildpunkt an der Position (x, y) in dem dem genannten Detektorkanal entsprechenden Bildkanal interpretiert.
-
Zur Aufnahme des nicht-konfokalen Transmissionsbildes steuert die Steuereinheit die Lampe 102 der Weitfeldlichtquelle 101 an, um diese einzuschalten und somit den abbildbaren Bereich der Objektebene 108 in gewünschter Weise, z.B. vollständig oder aber auch nur großflächig aber unvollständig auszuleuchten. Bei eingesetztem Filter 104 wird die Emission der Weitfeldlichtquelle 101 auf einen festgelegten Spektralbereich eingeschränkt. Das von der Weitfeldlichtquelle 101 abgestrahlte Licht durchquert die Objektebene 108 und tritt durch die der Objektebene 108 zugewandte Apertur des Objektivs 110.
-
Hat nun die Steuereinheit den Scanspiel 112 in dieselbe Orientierung verkippt wie bei der vorstehend beschriebenen konfokalen Abbildung der Position (x, y) in der der Objektebene 108, so wird ein durch die der Objektebene 108 an die Position (x, y) transmittierter Anteil des von der Weitfeldlichtquelle 101 erzeugten Lichts auf analoge Weise wie beim Konfokalbild umgelenkt und abgebildet und gelangt so, ggf. unter Reduzierung der Intensität durch den Strahlteiler 122 und die Blende 128, in die Eingangsapertur des Detektors 130. Dabei kann der Filter 124 aus der Detektorbaugruppe 131 ausgebaut sein oder mit einem spektralen Durchlässigkeitsbereich des Filters 104 der Weitfeldlichtquelle 101 überlappen. Die Aufnahme des nicht-konfokalen Transmissionsbildes kann auch ohne beide Filter (104, 124) erfolgen. Schließlich gibt der Detektor 130 auf einem entsprechenden Detektorausgangskanal 130 ein Ausgangssignal ab, das nachgelagert als Bildpunkt des nicht-konfokalen Transmissionsbildes für die Position (x, y) der Objektebene 108 interpretiert wird.
-
Wie vorstehend verwendet, bezeichnet der Begriff „abbildbarer Bereich“ die Gesamtheit aller Positionen (x, y) in der Objektebene 108, welche durch entsprechende Abbildung auf den Detektor 130 als Bildpunkte eines Rasterbildes (d. h. des Konfokalbildes oder des nicht-konfokalen Transmissionsbildes) durch entsprechende Steuerung des Konfokalmikroskops 100 durch die Steuereinheit erfasst werden können. Größe und Form des abbildbaren Bereichs werden beispielsweise durch den ansteuerbaren Verschwenkungsbereich des Scanspiegels 112 und die Aperturgrößen der eingesetzten optischen Elemente wie beispielsweise des Objektivs 110 bestimmt. Die Auflösung des Rasterbildes des abbildbaren Bereichs wird beispielsweise durch die Feinheit der mechanischen Steuerung des Scanspiegels 112 festgelegt. Bei alternativen Rasterungsverfahren kann die Auflösung ebenfalls durch die Feinheit mechanischer Antriebe festgelegt sein, beispielsweise durch die Feinheit der Positionierung eines verschiebbaren Objekttisches oder eines verschiebbaren Objektivs 110. Bei einem Zeilenscanner- oder einem Nipkow-Scheiben-System gelten bekannte auflösungsbestimmende Faktoren entsprechend.
-
Beschrieben ist außerdem ein Verfahren zum Betreiben eines Mikroskopiersystems, wobei das Mikroskopiersystem ein Konfokalmikroskop für ein in einer Objektebene des Konfokalmikroskops anordenbares Präparat sowie eine Steuereinheit zum Steuern des Konfokalmikroskops aufweist, wobei das Konfokalmikroskop eine Konfokallichtquelle zum Erzeugen eines Lichtstrahls mit einem Brennpunkt in der Objektebene, eine Weitfeldlichtquelle zum Durchleuchten der Objektebene sowie einen Detektor zum Erfassen eines optischen Signals aus der Objektebene aufweist, wobei das Verfahren aufweist:
- Steuern, durch die Steuereinheit, des Konfokalmikroskops zur Aufnahme, mithilfe von mit der Konfokallichtquelle erzeugtem Licht, eines Konfokalbildes zumindest eines Teils der Objektebene durch den Detektor; und
- Steuern, durch die Steuereinheit, des Konfokalmikroskops zur Aufnahme, mithilfe von mit der Weitfeldlichtquelle erzeugtem Licht, eines nicht-konfokalen Transmissionsbildes zumindest eines Teils der Objektebene durch den Detektor.
-
Beschrieben ist außerdem ein Computerprogrammprodukt, aufweisend einen computerlesbaren Datenträger, wobei der Datenträger Programmanweisungen zur Ausführung durch einen Prozessor eines Computersystems aufweist, wobei die Programmanweisungen dazu ausgebildet sind, das Computersystem bei Ausführung durch den Prozessor zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 14 zu veranlassen.
-
Bezugszeichenliste
-
- 100
- Konfokalmikroskop
- 101
- Weitfeldlichtquelle
- 102
- Lampe
- 104
- Filter
- 106
- Linse
- 108
- Objektebene
- 110
- Objektiv
- 112
- Scanspiegel
- 114
- Klappspiegel
- 116
- Linse
- 118
- Okularvorrichtung
- 120
- Konfokallichtquelle
- 122
- Strahlteiler
- 124
- Fluoreszenzfilter
- 126
- Linse
- 128
- Blende
- 130
- Detektor
- 131
- Detektor-Baugruppe
