DE102010037786A1

DE102010037786A1 - Verfahren zur Detektion von transmittiertem Licht im konfokalen Laserscan-Mikroskop und konfokales Laserscan-Mikroskop

Info

Publication number: DE102010037786A1
Application number: DE201010037786
Authority: DE
Inventors: Jürgen Riedmann
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2010-09-27
Filing date: 2010-09-27
Publication date: 2012-03-29

Abstract

Ein Mikroskop (20) zum Untersuchen einer Probe (36) hat eine erste Beleuchtungslichtquelle (22), die als Laserlichtquelle ausgebildet ist und die zum Beleuchten der Probe (36) erstes Beleuchtungslicht (24) erzeugt. Eine Scaneinheit (28) lenkt das erste Beleuchtungslicht (24) so ab, dass das erste Beleuchtungslicht (24) die Probe (36) von einer ersten Seite aus optisch abtastet, wodurch von der Probe (36) entgegen gerichtet zu dem ersten Beleuchtungslicht (24) erstes Detektionslicht (38) ausgeht. Ein Hauptstrahlteiler (26) trennt das erste Beleuchtungslicht (24) von dem ersten Detektionslicht (38). Eine Detektionsblende (42, 52, 54) begrenzt eine laterale Ausdehnung des ersten Detektionslichts (38). Eine Detektoranordnung (44, 56) detektiert das lateral begrenzte erste Detektionslicht (38). Eine zweite Beleuchtungslichtquelle (50) erzeugt zweites Beleuchtungslicht (46) und beleuchtet die Probe (36) von einer zweiten Seite aus, wodurch von der Probe (36) entgegen gerichtet zu dem ersten Beleuchtungslicht (24) zweites Detektionslicht (51) ausgeht, wobei die Detektoranordnung (44, 56) das zweite Detektionslicht (51) detektiert.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop zum Untersuchen einer Probe, insbesondere ein konfokales Laserscan-Mikroskop. Das Mikroskop umfasst eine erste Beleuchtungslichtquelle, die als Laserlichtquelle ausgebildet ist und die zum Beleuchten der Probe erstes Beleuchtungslicht erzeugt. Eine Scaneinheit lenkt das erste Beleuchtungslicht so ab, dass das erste Beleuchtungslicht die Probe von einer ersten Seite aus optisch abtastet, wodurch von der Probe entgegen gerichtet zu dem ersten Beleuchtungslicht erstes Detektionslicht ausgeht. Ein Hauptstrahlteiler trennt das erste Beleuchtungslicht von dem ersten Detektionslicht. Eine Detektionsblende begrenzt eine laterale Ausdehnung des ersten Detektionslichts. Eine Detektoranordnung detektiert das lateral begrenzte erste Detektionslicht. Das erste Detektionslicht verläuft longitudinal entlang eines Detektionslichtpfads. Die laterale Richtung, in der das erste Detektionslicht begrenzt wird, steht senkrecht oder nahezu senkrecht auf der longitudinalen Richtung, die parallel zu dem Detektionslichtpfad verläuft. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Betreiben des Mikroskops. Das Verfahren kann als Verfahren zur Detektion von transmittiertem Licht in dem konfokalen Laserscan-Mikroskop bezeichnet werden.
DE 199 49 272 C2 offenbart ein konfokales Scan-Mikroskop. Das Mikroskop hat eine Lichtquellenanordnung zur Beleuchtung eines Objekts und einen Detektor zum Detektieren des von dem Objekt kommenden Detektionslichts. Die Lichtquellenanordnung umfasst zwei Lichtquellen, die nur gemeinsam und nach Einstellung von Mikroskopsystemparametern ein einem Singlemodelaser weitgehend entsprechendes Signal/Rausch-Verhältnis erzeugen. Mindestens eine der beiden Lichtquellen ist als konventionelle Lichtquelle oder als Multimode-Laser ausgebildet.
DE 202 06 153 U1 offenbart ein Scan-Mikroskop mit einem Mikroskopstativ, einer Lichtquelle, die einen Beleuchtungslichtstrahl zur Beleuchtung einer Probe emittiert, einer in dem Mikroskopstativ angeordneten Strahlablenkeinrichtung zum Scannen des Beleuchtungslichtstrahls über die Probe, einem Objektiv, das den Beleuchtungslichtstrahl auf die Probe fokussiert, und mit mindestens einem Detektor der von der Probe ausgehendes Detektionslicht empfängt. Zwischen der Probe und dem Detektor ist ein Bauernfeindprisma angeordnet.
Aus der DE 10 2005 005 618 A1 ist ein LED-Modul zur Beleuchtung in einem Mikroskop bekannt. Das LED-Modul ist derart ausgestaltet, dass es in einem herkömmlichen Lampensockel für eine herkömmliche Lichtquelle eingesetzt werden kann. Dabei sind am Mikroskop keinerlei schaltungstechnische Veränderungen vorzunehmen. Die Funktionalität des LED-Moduls ist alleine durch das Einsetzen in den Lampensockel gewährleistet.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mikroskop und ein Verfahren zum Betreiben eines Mikroskops zu schaffen, das auf besonders einfache Weise ermöglicht, Bilder der Probe auf unterschiedliche Arten aufnehmen zu können.
Die Aufgabe wird gelöst durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Die Erfindung zeichnet sich gemäß einem ersten Aspekt durch eine zweite Beleuchtungslichtquelle aus, die zweites Beleuchtungslicht erzeugt und die die Probe von einer zweiten Seite aus beleuchtet, wobei die zweite Seite von der ersten Seite abgewandt ist. Dies bewirkt, dass von der Probe entgegen gerichtet zu dem ersten Beleuchtungslicht, insbesondere dem Beleuchtungslichtpfad des ersten Beleuchtungslichts, zweites Detektionslicht ausgeht. Die Detektoranordnung detektiert das zweite Detektionslicht. Das zweite Detektionslicht verläuft insbesondere parallel und gleich gerichtet wie das erste Detektionslicht.
Somit wird die Detektoranordnung sowohl dazu genutzt, das erste Detektionslicht zu detektieren, was einer Bildaufnahme im Auflichtverfahren entspricht, als auch das zweite Detektionslicht zu detektieren, was einer Bildaufnahme im Durchlichtverfahren entspricht. Somit kann für den Auflichtpfad und den Durchlichtpfad die gleiche Detektoranordnung, und insbesondere die gleichen Detektoren, verwendet werden.
Die zweite Beleuchtungslichtquelle stellt eine Durchlichtbeleuchtung des Mikroskops dar und ist vorzugsweise eine Lampe, beispielsweise eine UV-Lampe oder eine IR-Lampe oder eine Lampe, die Licht im sichtbaren Spektralbereich erzeugt. Somit sind für den Zweck der Aufnahme von Durchlichtbildern keine gesonderten Komponenten erforderlich. Ferner kann auf schaltbare Spiegel, einen separaten Durchlichtdetektor oder ähnliches im Durchlichtpfad verzichtet werden. Dadurch verringert sich insgesamt ein Verkabelungsaufwand, ein Aufwand zum Aufbringen von Abschirmungen und das gesamte Mikroskop kann relativ einfach ausgestaltet sein.
Gemäß einer Ausgestaltung gelangt das zweite Detektionslicht über die Scaneinheit zu der Detektoranordnung. Dies ermöglicht das Abscannen des Durchlichts auf einfache Weise. Das mikroskopische Bild der Probe wird erzeugt durch Scannen des von der Lampe im gesamten Sehfeld erzeugten Durchlichts nach Durchleuchten der Probe und durch dazu korrespondierendes Auslesen der Detektorsignale der Detektoranordnung in Abhängigkeit von Stellungen von Stellelementen der Scaneinheit.
Bei einer Ausführungsform umfasst die Detektoranordnung mehrere Detektoren. Das zweite Detektionslicht durchläuft ein spektral aufspaltendes optisches Element. Ein erster Anteil des zweiten Detektionslichts, der Detektionslicht eines ersten Wellenlängenbereichs umfasst, wird mit Hilfe eines ersten Detektors detektiert. Ein zweiter Anteil des zweiten Detektionslichts, der Detektionslicht eines zweiten Wellenlängenbereichs umfasst, wird mit Hilfe eines zweiten Detektors detektiert. Dies ermöglicht die Aufnahme von Durchlichtbildern der Probe in unterschiedlichen Spektralbereichen des Detektionslichts. Zusätzlich zu der Aufspaltung des Detektionslicht in zwei Anteile und der entsprechenden Detektion mit Hilfe von zwei Detektoren, können noch weitere Anteile des zweiten Detektionslichts unterschiedlicher Wellenlänge separat detektiert werden. Beispielsweise können drei Detektionskanäle verwendet werden, die in den Spektralbereichen rot-grün-blau sensitiv sind. Dies ermöglicht die Aufnahme von RGB-Farb-Durchlichtbildern. Die Aufnahme der Bilder unterschiedlicher Spektralbereiche kann simultan oder sequentiell und somit gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Im letzteren Fall können die Bilder nachträglich zusammengesetzt werden.
Eine Ausführungsform hat eine Ausblendvorrichtung, beispielsweise eine Beleuchtungsblende, insbesondere eine Irisblende, Feldblende oder insbesondere eine Aperturblende, die die Beleuchtung der Probe auf ein Steuersignal hin unterbindet oder freigibt. Dabei können entweder im Pfad des ersten Beleuchtungslichts oder im Pfad des zweiten Beleuchtungslichts oder in beiden Lichtpfaden je eine Beleuchtungsblende vorgesehen sein. Die Beleuchtungsblenden ermöglichen ein Zu- und Abschalten der beiden Lichtquellen unabhängig voneinander. Eine der Beleuchtungsblenden kann insbesondere direkt an der zweiten Beleuchtungseinheit oder in bzw. nahe einem Kondensor angeordnet sein. Zusätzlich zu der bzw. den Beleuchtungsblenden können noch Filter verwendet werden, um die Lichtintensität des Beleuchtungslichts, insbesondere des zweiten Beleuchtungslichts einzustellen. Ferner können die unterschiedlichen Blenden unterschiedliche Formen und Größen aufweisen und/oder verstellbar sein, so dass genau der Probenbereich ausgewählt werden kann, der beleuchtet werden soll. Alternativ oder zusätzlich kann die Ausblendvorrichtung einen oder mehrere AOTF's (Acousto-Optic Tunable Filter) und/oder EOM's (Electro-Optic Modulator) zum Unterbinden oder frei Geben der Beleuchtung der Probe umfassen. Diese ermöglichen ein besonders schnelles Zu- und Abschalten der beiden Lichtquellen unabhängig voneinander. Beispielsweise kann die Beleuchtung der Probe mit Hilfe des ersten Beleuchtungslichts mit einem AOTF und/oder EOM unterbunden werden und die Beleuchtung der Probe mit Hilfe des zweiten Beleuchtungslichts kann mit Hilfe einer der Blenden unterbunden werden. Mit Hilfe des AOTF bzw. EOM kann auch die Intensität des entsprechenden Beleuchtungslichts variiert werden.
Die Erfindung zeichnet sich aus gemäß einem zweiten Aspekt durch ein Verfahren zum Betreiben des Mikroskops. Dabei wird zum Beleuchten der Probe das Laserlicht als erstes Beleuchtungslicht erzeugt. Das erste Beleuchtungslicht wird so abgelenkt, dass das erste Beleuchtungslicht die Probe von der ersten Seite aus optisch abtastet, wodurch von der Probe ausgehend das dem ersten Beleuchtungslicht entgegen gerichtete erste Detektionslicht erzeugt wird. Das erste Detektionslicht wird von dem ersten Beleuchtungslicht getrennt. Eine laterale Ausdehnung des ersten Detektionslichts wird begrenzt. Das lateral begrenzte erste Detektionslicht wird mit Hilfe der Detektoranordnung detektiert. Die Probe wird von einer zweiten Seite aus beleuchtet, die bezüglich der Probe von der ersten Seite abgewandt ist. Dadurch wird dem ersten Beleuchtungslicht entgegen gerichtetes zweites Detektionslicht erzeugt. Das zweite Detektionslicht wird mit Hilfe der Detektoranordnung detektiert.
Gemäß einer Ausführungsform wird das zweite Detektionslicht mit Hilfe einer Detektionsblende lateral begrenzt.
Das vorstehend genannte Verfahren kann auch mit bekannten Durchlichtkontrastverfahren wie PHAKO (Phasenkontrast), DIC (Differential Interference Contrast, = Differentieller Interferenzkontrast), Nomarski-Prisma, Dunkelfeldmikroskopie und weiteren kombiniert werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird mit Hilfe der zweiten Beleuchtungslichtquelle ein Teil des Wellenlängenspektrums des Beleuchtungslichts zugänglich gemacht, der über die erste Beleuchtungslichtquelle nicht verfügbar ist. Beispielsweise ist es denkbar, die zweite Beleuchtungslichtquelle als UV-Lampe oder IR-Lampe auszulegen, die Probe mit Beleuchtungslicht im UV- bzw. IR-Bereich zu beleuchten und so UV-Informationen bzw. IR-Informationen über die Probe zu erhalten, ohne einen aufwendigen UV-Laser oder IR-Laser vorsehen zu müssen.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend anhand von schematischen Zeichnungen näher erläutert.
Es zeigen:
1 eine Ausführungsform eines Mikroskops,
2 eine weitere Ausführungsform des Mikroskops, und
3 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens zum Betreiben des Mikroskops.
Elemente gleicher Konstruktion oder Funktion sind figurenübergreifend mit den gleichen Bezugszeichen gekennzeichnet.
1 zeigt ein Mikroskop 20, das als konfokales Laserscan-Mikroskop ausgebildet ist. Das Mikroskop 20 umfasst eine erste Beleuchtungslichtquelle 22, die erstes Beleuchtungslicht 24 erzeugt. Die erste Beleuchtungslichtquelle 22 ist eine Laserlichtquelle und das erste Beleuchtungslicht 24 ist ein Laserstrahl, der entlang eines Beleuchtungslichtpfades verläuft. Das erste Beleuchtungslicht 24 wird mit Hilfe eines Hauptstrahlteilers 26, der beispielsweise einen Winkel von 45° mit einer Strahlachse des ersten Beleuchtungslichts 24 einschließt, in eine Scaneinheit 28 eingekoppelt, die beispielsweise einen oder mehrere verstellbare Spiegel zum Ablenken des ersten Beleuchtungslichtstrahls 24 aufweist. Ferner kann die Scaneinheit 28 beispielsweise drei Spiegel umfassen, wobei sich ein erster der drei Spiegel mit einem zweiten der drei Spiegel mitdreht. Eine derartige Scaneinheit 28 ist beispielsweise in DE 100 335 49 oder DE 196 54 210 gezeigt. Zum Verstellen der Spiegel sind diese mit ansteuerbaren Stellelementen gekoppelt. Das mit Hilfe der Scaneinheit 28 abgelenkte erste Beleuchtungslicht 24 durchdringt eine Scanlinse 30 und eine Tubuslinse 32 und wird nachfolgend mit Hilfe eines Objektivs 34 auf eine Probe 36 fokussiert.
Das Mikroskop 20 eignet sich insbesondere zum Aufnehmen von Fluoreszenzlichtbildern. Dabei werden mit Hilfe des Beleuchtungslichts fluoreszierende Stoffe in der Probe 36 derart angeregt, dass sie Detektionslicht aussenden. Erstes Detektionslicht 38 folgt von der Probe 36 ausgehend zunächst dem Beleuchtungslichtpfad zurück durch das Objektiv 34, die Tubuslinse 32, die Scanlinse 30 und die Scaneinheit 28 und ist soweit entgegen dem ersten Beleuchtungslicht gerichtet 24. Dabei tritt aus dem Objektiv 34 ein parallelisierter Detektionslichtstrahl aus, der mit Hilfe der Tubuslinse 32 fokussiert wird, so dass zwischen Tubuslinse 32 und Scanlinse 30 eine Zwischenbildebene entsteht. Die Scanlinse 30 parallelisiert das erste Detektionslicht 38. Die Scaneinheit 28 ist in einer zur Eintrittspupille des Objektivs 34 konjugierten Ebene positioniert und tastet das erste Detektionslicht 38 ab. Nach Austritt aus der Scaneinheit 28 wird das erste Detektionslicht 38 mit Hilfe des Hauptstrahlteilers 26 von dem ersten Beleuchtungslicht 24 getrennt. Zu diesem Zweck wird als Hauptstrahlteiler 26 beispielsweise ein dichroitischer Spiegel verwendet, der das erste Beleuchtungslicht 24 in Richtung hin zu der Scaneinheit 28 ablenkt, und der das erste Detektionslicht 38 hin zu einer optischen. Vorrichtung 40 durchlässt. Dabei wird ausgenutzt, dass das Fluoreszenzlicht umfassende erste Detektionslicht 38 grundsätzlich eine andere Wellenlänge als das erste Beleuchtungslicht 24 hat.
Die optische Vorrichtung 40 umfasst beispielsweise eine Fokussierlinse zum Fokussieren des ersten Detektionslichts 38 und/oder ein Prisma zum spektralen Aufspalten des ersten Detektionslichts 38. Mit Hilfe der Fokussierlinse wird das erste Detektionslicht 38 auf eine Blendenöffnung einer ersten Blende 42, die auch als Detektionsblende bezeichnet werden kann, gerichtet. Die erste Blende 42 begrenzt das in longitudinaler Richtung hin zu einer Detektoranordnung, die mindestens einen ersten Detektor 44 umfasst, verlaufende erste Detektionslicht 38 in lateraler Richtung, also senkrecht zur longitudinalen Ausbreitungsrichtung des ersten Detektionslichts 38. Der Hauptstrahlteiler 26 kann auch zwischen der optischen Vorrichtung 40 und der Detektionsblende 42 angeordnet sein. Die Größe der Blendenöffnung der Detektionsblende 42 beeinflusst unter anderem die Lichtintensität des ersten Detektionslichts 38 an der Detektoranordnung und damit das Signal/Rausch-Verhältnis bei der Bildaufnahme.
Alternativ oder zusätzlich zu der Beleuchtung der Probe 36 mit Hilfe der ersten Beleuchtungslichtquelle 22 und der Detektion des ersten Detektionslichts 38 mit Hilfe der Detektoranordnung, was der Aufnahme von Bildern im Auflichtverfahren entspricht, kann die Probe 36 auch mit Hilfe einer zweiten Beleuchtungslichtquelle 50 beleuchtet werden. Ein Detektieren von dadurch entstehendem zweiten Detektionslicht 51 mit Hilfe derselben Detektoranordnung entspricht einer Aufnahme von Bildern der Probe 36 im Durchlichtverfahren. Die zweite Beleuchtungslichtquelle 50 erzeugt zweites Beleuchtungslicht 46, das mit Hilfe einer Durchlichtlinse 48 auf die Probe 36 gerichtet ist. Zum Erzeugen des zweiten Beleuchtungslichts 46 umfasst die zweite Beleuchtungslichtquelle 50 beispielsweise eine Lampe. Die Lampe kann Licht im sichtbaren Spektralbereich erzeugen oder eine UV- oder IR-Lampe sein und Licht im ultravioletten bzw. infraroten Spektralbereich erzeugen. Beim Aufnehmen von Bildern im Durchlichtverfahren kann eine Detektionszeit oder Aufnahmedauer pro Bildpunkt gegenüber dem Auflichtverfahren verlängert werden, da beim Durchlichtverfahren aus einer flächigen Beleuchtung der Probe 36 und damit einem lateral ausgedehnten, flächigen Durchlichtquerschnitt mit Hilfe der Scaneinheit 28 nur ein Teil des zweiten Detektionslichts 51 ausgeschnitten wird und zu der Detektoranordnung gelenkt wird, weshalb die Intensität des zweiten Detektionslichts 51, das bei der Detektoranordnung im Durchlichtverfahren ankommt, relativ gering sein kann gegenüber der Intensität des bei der Detektoranordnung ankommenden ersten Detektionslichts 38 im Auflichtverfahren. Die Detektionszeit bzw. Aufnahmedauer pro Bildpunkt kann über die Stellgeschwindigkeit der Stellelemente der Scaneinheit 28 gesteuert werden. Dabei bewirkt eine langsame Verstellung der Stellelemente eine lange Detektionszeit pro Bildpunkt und eine schnelle Verstellung der Stellelemente eine kurze Detektionszeit. Alternativ zu dem Verlängern der Detektionszeit können auch mehrere Bilder im Durchlichtverfahren aufgenommen werden und anschließend zusammengesetzt werden, indem für jeden Bildpunkt die erfassten Werte gemittelt werden und das Bild dann aus den Bildpunkten mit gemittelten Werten zusammengesetzt wird. Die Größe der Blendenöffnung der Detektionsblende 42 bestimmt beim Durchlichtverfahren die Größe des aus der flächigen Beleuchtung ausgeschnittenen Lichtpunktes und damit die Auflösung des Bildes der Probe 36.
Wird die Probe 36 mit Hilfe des zweiten Beleuchtungslichts 46 beleuchtet, so geht von der Probe 36 zweites Detektionslicht 51 aus. Das zweite Detektionslicht 51 verläuft dem ersten Detektionslicht 38 entsprechend durch das Objektiv 34 bis hin zu der Detektoranordnung und insbesondere hin zu dem ersten Detektor 44. In anderen Worten folgt das zweite Detektionslicht 51 dem Detektionslichtpfad des ersten Detektionslichts 38. Somit wird der erste Detektor 44 sowohl zur Detektion des ersten Detektionslichts 38 als auch zur Detekion des zweiten Detektionslichts 51 verwendet. Dabei kann bei aufgrund des zweiten Beleuchtungslichts 46 vollständig ausgeleuchteter Probe 36 das zweite Detektionslicht 51 mit Hilfe der Scaneinheit 28 derart gescannt werden, dass nacheinander Licht aus unterschiedlichen Regionen der Probe 36 auf den ersten Detektor 44 trifft. Dabei sind die Scaneinheit 28 und der erste Detektor 44 derart mit einer nicht dargestellten Recheneinheit gekoppelt, der die aktuelle Stellung der Stellelemente oder Spiegel der Scaneinheit 28 bekannt ist, dass zu jedem Zeitpunkt bekannt ist, aus welcher Region der Probe 36 aktuell das Detektionslicht 38, 51 stammt, so dass mit Hilfe der Recheneinheit ein Gesamtbild der Probe 36 und insbesondere der darin enthaltenen fluoreszierenden Stoffe erstellt werden kann. Der Recheneinheit ist die aktuelle Stellung der Stellelemente bekannt, da sie die Stellelemente ansteuert, deren Stellung mit Hilfe von Sensoren erfasst und/oder deren Stellung regelt. Scanelemente umfassen beispielsweise einen oder mehrere mit Stellelementen gekoppelte Spiegel.
2 zeigt eine alternative Ausführungsform des Mikroskops 20, das im Unterschied zu dem in 1 gezeigten Mikroskop 20 eine zweite Blende 52, eine dritte Blende 54, einen zweiten Detektor 56 und eine Ausblendvorrichtung, insbesondere eine erste Beleuchtungsblende 60 und eine zweite Beleuchtungsblende 64, umfasst. Alternativ oder zusätzlich zu der ersten Beleuchtungsblende 60 und/oder im Besonderen alternativ oder zusätzlich zu der zweiten Beleuchtungsblende 64 kann die Ausblendvorrichtung auch einen AOTF 68 oder einen EOM zum Unterbinden oder frei Geben der Beleuchtung der Probe 36 umfassen. Diese ermöglichen ein besonders schnelles Zu- und Abschalten der entsprechenden Lichtquelle 22, 50. Mit Hilfe des AOTF 68 bzw. EOM kann auch die Intensität des entsprechenden Beleuchtungslichts 24, 46 variiert werden. Ferner weist die optische Vorrichtung 40 zumindest ein spektral aufspaltendes Element, insbesondere ein Prisma auf. Somit spaltet die optische Vorrichtung 40 das Detektionslicht 38, 51 spektral auf, so dass ein spektral aufgefächerter Detektionslichtstrahl über die erste Blende 42 auf die zweite Blende 52 trifft. Ansonsten entspricht das Mikroskop 20 gemäß 2 in Aufbau und Funktionsweise dem Mikroskop 20 aus 1.
Die zweite Blende 52 weist an ihrer von dem ersten Detektor 44 abgewandten Blendenfläche eine Verspieglung auf, durch die Anteile des Detektionslichts 38, 51, die nicht hin zu dem ersten Detektor 44 durchgelassen werden, hin zu dem zweiten Detektor 56 abgelenkt werden. Insbesondere durchdringt ein erster Anteil 53 des Detektionslichts 38, 51 die zweite Blende 52 hin zu dem ersten Detektor 44. Ein zweiter Anteil 55 des Detektionslichts 51, 38 wird von dem verspiegelten Bereich der zweiten Blende 52 auf die dritte Blende 54 gelenkt, die einen Teil des zweiten Anteils 55 hin zu dem zweiten Detektor 56 durchlässt. Zusätzlich können noch weitere Blenden und/oder Detektoren vorgesehen sein, zu denen beispielsweise Licht gelangt, das von weiteren verspiegelten Bereichen der zweiten Blende 52 oder von einem verspiegelten Bereich der dritten Blende 54 hin zu entsprechenden weiteren Detektoren abgelenkt wird. Die zweite und die dritte Blende 52, 54 sind vorzugsweise verstellbar ausgestaltet. Insbesondere können Größen von Blendenöffnungen der Blenden 52, 54 veränderbar ausgestaltet sein. Ferner können die Blenden 52, 54 auch verschoben werden. Ein Verstellen der zweiten Blende 52 führt dazu, dass ein anderer Wellenlängenbereich auf den Detektor 44 trifft als vor dem Verstellen. Somit kann eingestellt werden, Licht welcher Wellenlänge mit Hilfe des ersten Detektors 44 detektiert werden sollen.
Die erste Beleuchtungsblende 60 ist mit einem nicht dargestellten Stellelement gekoppelt, das ermöglicht, die erste Beleuchtungsblende 60 entlang einer ersten Bewegungsrichtung 62 zu bewegen, und zwar so, dass mit Hilfe der ersten Beleuchtungsblende 60 das zweite Beleuchtungslicht 46 schnell abgeschattet werden kann. Alternativ oder zusätzlich kann das erste Beleuchtungslicht 24 mit Hilfe der zweiten Beleuchtungsblende 64 abgeschattet werden, indem die zweite Beleuchtungsblende 64 mit Hilfe eines nicht dargestellten Stellelements entlang der Bewegungsrichtung 66 in den Strahlengang des ersten Beleuchtungslichts 24 verschoben werden kann.
Auf der Recheneinheit des Mikroskops 20 ist vorzugsweise ein Programm gespeichert, das dazu dient, das Mikroskop 20 zu betreiben. Das Programm ermöglicht, die Probe 36 im Durchlichtverfahren oder im Auflichtverfahren zu untersuchen. Vorzugsweise wird das Programm in einem Schritt S2 gestartet, in dem beispielweise Variablen initialisiert werden.
In einem Schritt S4 erfolgt eine Abfrage, ob die Probe 36 im Durchlichtverfahren aufgenommen werden soll. Diese Abfrage kann beispielsweise von einem Nutzer des Mikroskops 20 beantwortet werden. Ist die Bedingung des Schritts S4 nicht erfüllt, so soll die Probe 36 nicht im Durchlichtverfahren untersucht werden und das Programm wird in einem Schritt S6 fortgesetzt. Ist die Bedingung des Schritts S4 erfüllt, so bedeutet dies, dass die Probe 36 im Durchlichtverfahren untersucht werden soll, und das Programm wird in einem Schritt S8 fortgesetzt.
In dem Schritt S6 wird das zweite Beleuchtungslicht 46 abgeschaltet oder abgeschattet und die Probe 36 wird mit Hilfe des ersten Beleuchtungslichts 24 von oben beleuchtet.
In dem Schritt S8 wird das erste Beleuchtungslicht 24 abgeschaltet oder abgeschattet und das zweite Beleuchtungslicht 46 trifft von unten auf die Probe 36.
In einem optionalen Schritt S10 erfolgt eine Aufspaltung des Detektionslichts 38, 51, beispielsweise mit Hilfe des Prismas.
In einem Schritt S12 erfolgt eine Detektion des ersten oder zweiten Detektionslichts 38, 51.
In einem Schritt S14 kann das Programm beendet werden, beispielsweise indem die während des Scanvorgangs gesammelten Bilddaten zu einem Gesamtbild der Probe zusammengesetzt werden. Dabei ist es möglich, zunächst nur Probenaufnahmen von Detektionslicht 38, 51 bestimmter Wellenlängen aufzunehmen und nachfolgend Bilder von Detektionslicht 38, 51 unterschiedlicher Wellenlängen zusammenzusetzen. Alternativ dazu können bei einem Durchlauf gleich mehrere Wellenlängenbereiche detektiert werden und das entsprechende mikroskopische Bild kann sofort zusammengesetzt werden.
Zusätzlich zu den dargestellten optischen Elementen können beispielsweise noch Filter vorgesehen sein, durch die eine Lichtintensität des Beleuchtungslichts 24, 46 einstellbar oder steuerbar ist. Insbesondere kann der zweiten Beleuchtungslichtquelle 50 ein Filter, beispielsweise ein Graufilter nachgeschaltet sein. Die verwendeten Blenden 42, 52, 54 und/oder deren Blendenöffnungen können unterschiedliche Formen und Größen aufweisen, so dass unterschiedlichste Probenbereiche zum Untersuchen ausgewählt werden können. Die dargestellte Vorgehensweise zum Untersuchen der Probe 36 kann mit anderen bekannten Durchlichtkontrastverfahren wie PHAKO (Phasenkontrast), DIC (Differential Interference Contrast, = Differentieller Interferenzkontrast), Nomarski-Prisma, Dunkelfeldbeleuchtung etc. kombiniert werden. Ferner können auch bei dem Ausführungsbeispiel gemäß 1 die Ausblendvorrichtung und insbesondere die Beleuchtungsblenden 60, 64 und/oder der oder die AOTF's 68 oder EOM's vorgesehen sein. Ferner kann die erste Blende 42 im Detektionsstrahlengang auch vor der optischen Vorrichtung 40 angeordnet sein. Ferner kann die optische Vorrichtung 40 ein spektral aufspaltendes Element, beispielsweise ein Prisma, und eine oder mehrere Linsen umfassen, die beispielsweise im Detektionsstrahlengang vor und/oder hinter dem Prisma angeordnet sind.
Bezugszeichenliste

20: Mikroskop
22: erste Beleuchtungslichtquelle
24: erstes Beleuchtungslicht
26: Hauptstrahlteiler
28: Scaneinheit
30: Scanlinse
32: Tubuslinse
34: Objektiv
36: Probe
38: erstes Detektionslicht
40: optische Vorrichtung
42: erste Blende
44: erster Detektor
46: zweites Beleuchtungslicht
48: Durchlichtlinse
50: zweite Beleuchtungslichtquelle
51: zweites Detektionslicht
52: zweite Blende
53: erster Anteil
54: dritte Blende
55: zweiter Anteil
56: zweiter Detektor
60: erste Beleuchtungsblende
62: erste Bewegungsrichtung
64: zweite Beleuchtungsblende
66: zweite Bewegungsrichtung
68: AOTF
S2–S14: Schritte zwei bis vierzehn
n: Bedingung nicht erfüllt
j: Bedingung erfüllt

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 19949272 C2 [0002]
DE 20206153 U1 [0003]
DE 102005005618 A1 [0004]
DE 10033549 [0023]
DE 19654210 [0023]

Claims

Mikroskop (20) zum Untersuchen einer Probe (36), mit einer ersten Beleuchtungslichtquelle (22), die als Laserlichtquelle ausgebildet ist und die zum Beleuchten der Probe (36) erstes Beleuchtungslicht (24) erzeugt, einer Scaneinheit (28), die das erste Beleuchtungslicht (24) so ablenkt, dass das erste Beleuchtungslicht (24) die Probe (36) von einer ersten Seite aus optisch abtastet, wodurch von der Probe (36) entgegen gerichtet zu dem ersten Beleuchtungslicht (24) erstes Detektionslicht (38) ausgeht, einem Hauptstrahlteiler (26), der das erste Beleuchtungslicht (24) von dem ersten Detektionslicht (38) trennt, einer Detektionsblende (42, 52, 54), die eine laterale Ausdehnung des ersten Detektionslichts (38) begrenzt, einer Detektoranordnung (44, 56), die das lateral begrenzte erste Detektionslicht (38) detektiert, und mit einer zweiten Beleuchtungslichtquelle (50), die zweites Beleuchtungslicht (46) erzeugt und die die Probe (36) von einer zweiten Seite aus beleuchtet, wodurch von der Probe (36) entgegen gerichtet zu dem ersten Beleuchtungslicht (24) zweites Detektionslicht (51) ausgeht, wobei die Detektoranordnung (44, 56) das zweite Detektionslicht (51) detektiert.
Mikroskop (20) nach Anspruch 1, bei dem das zweite Detektionslicht (51) über die Scaneinheit (28) zu der Detektoranordnung (44, 56) gelangt.
Mikroskop (20) nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Detektoranordnung (44, 56) mehrere Detektoreinheiten (44, 56) umfasst, das zweite Detektionslicht (51) ein spektral aufspaltendes optisches Element durchläuft, ein erster Anteil (53) des zweiten Detektionslichts (51), der Detektionslicht eines ersten Wellenlängenbereichs umfasst, mit Hilfe einer ersten der Detektoreinheiten (44) detektiert wird, und bei dem ein zweiter Anteil (55) des zweiten Detektionslichts (51), der Detektionslicht eines zweiten Wellenlängenbereichs umfasst, mit Hilfe einer zweiten der Detektoreinheiten (56) detektiert wird.
Mikroskop (20) nach einem der vorstehenden Ansprüche, mit einer Ausblendvorrichtung (60, 64, 68), die die Beleuchtung der Probe (36) auf ein Steuersignal hin unterbindet oder frei gibt.
Mikroskop (20) nach Anspruch 4, bei dem eine erste Ausblendvorrichtung (64) die Beleuchtung der Probe (36) mit Hilfe des ersten Beleuchtungslichts (24) unterbindet oder frei gibt.
Mikroskop (20) nach Anspruch 4, bei dem eine zweite Ausblendvorrichtung (60) die Beleuchtung der Probe (36) mit Hilfe des zweiten Beleuchtungslichts (46) unterbindet oder frei gibt.
Mikroskop (20) nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das zweite Beleuchtungslicht (46) Licht mit Wellenlängen im ultravioletten oder infraroten Spektralbereich umfasst.
Verfahren zum Betreiben eines Mikroskops, bei dem zum Beleuchten einer Probe (36) Laserlicht als erstes Beleuchtungslicht (24) erzeugt wird, das erste Beleuchtungslicht (24) so abgelenkt wird, dass das erste Beleuchtungslicht (24) die Probe (36) von einer ersten Seite aus optisch abtastet, wodurch von der Probe (36) ausgehendes dem ersten Beleuchtungslicht (24) entgegen gerichtetes erstes Detektionslicht (38) erzeugt wird, das erste Detektionslicht (38) von dem ersten Beleuchtungslicht (24) getrennt wird, eine laterale Ausdehnung des ersten Detektionslichts (38) begrenzt wird, das lateral begrenzte erste Detektionslicht (38) mit Hilfe einer Detektoranordnung (44, 56) detektiert wird, die Probe (36) von einer zweiten Seite aus beleuchtet wird, wodurch dem ersten Beleuchtungslicht (24) entgegen gerichtetes zweites Detektionslicht (51) erzeugt wird, und bei dem das zweite Detektionslicht (51) mit Hilfe der Detektoranordnung (44, 56) detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das zweite Detektionslicht (51) mit Hilfe einer Scaneinheit (28) abgelenkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, bei dem das zweite Detektionslicht (51) mit Hilfe einer Detektionsblende (42, 52, 54) lateral begrenzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, bei dem das zweite Detektionslicht (51) spektral aufgespaltet wird, ein erster Anteil (53) des aufgespalteten zweiten Detektionslichts (51), der Detektionslicht eines ersten Wellenlängenbereichs umfasst, mit Hilfe einer ersten Detektoreinheit (44) der Detektoranordnung detektiert wird, und bei dem ein zweiter Anteil (55) des aufgespalteten zweiten Detektionslichts (51), der Detektionslicht eines zweiten Wellenlängenbereichs umfasst, mit Hilfe einer zweiten Detektoreinheit (56) der Detektoranordnung detektiert wird.