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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abbildung eines Objekts mittels
einer Weitfeldoptik auf einen ortsauflösenden Detektor für optische
Strahlung mit Unterdrückung
von Falschlicht sowie eine entsprechende Vorrichtung.
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Biologische
Proben oder Materialien werden häufig
mikroskopisch untersucht. Insbesondere können entsprechende Objekte
mit Weitfeldoptiken untersucht werden, die das Objekt bzw. eine
Ebene des Objekts auf einen ortsauflösenden Detektor abbilden. Die
Untersuchung kann beispielsweise mit normaler Mikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie,
insbesondere quantitativer Fluoreszenzmikroskopie, erfolgen. Bei
den Objekten kann es sich insbesondere um Biochips, welche auf photolithographischem
Wege oder mittels eines Spotters hergestellt wurden, oder um Materialoberflächen handeln.
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Bei
der Verwendung von Weitfeldoptiken zur Abbildung von heterogen leuchtenden
Flächen
bzw. flächenhaften
Objekten auf einen ortsauflösenden Detektor,
beispielsweise in einer CCD-Kamera, ergibt sich stets das Problem
des Vorhandenseins von "Falschlicht", welches die Abbildung
des Objektes negativ beeinträchtigt.
Unter Falschlicht wird hier jegliches Licht verstanden, das den
Kontrast der detektierten Intensitätsverteilung verringert oder
verfälscht.
Falschlicht entsteht beispielsweise durch Reflexionen und durch
Streulicht an Oberflächen,
in Gläsern,
z.B. aufgrund von Lufteinschlüssen,
durch Eigenfluoreszenz der verwendeten Gläser, an Fassungen oder bei
Fluoreszenzmessungen durch nicht unterdrücktes Anregungslicht. Weiterhin
kann Falschlicht auch aus außerhalb
der Fokusebene liegenden Bereichen des Objektes oder der Probe kommen,
beispielsweise von der Rückseite
eines Objektträgers.
Zum Problem wird das Falschlicht insbesondere dann, wenn die Helligkeitsverteilung
der Probe stark heterogen ist und ein hohes Kontrastverhältnis bei
der Detektion verlangt wird.
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Beispielsweise
kann sich in einem Bild eines Objekt, das eine Vielzahl gleichartig
fluoreszierender Kügelchen
umfaßt,
eine helle Fläche
aus einer entsprechenden Vielzahl gleichartig fluoreszierender Kügelchen
bzw. Kreise mit einem scharf definierten Durchmesser zusammensetzen.
Somit sollte – von Beugungseffekten
abgesehen – im
Idealfall dort, wo sich die Kügelchen
bzw. Kreise befinden, maximale Helligkeit vorhanden sein. In den übrigen Bereichen sollte
vollkommene Dunkelheit herrschen. Tatsächlich ist jedoch auch dort,
wo es dunkel sein sollte, eine gewisse Resthelligkeit vorhanden,
d.h. ein inhomogener Untergrund, dessen Ursache in dem oben genannten
Falschlicht liegt. Wäre
dieser Untergrund homogen über
das Bild verteilt, könnte
er als "offset" betrachtet und in
einfacher Weise von allen Pixelwerten des Detektors subtrahiert
werden. Ein solcher idealer Fall ist jedoch in der Praxis kaum vorzufinden, und
demzufolge ist diese Vorgehensweise nicht generell anwendbar.
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Bei
radiometrischen Messungen, speziell bei Biochip-Anwendungen und quantitativer Fluoreszenzmikroskopie
im Allgemeinen, wird die nutzbare Intensitätsdynamik, welche das Verhältnis von
größtem zu
kleinstem detektierbarem Intensitätswert wiedergibt, durch den
inhomogenen Untergrund stark eingeschränkt, da bei einer unbekannten
Fluorophor-Verteilung
das Nutzlicht nicht vom Falschlicht unterschieden werden kann. Dieses
ist insbesondere dann problematisch, wenn keine oder kaum Referenzflächen zur
Verfügung stehen,
an denen lokal der Untergrund bestimmt werden kann, also z.B. bei hochdichten
Biochips, welche photolithographisch hergestellt wurden.
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Eine
Möglichkeit
zur Vermeidung von Falschlicht liegt in der Verwendung von konfokalen Laserscannern.
Bei einem konfokalen Laserscanner wird stets nur eine kleine Fläche der
Probe von wenigen μm2 beleuchtet und zudem bei der Detektion
nur diese kleine Fläche
betrachtet. Wird dies mit Hilfe einer gut angepaßten Lochblende konsequent
durchgeführt,
so wird Falschlicht von vornherein unterdrückt. Laserscanner weisen jedoch
gegenüber
Mikroskopen mit Weitfeldoptik eine Reihe von Nachteilen auf. Beispielsweise
kann bei Fluoreszenzmikroskopie Anregungssättigung und ein starkes Ausbleichen
von Fluorophoren auf Grund der hohen Strahlungsintensität im Fokus
auftreten. Ferner gibt es deutliche Einschränkungen bei der Wahl der Wellenlänge. Viele
bewegliche Komponenten, ein hoher Justieraufwand sowie eine geringe
Quanteneffizienz des Detektors, in der Regel ein Photomultiplier,
sind weitere Nachteile.
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In
der
DE 199 30 816
A1 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Tiefenselektion
von Mikroskopbildern beschrieben, bei denen ein eindimensional periodisches
Gitter, z.B. ein Streifengitter, zur Beleuchtung verwendet wird.
Dabei werden mindestens n (n > 2)
CCD- Kameraaufnahmen gemacht, wobei die Struktur der Beleuchtung
um jeweils 1/n der Gitterkonstanten verschoben wird. Aus den mindestens drei
Aufnahmen wird anschließend
ein konfokaler Schnitt der Probe berechnet. Dieses Verfahren ist
anfällig
für Artefakte,
wenn das Gitter keine sinusförmige
Beleuchtungsintensität
auf der Probe erzeugt.
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Die
WO 98/45745 A1 (
DE
698 02 514 T2 ) beschreibt ein Abbildungssystem und -verfahren
für Mikroskope,
bei denen eine strukturierte Beleuchtung mittels Überlagerung
zweier kohärenter
Lichtstrahlen vorgesehen ist. Das Verfahren verfolgt ebenso wie das
oben beschriebene Verfahren gemäß der
DE 199 30 816 A1 hauptsächlich das
Ziel, optische Schnitte in verschiedenen Objektebenen analog einem
Laser-Scanning-Mikroskop
zu generieren.
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Beide
Verfahren verfolgen das Ziel, eine Tiefenauflösung von dicken Proben zu erhalten.
Sie dienen dazu, mit einer Weitfeldoptik konfokale Schnitte einer
im Vergleich zur Tiefenschärfe
dicken Probe oder eines Objektes zu erhalten. In beiden Fällen ist der
Rechenaufwand relativ groß,
weil trigonometrische Gleichungen gelöst werden müssen.
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In
der unveröffentlichten
deutschen Patentanmeldung
P
103 30 716.8 ist eine Vorrichtung zur Durchführung eines
Verfahrens zur Eliminierung von Falschlicht bei der Abbildung von
heterogenen, leuchtenden oder beleuchteten flächenhaften Objekten beschrieben.
Diese umfaßt
eine Strahlungsquelle mit nachgeordneter, die Strahlung homogenisierender
Beleuchtungsoptik zur homogenen Ausleuchtung einer nachgeordneten
Feldblendenebene, in welcher eine strukturierte Feldblende zur Erzeugung
einer dem Objekt oder der Probe überlagerten
Beleuchtungsstruktur angeordnet ist. Diese Beleuchtungsstruktur
wird durch erste optische Mittel auf die Probe abgebildet, wobei
diese ersten optischen Mittel einen Beleuchtungstubus, gegebenenfalls
einen Farbteiler, und ein Objektiv umfassen können. Es sind ferner zweite
optische Mittel zur Abbildung der Probe zusammen mit der überlagerten
Beleuchtungsstruktur auf einen ortsauflösenden Detektor, insbesondere
für optische
Strahlung, vorgesehen. Die Anordnung enthält ferner Einstellmittel, mit
denen die Beleuchtungsstruktur in der Objektebene auf dem Objekt
oder der Probe definiert positionierbar ist. Der Detektor ist mit einer
Auswerteeinrichtung zur Ermittlung und Eliminierung des Falschlichtes
verbunden. Es wird eine strukturierte Hellfeldbeleuchtung mit wenigstens
zwei verschiedenen Beleuchtungsmustern verwendet, bei der sich dunkle
Bereiche nicht überschneiden.
Aus entsprechenden Bildern kann dann ein Dunkelbild und ein Hellbild
ermittelt werden. Durch Subtraktion des Dunkelbildes von dem Hellbild
kann ein resultierendes Bild erhalten werden.
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Die
bei dieser Vorrichtung vorgesehene strukturierte Hellfeldbeleuchtung,
bei welcher die Objektbeleuchtung und die Abbildung des Objektes
zusammen mit der aufbelichteten Feldblendenstruktur durch ein einziges
Objektiv erfolgen, kann das Anregungslicht im Objektiv das Auftreten
von Falschlicht, insbesondere durch Eigenfluoreszenz der verwendeten
Gläser,
hervorrufen. Weiterhin wird die Rückseite eines Objekts, z.B.
eines Biochips, mit nahezu der gleichen Anregungsintensität bestrahlt
wie die Fokusebene. Daher kann auch die durch die Kontamination
der Rückseite
bedingte Fluoreszenzintensität
entsprechend hoch sein und zu Meßfehlern Anlaß geben.
Es wurde daher vorgeschlagen, bei einem zweiten Verfahren zur Vermeidung
dieser Nachteile statt der Hellfeldbeleuchtung eine strukturierte
Dunkelfeldbeleuchtung zu verwenden.
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Bei
beiden Verfahren ist es jedoch notwendig, eine Interpolation zwischen
nicht beleuchteten Bereichen durchzuführen, um ein vollständiges Dunkel-
bzw. Falschlichtbild zu erhalten.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, bei einem
Verfahren zur Abbildung eines Objekts mittels einer Weitfeldoptik,
bei dem die gesuchte Information innerhalb der Schärfentiefe
des zur Abbildung verwendeten Objektivs liegt, den Einfluß von Falschlicht
auf Messungen und Beobachtungen zu unterdrücken und eine entsprechende
Abbildungsvorrichtung zu schaffen.
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Die
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein Verfahren zur Abbildung eines Objekts mittels einer Weitfeldoptik
auf einen ortsauflösenden Detektor
für optische
Strahlung mit Unterdrückung von
Falschlicht, bei dem das Objekt in wenigstens einer Objektebene
mit wenigstens zwei Beleuchtungsmustern beleuchtet wird und für jedes
der Beleuchtungsmuster entsprechende Bilder erfaßt werden, wobei die Beleuchtungsmuster
in der Objektebene jeweils Dunkelbereiche, die bei Überlagerung
der Beleuchtungsmuster in der Objektebene das Objekt vollständig überdecken,
und Hellbereiche aufweisen, bei dem aus den erfaßten Bildern ein Dunkelbild
und ein Hellbild des Objekts erzeugt wird und von dem Hellbild das
Dunkelbild subtrahiert wird.
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Die
Aufgabe wird weiterhin gelöst
durch eine Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts,
in dem Falschlichteinflüsse
unterdrückt
sind, mit einer Beleuchtungseinrichtung zur Beleuchtung des Objekts
wenigstens in einer Objektebene, einer Einrichtung zur Erzeugung
wenigstens zweier vorgegebener Beleuchtungsmuster mit einem im Strahlengang
nach der Beleuchtungseinrichtung angeordneten, als strukturierte
Blende wirkenden Element, wobei die Beleuchtungsmuster in der Objektebene
jeweils Dunkelbereiche, die bei Überlagerung
das Objekt vollständig überdecken,
und Hellbereiche aufweisen, einer Abbildungsoptik zur Abbildung der
Objektebene auf eine Bildebene, einem in der Bildebene angeordneten
ortsauflösenden
Detektor zur Detektion der von dem Objekt ausgehenden optischen Strahlung,
und einer Auswerteeinrichtung zur Auswertung von Detektionssignalen
des Detektors, mittels derer aus bei der Bestrahlung mit den Beleuchtungsmustern
jeweils erfaßten
Bildern ein Dunkelbild ermittelbar ist, und mittels derer das Dunkelbild
von einem Hellbild des Objekts subtrahierbar ist.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren,
das mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung
durchführbar
ist, dient zur Abbildung von Objekten, vorzugsweise flächenhaften
Objekten, insbesondere heterogenen, leuchtenden oder beleuchteten
Objekten. Insbesondere kann es sich bei diesem Verfahren um ein
Mikroskopieverfahren handeln.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird das Objekt, unter dem im Rahmen der Erfindung je nach Größe des abbildbaren
Bereichs in der Objektebene eine ganze Probe oder ein ganzer Gegenstand
oder nur ein zu untersuchender bzw. abbildbarer Teilbereich einer
ganzen Probe oder eines ganzen Gegenstands verstanden wird, mit
wenigstens zwei strukturierten Beleuchtungsmustern beleuchtet. Hierzu
sind bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung die
Beleuchtungseinrichtung zur Abgabe von Beleuchtungslicht, unter
dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung neben sichtbarem auch infrarotes
oder ultraviolettes Licht verstanden wird, und die Einrichtung zur
Erzeugung wenigstens zweier vorgegebener Beleuchtungsmuster zur
insbesondere auch strukturierten Beleuchtung des Objekts wenigstens
in der abzubildenden Objektebene vorgesehen. Die Einrichtung zur
Erzeugung der Beleuchtungsmuster weist hierzu insbesondere ein als
Blende wirkendes Element auf, das vorzugsweise als Feldblende wirkt.
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Das
Element verfügt über lichtdurchlässige bzw.
transparente und lichtundurchlässige
bzw. opake Bereiche, denen in den Beleuchtungsmustern jeweils Hell-
und Dunkelbereiche entsprechen, die benachbart sind. Dementsprechend
treten in bzw. auf dem Objekt bzw. dem untersuchten Bereich mit
Beleuchtungslicht beleuchtete und unbeleuchtete Bereiche auf.
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Bei
dem Verfahren wird das Objekt nacheinander mit jeweils nur einem
der Beleuchtungsmuster beleuchtet. Die bei dem Verfahren verwendeten
Beleuchtungsmuster sind so gewählt,
daß deren
Dunkelbereiche bei einer vorgestellten bzw. fiktiven Überlagerung
der Beleuchtungsmuster das Objekt vollständig überdecken.
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Das
Objekt mit dem jeweiligen Beleuchtungsmuster wird dann mittels der
Abbildungsoptik, die insbesondere ein Objektiv umfassen kann, auf den
ortsauflösenden
Detektor abgebildet, der zur Erfassung der Bilder des Objekts dient.
Als ortsauflösender
Detektor kann vorzugsweise eine CCD- oder CMOS-Matrix eingesetzt werden.
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Die
Signale des ortsauflösenden
Detektors werden von der Auswerteeinrichtung, beispielsweise einer
Datenverarbeitungseinrichtung mit einer Videoschnittstelle und einem
Prozessor, zu Bildern verarbeitet.
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In
jedem erfaßten
Bild werden von den beleuchteten Bereichen des Objekts, die mit
Hellbereichen des jeweiligen Beleuchtungsmusters beleuchtet sind,
soweit vorhanden, dem Falschlicht entsprechende Lichtanteile in
die Bereiche des Bildes des Objekts gelenkt, die den Dunkelbereichen
des jeweiligen Beleuchtungsmusters auf bzw. in dem Objekt, d.h.
unbeleuchteten Bereichen des Objekts, entsprechen. In die sen Bereichen
des Bildes werden die Anteile dann als Falschlicht detektiert. Da
die Dunkelbereiche der Beleuchtungsmuster das Objekt bei Überlagerung
der Beleuchtungsmuster vollständig überdecken,
kann aus den Dunkelbereichen der Bilder ohne Interpolation ein Dunkelbild
bzw. Falschlichtbild des gesamten Objekts erhalten werden, das alle
zu eliminierenden Falschlichtanteile enthält. Dieses Dunkel- bzw. Falschlichtbild
wird von dem Hellbild des Objekts, das basierend auf Detektionssignalen des
Detektors erzeugt ist, subtrahiert, wodurch ein resultierendes Bild
entsteht, in dem das Falschlicht unterdrückt ist.
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Hierzu
ist keine Interpolation zwischen den Bildern der unbeleuchteten
Bereiche bzw. der Dunkelbereiche in der Objektebene notwendig.
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Darüber hinaus
zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren
durch seine Einfachheit aus, da neben der Bildung der Dunkel- und
gegebenenfalls der Hellbilder nur eine Subtraktion von Intensitätswerten
notwendig ist. Diese Schritte sind mit Computern, aber auch einfacheren
Prozessoren oder sogar nicht programmierten Schaltungen wesentlich
schneller durchführbar
als trigonometrische Operationen.
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Zur
Erzeugung des Dunkelbildes werden vorzugsweise Bereiche der erfaßten Bilder
zusammengefügt,
die Abbilder der Dunkelbereiche des Objekts bei Beleuchtung mit
den Beleuchtungsmustern sind. Die Dunkelbereiche des Objekts sind
dabei diejenigen Bereiche des Objekts, die bei Beleuchtung mit einem
jeweiligen Beleuchtungsmuster in den Dunkelbereichen des Beleuchtungsmusters
liegen. Unter einem Zusammenfügen
wird dabei auch verstanden, daß sich
die Bilder der Dunkelbereiche des Objekts teilweise überlappen
können.
Das Zusammenfügen
der Bereiche der erfaßten
Bilder kann auch als Bildmontage aufgefaßt werden. Die Bereiche werden
beim Zusammenfügen
entsprechend der Anordnung der entsprechenden Dunkelbereiche auf dem
Objekt relativ zueinander angeordnet. Das Zusammenfügen kann
beispielsweise durch Addition der Bilder erfolgen. Auf diese Weise
kann das Dunkelbild sehr einfach erhalten werden. Überlappen sich
die Dunkelbereiche der Beleuchtungsmuster, kann vorzugsweise über die
redundanten Teilbereiche der Bilder der Dunkelbereiche aus verschiedenen
Bildern gemittelt werden. Beispielsweise kann die Summe der Abbilder
der jeweiligen Dunkelbereiche durch entsprechende Renormierung in
den Überlappungsbereichen
korrigiert werden.
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Besonders
bevorzugt wird das Dunkelbild aus Teilbereichen der erfaßten Bilder
zusammengefügt,
die Abbilder der Dunkelbereiche des Objekts bei Beleuchtung mit
den Beleuchtungsmustern sind und im wesentlichen ohne Überlappung
aneinander angrenzen. Dazu sind die Beleuchtungsmuster auf dem Objekt
vorzugsweise so ausgebildet und bei Überlagerung zueinander ausgerichtet,
daß die
Dunkelbereiche bei Überlagerung
der Beleuchtungsmuster im wesentlichen überlappungsfrei aneinandergrenzen. Auf
diese Weise kann der Aufwand für
ein wegen einer Überlappung
der Teilbereiche wünschenswerte Korrektur
vermieden oder wenigstens stark reduziert werden.
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Weiter
wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
zur Reduktion von Rauscheffekten das Dunkelbild vorzugsweise rechnerisch
geglättet.
Diese Möglichkeit
stellt einen wesentlichen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
gegenüber
anderen Verfahren unter Verwendung einer strukturierten Beleuchtung
dar, bei denen kein vollständiges
Dunkelbild während
der Datenauswertung generiert wird bzw. werden kann.
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Das
Hellbild kann auf unterschiedliche Art und Weise erzeugt werden.
Bei einer Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird bevorzugt das Hellbild durch Erfassung eines Bildes bei einer
unstrukturierten Beleuchtung erzeugt. Dieses Vorgehen erlaubt eine
besonders schnelle Verarbeitung der erfaßten Bilder, da das Hellbild
nicht erst aus mehreren Teilen generiert zu werden braucht. Darüber hinaus
bestehen bei der Wahl der Beleuchtungsmuster größere Freiheiten, da die Hellbereiche
der Beleuchtungsmuster bei Überlagerung
der Beleuchtungsmuster in der Objektebene das Objekt nicht zu überdecken
brauchen.
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Um
nur eine möglichst
geringe Anzahl von Bildern erfassen zu müssen, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
bevorzugt das Hellbild aus den bei Beleuchtung mit den Beleuchtungsmustern erfaßten Bildern
erzeugt, wobei die Beleuchtungsmuster Hellbereiche aufweisen, die
bei Überlagerung der
Beleuchtungsmuster in der Objektebene das Objekt vollständig überdecken.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ist dazu bevorzugt die Einrichtung zur Erzeugung wenigstens zweier
vorgegebener Beleuchtungsmuster zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern
mit Hellbereichen ausgebildet, die bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster
in der Objektebene das Objekt vollständig überdecken, und bei der das
Hellbild mittels der Auswerteeinrichtung aus den bei Beleuchtung
mit den Beleuchtungsmustern erfaßten Bildern erzeugbar ist.
Wie bereits im Zusammenhang mit den Dunkelbereichen erwähnt, überdecken
die Hellbereiche das Objekt bei einer vorgestellten Überlagerung
der Beleuchtungsmuster, tatsächlich
wird das Objekt nacheinander mit den verschiedenen Beleuch tungsmustern
bestrahlt. Besonders bevorzugt werden zur Erzeugung des Hellbildes
Bereiche der erfaßten
Bilder zusammengefügt,
die Abbilder der Hellbereiche des Objekts bei Beleuchtung mit den
Beleuchtungsmustern sind. Wie schon bei der Bildung des Dunkelbildes
ausgeführt,
kann in dem Fall, in dem sich die Hellbereiche der Beleuchtungsmuster
auf dem Objekt bzw. in der Objektebene überlappen, über die redundanten Teilbereiche
der Bilder der Hellbereiche aus verschiedenen Bildern gemittelt
werden. Beispielsweise kann bei einer Summierung der Abbilder der
Hellbereiche eine Renormierung in den Überlappungsbereichen durchgeführt werden,
um Effekte einer doppelten Erfassung in diesen Bereichen zu korrigieren.
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Besonders
bevorzugt wird das Hellbild aus Teilbereichen der erfaßten Bilder
zusammengefügt, die
Abbilder der Hellbereiche des Objekts bei Beleuchtung mit den Beleuchtungsmustern
sind und im wesentlichen ohne Überlappung
aneinander angrenzen. Dazu sind die Beleuchtungsmuster auf dem Objekt
vorzugsweise so ausgebildet und bei Überlagerung zueinander ausgerichtet,
daß die
Dunkelbereiche bei Überlagerung
der Beleuchtungsmuster im wesentlichen überlappungsfrei aneinandergrenzen. Auf
diese Weise kann der Aufwand für
eine wegen einer Überlappung
der Teilbereiche wünschenswerte Korrektur
vermieden oder wenigstens stark reduziert werden.
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Besonders
bevorzugt kann das Hellbild durch additive Überlagerung aller Bilder erzeugt
werden, die bei Beleuchtung des Objekts mit den Beleuchtungsmustern
erfaßt
wurden. Vorzugsweise wird dann noch eine Normierung mit der additiven Beleuchtungsintensität vorgenommen.
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Die
Beleuchtungsmuster können
prinzipiell beliebig gewählt
werden, sofern die Dunkel- und Hellbereiche die zuvor genannten
Eigenschaften aufweisen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren jedoch sind bevorzugt
die Beleuchtungsmuster durch ein Grundmuster gegeben, das relativ
zu dem Objekt jeweils unterschiedlich versetzt ist. Die Beleuchtungsmuster
besitzen also die gleiche Struktur, sind aber in der Objektebene
gegeneinander versetzt. Solche Beleuchtungsmuster sind einfach zu
erzeugen. Darüber hinaus
gestaltet sich die Auswertung der mit den Beleuchtungsmustern jeweils
erzeugten Bilder besonders einfach.
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Der
Versatz der Beleuchtungsmuster relativ zu dem Objekt kann auf verschiedene
Art und Weise erzielt werden.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird das Objekt gegenüber
dem Beleuchtungsmuster verschoben. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ist dazu ein Antrieb, mit dem das Objekt oder ein Objektträger bewegbar
ist, von der Auswerteeinrichtung so steuerbar, daß auf dem
durch Bewegung versetzten Objekt ein von dem als strukturierte Blende
wirkenden Element erzeugtes Grundmuster eines der Beleuchtungsmuster
bildet, und daß mittels
der Auswerteeinrichtung Bilder nach jeder Lageänderung des Objekts automatisch
erfaßbar
sind. Als Antriebe können
vorzugsweise Piezoaktoren oder Exzenterantriebe zum Einsatz kommen,
die eine sehr genaue Positionierung erlauben. Der Antrieb kann gegebenenfalls auch
zur ohnehin notwendigen Positionierung des Objekts relativ zu der
Optik genutzt werden. Vorzugsweise kann ein ohnehin vorhandener
motorisch bewegbarer Mikroskoptisch verwendet werden. Die Bewegung
durch den Antrieb kann dabei, je nach verwendeten Beleuchtungsmustern,
in ein oder zwei Richtungen entlang der Ob jektebene möglich sein. Die
Auswerteeinrichtung kann insbesondere dazu ausgebildet sein, eine
Folge von Beleuchtungsmustern auf bzw. in dem Objekt durch Ansteuerung
des Antriebs zu erzeugen, wobei nach Einstellen jeweils eines Beleuchtungsmusters
ein Bild erfaßt
wird. Damit wird für
den Benutzer der Vorrichtung die Bedienung wesentlich vereinfacht.
Darüber
hinaus kann durch entsprechende Programmierung der Auswerteeinrichtung
die durch das Verfahren notwendige Abhängigkeit zwischen der Art der
Beleuchtungsmuster und notwenigen Verschiebungen automatisch berücksichtigt
werden.
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Um
eine Bewegung des Objekts relativ zu dem Detektor zu vermeiden,
kann zur vorbeschriebenen Variante alternativ bevorzugt das Grundmuster mittels
einer mechanischen Vorrichtung verschoben werden. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ist bevorzugt das als strukturierte Blende wirkende Element eine
Feldblende. Ein Antrieb, mit dem die Feldblende oder ein Teil der
Feldblende bewegbar ist, ist von der Auswerteeinrichtung so steuerbar,
daß die Beleuchtungsmuster
auf das Objekt gestrahlt werden. Nach jeder Änderung des Beleuchtungsmusters werden
mittels der Auswerteeinrichtung Bilder automatisch erfaßt. Unter
Feldblende wird hierbei insbesondere eine Blende verstanden, die
zur Bildung der strukturierten Beleuchtung starre, nichttransparente bzw.
opake Elemente aufweist.
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Alternativ
zur Bewegung der Beleuchtungsmuster kann vorgesehen sein, daß das als
strukturierte Blende wirkende Element eine Feldblende ist und zur
Erzeugung der mindestens zwei Beleuchtungsstrukturen hinter der
Feldblende ein bewegliches, lichtablenkendes Element angeordnet
ist. Die Feldblende kann dabei fest positioniert sein. Als lichtab lenkendes
Element kann insbesondere eine spiegelnde Fläche oder eine transparente
planparallele Platte verwendet werden, die je nach verwendeten Beleuchtungsmustern
um eine Achse oder zwei orthogonale Achsen kippbar ist. Als Antriebe
können vorzugsweise
piezoelektrische Antriebe oder Exzenterantriebe verwendet werden.
Um die Einstellung der Beleuchtungsmuster und die Erfassung der
entsprechenden Bilder zu vereinfachen, ist ein Antrieb, mit dem
das lichtablenkende Element bewegbar ist, von der Auswerteeinrichtung
so steuerbar, daß die Beleuchtungsmuster
auf das Objekt gestrahlt werden. Nach jeder Änderung des Beleuchtungsmusters mittels
der Auswerteeinrichtung werden Bilder automatisch erfaßt. Diese
Weiterbildung hat die zuvor im Zusammenhang mit der automatischen
Ansteuerung genannten Vorteile.
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In
beiden Ausführungsformen
weist die Feldblende transparente und opake Bereiche auf, die so ausgebildet
sind, daß in
der Objektebene die gewünschten
Beleuchtungsmuster erhalten werden.
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Soll
die Verwendung von mechanischen Mitteln zur Verschiebung des Grundmusters
vermieden werden, kann eine elektrisch steuerbare Modulationseinheit
für Licht
vorgesehen sein, die so angesteuert wird, daß die Beleuchtungsmuster erzeugt werden.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann
zum Beispiel das als Blende wirkende Element als eine solche elektronisch
ansteuerbare Modulationseinheit ausgebildet sein. Als elektrische
steuerbare Modulationseinheiten für Licht können beispielsweise sogenannte
DMDs ("digital mirror
devices") oder auch
elektronisch ansteuerbare Durchlicht- oder Reflexions-Flüssigkristallfelder
bzw. -LCDs zum Einsatz kommen. Wie zuvor ist vorzugsweise die Auswerteein richtung
so steuerbar, daß die
Beleuchtungsmuster auf den zu untersuchenden Bereich gestrahlt werden
und nach jeder Änderung
des Beleuchtungsmusters mittels der Auswerteeinrichtung Bilder automatisch
erfaßbar
sind. Diese Ausführungsform
der Erfindung erlaubt es nicht nur, auf mechanische Antriebe zu
verzichten, sondern gestattet auch einen einfachen Wechsel zwischen
verschiedenen Beleuchtungsmustertypen. Darüber hinaus ist es auch einfach
möglich,
das Objekt unstrukturiert zu beleuchten, sodaß ein Hellbild einfach direkt
erfaßbar
ist.
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Die
Beleuchtungsmuster selbst können
unterschiedliche Strukturen aufweisen.
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Beispielsweise
können
Beleuchtungsmuster mit radial verlaufenden Hell- und Dunkelbereichen verwendet
werden, die jeweils durch Drehung eines entsprechenden Grundmusters
um einen Mittelpunkt um einen vorgegebenen Winkel erzeugt werden.
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Bei
Verwendung mechanisch verstellbarer, als Blende wirkender Elemente
sollten bevorzugt Beleuchtungsmuster mit sich periodisch abwechselnden
streifenförmigen
Hell- und Dunkelbereichen verwendet werden, die quer zur Richtung
der Streifen versetzt sind. Die Streifen erstrecken sich dabei vorzugsweise über den
ganzen Untersuchungsbereich bzw. das ganze Objekt. Um eine Überdeckung
des Objekts mit den Dunkelfeldern erreichen zu können, sind vorzugsweise die
hellen Streifen schmaler als die dunklen Streifen der Beleuchtungsmuster.
Je nach Anzahl n der verwendeten Beleuchtungsmuster und der entsprechenden
Anzahl zu erfassender Bilder wird das Streifenmuster vorzugsweise
folgendermaßen
gewählt.
Bezeichnet p die Periode des Streifenmusters, wird die Breite h
der hellen Streifen kleiner als p/(n – 1) und größer als p/n, aber möglichst nahe
bei p/n, gewählt.
h soll dabei vorzugsweise so groß sein, daß Beugungseffekte bei der Zusammensetzung
des Hellbildes nicht stören.
Der Versatz v der Beleuchtungsmuster bzw. eines diesen zugrunde
liegenden Grundmusters ist so gewählt, daß die Dunkelbereiche der Beleuchtungsmuster
bei Überlagerung
das gesamte Objekt abdecken, vorzugsweise zu etwa p/n. Zur Vermeidung
von Beugungseffekten im Dunkelbild werden die dunklen Streifen so
breit wie möglich
gewählt,
wobei deren Breite d aber größer als
p∙(n – 2)/(n – 1) und
kleiner als p∙(n – 1)/n ist. Je
mehr Beleuchtungsmuster genutzt werden, desto weniger Anregungslicht
wird bei der Erfassung eines entsprechenden Bildes verwendet. Hierdurch
kann das Intensitätsrauschen
im Untergrund des resultierenden Bildes nahezu beliebig gesenkt
werden. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung
mit einer Feldblende weist die Feldblende bevorzugt eine streifenförmige Struktur
aus einander abwechselnden transparenten und opaken Bereichen auf.
Die Dimensionen der transparenten und opaken Bereiche sind dabei
so gewählt,
daß Beleuchtungsmuster
mit den zuvor genannten Parametern erzeugt werden können. Bei
Verwendung einer elektrisch ansteuerbaren Modulationseinheit genügt zur Erzeugung
dieser Beleuchtungsmuster eine entsprechende Ausbildung bzw. Programmierung
der Auswerteeinrichtung.
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Alternativ
können,
daß Beleuchtungsmuster mit
jeweils einer in zwei Richtungen periodischen Anordnung von Hell-
und Dunkelbereichen verwendet werden, wobei die Anordnungen in wenigstens
einer der Richtungen gegeneinander versetzt sind. Bei Verwendung
einer mechanisch verschiebbaren Feldblende weist die Feldblende
bevorzugt eine in zwei Richtungen periodische Anordnung von transparenten
und opaken Be reichen auf, wobei die opaken Bereiche aneinander angrenzen.
Bei Verwendung einer elektrisch ansteuerbaren Modulationseinheit
genügt zur
Erzeugung dieser Beleuchtungsmuster eine entsprechende Ausbildung
bzw. Programmierung der Auswerteeinrichtung. Die Richtungen können zueinander
orthogonal sein, jedoch braucht dies nicht unbedingt der Fall zu
sein. Bei dieser Ausführungsform wird
die Auszeichnung einer Richtung durch Verwendung von Streifen vermieden,
sodaß die
Unterdrückung
von Falschlicht weniger richtungsabhängig wird. Darüber hinaus
verschwindet die Modulation durch die strukturierte Beleuchtung
schneller außerhalb
der Fokusebene bzw. Objektebene, sodaß Licht außerhalb der Schärfentiefe
der Abbildungsoptik besser unterdrückt wird.
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Werden
periodische Beleuchtungsmuster verwendet, ist es möglich, daß in dem
von Falschlicht befreiten Bild noch durch die Periodizität der Beleuchtungsmuster
bedingte Beleuchtungsinhomogenitäten
vorhanden sind. Es ist daher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
bevorzugt, daß das
durch Subtraktion des Dunkelbildes von dem Hellbild entstandene
Bild niederfrequent gefiltert wird. Unter niederfrequent wird hierbei
verstanden, daß die
Filterung bei Frequenzen kleiner als die durch die Periodizität der Beleuchtungsmuster
gegebene Frequenz bzw. gegebenen Frequenzen erfolgt.
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Soll
ein Objekt mit einer Dunkelfeldbeleuchtung untersucht werden, was
insbesondere bei Fluoreszenzmikroskopie wünschenswert sein kann, ist die
Beleuchtungsoptik zur Abbildung des als Blende wirkenden Elements
auf das Objekt für
eine Dunkelfeldbeleuchtung ausgebildet.
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Bei
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
sollte dann die Beleuchtungsoptik als ein Beleuchtungsobjektiv mit
kleiner Apertur ausgebildet sein, wobei die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs
und die durch die Abbildungsoptik definierte optische Achse einen
Winkel α einschließen. Diese
Ausbildung ergibt einen großen
Schärfentiefebereich.
Der Winkel α soll
vorzugsweise größer als
50° sein,
um die Strahlungsintensität
auf der Unterseite von transparenten Objekten bzw. Proben zu minimieren.
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Vorzugsweise
ist in diesem Fall die Beleuchtungsoptik eine Scheimpflugoptik.
Dabei kann eine größere numerische
Apertur für
die Dunkelfeldbeleuchtung vorgesehen werden, da die Fokusebene der
Beleuchtung an die Oberseite der Probe angepaßt werden kann.
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Ferner
kann die Abbildungsoptik zur Abbildung des Objekts auf den Detektor
eine Scheimpflugoptik umfassen. In diesem Fall steht die optische Achse
des Beleuchtungsobjektivs senkrecht zur Oberfläche der Probe, während die
optische Achse des Abbildungsobjektivs unter einem Winkel α zur optischen
Achse des Beleuchtungsobjektivs steht.
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Sowohl
das Verfahren als auch die Vorrichtung, mit der dieses Verfahren
durchführbar
ist, können
vorteilhaft zum Auslesen von Biochips, in der Fluoreszenzmikroskopie
und bei photometrischen Messungen angewendet werden.
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Die
Erfindung wird nachfolgend beispielhaft anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es
zeigen:
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1 eine
schematische Darstellung eines optischen Aufbaus einer Vorrichtung
zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer ersten bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung,
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2 eine
schematische teilweise Darstellung einer Einrichtung zur Erzeugung
von Beleuchtungsmustern mit einer Feldblende mit Exzenterantrieb
in der Vorrichtung aus 1,
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3a,b
drei mit der Feldblende der Vorrichtung aus 1 erhältliche
Beleuchtungsmuster und entsprechende Verläufe von Signalen eines Detektors
der Vorrichtung aus 1 bei Beleuchtung eines homogen
fluoreszierenden Objekts mit diesen Beleuchtungsmustern,
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4 eine
schematische teilweise Darstellung einer Einrichtung zur Erzeugung
von Beleuchtungsmustern bei einer Vorrichtung zur Erfassung eines
Bildes eines Objekts nach einer vierten bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung,
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5 ein
in zwei Richtungen periodisches Beleuchtungsmuster bei der Vorrichtung
bzw. einem Verfahren nach der vierten bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung,
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6 eine
schematische teilweise Darstellung einer Einrichtung zur Erzeugung
von Beleuchtungsmustern bei einer Vorrichtung zur Erfassung eines
Bildes eines Objekts nach einer fünften bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung,
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7 eine
schematische Darstellung eines optischen Aufbaus einer Vorrichtung
zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer sechsten bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung,
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8 ein
in zwei Richtungen periodisches Beleuchtungsmuster bei der Vorrichtung
bzw. einem Verfahren nach der sechsten bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung, und
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9 eine
schematische Darstellung eines optischen Aufbaus einer Vorrichtung
zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer siebten bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung.
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Eine
in 1 stark vereinfacht und schematisch gezeigte Vorrichtung
zur Erfassung eines Bildes eines heterogen leuchtenden oder beleuchteten
flächenhaften
Objekts, in dem Falschlichteinflüsse
unterdrückt
sind, umfaßt
nach einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine
Beleuchtungseinrichtung 1, eine dieser nachgeordnete Einrichtung 2 zur
Erzeugung von Beleuchtungsmustern in einer Objektebene 3 eines
auf einem Träger
bzw. Tisch angeordneten Objekts 4, eine Abbildungsoptik 5 zur
Abbildung des Objekts 4 auf eine Bildebene B und einen in
der Bildebene angeordneten ortsauflösenden Detektor 6.
Eine Auswerteeinrichtung 7 ist über eine Detektorverbindung
mit dem Detektor 6 und über
eine Steuerleitung mit der Einrichtung 2 verbunden.
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Die
Beleuchtungseinrichtung 1 verfügt über eine Licht- oder Strahlungsquelle 8,
der ein Filter 9, ein Verschluß 10 und, nur optional,
den Strahlengang homogenisierende optische Elemente 11,
wie z.B. ein Lichtleitstab oder ein innen verspiegelter Glashohlstab,
und erste Beleuchtungsoptiken 12 und 13 zur homogenen
Ausleuchtung eines Bereichs einer Feldblendenebene 14 nachgeordnet
sind.
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Die
Einrichtung 2 besitzt ein im Strahlengang der Beleuchtungseinrichtung 1 angeordnetes,
durch diese homogen ausleuchtbares, als strukturierte Blende wirkendes,
im Strahlengang in zwei zueinander orthogonalen Richtungen in der
Feldblendenebene 14 definiert verschiebbar angeordnetes
Element, im Beispiel eine strukturierte Feldblende 15,
und einen in 1 nur schematisch gezeigten
Antrieb 16, mit dem die Feldblende 15 verschiebbar
ist.
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Der
mechanische Aufbau der Einrichtung 2 zur Erzeugung von
Beleuchtungsmustern ist in 2 genauer
gezeigt. Exzenterantriebe 17 und 18 sind mit der
Feldblende 15 so gekoppelt, daß dieses in der Feldblendenebene 14 in
zwei zueinander orthogonalen Richtungen lateral verschoben und auf
diese Weise definiert positioniert werden kann.
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Die
Feldblende 15 besitzt periodisch angeordnete, streifenförmige, opake
Bereiche, die durch transparente Bereiche voneinander getrennt sind,
so daß in
der Objektebene 3 entsprechende streifenförmige Beleuchtungsmuster
erzeugbar sind, wie weiter unten noch näher erläutert wird.
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Wie
weiter in 1 gezeigt, wird durch eine dem
Element 15 nachgeordnete zweite Beleuchtungsoptik 19,
die einen Beleuchtungstubus 20, einen Strahlenteiler 21 und
ein Objektiv 22 umfaßt,
die Feldblende 15 auf das zu untersuchende oder abzubildende
Objekt 4 bzw. die Objektebene 3 abgebildet, so
daß auf
das Objekt 4 ein der Stellung der Feldblende 15 in
der Feldblendenebene 14 und dessen Struktur entsprechendes
Beleuchtungsmuster gestrahlt wird.
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Die
Abbildungsoptik 5, die eine Weitfeldoptik darstellt, umfaßt im Beispiel
das Objektiv 22, den Strahlenteiler 21 sowie einen
Abbildungstubus 23, und bildet das mit der jeweiligen Beleuchtungsstruktur
beleuchtete Objekt 4 kontrastreich auf die Bildebene B
bzw. den ortsauflösenden
Detektor 6 für
optische Strahlung ab.
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Der
Strahlenteiler 21 ist im Beispiel als Farbteiler ausgebildet
und besitzt Filter 24 und 25, mit denen unerwünschte oder
störende
spektrale Strahlungsanteile ausgefiltert werden können. Der
Strahlenteiler 21 und die Filter 24 und 25 sind
Bestandteile einer Vorrichtung für
Auflichtfluoreszenz, wobei es vorteilhaft ist, wenn die Filter 25 und 26 um
einige Winkelgrade schräg
gestellt sind, um so störende
Reflexe aus dem Strahlengang zu entfernen.
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Der
Detektor 6 umfaßt
eine Matrix aus CCD- oder CMOS-Elementen
und ist im Beispiel Bestandteil einer CCD- Kamera.
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Der
Detektor 6 ist mit der Auswerteeinrichtung 7 verbunden,
welche Signale des Detektors 6 erfaßt, die Ermittlung bzw. Eliminierung
des Falschlichtes bei der Abbildung des Objekts 4 durchführt und
ein resultierendes Bild erzeugt. Die Auswerteeinrichtung 7 verfügt hierzu über einen
Prozessor, einen Speicher und entsprechende Schnittstellen. Die
resultierenden Bilder können
gespeichert und/oder über
eine in 1 nicht gezeigte Anzeigevorrichtung
oder einen Drucker ausgegeben werden.
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Die
Auswerteeinrichtung 7 dient weiterhin als Steuerung für den Antrieb 16,
mit dem die von der strukturierten Feldblende 15 erzeugte
Beleuchtungsstruktur verschiebbar ist. Die Auswerteeinrichtung 7 ist
so ausgebildet, daß sie
durch Ansteuerung des Antriebs 16 und des Verschlusses 10 eine
Folge von Beleuchtungsmustern erzeugt und durch Erfassung der Signale
des Detektors 6 eine Folge von jeweils den Beleuchtungsmustern
entsprechenden Bildern des Untersuchungsbereichs bzw. des Objekts 4 erfaßt. Diese
Bilder werden nach Erfassung des letzten Bildes der Folge in der
Auswerteeinrichtung 7 verarbeitet.
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Bei
der Durchführung
eines Verfahrens nach einer ersten bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden drei der Struktur der Feldblende 15 entsprechende
Beleuchtungsmuster verwendet, die in 3a genauer
dargestellt sind.
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Das
erste Beleuchtungsmuster ist ein Grundmuster. Die anderen Beleuchtungsmuster
gehen aus dem Grundmuster durch Verschiebung des Grundmusters um
die Strecke v hervor. Das Grundmuster besitzt eine periodische Struktur
der Periode p mit streifenförmigen
Dunkelbereichen 27 der Breite d und jeweils zwischen den
Dunkelbereichen angeordneten streifenförmigen Hellbereichen 26 der
Breite h. Die Parameter p, d und h sind so gewählt, daß die Breite h der Hellbereiche 26 zwischen
einem Drittel und der Hälfte
der Periode p, d.h. 1/3 p und 1/2 p, liegt. Dementsprechend liegt
die Breite d der Dunkelbereiche 27 zwischen 1/2 p und 2/3
p.
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Das
Grundmuster wird in einer Richtung, die orthogonal zu der Längsrichtung
der streifenförmigen Dunkelbereiche 27 bzw.
Hellbereiche 26 ausgerichtet ist, zweimal um die Strecke
v verschoben. Die Strecke v, um die die durch Verschiebung des Grundmusters
entstandenen, aufeinanderfolgenden Beleuchtungsmuster gegeneinander
versetzt sind, hat ungefähr
die Länge
von einem Drittel der Periode p.
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Die
Periode p liegt probenseitig vorzugsweise zwischen 1μm und 100μm.
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Bei Überlagerung
der drei Beleuchtungsmuster in der Objektebene 3 wird der
Untersuchungsbereich bzw. das Objekt 4 vollständig durch die
Dunkelbereiche 26 überdeckt.
Bei Zusammenfügung
der Dunkelbereiche 27 wird das Objekt 4 daher vollständig durch
diese abgedeckt, so daß keine
Interpolation zwischen den Dunkelbereichen 27 notwendig
ist.
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Entsprechendes
gilt für
die Hellbereiche 26.
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Bei
einem Verfahren zur Abbildung eines Objekts mittels einer Weitfeldoptik
auf einen ortsauflösenden
Detektor für
optische Strahlung mit Unterdrückung
von Falschlicht nach einer ersten bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird das Objekt 4 in der Objektebene 3 nacheinander
mit den drei Beleuchtungsmustern beleuchtet, wozu die Auswerteeinrichtung 7 den
Antrieb 16 und den Verschluß 10 entsprechend
ansteuert. Für
jedes der Beleuchtungsmuster wird mittels des Detektors 6 und
der Auswerteeinrichtung 7 ein entsprechendes Bild automatisch
erfaßt.
Die erfaßten
Bilder weisen gegebenenfalls in den Bereichen, in die die Dunkelbereiche 27 abgebildet
werden, Aufhellungen durch Falschlicht auf, das aus mit Hellbereichen 26 beleuchteten
Abschnitten des Objekts 4 abgegeben wird.
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Aus
den erfaßten
Bildern wird dann in der Auswerteeinrichtung 7 ein Hellbild
des Objekts erzeugt. Dazu werden die Bereiche der erfaßten Bilder, die
durch Abbildung der Hellbereiche 26 in der Objektebene 3 bzw.
auf dem Objekt 4 erhalten wurden, durch Summation zu einem
Hellbild des Objekts 4 zusammengefügt. Die Anordnung der Bereiche
der erfaßten
Bilder zueinander entspricht dabei der Anordnung der den Bereichen
der erfaßten
Bilder entsprechenden Dunkelbereiche der Beleuchtungsmuster auf
dem Objekt 4. Da sich die Hellbereiche 26 überlappen,
entstehen bei der Summation in den Überlappungsbereichen Intensitätsüberhöhungen,
die durch Referenzierung bzw. Renormierung beseitigt werden. Dies
ist beispielhaft für
den Fall eines homogen fluoreszierenden Objekts in dem Diagramm
in 3b dargestellt. In dem Diagramm sind die Hellsignale
für jedes
der darüber
dargestellten, mit den Ziffern 1, 2 bzw. 3 gekennzeichneten Beleuchtungsmuster
als Funktion des Ortes für
einen Schnitt durch die Objektebene 3 sowie das durch Summation
resultierende Hellsignal (1 + 2 + 3) dargestellt.
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Bei
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens werden nur Teilbilder der Abbilder der Hellbereiche 26 verwendet,
die bei Überlagerung
der erfaßten
Bilder aneinandergrenzen bzw. sich nur minimal überlappen. Gegebenenfalls kann zusätzlich nochmals
eine Renormierung stattfinden.
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Zur
Ermittlung eines Dunkel- bzw. Falschlichtbildes werden analog die
Bereiche der erfaßten
Bilder, die durch Abbildung der Dunkelbereiche 27 in der
Objektebene 3 bzw. in dem Objekt 4 erhalten wurden,
zu einem Dunkel- beziehungsweise Falschlichtbild zusammengefügt bzw.
summiert, ohne daß eine
Interpolation notwendig wäre.
Das Dunkelbild wird dann zur Rauschunterdrückung unter Verwendung eines
entsprechenden Tiefpaßfilters rechnerisch
geglättet.
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Schließlich wird
in der Auswerteeinrichtung 7 das Dunkelbild von dem Hellbild
subtrahiert, wobei ein resultierendes Bild des Objekts 4 entsteht,
in dem Falschlicht unterdrückt
ist.
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Bei
einer zweiten bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung
werden vier Beleuchtungsmuster verwendet, die aus ei nem Grundmuster
mit einer periodischen Streifenstruktur durch sukzessive Verschiebung
um eine Strecke v in einer Richtung orthogonal zu der Richtung der
Streifen hervorgehen. Die Breite h der Hellbereiche, die Breite
d der Dunkelbereiche und die Strecke v können bei Periode p der Streifenstruktur
folgendermaßen
gewählt sein:
1/4
p < h < 1/3 p, v = 1/4
p und 2/3 p < d < 3/4 p.
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Es
werden entsprechend der Anzahl der Beleuchtungsmuster vier Bilder
erfaßt,
die analog zu dem ersten Ausführungsbeispiel
zur Falschlichtunterdrückung
verarbeitet werden.
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Bei
Verwendung von fünf
Beleuchtungsmustern, die durch Verschiebung aus einem periodischen Grundmuster
mit Streifen um die Strecke v in einer Richtung orthogonal zu der
Richtung der Streifen hervorgehen, können die Breiten d und h der
Dunkel- bzw. Hellbereich und die Verschiebung beispielsweise folgendermaßen gewählt sein:
1/5
p < h < 1/4 p, v = 1/5
p und 3/4 p < d < 4/5 p.
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Je
mehr Beleuchtungsmuster verwendet werden, desto weniger Anregungslicht
wird bei der Erfassung eines entsprechenden Bildes genutzt. Hierdurch
kann das Intensitätsrauschen
im Untergrund des resultierenden Bildes nahezu beliebig gesenkt
werden.
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Bei
einer dritten bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung
wird die Feldblende 15 nicht bewegt, sondern das Objekt 4.
Hierzu kann ein Tisch verwendet werden, auf welchem das Objekt angeordnet
ist und der mittels eines von der Auswerteeinrichtung 7 gesteuerten
Antriebs in Richtungen parallel zu der Objektebene 3 bewegbar
ist. Die Auswertung der erfaßten
Bilder erfolgt analog zu dem ersten Ausführungsbeispiel. Zur Positionierung
des Objekts 4 in der Objektebene 3 sind als Antriebe
Piezoaktoren, Exzenterantriebe oder andere geeignete Verstellmechanismen
einsetzbar, vorzugsweise aber ein motorisierter Mikroskoptisch.
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Eine
Vorrichtung nach einer vierten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich
von der Vorrichtung des ersten Ausführungsbeispiels dadurch, daß eine modifizierte
Einrichtung 28, prinzipiell dargestellt in 4,
zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern und eine entsprechend modifizierte
Auswerteeinrichtung verwendet werden. Da die anderen Komponenten
im wesentlichen unverändert
sind, werden für
diese die gleichen Bezugszeichen verwendet und es gelten die Erläuterungen
zu dem ersten Ausführungsbeispiel
entsprechend.
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Die
teilweise in 4 gezeigte Einrichtung 28 besitzt
nun als als strukturierte Blende wirkendes Element eine in der Feldblendenebene 14 angeordnete
Feldblende 29 mit einer Struktur, die in zwei zueinander
orthogonalen Richtungen periodisch ausgebildete transparente und
opake Bereiche aufweist (vgl. 5). Zur
Erzeugung unterschiedlicher Beleuchtungsstrukturen verfügt die Einrichtung 28,
wie in 4 schematisch dargestellt, über eine der strukturierten
Feldblende 29 in Lichtrichtung nachgeordnete, planparallele
Glasplatte 30, die um zwei zueinander orthogonale Achsen
kippbar ist. Zur gesteuerten, definierten Kippung dieser Glasplatte 30 sind
als Antrieb 31 in vorteilhafter Weise Piezoaktoren 32 vorgesehen,
welche durch eine Steuerung der nicht dargestellten Auswerteeinrichtung
entsprechend ange steuert werden. Durch die Kippung der Glasplatte 30 erfolgt
bekanntermaßen
ein optischer Strahlenversatz des Strahlenganges und damit eine
versetzte Abbildung der Feldblende 29 auf das Objekt 4.
Die in der 5 eingezeichneten Pfeile kennzeichnen
die Kipprichtungen der Glasplatte 30.
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Zur
Erzeugung des Strahlenversatzes können auch andere geeignete
Elemente eingesetzt werden. Als Antriebe für die Glasplatte 30 können bei einer
anderen Ausführungsform
auch Exzenterantriebe oder andere geeignete Antriebsmechanismen vorgesehen
werden.
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Bei
Abbildung der Feldblende 29 in die Objektebene 3 ergibt
sich ein in 5 dargestelltes Grundmuster
mit in zwei zueinander orthogonalen Richtungen periodisch angeordneten
Hellbereichen 33 und Dunkelbereichen 34. Das Grundmuster
weist in der ersten, im Folgenden durch die Ziffer 1 gekennzeichneten
Richtung eine Periode p1 und in der zweiten, im Folgenden durch
Ziffer 2 gekennzeichneten Richtung die Periode p2 auf.
Die Hellbereiche 33 sind rechteckig mit Seitenlängen h1
und h2 und bilden zusammen mit den L-förmigen
Dunkelbereichen 34 Rechtecke mit Kantenlängen p1
und p2, die in 5 durch gestrichelte Linien
gekennzeichnet sind.
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Zur
Erzeugung der in diesem Beispiel sechs Beleuchtungsmuster wird das
Grundmuster, das selbst ein erstes Beleuchtungsmuster darstellt,
zunächst
zweimal nacheinander um die Strecke v1 in der Richtung 1,
d.h. parallel zu der Seite der Hellbereiche 33 mit der
Länge h1,
verschoben, wobei ein zweites und drittes Beleuchtungsmuster entstehen. Zur
Erzeugung eines vierten Beleuchtungsmusters erfolgt dann eine Verschiebung
um die Strecke v2 in einer Richtung 2 orthogo nal zu der
Richtung der ersten Verschiebung, d.h. parallel zu der Seite der
Hellbereiche mit der Länge
h2. Danach werden zwei weitere Beleuchtungsmuster durch Verschiebung
um jeweils die Strecke v1 in Richtung der ersten Verschiebungen
erzeugt.
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Die
Größe der Verschiebungen
v1 und v2 ergibt sich aus den Beziehungen
p1 = 3∙v1 und
p2 = 3∙v2,
die
Größe der Seiten
h1 und h2 der Hellbereiche 33 aus den Beziehungen
1/3∙p1 <h1 < 1/2∙p1 und
1/3∙p2 <h2 < 1/2∙p2.
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Die
Perioden p1 und p2 liegen in der Objektebene vorzugsweise im Bereich
zwischen 1μm
und 100μm.
Sie können
gleich oder verschieden groß gewählt sein.
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Bei Überlagerung
der sechs Beleuchtungsmuster decken deren Hellbereiche 33 das
Objekt 4 in der Objektebene 3 vollständig ab.
Entsprechendes gilt für
die Dunkelbereiche 34.
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Das
Verfahren zur Abbildung des Objekts 4 nach der vierten
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung erfolgt analog zu dem ersten Ausführungsbeispiel. Es werden die
sechs Beleuchtungsmuster nacheinander erzeugt und entsprechende
Bilder des Untersuchungsbereichs erfaßt. Die Erzeugung des resultierenden
Bildes erfolgt wie im ersten Ausführungsbeispiel mit der Änderung,
daß nun
die sechs bei Beleuchtung mit jeweils unterschiedlichen entsprechenden
Beleuchtungsmustern erfaßten
Bilder bzw. die den Dunkel- bzw. Hellbe reichen entsprechenden Teilbilder
zur Ermittlung des Dunkelbildes und des Hellbildes herangezogen
werden. Das resultierende Bild wird wie zuvor durch Subtraktion
des Dunkelbildes von dem Hellbild ermittelt.
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Das
Verfahren hat gegenüber
dem Verfahren des ersten Ausführungsbeispiels,
d.h. der Verwendung von Beleuchtungsmustern mit Streifen, den Vorteil,
daß die
Modulation durch die strukturierte Beleuchtung schneller außerhalb
der Fokusebene bzw. Objektebene verschwindet, so daß Licht
außerhalb der
Schärfentiefe
der Abbildungsoptik besser unterdrückt wird.
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Eine
Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer
fünften
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung unterscheidet sich von der Vorrichtung des ersten
Ausführungsbeispiels durch
einen anderen Antrieb für
die Feldblende 15. Alle anderen Komponenten sind unverändert, sodaß für diese
die gleichen Bezugszeichen verwendet werden und die Erläuterungen
im Zusammenhang mit dem ersten Ausführungsbeispiel gemäß 1 entsprechend
gelten.
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6 zeigt
eine schematische teilweise Darstellung der veränderten Einrichtung zur Erzeugung von
Beleuchtungsmustern. Der von der Steuerung in der Auswerteeinrichtung
gesteuerte Antrieb umfaßt Piezoaktoren 35 und 36,
welche mit der Feldblende 15 gekoppelt sind, so daß die Feldblende 15 mittels der
Piezoaktoren 35 und 36 definiert durch laterale Verschiebung
längs zweier
zueinander orthogonaler Richtungen in der Feldblendenebene 14 verstellt werden
kann. Durch die Abbildung der in unterschiedlichen Positionen eingestellten
Feldblende 15 auf das Objekt 4 werden wie zuvor
unterschiedliche Beleuchtungsstrukturen in der Ob jektebene 3 erzeugt,
welche dann zusammen mit dem Objekt 3 auf den Detektor 6 abgebildet
werden.
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Eine
sechste Ausführungsform
der Erfindung unterscheidet sich von den bisher beschriebenen Ausführungsbeispielen
dadurch, daß die
Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern nun weder eine
Feldblende noch einen Antrieb, sondern statt dessen als als strukturierte
Blende wirkendes Element eine in der Feldblendenebene 14 angeordnete elektrisch
steuerbare Modulationseinheit 45 in Form eines Durchlicht-LCD
besitzt. Wie in 7 schematisch dargestellt ist
die Modulationseinheit 45 über eine Steuerleitung mit
einer Auswerteeinrichtung 46 verbunden, die gegenüber der
Auswerteeinrichtung 7 des ersten Ausführungsbeispiels dahingehend
verändert
ist, daß in
der Auswerteeinrichtung gespeicherte Hell-Dunkel-Muster auf dem
Durchlicht-LCD dargestellt werden, sodaß auf die Objektebene 3 entsprechende
Beleuchtungsmuster gestrahlt werden.
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Bei
diesem Ausführungsbeispiel
werden zum einen zwei Beleuchtungsmuster verwendet, nämlich ein
Grundmuster, das in zwei zueinander orthogonalen Richtungen periodisch
angeordnete Hellbereiche 37 und Dunkelbereiche 38 aufweist,
und ein aus diesem durch Verschiebung in einer der Periodizitätsrichtungen
hervorgehendes Beleuchtungsmuster. Zum anderen wird eine unstrukturierte
Beleuchtung verwendet, um ein Hellbild zu erfassen.
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Das
Grundmuster ist genauer in 8 gezeigt.
In mit den Perioden p1 und p2 in den zueinander orthogonalen Richtungen 1 und 2 periodisch
angeordneten rechteckigen Zellen 39 mit Kanten in Richtung 1 und 2 mit
Kantenlängen
p1 und p2 sind jeweils auf der Diagonalen zwei gleiche rechteckige Hellfelder 37 mit
Kantenlängen
h1 und h2 angeordnet, von denen eines mit zwei seiner Kanten einen Teil
des Randes der Zelle 39 bildet und das andere so angeordnet
ist, daß die
Hellfelder 37 entlang einer Diagonalen des Grundmusters
gleiche Abstände
voneinander aufweisen.
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Die
Perioden p1 und p2 können
gleich oder voneinander verschieden sein und in der Objektebene 3 eine
Länge in
einem Bereich von 1μm
und 100μm
aufweisen. Die Kantenlängen
h1 und h2 sind so gewählt,
daß sie
die Beziehungen
h1 < 1/2∙p1 und
h2 < 1/2∙p2
erfüllen. Weiter
wird die Größe der Verschiebung
v1 zu 1/2∙p1
gewählt.
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Die
Dunkelbereiche 38 der beiden Beleuchtungsmuster überdecken
bei einer vorgestellten Überlagerung
der Beleuchtungsmuster den Untersuchungsbereich bzw. das Objekt 4.
Bei Zusammenfügen
der den Dunkelbereichen entsprechenden Bereiche der bei Beleuchtung
mit den beiden Beleuchtungsmustern erfaßten Bilder ist wie bei dem
Verfahren des ersten Ausführungsbeispiels
ein Dunkelbild ermittelbar.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
wird das Hellbild durch einfache Addition aller erfaßten Bilder und
nachfolgende Normierung mit der addierten Beleuchtungsintensität erzeugt.
Weiterhin werden vorzugsweise durch die Periodizität der Beleuchtungsmuster
gegebenenfalls entstehende Beleuchtungsinhomogenitäten in dem
durch Subtraktion des Dunkelbildes von dem Hellbild erhaltenen Bild
beseitigt, indem das erhaltene Bild einer Ortsfrequenz-Filterung mit
einem niederfrequenten Filter unterzogen wird, der der Periodizi tät entsprechende
Frequenzen herausfiltert bzw. deren Stärke auf ein dem restlichen Spektrum
der Frequenzen entsprechenden Wert setzt. Eine solche Filterung
kann auch bei den anderen Ausführungsbeispielen
zusätzlich
durchgeführt werden.
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Bei
einem Verfahren zur Abbildung eines Objekts mittels einer Weitfeldoptik
auf einen ortsauflösenden
Detektor für
optische Strahlung mit Unterdrückung
von Falschlicht nach der sechsten bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird das Objekt 4 in der Objektebene 3 nacheinander
mit den beiden strukturierten Beleuchtungsmustern und der unstrukturierten
Beleuchtung beleuchtet, wozu die Auswerteeinrichtung 46 die
Modulationseinheit 45 entsprechend ansteuert. Für jedes
der Beleuchtungsmuster wird mittels des Detektors 6 und
der Auswerteeinrichtung 7 ein entsprechendes Bild erfaßt.
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Aus
den erfaßten
Bildern bei Beleuchtung mit einem Beleuchtungsmuster wird analog
zu dem ersten Ausführungsbeispiel
(vgl. 1) ein Dunkelbild ermittelt, das unter Bildung
eines resultierenden Bildes von dem bei unstrukturierter Beleuchtung
erfaßten
Hellbild subtrahiert wird.
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Eine
Vorrichtung nach einer siebten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, deren
optischer Gesamtaufbau schematisch vereinfacht in 9 gezeigt
ist, unterscheidet sich von der Vorrichtung des ersten Ausführungsbeispiels
dadurch, daß das
als Blende wirkende Element zur Dunkelfeldbeleuchtung scharf auf
das Objekt abbildbar ist. Hierzu ist die zweite Beleuchtungsoptik 19 durch
eine modifizierte zweite Beleuchtungsoptik 40 ersetzt,
der Strahlenteiler 21 ist nicht mehr notwendig. Für Komponenten,
die gegenüber dem
ersten Ausführungsbeispiel
im Wesentlichen unverändert
sind, gelten die Ausführungen
des ersten Ausführungsbeispiels
entsprechend und es werden die gleichen Bezugszeichen verwendet.
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Die
Vorrichtung umfaßt
die Beleuchtungseinrichtung 1 mit der Licht- oder Strahlungsquelle 8,
der optional der Verschluß 10 und,
vorteilhaft, den Strahlengang homogenisierende optische Elemente 11, wie
z.B. ein Lichtleitstab oder ein innen verspiegelter Glashohlstab,
und Beleuchtungsoptiken 12 und 13 zur homogenen
Ausleuchtung einer in der Feldblendenebene 14 im Strahlengang
angeordneten Einrichtung 2 zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern,
die im Beispiel die strukturierte Feldblende 15 umfaßt, nachgeordnet
sind. Diese Feldblende 15 ist im Strahlengang in zwei zueinander
orthogonalen Richtungen der Feldblendenebene 14 definiert
positionierbar angeordnet. Sie kann also mittels des mit der Feldblende 15 gekoppelten
Antriebs 16 in dieser Ebene 14 verschoben werden.
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Durch
die der Feldblende 15 nachgeordnete modifizierte zweite
Beleuchtungsoptik 40, die im Beispiel einen Beleuchtungstubus 41,
einen Ablenkspiegel 42, einen Anregungsfilter 43,
und ein Objektiv 44, wird das als strukturierte Blende
wirkende Element, d.h. hier die strukturierte Feldblende 15,
in Dunkelfeldbeleuchtung auf das zu untersuchende oder zu messende
Objekt 4 bzw. die Objektebene 3 abgebildet. Die
zweite Beleuchtungsoptik 40 bildet eine sogenannte Scheimpflugoptik,
deren optische Achse unter einem Winkel α zur senkrecht zur Oberfläche des
Objekts 4 bzw. der Objektebene 3 verlaufenden optischen
Achse der Abbildungsoptik 5 angeordnet ist. Vorteilhaft
ist der Winkel α > 50°. Durch diese Abbildungsoptik 5,
die beispielsweise das Objektiv 22, den Filter 25 sowie
den Abbildungstubus 23 umfaßt, wird das Objekt 4 kontrastreich
zusammen mit der ihr überlagerten
Beleuchtungsstruktur auf den ortsauflösenden Detektor 6 für optische
Strahlung abgebildet.
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In
analoger Weise kann jedoch auch bei einer modifizierten Ausführungsform
die Abbildungsoptik als eine Scheimpflugoptik ausgebildet sein.
In diesem Fall steht die optische Achse der zweiten Beleuchtungsoptik 40 senkrecht
auf der Oberfläche
des Objekts 4 bzw. der Objektebene 3. Mit dieser
optischen Achse bildet dann die optische Achse der Abbildungsoptik
den Winkel α.
-
- 1
- Beleuchtungseinrichtung
- 2
- Einrichtung
zur Erzeugung von
-
- Beleuchtungsmustern
- 3
- Objektebene
- 4
- Objekt
- 5
- Abbildungsoptik
- 6
- Detektor
- 7
- Auswerteeinrichtung
- 8
- Strahlungsquelle
- 9
- Filter
- 10
- Verschluß
- 11
- homogenisierendes
optisches
-
- Element
- 12,
13
- erste
Beleuchtungsoptiken
- 14
- Feldblendenebene
- 15
- Feldblende
- 16
- Antrieb
- 17,
18
- Exzenterantrieb
- 19
- zweite
Beleuchtungsoptik
- 20
- Beleuchtungstubus
- 21
- Strahlenteiler
- 22
- Objektiv
- 23
- Abbildungstubus
- 24,
25
- Filter
- 26
- Dunkelbereiche
- 27
- Hellbereiche
- 28
- Einrichtung
zur Erzeugung von
-
- Beleuchtungsmustern
- 29
- Feldblende
- 30
- Glasplatte
- 31
- Antrieb
- 32
- Piezoaktoren
- 33
- Hellbereiche
- 34
- Dunkelbereiche
- 35
- Piezoaktor
- 36
- Piezoaktor
- 37
- Hellbereiche
- 38
- Dunkelbereiche
- 39
- Zellen
- 40
- zweite
Beleuchtungsoptik
- 41
- Beleuchtungstubus
- 42
- Ablenkspiegel
- 43
- Anregungsfilter
- 44
- Objektiv
- 45
- Modulationseinheit
- 46
- Auswerteeinrichtung