JP5239128B2

JP5239128B2 - 観察装置

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Publication number: JP5239128B2
Application number: JP2006141677A
Authority: JP
Inventors: 宏昭紀伊; 泰次郎清田
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2006-05-22
Filing date: 2006-05-22
Publication date: 2013-07-17
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Description

本発明は、細胞を観察するための観察装置に関する。

次のような細胞培養装置が特許文献１によって知られている。この細胞培養装置によれば、カメラで撮影した細胞培養容器内の画像を解析して、細胞容器内の細胞面積や細胞数を検出する。

特開２００４−１６１９４号公報

しかしながら、従来の細胞培養装置においては、細胞容器内の細胞面積や細胞数を検出するための手法が開示されていないが、一般的にこれらを検出するためには細胞の位相差画像を撮影して位相差画像を解析する必要がある。このため、位相差画像を取得するための位相差顕微鏡等が必要となり、装置が高価になるという問題が生じていた。

請求項１の発明は、培養される細胞などの試料を観察する観察装置において、明部と暗部の繰り返してなるストライプ光で試料を照明する照明手段と、照明手段により試料を照明して試料を透過した光のストライプ画像を撮像する撮像手段と、培養容器内の試料の占有率と試料の空間周波数情報の統計処理データとの相関関係を示す相関データを記憶した記憶手段と、撮像手段で撮像されたストライプ画像のストライプの方向と直交する方向の画像領域に対する色成分の空間周波数情報に基づいて統計処理データを求め、記憶手段の相関データを用いて、培養容器内における試料の占有率を算出する算出手段と、照明手段によるストライプ光を回転する移動手段とを備え、算出手段は、移動手段でストライプ光を回転させない場合と９０度回転させた場合とで撮像した縦方向と横方向のストライプ画像の画像領域に対する色成分の空間周波数情報に基づいて統計処理データを求め、培養容器内における試料の占有率を算出することを特徴とする。

本発明によれば、位相差顕微鏡などの高価な装置を必要とせず、安価な構成で培養容器内における細胞の占有率を算出することができる。

―第１の実施の形態―
図１（ａ）は、第１の実施の形態における観察装置の一実施の形態の構成を模式的に示した図である。観察装置１００は、カメラ１０１と、照明装置１０２と、制御装置１０３と、記録部１０４とを備えている。この観察装置１００においては、観察対象となるサンプルＡに対して照明装置１０２で下部から照明光を照射し、そのときにサンプルＡを透過する光の像をカメラ１０１により撮像する。なお、サンプルＡは、例えば培養容器内で培養される細胞などの試料である。

制御装置１０３は、カメラ１０１で取得した画像を処理して培養容器内における細胞の占有率を算出する。すなわち、培養容器底面の全体を覆う培地の全面積に対する細胞の占有率を算出する例について説明する。制御装置１０３による具体的な処理については後述する。

カメラ１０１は、例えば撮像素子にカラーＣＣＤを有するＣＣＤカメラであり、サンプルＡの上部から培養容器内全体が撮影可能なように設置されている。また、カメラ１０１は、結像光学系を有しており、サンプルＡから射出した光は、当該結像光学系によって捉えられ、撮像素子の撮像面上に結像する。

このカメラ１０１で撮像されて得られる画像データは、ＲＧＢ表色系で示されている。そして、この画像データを構成する各々の画素には、ＲＧＢの各色成分の色情報が全て存在しているものとする。例えば、カメラ１０１が備えるＣＣＤの受光面全体に図２に示す配列のカラーフィルタが設けられている場合には、制御装置１０３は、ＣＣＤから出力される画像データに対して補間処理を施して各画素にＲＧＢの各色成分の色情報が全て存在するように変換する。カメラ１０１は、制御装置１０３からの指示に基づいてサンプルＡの像を撮像して得た画像データを制御装置１０３へ出力し、当該画像データは記録部１０４に記録される。

照明装置１０２は、サンプルＡを下部から照射するように設置されている。これによって、カメラ１０１は照明装置１０２で照明されたサンプルＡの透過光の像を撮像することができる。なお、照明装置１０２は、明部と暗部との繰り返しからなる面光源でサンプルＡを照明するように、一定の間隔で縞状に光を通す範囲と光を遮る範囲とが並んだスリット板を通してサンプルＡを照明する。すなわち、照明装置１０２は、サンプルＡに直接光が照射される範囲と光が遮断された範囲とからなるストライプ状の光（ストライプ光）を照射する。

このとき、照明装置１０２における明部と暗部の間隔は、カメラ１０１によって取得される画像上で直接光が照射された範囲に相当する白い領域と、光が遮断された範囲に相当する黒い領域（暗視野領域）とが形成されるように設計されている。

照明装置１０２はまた、ストライプ光の照射方向に対して垂直方向、すなわち図１（ａ）における左右方向に移動可能に設置されており、サンプルＡに対してストライプ光の照射位置をずらすことができる。例えば、サンプルＡ上で直接光が照射されている範囲に対して、照明装置１０２を移動させて直接光を遮断することができる。なお、照明装置１０２によるストライプ光の照射、および照明装置１０２の移動は、制御装置１０３によって制御される。

ここで、図１（ｂ）を用いて、観察装置１００の光学系部分の作用について説明する。なお、図１（ｂ）は、観察装置１００の光学系部分の概念を示した図である。まず、面光源上のある暗部１４Ａと、その暗部１４Ａに正対するサンプルＡ上の部分領域１ｂとに着目して説明する。この部分領域１ｂには、暗部１４Ａに隣接する２つの明部１４Ｂおよび１４Ｃからの光ＬＢおよびＬＣが入射するが、暗部１４Ａからは光が入射しない。よって部分領域１ｂは、光ＬＢおよびＬＣで斜光照明される。

その部分領域１ｂでは、入射した光ＬＢおよびＬＣの一部が回折せずにそのまま透過するが、光ＬＢおよびＬＣの一部は、部分領域１ｂ中の屈折率の段差の影響を受けて回折（あるいは散乱）する。この部分領域１ｂをそのまま透過した非回折光ＬＢおよびＬＣは、カメラ１０１が有する結像光学系１０１ｂへの瞳に入射しないが、部分領域１ｂで発生した一部の回折光（あるいは散乱光）ＬｂおよびＬｃは、結像光学系１０１ｂの瞳へ入射する。

このとき、部分領域１ｂと共役関係にある撮像素子１０１ａ上の領域１ａには、暗部１４Ａの像と部分領域１ｂに存在した位相物体の輪郭の像とが重畳して形成される。すなわち部分領域１ｂの暗視野像が形成される。ここで、部分領域１ｂからみると、２つの明部１４Ｂおよび１４Ｃの張る角度は十分に小さい。よって、光ＬＢおよびＬＣによる部分領域１ｂの照明角度も十分に小さい。このとき、部分領域１ｂの観察像は、小角度で射出した大強度の回折光ＬｂおよびＬｃによって生成されることになる。これにより部分領域１ｂの明るさは十分に高いものとなる。

また、以上のことは、各暗部に正対するサンプルＡ上の各領域についてそれぞれ当てはまる。従って、撮像素子１０１ａによって取得される画像は、上述したように白い領域と黒い領域とからなるストライプ状の画像となる。

制御装置１０３は、ＣＰＵ、メモリ、およびその他の周辺回路で構成され、信号処理部１０３ａを機能的に備えている。そして、制御装置１０３は、照明装置１０２を制御してストライプ光を培養容器全体に照射し、同時にカメラ１０１を制御して培養容器を透過したストライプ光の像を撮像する。信号処理部１０３ａは、カメラ１０１で撮像して得た画像に対して画像処理を実行して、画像内から培養容器の内部に相当する画像のみをストライプ画像として抽出する。

信号処理部１０３ａは、このために、例えば公知のエッジ抽出処理を行って画像内のエッジを抽出し、抽出したエッジの中から培養容器の形状と一致する形状を構成するエッジを検出する。そして、その内部を培養容器の内部と認識してストライプ画像を抽出する。これによって、例えば図３に示すようなストライプ画像が得られる。なお、図３の例においては、培養容器の形状として四角形のエッジが抽出された場合を示しているが、円形の培養容器の場合には円状のストライプ画像が抽出される。

このストライプ画像においては、スリット板を通して直接光が当たった範囲は画像上では白い領域３ａとして撮像され、光が遮られた範囲は画像上で黒い領域（暗視野領域）３ｂとして撮像される。このとき、このストライプ画像の画像データにおいては、上述したように各々の画素にはＲＧＢの各色成分の色情報が全て存在していることから、直接光が当たる範囲と光が遮断された範囲との境界（回折光の領域）が１画素×１ライン上に含まれると、その境界に相当する画素はグレーの領域（回折光の領域）として撮影されることになる。これによってストライプ画像上では、白い領域３ａと黒い領域３ｂとの境界にグレーの領域（グレーゾーン）３ｃが現れる。

信号処理部１０３ａは、このようにカメラ１０１で得られたストライプ画像に基づいて、培養容器内における細胞の占有率（細胞占有率）を算出する。すなわち、上述したように培養容器底面を満たすように培地が存在している場合を想定した場合には、培養容器底面の培地全体に対する細胞の占有率を算出する。以下、第１の実施の形態における細胞占有率の算出原理について説明する。

ストライプ画像内で培地のみの像を撮像した領域（培地領域）と、細胞が存在する範囲の像を撮像した領域（細胞領域）とについて、それぞれ黒い領域３ｂにおけるＲ、Ｇ、Ｂ各色成分の輝度値を取得し、各色成分について輝度値に対する画素数のヒストグラムを作成すると図４に示すようになる。

この図４に示すように、培地領域と細胞領域とは、ストライプ光の屈折率の違いによって作成されるヒストグラムの形状が異なる。具体的には、細胞領域におけるヒストグラムのピーク位置４ａは、細胞が存在することによって培養領域のヒストグラムのピーク位置４ｂよりもヒストグラムの形状が滑らかになる。なお、図４では、培養領域と細胞領域とのそれぞれについて、Ｒ成分についての輝度値に対する画素数のヒストグラムを示しているが、他の色成分についても同様の結果が得られる。

本実施の形態では、このような培地領域におけるヒストグラムの形状と細胞領域におけるヒストグラムの形状の違いに着目して、培養容器内における細胞の密度を変化させながら各色成分における培地領域と細胞領域とのヒストグラムの分散および尖度求めると、図５に示すようなグラフが得られる。この図５に示すグラフは、培地に対する細胞の割合（細胞密度）を約２０％にしたときに得られるデータ５ｇ、約５０％にしたときに得られるデータ５ｈ、および約１００％にしたときに得られるデータ５ｉを算出して作成した場合の具体例を示している。

図５に示すように、Ｒ成分のヒストグラムの分散（Ｒ成分の分散）５ａ、Ｇ成分の分散５ｂ、Ｂ成分の分散５ｃ、Ｒ成分のヒストグラムの尖度（Ｒ成分の尖度）５ｄ、Ｇ成分の尖度５ｅ、およびＢ成分の尖度５ｆの全てにおいて、細胞の占有率が小さいとき（２０％）よりも細胞の占有率が大きいとき（１００％）の方がヒストグラムの分散および尖度が小さくなる。特に、Ｒ成分とＢ成分においては、細胞の占有率が大きくなるにつれて、ヒストグラムの尖度および分散は減少している。

なお、図５に示す例では、例えば培養容器内で赤色の培地を用いて透明な細胞を培養した場合を示しており、このため細胞の占有率が大きくなるにつれてＲ成分とＢ成分のヒストグラムの尖度および分散が減少するような結果が得られている。しかし、細胞の種類や培地の色が異なる場合には、細胞の占有率が大きくなるにつれてヒストグラムの尖度および分散が減少する色成分が異なる場合がある。

本実施の形態では、細胞の占有率が大きくなるにつれてヒストグラムの尖度および分散が減少する色成分に着目し、この色成分のヒストグラムの尖度および分散から培地に対する細胞の占有率を算出する。すなわち、信号処理部１０３ａは、例えば培地の色が赤色である場合には、Ｒ成分について図４に示すヒストグラムを作成し、このヒストグラムの尖度および分散を算出する。そして、あらかじめ実験によって得た図５に示すグラフに基づいて、算出したヒストグラムの尖度および分散における細胞の占有率を算出する。

なお、上述したように、図５に示すグラフは、細胞の種類や培地の色に応じて異なる結果が得られることから、細胞の種類や想定される培地の色ごとにあらかじめ実験データを得ておけば、条件に応じた細胞の占有率算出が可能となる。

信号処理部１０３ａは、具体的には次のように処理して培地に対する細胞の占有率を算出する。まず、制御装置１０３は、上述したように、照明装置１０２を制御してサンプルＡ、すなわち培養容器に対してストライプ光を照射する。そしてこのときの培養容器を透過する光の像をカメラ１０１を制御して撮像し、得られた画像データを記録部１０４に記録する。制御装置１０３は、その後、照明装置１０２を移動させる。

すなわち、上述したように、信号処理部１０３ａは、ストライプ画像上で黒い領域３ｂにおけるヒストグラムに基づいて細胞の占有率を求める必要があるのに対して、ストライプ画像は白い領域３ａとグレーゾーン３ｃとを含んでいる。このため、１枚のストライプ画像から黒い領域３ｂのみを抽出して細胞の占有率を算出した場合には、白い領域３ａとグレーの領域３ｃにおける細胞の占有率を算出することができず、正確な算出結果を得られない可能性がある。

このため、培養容器内全体から細胞の占有率を算出するために、制御装置１０３は、１枚目に得たストライプ画像におけるグレー領域３ｃに黒い領域３ｂが重なり、かつ１枚目に得たストライプ画像における黒い領域３ｃと新たに得る画像の黒い領域３ｂとが少なくとも１画素重なるように照明装置１０２に移動量を決定する。そして、このように決定した移動量だけ照明装置１０２を移動した後の位置においてカメラ１０１を制御してストライプ画像を取得し、得られた画像データを記録部１０４に記録する。

この処理を１枚目に得たストライプ画像上の白い領域３ａおよびグレーゾーン３ｃがなくなるまで所定回数繰り返して行うことによって、照明装置１０２を移動させて得た複数の画像データに基づいて、培養容器全体における細胞占有率を算出することが可能となる。なお、照明装置１０２の移動およびカメラ１０１による撮像を何回行うかは、スリット板のスリット間隔によって異なるため、あらかじめスリット間隔に応じた処理回数を設定しておく必要がある。

信号処理部１０３ａは、このように撮像して得たストライプ画像を記録部１０４から読み込んで、各ストライプ画像内から黒い領域３ｂを抽出し、抽出した各黒い領域３ｂ内に所定の大きさの計算対象領域３ｄを設定する。これによってグレーゾーン３ｃを排除して黒い領域のみからなる計算対象領域３ｄを設定することができる。なお、ここでは計算対象領域３ｄとして黒い領域３ｂ内に所定の大きさの領域を設定する例について説明するが、黒い領域３ｂ全体を計算対象領域として設定してもよい。

そして、各計算対象領域３ｄに対して統計処理を施す。すなわち、設定した計算対象領域３ｄのそれぞれに対して、Ｒ、Ｇ、Ｂの各色成分について輝度値に対する画素数のヒストグラムを作成し、作成したヒストグラムの分散および尖度求める。そして、信号処理部１０３ａは、これらの値を実験データに基づいてあらかじめ算出された図５に示すヒストグラムの分散および尖度と細胞の占有率との関係を表すグラフに当てはめて、各計算対象領域３ｄにおける細胞の占有率を算出する。すなわち、算出したヒストグラムの尖度および分散と、あらかじめ記録しておいたヒストグラムの尖度および分散と細胞の占有率との相関関係を示すデータとを比較して、細胞の占有率を算出する。

以上の処理によって、各計算対象領域３ｄごとに、培地に対する細胞の占有率を算出することができ、複数のストライプ画像について各計算対象領域３ｄにおける細胞の占有率を算出することによって、培養容器内全体について培地に対する細胞の占有率を算出することができる。これによって、従来、培養容器内の細胞の占有率を算出するためには、位相差光学系を有する顕微鏡を用いて位相差画像を得て位相差画像を解析する必要があり、高価な装置を準備する必要があったが、本発明によれば、位相差顕微鏡などの高価な装置を必要とせず、安価な装置で細胞の占有率を精度高く算出することができる。

制御装置１０３は、上述した処理を所定時間間隔で繰り返し実行することによって、時間とともに変化する培養容器内の細胞の占有率を観測することができる。

図６は、第１の実施の形態における観察装置１００の処理を示すフローチャートである。図６に示す処理は、使用者によって不図示のスイッチが操作され、細胞占有率の算出の開始が指示された場合に起動する処理として、制御装置１０３によって実行される。

ステップＳ１０において、制御装置１０３は、照明装置１０２を制御して培養容器にストライプ光を照明して、ステップＳ２０へ進む。ステップＳ２０では、制御装置１０３は、カメラ１０１を制御してストライプ光が培養容器を透過する光の像を撮像し、取得した画像データを記録部１０４へ記録する。その後、ステップＳ３０へ進む。

ステップＳ３０では、制御装置１０３は、上述したように１枚目に得たストライプ画像におけるグレー領域３ｃに黒い領域３ｂが重なり、かつ１枚目に得たストライプ画像における黒い領域３ｃと新たに得る画像の黒い領域３ｂとが少なくとも１画素重なるように照明装置１０２を移動させ、培養容器に照射するストライプ光を移動させる。その後、ステップＳ４０へ進み、制御装置１０３は、あらかじめ設定した所定回数だけ照明装置１０２を移動したか、すなわち細胞の占有率を算出するために必要がストライプ画像の取得が完了したか否かを判断する。

必要量のストライプ画像の取得が完了していないと判断した場合には、ステップＳ２０へ戻って処理を繰り返す。これに対して必要量のストライプ画像の取得が完了したと判断した場合には、ステップＳ５０へ進む。ステップＳ５０では、信号処理部１０３ａは、記録部１０４に記録されたストライプ画像を読み込んで、各ストライプ画像内の黒い領域３ｂ内に計算対象領域３ｄを設定してステップＳ６０へ進む。

ステップＳ６０では、設定した計算対象領域３ｄのそれぞれに対して統計処理を施して、Ｒ、Ｇ、Ｂの各色成分について輝度値に対する画素数のヒストグラムを作成し、作成したヒストグラムの分散および尖度求める。その後、ステップＳ７０へ進み、信号処理部１０３ａは、これらの値を実験データに基づいてあらかじめ算出された図５に示すヒストグラムの分散および尖度と細胞の占有率との関係を表すグラフに当てはめて、各計算対象領域３ｄにおける細胞の占有率を算出する。この処理を全てのストライプ画像上に設定した全て計算対象領域３ｄに対して実行することによって、培養容器全体について培地に対する細胞の占有率を算出する。その後、処理を終了する。

以上説明した第１の実施の形態によれば、以下のような作用効果を得ることができる。
（１）培養容器にストライプ光を照射し、そのときにカメラで撮像して得られるストライプ画像の黒い領域３ｂ内に設定した計算対象領域３ｄに対して輝度値のヒストグラムを作成し、ヒストグラムの分散および尖度に基づいて計算対象領域３ｄ内の細胞の占有率を算出するようにした。これによって、従来、培養容器内の細胞の占有率を算出するためには、位相差光学系を有する顕微鏡を用いて位相差画像を得て位相差画像を解析する必要があり、高価な装置を準備する必要があったが、本発明によれば、位相差顕微鏡などの高価な装置を必要とせず、安価な装置で細胞の占有率を精度高く算出することができる。

（２）ストライプ画像の中から黒い領域３ｂのみを抽出し、その中に設定した計算対象領域３ｄについて輝度値のヒストグラムを作成するようにした。これによって、計算対象領域３ｄにおけるヒストグラムの尖度および分散と、細胞の占有率との間には図５に示すような関係があることを加味して、精度高く細胞の占有率を算出することができる。また、信号処理部１０３ａの処理範囲を計算対象領域３ｄに限定することで、処理の負荷を低減することができる。

（３）照明装置１０２を移動させながら複数のストライプ画像を得るようにした。これによって、直接光が当たる範囲と光が遮断された範囲との境界が１画素内に含まれると、その境界に相当する画素はグレーゾーン３ｃとして撮影されることを加味して、このグレーゾーン３ｃを排除して精度高く細胞の占有率を算出することができる。

―第２の実施の形態―
上述した第１の実施の形態では、黒い領域における各色成分の輝度値のヒストグラムの尖度および分散と細胞の占有率との間には図５に示すような関係があることに着目して細胞の占有率を算出する例について説明した。これに対して第２の実施の形態では、ストライプ光を照射して得た培養容器の画像データの空間周波数情報と細胞の培養率との関係に着目して、細胞の占有率を算出する例について説明する。なお、図１に示した図、図２に示したＣＣＤのカラーフィルタの配列図、および図３に示したストライプ画像の具体例を示す図については、第１の実施の形態と同様のため説明を省略する。

第２の実施の形態では、制御装置１０２は、第１の実施の形態と同様に、照明装置１０２およびカメラ１０１を制御して図３に示したストライプ画像を得る。なお、第２の実施の形態においては、照明装置１０２は、ストライプ光を回転方向に移動できるように設置されている。制御装置１０３は、１枚目のストライプ画像を取得した後、照明装置１０２をストライプ光が９０度回転するように移動させて図７に示すようなストライプ画像を取得する。すなわち、図３に示す縦方向のストライプが現れた画像（縦ストライプ画像）とストライプが横方向のストライプが現れた画像（横ストライプ画像）とを取得する。

信号処理部１０３ａは、取得した各ストライプ画像に対してストライプの方向と垂直方向に計算対象領域を設定する。例えば、縦ストライプ画像に対しては図８に矢印で示すように、所定の幅、例えば３画素の幅を有するライン状の領域を計算対象領域８ａとして設定する。そして、設定した計算対象領域８ａを対象として矢印の示す方向に、各画素のＲ、Ｇ、Ｂ各色成分の輝度値のラインプロファイルを取得する。これによって、例えば図９に示すように、横軸に画素位置をとり、縦軸に輝度値をとった場合のＲ成分の輝度値のラインプロファイル９ａ、Ｇ成分の輝度値のラインプロファイル９ｂ、およびＢ成分の輝度値のラインプロファイル９ｃを示すグラフを得ることができる。

信号処理部１０３ａは、図９に示す各色成分ごとの輝度値のラインプロファイルをフーリエ変換して空間周波数についてＭＴＦを算出し、算出したＭＴＦに基づいて培地に対する細胞の占有率を算出する。以下、第２の実施の形態における細胞占有率の算出原理について説明する。

図１０は、計算対象領域８ａ内に培地のみが存在する場合に算出した空間周波数についてのＭＴＦを示すグラフ１０ｄと、計算対象領域８ａ内に細胞が存在する場合に算出した空間周波数についてのＭＴＦを示すグラフ１０ｅとを示している。この図１０に示すように、空間周波数が基本周波数の整数倍となる点、例えば基本周波数１０ａ、基本周波数の２倍の周波数１０ｂ、および３倍の周波数１０ｃにおいて細胞が存在している場合のＭＴＦは培地のみの場合のＭＴＦよりも減少している。

具体的には、図１１に示すように、基本周波数１０ａにおける細胞が存在する場合のＭＴＦは、培地のみの場合のＭＴＦに対して６６．４％となっている。また、基本周波数の２倍の周波数１０ｂにおける細胞が存在する場合のＭＴＦは、培地のみの場合のＭＴＦに対して４８．１％となっている。また、基本周波数の３倍の周波数１０ｃにおける細胞が存在する場合のＭＴＦは、培地のみの場合のＭＴＦに対して５２．６％となっている。

従って、これらのいずれかの周波数における培地のみの場合のＭＴＦに対する細胞が存在する場合のＭＴＦの割合と、培地に対する細胞の占有率との相関関係を図１２に示すようにあらかじめ実験に基づいてデータ化しておけば、信号処理部１０９はそのデータに基づいて培地に対する細胞の占有率を算出することができる。

図１２に示す例は、縦軸が基本周波数における培地のみの場合のＭＴＦに対する細胞が存在する場合のＭＴＦの割合（％）を表し、横軸が培地に対する細胞の占有率を表している。そして、グラフ１２ａはＲ成分におけるＭＴＦの割合と細胞の占有率を示し、グラフ１２ｂはＧ成分におけるＭＴＦの割合と細胞の占有率を示し、グラフ１２ｃはＢ成分におけるＭＴＦの割合と細胞の占有率を示している。

信号処理部１０３ａは、この図１２に示すデータに基づいて、次のようにして培地に対する細胞の占有率を算出する。なお、ここでは基本周波数のＭＴＦについて説明するが、その他、基本周波数の整数倍のＭＴＦについても同様に処理できる。

まず、信号処理部１０３ａは、図９に示した各色成分ごとの輝度値のラインプロファイルをフーリエ変換して空間周波数についてＭＴＦを算出し、あらかじめ算出してある培地のみの場合のＭＴＦを用いて、各色成分ごとに培地のみの場合のＭＴＦに対するラインプロファイルに基づいて算出したＭＴＦの割合を算出する。そして、ラインプロファイルに基づいて算出したＭＴＦの割合を図１２に示した各色成分ごとのグラフ１２ａ〜１２ｃに当てはめることによって、ラインプロファイルを取得した計算対象領域８ａ内の培地に対する細胞の占有率を算出することができる。

すなわち、算出したＭＴＦの割合と、あらかじめ記録しておいたＭＴＦの割合と培地に対する細胞の占有率との相関関係を示すデータとを比較して培地に対する細胞の占有率を算出する。なお、色成分ごとにグラフ１２ａ〜１２ｃに当てはめて算出した占有率に誤差がある場合には、色成分ごとに算出した占有率を平均して代表値を算出してもよいし、いずれか１の色成分について算出して占有率を代表値としてもよい。

以上説明した処理をストライプ画像全体に対して実行することによって、培養容器内の培地全体に対して細胞の占有率を算出することができる。さらに、縦ストライプ画像と横ストライプ画像のそれぞれに対して処理を実行し、ストライプ画像の縦方向のラインプロファイルに基づく細胞の占有率と、横方向のラインプロファイルに基づく細胞の占有率とを算出するため、両方向の細胞の占有率を加味すれば細胞の占有率を２次元で把握することができる。

図１３は、第２の実施の形態における観察装置１００の処理を示すフローチャートである。図１３に示す処理は、使用者によって不図示のスイッチが操作され、細胞占有率の算出の開始が指示された場合に起動する処理として、制御装置１０３によって実行される。

ステップＳ１１０において、制御装置１０３は、照明装置１０２を制御して培養容器にストライプ光を照明して、ステップＳ１２０へ進む。ステップＳ１２０では、制御装置１０３は、カメラ１０１を制御してストライプ光が培養容器を透過する光の像を撮像し、取得した画像データを記録部１０４へ記録する。その後、ステップＳ１３０へ進む。

ステップＳ１３０では、制御装置１０３は、上述したようにストライプ光が９０度回転するように照明装置１０２を移動させ、培養容器に照射するストライプ光を移動させる。その後、ステップＳ１４０へ進み、制御装置１０３は、必要量の画像を取得したか、すなわち縦ストライプ画像と横ストライプ画像の取得が完了したか否かを判断する。必要量のストライプ画像の取得が完了していないと判断した場合には、ステップＳ１２０へ戻って処理を繰り返す。これに対して必要量のストライプ画像の取得が完了したと判断した場合には、ステップＳ１５０へ進む。

ステップＳ１５０では、取得した各ストライプ画像に対してストライプの方向と垂直方向にラインプロファイルを取得するための計算対象領域８ａを設定する。その後、ステップＳ１６０へ進み、設定した計算対象領域８ａを対象として各画素のＲ、Ｇ、Ｂ各色成分の輝度値のラインプロファイルを取得してステップＳ１７０へ進む。ステップＳ１７０では、各色成分ごとの輝度値のラインプロファイルをフーリエ変換して空間周波数についてＭＴＦを算出する。その後、ステップＳ１８０へ進む。

ステップＳ１８０では、あらかじめ算出してある培地のみの場合のＭＴＦを用いて、各色成分ごとに培地のみの場合のＭＴＦに対するラインプロファイルに基づいて算出したＭＴＦの割合を算出する。そして、算出したＭＴＦの割合を図１２に示した各色成分ごとのグラフ１２ａ〜１２ｃに当てはめることによって、ストライプ画像上のラインプロファイルを取得した領域内の培地に対する細胞の占有率を算出し、この処理をストライプ画像全体に対して実行することによって、培養容器内の培地全体に対して細胞の占有率を算出する。その後、処理を終了する。

以上説明した第２の実施の形態によれば、第１の実施の形態における作用効果に加えて、以下のような作用効果を得ることができる。
（１）色成分ごとの輝度値のラインプロファイルをフーリエ変換して空間周波数についてＭＴＦを算出し、算出結果を各色成分ごとのグラフ１２ａ〜１２ｃに当てはめることによって、ストライプ画像上のラインプロファイルを取得した領域内の培地に対する細胞の占有率を算出するようにした。これによって、細胞が存在している場合のＭＴＦは、空間周波数が基本周波数の整数倍となる点において培地のみの場合のＭＴＦよりも減少し、その減少する割合と培地に対する細胞の占有率との相には相関関係があることを加味して、精度高く培地に対する細胞の占有率を算出することができる。

（２）縦ストライプ画像と横ストライプ画像のそれぞれに対して処理を実行し、ストライプ画像の縦方向のラインプロファイルに基づく細胞の占有率と、横方向のラインプロファイルに基づく細胞の占有率とを算出するようにした。これによって、両方向の細胞の占有率に基づいて細胞の占有率を２次元で把握することができる。

―変形例―
なお、上述した実施の形態の観察装置は、以下のように変形することもできる。
（１）上述した第１および第２の実施の形態では、照明装置１０２はサンプルＡを下部から照明し、カメラ１０１はサンプルＡを透過した透過光の像をサンプルＡの上部から撮像する例について説明した。しかしながら、照明装置１０２はサンプルＡを上部から照明し、カメラ１０１はサンプルＡを透過した透過光の像をサンプルＡの下部から撮像するようにしてもよい。

（２）上述した第２の実施の形態では、照明装置１０２を９０度回転して得た縦ストライプ画像と横ストライプ画像とに基づいて、縦方向に設定した計算対象領域８ａ内の細胞の占有率と、横方向に設定した計算対象領域８ａ内の細胞の占有率とを算出して、細胞の占有率を２次元で把握できるようにした。これは第１の実施の形態にも適用可能であり、縦ストライプ画像と横ストライプ画像とのそれぞれにおいて、黒い領域３ｂ内に計算対象領域３ｄを設定してもよい。これによって、縦方向に設定した計算対象領域３ｄ、および横方向に設定した計算対象領域３ｄのそれぞれについて細胞の占有率を算出することができ、第１の実施の形態でも細胞の占有率を２次元で把握することができる。

（３）上述した第１および第２の実施の形態では、観察装置１００によって培養容器内の培地に対する細胞の占有率を算出する例について説明した。しかしこれに限定されず、本発明における観察装置１００を細胞を自動培養するための培養装置に適用し、培養装置において培地に対する細胞の占有率を算出して、培養状況の監視を行うようにしてもよい。そして、培養装置は、培養状況の監視を行った結果、その培養状況を使用者に通知してもよく、あるいは培養状況に応じて自動継代を実行するようにしてもよい。

（４）上述した第１および第２の実施の形態では、ストライプ光を移動させるために照明装置１０２を移動させる例について説明したが、培養容器を移動させることによって相対的に培養容器に照射されるストライプ光を移動させてもよい。

なお、本発明の特徴的な機能を損なわない限り、本発明は、上述した実施の形態における構成に何ら限定されない。

観察装置の一実施の形態の構成を模式的に示した図である。カメラ１０１におけるＣＣＤのカラーフィルタの配列図である。ストライプ画像の具体例を示す図である。Ｒ成分についての輝度値に対する画素数のヒストグラムの具体例を示す図である。各色成分における培地領域と細胞領域とのヒストグラムの分散および尖度と、細胞の密度との関係を示す図である。第１の実施の形態における観察装置１００の処理を示すフローチャート図である。横ストライプ画像の具体例を示す図である。第２の実施の形態における計算対象領域の設定例を示す図である。各色成分の輝度値のラインプロファイルの取得結果を示す図である。空間周波数についてのＭＴＦを示すグラフの具体例を示す図である。基本周波数の整数倍のＭＴＦの比較例を示す図である。基本周波数における培地のみの場合のＭＴＦに対する細胞が存在する場合のＭＴＦの割合と、培地に対する細胞の占有率との相関関係を示す図である。第２の実施の形態における観察装置１００の処理を示すフローチャート図である。

符号の説明

１００観察装置、１０１カメラ、１０２照明装置、１０３制御装置、１０３ａ信号処理部、１０４記録部

Claims

培養される細胞などの試料を観察する観察装置において、
明部と暗部の繰り返してなるストライプ光で前記試料を照明する照明手段と、
前記照明手段により前記試料を照明して前記試料を透過した光のストライプ画像を撮像する撮像手段と、
培養容器内の試料の占有率と前記試料の空間周波数情報の統計処理データとの相関関係を示す相関データを記憶した記憶手段と、
前記撮像手段で撮像された前記ストライプ画像のストライプの方向と直交する方向の画像領域に対する色成分の空間周波数情報に基づいて前記統計処理データを求め、前記記憶手段の相関データを用いて、前記培養容器内における前記試料の占有率を算出する算出手段と、
前記照明手段によるストライプ光を回転する移動手段とを備え、
前記算出手段は、前記移動手段で前記ストライプ光を回転させない場合と９０度回転させた場合とで撮像した縦方向と横方向の前記ストライプ画像の前記画像領域に対する色成分の空間周波数情報に基づいて前記統計処理データを求め、前記培養容器内における前記試料の占有率を算出することを特徴とする観察装置。