JP3740019B2 - 微生物計量装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数種類の微生物（その意味するところは少なくとも細菌と真菌を含む概念である）、即ち、細菌類および真菌類等が付着あるいは混入している可能性のある検体から、微生物若しくはその代謝物を発色させ、生菌数、死菌数および特定菌の菌数若しくは少なくともその存在を簡単にしかも迅速に計量できる微生物計量装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、この種の微生物を計量する微生物計量装置に関するものは、特開平５−１１１３９４に記載されるように微生物を含む試料に直接励起光を当てて、微生物内に生産された蛍光物質から発せられる蛍光を画像データとして取得し、微生物内蛍光物質の濃度を測定し、その蛍光強度の積算から微生物の活性を測定するものが知られている。図１０にその微生物測定方法の詳細を示す。プレパラート１０１にメタン菌懸濁液を設置し、励起光１０２を照射して発生した蛍光を高感度テレビカメラ１０３とＶＴＲ１０４を用いて認識、保存し、画像処理装置１０５を用いてモニタテレビ１０６に映し出された画像から目的の蛍光の強度を検出するものであった。
【０００３】
また、図には示していないが、一般的な付着菌数を求める方法である寒天培地拡散法の一つとして付着菌測定キットも知られている。付着菌測定キットは、培地表面を直接検体に接触させ、検体から付着した微生物を培養し、生じたコロニーを直接若しくはレンズを用いて拡大化したものを目視にて数を測定するものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような従来の微生物計量方法では、蛍光物質を生産しない微生物には対応できないこと、また、活性が弱いために蛍光物質を生産できない微生物は該当の微生物であったとしても検出されないことがあり、必ずしも微生物の活性若しくは数を検出できるものではなかった。微生物計量装置は、食品工場で使用されることが多く、その場合特定の菌よりもまずは、微生物全体がどの程度いるのかが管理上の重要な要素になっている。従って、生野菜の生菌数の基準も一般細菌が１００万個以下／ｍｌとなっている。また、最近のＨＡＣＣＰの導入によって、食品そのものの生菌数検査だけでなく、工場自体や作業行程の検査、例えば、壁・床面、まな板・包丁などの調理器具などの生菌数の検査も行われており、食品そのものの管理及び環境の管理が重要になっている。しかし、その一方で従来の技術は、煩雑であることや専門知識を要することなど、現場で簡単に誰でも測定できるものではなかった。また、装置の点でも微生物によって生産された蛍光物質に励起光を照射し、その蛍光を画像処理にて解析するため、顕微鏡の様に高倍率に拡大するための技術を要すものであった。
【０００５】
また、一般的な付着菌を検出する培養法では、付着した微生物の培養に時間がかかるという問題があった。さらに、微生物の種類によっては付着させた培地上で増殖しない場合があり、過少評価の原因となる場合があった。さらに、培養法は生菌のみを検出するため、その環境に存在していた微生物数及びその生死状態を必ずしも確認できるものではなかった。
【０００６】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、生細胞とのみ反応して生細胞のみを発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、微生物由来のその微生物に固有の物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入された検体接触手段と、前記検体接触手段の一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、励起光照射時間を励起光により発光した蛍光強度が消光しない時間とし、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに微生物１個と判断する微生物判断手段と、０．２〜７μｍの大きさを検知できる受光手段または検体接触手段を連続または断続的に移動させる移動手段と、微生物判断手段から０．２〜７μｍの大きさの微生物１個と判断された信号を順次積算することで前記検体接触手段の微生物の数量を積算する手段を有する微生物計量装置を提供することを目的とする。
【０００７】
また、生細胞とのみ反応して生細胞のみを発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、微生物由来のその微生物に固有の物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入された検出試薬含有部と検体接触手段と、前記検体接触手段の一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、励起光照射時間を励起光により発光した蛍光強度が消光しない時間とし、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに微生物１個と判断する微生物判断手段と、０．２〜７μｍの大きさを検知できる受光手段または検体接触手段を連続または断続的に移動させる移動手段と、微生物判断手段から０．２〜７μｍの大きさの微生物１個と判断された信号を順次積算することで前記検体接触手段の微生物の数量を積算する手段を有する微生物計量装置を提供することを目的とする。
【０００８】
また、微生物を含むあるいは含んでいるかを検査する検体に前記検体接触手段の表面を接触させること、または検体に接触させた転写手段を前記検体接触手段の表面に接触させて検体の微生物を前記検体接触手段に転写させて微生物を計量できる装置を提供することを目的とする。
【０００９】
また、液状の検体についても、前記検体接触手段をその検体を保管する保管槽とし、保管槽に貯蔵された液状の検体が一定の厚みとなるようにした装置を提供することを目的とする。
【００１０】
また、微生物の発色を蛍光とした装置を提供することを目的とする。
【００１１】
また、微生物由来物質と反応することで発色する第１の試薬を含む装置を提供することを目的とする。
【００１２】
また、核酸結合性の第２の試薬を含む装置を提供することを目的とする。
【００１３】
また、核酸結合性の第３の試薬を含む装置を提供することを目的とする。
【００１４】
また、第１の試薬が反応する微生物由来物質を酵素タンパク質とした装置を提供することを目的とする。
【００１５】
また、第４の試薬が反応する微生物由来のその微生物に固有の物質を酵素タンパク質とした装置を提供することを目的とする。
【００１６】
また、受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けた装置を提供することを目的とする。
【００１７】
また、複数の光電変換素子を線状に配置した装置を提供することを目的とする。
【００１８】
また、検体接触手段を円盤状とし、その検体接触手段を可動させることを特徴とした装置を提供することを目的とする。
【００１９】
また、前記検体接触手段を測定する面積を多角形として、その検体接触手段を可動させることを特徴とした装置を提供することを目的とする。
【００２０】
また、光源より発せられる光の集光手段および／または受光手段への集光手段として反射板を設けた装置を提供することを目的とする。
【００２１】
また、光源から発せられる光を光ファイバーを使用して検体接触手段へと導入する手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００２２】
また、紫外線を透過するレンズを光源集光手段として用いたことを特徴とする装置を提供することを目的とする。
【００２３】
また、検体接触手段の測定位置を示す手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００２４】
また、検体接触手段の測定位置を示す手段に磁気を用いる装置を提供することを目的とする。
【００２５】
また、検体接触手段の測定位置を認識する手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００２６】
また、検体接触手段の測定位置を認識する軌道を移動させる際、認識軌道位置から一定の距離を保った状態で次の認識軌道位置へ移動する手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００２７】
また、認識軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとした装置を提供することを目的とする。
【００２８】
また、検体接触手段に含まれる微生物から得られた信号を、二値化した点座標として認識し、信号が得られた点座標の数を計測する機能を有した装置を提供することを目的とする。
【００２９】
また、信号が得られた点座標のうち、近隣した信号を一つの信号として認識する機能を有した装置を提供することを目的とする。
【００３０】
【課題を解決するための手段】
本発明の微生物計量装置は、上記目的を達成するため生細胞とのみ反応して生細胞のみを発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、微生物由来のその微生物に固有の物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入された検体接触手段と、前記検体接触手段の一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、励起光照射時間を励起光により発光した蛍光強度が消光しない時間とし、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに微生物１個と判断する微生物判断手段と、０．２〜７μｍの大きさを検知できる受光手段または検体接触手段を連続または断続的に移動させる移動手段と、微生物判断手段から０．２〜７μｍの大きさの微生物１個と判断された信号を順次積算することで前記検体接触手段の微生物の数量を積算する手段を有するものである。そして、本発明によれば検体接触手段に含まれる微生物の生死状態および／または特定の菌種の数若しくは有無を同時に、かつ迅速に把握することができ、励起光の照射面積及び時間を最小限にすることで励起光による検体接触手段に含まれる化合物の消光を抑えることができるものである。さらに蛍光強度のしきい値を設けることで微生物と異物の区別が可能であり、一定面積に含まれる微生物の数量の計量を迅速かつ同時に行うことができる微生物計量装置が得られる。
【００３１】
また、検体接触手段に微生物の生死状態を把握することができる試薬を含ませることで、微生物の検出を迅速かつ容易にすることができ、検出試薬含有部と検体接触手段を分離することで被検体への検出試薬含有部付着を避けることができる検体接触手段を有する微生物計量装置が得られる。
【００３２】
また、検体接触手段の表面に対象物に含まれる微生物の転写手段を設けることで、検体から効率良く微生物を回収することができ、高感度な微生物計量装置が得られる。
【００３３】
また、液状の検体についても、液状検体を検体接触手段としての保管槽に導入することで、外部からの検体への汚染若しくは外部への検体の汚染を防止できる。さらに、液体の検体を一定の厚みで保持することで光源からの励起光照射面積を一定化し、過大若しくは過少評価を抑えることができる微生物計量装置が得られる。
【００３４】
また、発色を蛍光とすることで高感度な計量が可能な微生物計量装置が得られる。
【００３５】
また、第１の試薬として微生物由来物質である微生物によって生産された物質と反応することで発色する化合物を利用することで、微生物の活性を評価でき、また、生きている微生物のみの計量が可能となる微生物計量装置が得られる。
【００３６】
また、第２の試薬として核酸結合性の化合物を用いることで、死細胞を一細胞レベルまでの検出が可能となり、高感度な微生物計量装置が得られる。
【００３７】
また、第３の試薬として核酸結合性の化合物を用いることで、生死細胞を一細胞レベルまでの検出が可能となり、高感度な微生物計量装置が得られる。
【００３８】
また、第１の試薬が反応する微生物由来物質を酵素タンパク質とすることで、酵素反応を伴うため、高い感度で計量することができる微生物計量装置が得られる。
【００３９】
また、第４の試薬として特定微生物由来物質と反応することで発色する試薬を用いることで特定の微生物を検出できる微生物計量装置が得られる。
【００４０】
また、微生物由来のその微生物に固有の物質を酵素タンパク質とし、これを検出の標的とすることで、酵素反応を伴うため、高い感度で計量することができる微生物計量装置が得られる。
【００４１】
また、光電変換素子を利用することで迅速な計量が可能となり、さらに前段に集光レンズを設けることで高い感度の計量ができる微生物計量装置が得られる。
【００４２】
また、光電変換素子を線状に配置することで、一定範囲の検知を一度に実施することができ、計量を迅速化することができる微生物計量装置が得られる。
【００４３】
また、検体接触手段を円盤状とすることで回転方向への検体接触手段の駆動を容易にし、光源、受光手段の両方若しくは少なくともどちらか一方の検出移動距離を最小限に抑えることができる微生物計量装置が得られる。
【００４４】
また、検体接触手段を多角形とすることで一方向への検体接触手段の駆動を容易にし、光源、受光手段、検体接触手段の少なくとも一つを移動することで微生物を計量できる微生物計量装置が得られる。
【００４５】
また、光源より発せられる光または検体接触手段より発せられた光の少なくともいずれか一方を反射板を使用し、集光することで、検体接触手段への効率の高い照射または受光手段での効率の高い検出が可能となる微生物計量装置が得られる。
【００４６】
また、光ファイバーを利用して光源からの励起光を導入することで、熱源となる光源を別部に設置することが可能となり、さらに検体接触手段が複雑な形状の場合でも常時一定の光量を検体接触手段へと導入することができる微生物計量装置が得られる。
【００４７】
また、光源集光手段に紫外線透過性レンズを使用することで紫外領域の励起波長の光量を減少させることなく検体接触手段へと導入することができる微生物計量装置が得られる。
【００４８】
また、検体接触手段の測定位置を示す手段を設けることで検出位置を認識させることができる装置が得られる。
【００４９】
また、検体接触手段の測定位置を示す手段を設けることで検体接触手段の大きさ、形状等に影響を受けずに検出位置を認識させることができる装置が得られる。
【００５０】
また、検体接触手段に測定位置を示す手段を設けることで検体接触手段の種類に応じて検出位置を認識させることができる微生物計量装置が得られる。
【００５１】
また、検体接触手段の測定位置を示す手段を磁気とすることで簡略かつ正確に検体接触手段の検出位置を認識させることができる微生物計量装置が得られる。
【００５２】
また、検体接触手段の測定位置を認識する手段を有することで検体接触手段の検出対象位置を調整することができる微生物計量装置が得られる。
【００５３】
また、検体接触手段の測定位置を認識する軌道位置から次の認識軌道位置までを一定の距離を保った状態で移動させる手段を有することで検体全体を検出する必要がなくなり、計量を迅速化できる微生物計量装置が得られる。
【００５４】
また、検体接触手段の測定位置を認識する軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとすることで培養法と相関性の高い計量が可能となる微生物計量装置が得られる。
【００５５】
また、検体接触手段に含まれる微生物から得られた信号を二値化した点座標として認識することで、容易で迅速に計量することができる微生物計量装置が得られる。
【００５６】
また、信号が得られた点座標のうち近隣した信号を一つの信号として認識することで培養法と相関性の高い計量が可能となる微生物計量装置が得られる。
【００５７】
【発明の実施の形態】
本発明は、被検体に含まれる微生物を計量する装置であり、フードスタンプのような形状かあるいはフィルム状など壁面や調理器具など容易に接触できる形状あるいは把手がついた構造などを有した検体接触手段に、予め、生細胞を発色させる第１の試薬と死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類を混入しておくものである。この検体接触手段は目的に応じて混入する試薬を変えることで検査対象を変えることができる。例えば、検査対象を生菌のみとした場合は第１の試薬だけを、殺菌効果を検証する場合は第１と第２の試薬を混入するなど測定したい目的、対象によって任意に選定することができる。検体接触手段は通常使われる培養するタイプであれば、直径４０ｍｍ程度の大きさであるが、そこに含まれる菌の大きさが１乃至５μｍと非常に小さく、従来使用されているＣＣＤカメラを使い、画像処理をおこなうと、必要な画素数が膨大になり、直接的な認識が困難になるため、１０００倍程度の拡大手段を用いないと認識できなかった。そこで、本発明者らは、検体接触手段の検体と接触させた面の中に含まれる菌の大きさに着目し、１乃至５μｍ角の面積（受光手段の輝度として測定できればできるだけ大きな面積が望ましいが、フォトダイオードと同じ程度の大きさ３０μｍ角以下が望ましい）に予め定められた波長域で励起光を照射し、その励起光によって発光する光量を測定し、その積算から微生物の数を計量することにしたものである。このとき、励起光を照射して、発光した蛍光の強度は時間とともに変化する。従って、一定の発光光量の範囲内での時間を設定し、そのときの光量で微生物の有無を判断する必要がある。具体的には、微生物以外の不純物は、蛍光を発しないが、励起光の散乱光など発し、受光時に影響を受けることがあるため、受光した光量がある一定値以上を示した場合を微生物と判断する。また、不純物の種類によっては微生物以上の蛍光を発する場合も想定されるため、設定した光量の範囲内のときに微生物と判断させ、基本的には、範囲内の光量を受光した場合を１個の微生物として計量する。そして、この励起光を照射する微小面積を連続的あるいは断続的に移動させ、例えば、従来法の寒天培地拡散法のデータと比較する場合には、直径４０ｍｍの面積全体をスキャンし、その面積での微生物の数を積算して計量することができる。従って、励起光による化合物の消光に伴う過少評価の発生を防止し、異物から発せられる発光による過大評価の発生を防止する能力を有するものであり、従来の培養法や抗体法と比べ、特殊な技術や設備を必要とせず、短時間で微生物の生死の確認ならびに生死菌数の計量をすることができる。
【００５８】
また、第１乃至第４の試薬は、できるだけ無害な試薬を選定することは当然である。しかし、本微生物計量装置は主に食品工場などで使用させることが多く、検体の対象が調理器具などの場合、例え無害であっても、その試薬を含んだ検体接触手段を接触させるのは、衛生上好ましくない。また、試薬の特性によっては励起光に照射する直前に検体に反応させた方が望ましい場合もあり、第１乃至第４の化合物は、検体接触手段とは別にフィルムなどに担持したり、容器に貯蔵し、検体接触手段に直前に添加した方が良い場合がある。本観点を踏まえた上で、例えば、検出試薬含有部には生死細胞の膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合する試薬の一つである４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを検体試薬含有部に保持し、検体試薬含有部から検体接触手段にて採取された微生物に浸透させる。また、同時に死細胞の膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合する試薬の一つであるプロピジウムイオダイドを用いて二重染色し、それぞれに特異的な波長の励起光を照射して発色させることで採取された微生物の生死を判定することができる。あるいは、６−カルボキシフルオレセインジアセテートのように細胞内に浸透し、生菌細胞内に存在するエステラーゼによって分解されることで発色する化合物に特異的な波長の励起光を照射して発色させることで生菌を直接検出することができる。また、特定微生物由来物質と反応する化合物を含有させた検体試薬含有部と微生物接触手段を用いることで、検体より採取された微生物の中に検出対象となる微生物がいるかどうかを迅速に確認できるという作用を有する。
【００５９】
また、被検体に存在する微生物を転写手段を利用することで検体接触手段へ効率良く付着させる。転写手段としては、粘性を有するもの格子状にて付着しやすいものなどが挙げられる。本転写手段を有する検体接触手段を用いて検出することで被検体に含まれる微生物の過少評価を防止できるという作用を有する。
【００６０】
また、検体が液体の場合でも検体を保管する保管槽を利用することで検出が可能となる。保管槽の例として、検体を添加する部位が薄層になっており、そこに検体を導入することで検体が広がり、検体に含まれる微生物が一定化される。それを検出するものである。あるいは、予め、細溝を保管槽に作製しておき、そこに液体の検体を流し込むことで、液体の検体を保管槽に広げることが可能となる。さらに保管槽に貯蔵された液状の検体が一定の厚みとなるようにした検体接触手段を使用することで、光源若しくは受光手段から検体までの距離を一定に保持し、誤差の少ない評価を実施することができるという作用を有する。
【００６１】
また、発色を蛍光とすることで、高感度に検出することが可能となり、微小な検体も高感度に検出することができるという作用を有する。
【００６２】
また、生細胞を発色させる化合物を微生物由来物質と反応することで発色する試薬とすることにより、その微生物由来物質の生産量を検出することで微生物の活性を評価することができる。また、その際、発色した微生物数を計量することによりその数を把握することができる作用を有する。
【００６３】
また、生死細胞、死細胞を発色させる試薬を核酸結合性の試薬とすることで、細胞内に保持されている核酸を検出でき、それに伴い一細胞レベルまで検出可能となり、存在する微生物数を計量することができる。
【００６４】
また、特定微生物由来物質に標的を置くことで、特定微生物を検出することができる。さらにその標的を酵素タンパク質とすることで高い感度で検出が可能となり、また、特定微生物の活性も把握できる。
【００６５】
また、受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けたことで励起光によって発生した蛍光範囲を拡大した状態で光電変換素子へ導入することが可能となるため高い検出感度を保持できるという作用を有する。
【００６６】
また、受光手段に含まれる複数の光電変換素子を線状に配置することによってＸ軸方向（配列方向）への移動を不要なものとし、Ｙ軸方向（移動方向）のみの移動によって一定範囲の検知を実施することが可能となり、計量を迅速に実施することができるという作用を有する。
【００６７】
また、検体接触手段を円盤状とし、その検体接触手段を可動させることで検体若しくは光源の回転による検出が可能となる。検出方法としては、例えば、光ディスク読み取り用装置が挙げられる。検体接触手段を設置し、回転させることで光源の移動を検体接触手段の半径のみで実施可能となる。それにより検出を自動化、迅速化することができるという作用を有する。
【００６８】
また、検体接触手段を多角形として、その検体接触手段を可動させることで検体接触手段上に含まれる微生物の検出が容易に可能となる。検出手段としては、例えば、スキャナーが挙げられる。検体接触手段を設置し、移動させることで、これにより検出を自動化、迅速化することができるという作用を有する。
【００６９】
また、光源より発せられる光の集光手段および／または受光手段への集光手段として反射板を設けることによって余計な光のロスを防止し、また、光を集めることで感度を高めることができるという作用を有する。
【００７０】
また、光源から発せられる光を光ファイバーを使用して検体接触手段へと導入する手段を有することで複雑な形状の検体接触手段でも安定した励起光を提供することができる。さらに、光ファイバーを使用することで光源部を別部に設けることが可能となる。これにより、発熱する光源を使用した場合でも、その発熱による検体接触手段および検体接触手段にて採取された微生物に対する負荷を最小限とすることができるという作用を有する。
【００７１】
また、紫外光を透過するレンズを使用することで光源に紫外光発生手段を使用でき、紫外領域の励起光でも安定的に検体接触手段へ提供できる。
【００７２】
また、装置若しくは検体接触手段に測定位置を示す部位を設け、受光手段に測定位置を認識する手段を設けることで光源または受光手段の少なくともいずれか一方が存在する位置を把握し、同位置の二重検出若しくは検出もれを防ぎ、過大若しくは過少評価を避けることができる。さらに、検体接触手段の測定位置を示す手段に磁気を用いることで簡易的かつ正確な位置認識が可能となり、過大若しくは過少評価を避けることができるという作用を有する。
【００７３】
また、検体接触手段の測定位置を認識する軌道を移動させる際、認識軌道位置から一定の距離を保った状態で次の認識軌道位置へ移動させることで検出もれを防止し、検体接触手段全体を検出することが可能となる。さらに、認識軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとすることで従来法の一つである培養法との相関性を高めることができるという作用を有する。これは、培養法においてコロニーが重複することによって一つのコロニーと認識する範囲を避ける事ができる最低限の距離である。
【００７４】
また、検体接触手段に含まれる微生物から得られた信号を、二値化した点座標として認識し、信号が得られた点座標の数を計測することにより、検体接触手段に含まれる微生物を容易にかつ迅速に計量することができる。さらにその二値化した点座標から輝度を求め、菌が保有する活性を計量することも可能となる。また、近隣した信号を一つの信号と認識することで培養法との相関性を高めることができる。さらに近隣した信号から検体接触手段に付着した付着物の形状を把握することができ、微生物以外の形状のものは計量から除去することが可能となり、精度を向上することができるという作用を有する。
【００７５】
以下、本発明の実施例について図面を参照しながら説明する。
【００７６】
【実施例】
以下に本発明の実施例１について説明する。
【００７７】
図１に示すように微生物計量装置に設置されている励起光の検体上における軌道は、検体接触手段１全体を網羅するものであることが望まれる。そのために検体の幅、長さを軌道Ａ２のように移動し、検出するものである。また、図２に示したように検体全体を検出するための軌道は円状のものも可能であるため軌道Ｂ３のように移動し、検出することも可能である。光源４は、検体接触手段上を各軌道に沿って移動させ、光源４より発した励起光によって生ずる蛍光を利用した微生物判断手段のモデルを図３に示した。検体から発せられた蛍光は蛍光を発した部位と相関して微生物判断手段５を形成する。微生物判断手段５には、不純物などから生ずる散乱光あるいは同励起光によって発生する蛍光などが混在しており、目的の微生物から発せられる蛍光に限定されたものではない場合が生ずる。そこで、しきい値を設けるものである。しきい値は、蛍光強度の上限６と下限７があり、その範囲内の蛍光を微生物由来のものとして認識し、積算する。これにより、微生物以外の不純物由来の蛍光を把握し、正確な計量を可能なものとしたものである。しきい値は、微生物が発する蛍光強度によって決定されるものである。また、微生物が近接している場合、微生物が発する蛍光から形成される波形は、図４に示したように隣接したものが得られる。この場合、隣接した微生物を従来法の一つである寒天培地拡散法で検出した場合、微生物の増殖とコロニーの拡大に伴い、コロニー同士が重層し、目視で確認する時点で一つのコロニーとして判断してしまう場合がある。そこで、本発明において波形８に示すような場合は、一つの微生物として検出するように設定した。これにより寒天培地拡散法との相関性を得ることができるものである。
【００７８】
また、検体接触手段１への励起光照射時間は、図５に示したように蛍光強度が消光しない時間の範囲で照射される。即ち、しきい値９の範囲である。
【００７９】
図６に示すように微生物計量装置は、光源４、光源集光手段としてのレンズ１０、受光部１１より成る。光源４から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルター１２で分光する。分光された励起光はプリズム１３を経て、光路を変化させられる。光路を変化した励起光はレンズ１０を経て検体接触手段１の表面に集光される。そこで励起光によって励起された微生物が有する蛍光は、再びプリズム１３を透過する。その際、蛍光はプリズム１３をそのまま透過し、受光部１１に到達する。受光部１１に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルター１４を経て、受光部１１に内蔵された光電変換素子１５に到達し、信号化され、認識される。また、図には示していないが、検体接触手段１若しくは微生物計量装置には、検体接触手段を移動する手段を備えており、検体接触手段１の蛍光発色を全て、若しくは一部を受光することができる。
【００８０】
光電変換素子１５に到達した蛍光は、微生物判断手段５において微生物若しくは異物と判断され、微生物と判断された蛍光は積算されて、その数量が計量される。
【００８１】
光源４より発生した励起光は、レンズ１０によって集光されるが、その際、レンズ１０によって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。この場合、微小な一定面積とは細菌や真菌などの大きさに基づいて設定した場合、一辺０．２μｍ乃至７．０μｍ程度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖した微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、この場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。
【００８２】
レンズ１０によって集光された励起光の照射時間は、蛍光を発する化合物の消光時間と励起光強度に依存する。化合物の種類によっては、自然界に存在する紫外光によっても分解する場合があり、２秒乃至３００秒前後の範囲内で励起光を照射することが望ましい。
【００８３】
発色後の輝度を認識する場合、図７に示したように蛍光発色した位置を「０」と「１」の二値化にて表現する。二値化した場合、隣接した発色を一つの発色源１６としてみなす。また、発色源の大きさおよびその輝度が設定の大きさと比較して相対的に大きく異なる場合、異物１７として認識し、検査対象外とみなすことで微生物として計量しない。隣接した発色の隣接距離としては、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養され、増殖した微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。
【００８４】
検体上に付着された微生物は、発色性化合物によって蛍光を発する。発色する化合物としては、微生物の生死にかかわらず、非特異的に微生物細胞内へ浸透し、微生物の核酸へ結合することで発色する試薬の一つである４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールや死細胞に非特異的に浸透し、微生物の核酸へ結合することで発色する試薬の一つであるプロピジウムイオダイドが挙げられる。その他にも発色させる試薬として６−カルボキシフルオレセインジアセテート、２'，７'ジクロロフルオレセインジアセテート、６−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）−３'，６'−０，０'−ジアセチルフルオレセイン、ジヒドロドローダミン、二酢酸フルオレセイン、二酢酸４−アジドフルオレセインなどが挙げられる。これらの発光は、細胞内の酵素活性に依存しており、生菌を染色することができる。また、大腸菌群などの特定微生物を染色する試薬として、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドなどが挙げられる。これらは、特定微生物が生産する酵素と特異的に反応してそれぞれ４−メチルウンベリフェロンに分解される。４−メチルウンベリフェロンは紫外光に対し、励起され蛍光を発する。紫外光によって励起された蛍光を検出することによって特定微生物の数若しくはその有無を検出することが可能となる。
【００８５】
本発明はこれら発色後の微生物を検出する手段である。各化合物は、異なる波長の最大励起波長を有し、励起された後、異なる波長の蛍光を発するため多重染色が可能となる。発色を検出する際、光源４の波長の幅が広いものである場合は、励起光分光フィルター１２によって励起波長を調整、分光することが可能となる。励起光分光フィルター１２は、目的の検出対象に応じて変えられるため、様々な蛍光試薬に対応できる。また、同時に、発色した蛍光波長の幅が広いものである場合は、目的の発色を検出するために蛍光分光フィルター１４を目的の検出対象に応じて変えることで様々な蛍光試薬に対応できる。
【００８６】
光源４としては、各種ダイオード、ハロゲンランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、ブラックライト、水銀ランプなどが挙げられる。これらの光源のうち最大励起波長が比較的限定されているダイオード、冷陰極管、ブラックライトなどは、前記励起光分光フィルター１２および蛍光分光フィルター１４を使用することなく実施できる場合がある。また、ハロゲンランプ、水銀ランプなどについては、励起光分光フィルター１２および蛍光分光フィルター１４を使用する必要がある場合がある。
【００８７】
プリズム１３およびレンズ１０は、必要に応じてそれぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスなどが挙げられる。これにより紫外光で励起される蛍光試薬などにも対応できる。検体接触手段１を設置する部位は回転能を有し、その上部に検体接触手段１を設置する。レンズ１０により集光された励起光は、検体接触手段１の外周部より中心部へ、若しくは、中心部より外周部へ、半径分の距離を移動する。その際、レンズ３により集光された励起光の位置が外周部に存在するときと中心部に存在するときの検体接触手段１の回転速度を変化させることによって、レンズ１０により集光された励起光が外周部に存在するときと中心部に存在するときの励起された化合物が発した蛍光のずれ、残像および残光の発生を防止することができる。
【００８８】
なお、集光した位置を認識する手段を設けることでレンズ１０によって集光された励起光の位置を認識し、集光が軌道から逸れないように、また、逸れた場合は再び軌道に戻すように設定されるものである。
【００８９】
なお、発色試薬は、細胞浸透性のものを挙げているが、細胞膜付着性、細胞壁付着性、糖鎖結合性、各官能基結合性、アミノ酸付着性、イオン感受性、酸素反応性などの発色試薬の場合でも同様に検出可能である。
【００９０】
なお、発色試薬は、励起光によって励起され蛍光を発するものを挙げているが、細胞を染色し、着色する能力の有る試薬の場合でも同様に検出可能である。
【００９１】
なお、励起光を照射する微小な一定面積は、正方形を含む多角形に限らず、円形、楕円形等でも可能であり、検体を照射できるものであればよい。
【００９２】
なお、検体接触手段に含有する化合物は多重染色を実施することも可能であるが、必ずしも各化合物を混合する必要は無い。例えば、一つの検体接触手段を染色化合物の数に相当する分割を行い、それぞれを検出するなども可能である。
【００９３】
なお、励起光若しくは蛍光を分光する手段として回折格子などを利用することも可能である。
【００９４】
なお、検体接触手段１の回転速度を調整することで蛍光の残像および残光を防ぐとしたが、励起光を照射するレンズ１０の移動速度を調整することで残像および残光を防ぐことも可能である。
【００９５】
なお、集光した位置を認識する手段は、必ずしも励起光の集光位置を直接認識する必要は無く、検体接触手段１上の軌道を把握するものであればよい。
【００９６】
以下に本発明の実施例２について説明する。
【００９７】
図８に示すように微生物計量装置は、検体接触手段１、光源４、反射板１８、レンズ１０、受光部１１より成る。光源４から発せられた励起光によって、検体中に存在する染色後の微生物から励起され、生じた蛍光を反射板１８によって光の方向を変化させ、レンズ１０によって集光し、受光部１１にて検出する。受光部１１に到達した蛍光は、微生物判断手段５において微生物若しくは異物と判断され、微生物と判断された蛍光は積算されて、その数量が計量される。光源４は、検体接触手段１をスキャンする。さらに、光源４の軌道に合わせて反射板１８を設置させる。
【００９８】
光源４より発生した励起光は、レンズ１０によって集光されるが、その際、励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。この場合、微小な一定面積とは細菌など微生物の大きさに基づいて設定した場合、一辺０．２μｍ乃至７．０μｍ程度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖された微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、この場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。
【００９９】
レンズ１０によって集光された励起光の照射時間は、蛍光を発する化合物の消光時間と励起光強度に依存する。化合物の種類によっては、自然界に存在する紫外光によっても分解する場合があり、２秒乃至３００秒前後の範囲内で照射することが望ましい。
【０１００】
光源４としては、各種ダイオード、ハロゲンランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、ブラックライトなどが挙げられる。
【０１０１】
反射板１８およびレンズ１０は、必要に応じて、それぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスなどが挙げられる。これにより紫外光によって励起される蛍光試薬などにも対応できる。
【０１０２】
なお、検体接触手段１への光源４より発せられる励起光の強度の減少若しくは外部光による蛍光への影響を防ぐために検体接触手段１を暗視野環境下に置くための暗視野板等を設置することも可能である。
【０１０３】
なお、光源４が移動するとは限らない。検体接触手段１を移動させ、付着した微生物を検出することも可能である。
【０１０４】
なお、光源４が内蔵されているとは限らない。外部に光源４を含む光源部を設け、そこから光ファイバー等を利用して装置内へ励起光を導入することも可能である。
【０１０５】
なお、光源の種類により、目的以外の波長を除去する手段を設けることも可能である。例えば、励起光分光フィルターや回折格子などが手段として挙げられる。
【０１０６】
なお、発せられる蛍光の種類により、目的以外の波長を除去する手段を設けることも可能である。例えば、蛍光分光フィルターや回折格子などが手段として挙げられる。
【０１０７】
なお、反射板１８の代わりにプリズム体などを利用することも可能である。
【０１０８】
以下に本発明の実施例３について説明する。
【０１０９】
図９に示すように検体接触手段１は、作業者の取り扱い性を向上するために把手部１９と検査対象から微生物を付着させるための検体接触部２０と検出開始点を認識するための検出開始線２１と検出軌道を認識するための検体認識軌道２２からなる。
【０１１０】
作業者は、把手部１９を手に取り、目的の検査対象へ数秒押し付ける。その際、検体接触部２０が破砕しない程度の強度と時間で実施する。検査対象より付着した微生物は、その状態あるいはその性質によって発色する化合物の添加若しくは検体接触部２０に予め含有されている化合物の浸透によって染色される。染色後の微生物を含む検体接触手段１の検出を開始する。また、検体接触手段１上に集光せしめた励起光の位置を認識させるため、検体接触手段１に予め設けられている検体認識軌道２２を検出し励起光の位置を認識するものである。図６記載のレンズ１０より集光された励起光は、検出開始線２１を開始点として、外周を移動する。外周移動後、再び検出開始線２１に到達後、図６記載のレンズ１０より集光された励起光は、一つ内側の検体認識軌道２２にずれ、その軌道上に含まれる発色数を認識する。これを繰り返しながら中心へ向かって励起光を移動させることによって検出を必要とする面積に含まれる微生物数を検出する。
【０１１１】
検体接触部２０に用いられる物質は、蛍光に影響しない物質が望ましい。また、被検体より微生物を効率良く接触するために粘着性のあるものが望ましい。例えば、アラビアゴム、アクリル樹脂など各種高分子や寒天のように適度の水分を含み、粘着性を有するものである。
【０１１２】
検出開始線２１は、直接検体接触手段へ刻み込まれたマーキングや励起光あるいは集光位置を認識できる反射性を有したマーカーなどが挙げられる。これは、検体認識軌道２２も同様であるが、このマーカーが蛍光に影響を与えないものを使用することが望ましい。
【０１１３】
なお、把手部は外周に存在するとは限らない。
【０１１４】
なお、検出開始点を認識するのは、線とは限らない。
【０１１５】
なお、検出軌道はらせん状や斜め方向でも構わない。
【０１１６】
なお、励起光の移動は外周からとは限らない。
【０１１７】
【発明の効果】
以上の実施例から明らかなように、本発明によれば被検体に存在する微生物のうち、その場に存在している全ての菌数、生菌数、死菌数、特定の菌の菌数若しくはその有無を、異なる波長の励起光で励起され、異なる波長の蛍光で蛍光を発する試薬を用いて同時に、かつ迅速に検出できる。さらに励起光による蛍光の消光を抑え、正確に検出できるようにしたものであり、しきい値を設けたことで、設定した範囲内の光量を受光した場合を１個の微生物として計量し、異物混入による過大評価を防止し、高い感度を保持した微生物計量装置を提供できる。
【０１１８】
また、各検出試薬を検出試薬含有部に含ませ、検体接触手段と分離したことで検体接触手段を直接被検体に付着させることが可能となり、対象が食品や医療器具などの場合の検出試薬付着防止という点で衛生状態を保持したものである。これにより、被検体への直接接触が可能なため高感度な微生物検出が可能となる微生物計量装置を提供できる。
【０１１９】
また、被検体から転写手段によって微生物を検体接触手段へ転写することで被検体に含まれる微生物を効率良く付着させることが可能となるため高感度な微生物計量装置を提供できる。
【０１２０】
また、液状の検体の場合でも、その検体を保管する保管槽を用いることで計量可能となり、さらに保管槽に貯蔵された液状の検体が一定の厚みとなるようにすることで検体より採取された微生物の拡散による過大若しくは過少評価を防止できるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２１】
また、発色を蛍光とすることで感度を高め、さらに異なる波長の蛍光を発する検出試薬を用いることで複数の菌を一度で検出できるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２２】
また、生菌検出化合物を微生物由来物質と反応する物質とすることで、微生物由来物質の生産量から微生物の活性を評価することができる。また、その際、発色した微生物数を計量することによりその数を把握することができるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。さらに別に異なる波長によって励起され、核酸結合性の化合物を利用することで、細胞内に保持されている核酸を染めることが可能となり、一細胞レベルまで正確に検出することができるという効果の有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２３】
また、特定微生物の生産する物質によって発色する化合物を利用することで特定微生物を検出することができ、さらにその標的を酵素タンパク質とすることで高い感度で検出が可能となり、また、特定微生物の活性も把握できるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２４】
また、受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けたことで高い検出感度を得ることができる。さらに、光電変換素子を線状に配置することで一方向へのスキャンで検体接触手段上に存在する微生物を検出することができ、微生物の計量を迅速化することができるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２５】
また、検体接触手段を円盤状とすることで回転方向への検体接触手段の駆動を容易にし、それにより検出速度の向上が可能となる。さらに光源、受光手段の少なくともどちらか一方の検体検出移動距離を最小限に抑えることができる。それに伴い、検出時間の迅速化および微生物計量装置の簡易化が可能になるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２６】
また、光源より発せられる励起光の検体への照射の微小面積を設定速度範囲内で可動させることで発色のずれや残像、残光を防止でき、それに伴い過大若しくは過少評価を防止することができるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２７】
また、光源より発せられる光または検体接触手段より発せられた光の少なくともいずれか一方を反射板を使用し、集光することで、検体接触手段への効率の高い照射または受光手段での効率の高い検出が可能になり、装置構成を簡易化することができるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２８】
また、光ファイバーを利用して光源からの励起光を導入することで、熱源となる光源を別部に設置することが可能となり、これにより検体接触手段に採取された微生物あるいは関連タンパク質等への熱の影響を防止し、誤差拡大の回避が可能となる。さらに検体接触手段が複雑な形状の場合でも常時、一定の光を検体接触手段へと導入することができ、より正確な計量が可能になるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２９】
また、光源集光手段に紫外光透過性レンズを使用することで紫外領域の波長の光量を減少させることなく検体接触手段へと導入することができ、紫外領域の波長によって検出可能な化合物の計量ができるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１３０】
また、装置若しくは検体接触手段に測定位置を示す手段を設けることで検出位置を認識させることができ、誤検出の防止あるいは検体検出速度の調整ができる。さらに、検体認識手段の測定位置を示す手段に磁気を利用することで簡易かつ正確な検出が可能となるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１３１】
また、検体接触手段の測定位置を認識する軌道位置から次の認識軌道位置までを一定の距離を保った状態で移動させる手段を有することで検体全体を検出する必要がなくなり、迅速化が可能となる。また、各軌道間に位置する微生物の誤認識を防止し、より正確な計量を実施できる。さらに、各軌道間の距離を１０乃至５０μｍとすることで従来法との相関性を出すことができるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１３２】
また、検体接触手段に含まれる微生物から得られた蛍光を「０」と「１」の二値化した点座標として認識することで、容易でかつ迅速に計量でき、その位置関係によって異物として認識されたものを対象外として除去し、同様にその位置関係として微生物として認識されたもののうち、従来法の寒天培地拡散法と比較した場合、近隣した微生物として認識されたものを一つ微生物として認識することで従来法と相関性を有するという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の実施例１の励起光の検体上における軌道Ａの構成図
【図２】 同実施例１の励起光の検体上における軌道Ｂの構成図
【図３】 同実施例１の波形モデルを示す図
【図４】 同実施例１の微生物隣接存在時における波形モデルを示す図
【図５】 同実施例１の蛍光消光モデルを示す図
【図６】 同実施例１の微生物計量装置を示す図
【図７】 同実施例１の二値化モデルを示す図
【図８】 本発明の実施例２の微生物計量装置を示す図
【図９】 本発明の実施例３の検体接触手段を示す図
【図１０】 従来例の微生物測定装置の構成図
【符号の説明】
１ 検体接触手段
２ 軌道Ａ
３ 軌道Ｂ
４ 光源
５ 微生物判断手段
６ 上限
７ 下限
８ 波形
９ しきい値
１０ レンズ
１１ 受光部
１２ 励起光分光フィルター
１３ プリズム
１４ 蛍光分光フィルター
１５ 光電変換素子
１６ 発色源
１７ 異物
１８ 反射板
１９ 把手部
２０ 検体接触部
２１ 検出開始線
２２ 検体認識軌道
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数種類の微生物（その意味するところは少なくとも細菌と真菌を含む概念である）、即ち、細菌類および真菌類等が付着あるいは混入している可能性のある検体から、微生物若しくはその代謝物を発色させ、生菌数、死菌数および特定菌の菌数若しくは少なくともその存在を簡単にしかも迅速に計量できる微生物計量装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、この種の微生物を計量する微生物計量装置に関するものは、特開平５−１１１３９４に記載されるように微生物を含む試料に直接励起光を当てて、微生物内に生産された蛍光物質から発せられる蛍光を画像データとして取得し、微生物内蛍光物質の濃度を測定し、その蛍光強度の積算から微生物の活性を測定するものが知られている。図１０にその微生物測定方法の詳細を示す。プレパラート１０１にメタン菌懸濁液を設置し、励起光１０２を照射して発生した蛍光を高感度テレビカメラ１０３とＶＴＲ１０４を用いて認識、保存し、画像処理装置１０５を用いてモニタテレビ１０６に映し出された画像から目的の蛍光の強度を検出するものであった。
【０００３】
また、図には示していないが、一般的な付着菌数を求める方法である寒天培地拡散法の一つとして付着菌測定キットも知られている。付着菌測定キットは、培地表面を直接検体に接触させ、検体から付着した微生物を培養し、生じたコロニーを直接若しくはレンズを用いて拡大化したものを目視にて数を測定するものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような従来の微生物計量方法では、蛍光物質を生産しない微生物には対応できないこと、また、活性が弱いために蛍光物質を生産できない微生物は該当の微生物であったとしても検出されないことがあり、必ずしも微生物の活性若しくは数を検出できるものではなかった。微生物計量装置は、食品工場で使用されることが多く、その場合特定の菌よりもまずは、微生物全体がどの程度いるのかが管理上の重要な要素になっている。従って、生野菜の生菌数の基準も一般細菌が１００万個以下／ｍｌとなっている。また、最近のＨＡＣＣＰの導入によって、食品そのものの生菌数検査だけでなく、工場自体や作業行程の検査、例えば、壁・床面、まな板・包丁などの調理器具などの生菌数の検査も行われており、食品そのものの管理及び環境の管理が重要になっている。しかし、その一方で従来の技術は、煩雑であることや専門知識を要することなど、現場で簡単に誰でも測定できるものではなかった。また、装置の点でも微生物によって生産された蛍光物質に励起光を照射し、その蛍光を画像処理にて解析するため、顕微鏡の様に高倍率に拡大するための技術を要すものであった。
【０００５】
また、一般的な付着菌を検出する培養法では、付着した微生物の培養に時間がかかるという問題があった。さらに、微生物の種類によっては付着させた培地上で増殖しない場合があり、過少評価の原因となる場合があった。さらに、培養法は生菌のみを検出するため、その環境に存在していた微生物数及びその生死状態を必ずしも確認できるものではなかった。
【０００６】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、生細胞とのみ反応して生細胞のみを発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、微生物由来のその微生物に固有の物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入された検体接触手段と、前記検体接触手段の一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、励起光照射時間を励起光により発光した蛍光強度が消光しない時間とし、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに微生物１個と判断する微生物判断手段と、０．２〜７μｍの大きさを検知できる受光手段または検体接触手段を連続または断続的に移動させる移動手段と、微生物判断手段から０．２〜７μｍの大きさの微生物１個と判断された信号を順次積算することで前記検体接触手段の微生物の数量を積算する手段を有する微生物計量装置を提供することを目的とする。
【０００７】
また、生細胞とのみ反応して生細胞のみを発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、微生物由来のその微生物に固有の物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入された検出試薬含有部と検体接触手段と、前記検体接触手段の一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、励起光照射時間を励起光により発光した蛍光強度が消光しない時間とし、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに微生物１個と判断する微生物判断手段と、０．２〜７μｍの大きさを検知できる受光手段または検体接触手段を連続または断続的に移動させる移動手段と、微生物判断手段から０．２〜７μｍの大きさの微生物１個と判断された信号を順次積算することで前記検体接触手段の微生物の数量を積算する手段を有する微生物計量装置を提供することを目的とする。
【０００８】
また、微生物を含むあるいは含んでいるかを検査する検体に前記検体接触手段の表面を接触させること、または検体に接触させた転写手段を前記検体接触手段の表面に接触させて検体の微生物を前記検体接触手段に転写させて微生物を計量できる装置を提供することを目的とする。
【０００９】
また、液状の検体についても、前記検体接触手段をその検体を保管する保管槽とし、保管槽に貯蔵された液状の検体が一定の厚みとなるようにした装置を提供することを目的とする。
【００１０】
また、微生物の発色を蛍光とした装置を提供することを目的とする。
【００１１】
また、微生物由来物質と反応することで発色する第１の試薬を含む装置を提供することを目的とする。
【００１２】
また、核酸結合性の第２の試薬を含む装置を提供することを目的とする。
【００１３】
また、核酸結合性の第３の試薬を含む装置を提供することを目的とする。
【００１４】
また、第１の試薬が反応する微生物由来物質を酵素タンパク質とした装置を提供することを目的とする。
【００１５】
また、第４の試薬が反応する微生物由来のその微生物に固有の物質を酵素タンパク質とした装置を提供することを目的とする。
【００１６】
また、受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けた装置を提供することを目的とする。
【００１７】
また、複数の光電変換素子を線状に配置した装置を提供することを目的とする。
【００１８】
また、検体接触手段を円盤状とし、その検体接触手段を可動させることを特徴とした装置を提供することを目的とする。
【００１９】
また、前記検体接触手段を測定する面積を多角形として、その検体接触手段を可動させることを特徴とした装置を提供することを目的とする。
【００２０】
また、光源より発せられる光の集光手段および／または受光手段への集光手段として反射板を設けた装置を提供することを目的とする。
【００２１】
また、光源から発せられる光を光ファイバーを使用して検体接触手段へと導入する手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００２２】
また、紫外線を透過するレンズを光源集光手段として用いたことを特徴とする装置を提供することを目的とする。
【００２３】
また、検体接触手段の測定位置を示す手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００２４】
また、検体接触手段の測定位置を示す手段に磁気を用いる装置を提供することを目的とする。
【００２５】
また、検体接触手段の測定位置を認識する手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００２６】
また、検体接触手段の測定位置を認識する軌道を移動させる際、認識軌道位置から一定の距離を保った状態で次の認識軌道位置へ移動する手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００２７】
また、認識軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとした装置を提供することを目的とする。
【００２８】
また、検体接触手段に含まれる微生物から得られた信号を、二値化した点座標として認識し、信号が得られた点座標の数を計測する機能を有した装置を提供することを目的とする。
【００２９】
また、信号が得られた点座標のうち、近隣した信号を一つの信号として認識する機能を有した装置を提供することを目的とする。
【００３０】
【課題を解決するための手段】
本発明の微生物計量装置は、上記目的を達成するため生細胞とのみ反応して生細胞のみを発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、微生物由来のその微生物に固有の物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入された検体接触手段と、前記検体接触手段の一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、励起光照射時間を励起光により発光した蛍光強度が消光しない時間とし、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに微生物１個と判断する微生物判断手段と、０．２〜７μｍの大きさを検知できる受光手段または検体接触手段を連続または断続的に移動させる移動手段と、微生物判断手段から０．２〜７μｍの大きさの微生物１個と判断された信号を順次積算することで前記検体接触手段の微生物の数量を積算する手段を有するものである。そして、本発明によれば検体接触手段に含まれる微生物の生死状態および／または特定の菌種の数若しくは有無を同時に、かつ迅速に把握することができ、励起光の照射面積及び時間を最小限にすることで励起光による検体接触手段に含まれる化合物の消光を抑えることができるものである。さらに蛍光強度のしきい値を設けることで微生物と異物の区別が可能であり、一定面積に含まれる微生物の数量の計量を迅速かつ同時に行うことができる微生物計量装置が得られる。
【００３１】
また、検体接触手段に微生物の生死状態を把握することができる試薬を含ませることで、微生物の検出を迅速かつ容易にすることができ、検出試薬含有部と検体接触手段を分離することで被検体への検出試薬含有部付着を避けることができる検体接触手段を有する微生物計量装置が得られる。
【００３２】
また、検体接触手段の表面に対象物に含まれる微生物の転写手段を設けることで、検体から効率良く微生物を回収することができ、高感度な微生物計量装置が得られる。
【００３３】
また、液状の検体についても、液状検体を検体接触手段としての保管槽に導入することで、外部からの検体への汚染若しくは外部への検体の汚染を防止できる。さらに、液体の検体を一定の厚みで保持することで光源からの励起光照射面積を一定化し、過大若しくは過少評価を抑えることができる微生物計量装置が得られる。
【００３４】
また、発色を蛍光とすることで高感度な計量が可能な微生物計量装置が得られる。
【００３５】
また、第１の試薬として微生物由来物質である微生物によって生産された物質と反応することで発色する化合物を利用することで、微生物の活性を評価でき、また、生きている微生物のみの計量が可能となる微生物計量装置が得られる。
【００３６】
また、第２の試薬として核酸結合性の化合物を用いることで、死細胞を一細胞レベルまでの検出が可能となり、高感度な微生物計量装置が得られる。
【００３７】
また、第３の試薬として核酸結合性の化合物を用いることで、生死細胞を一細胞レベルまでの検出が可能となり、高感度な微生物計量装置が得られる。
【００３８】
また、第１の試薬が反応する微生物由来物質を酵素タンパク質とすることで、酵素反応を伴うため、高い感度で計量することができる微生物計量装置が得られる。
【００３９】
また、第４の試薬として特定微生物由来物質と反応することで発色する試薬を用いることで特定の微生物を検出できる微生物計量装置が得られる。
【００４０】
また、微生物由来のその微生物に固有の物質を酵素タンパク質とし、これを検出の標的とすることで、酵素反応を伴うため、高い感度で計量することができる微生物計量装置が得られる。
【００４１】
また、光電変換素子を利用することで迅速な計量が可能となり、さらに前段に集光レンズを設けることで高い感度の計量ができる微生物計量装置が得られる。
【００４２】
また、光電変換素子を線状に配置することで、一定範囲の検知を一度に実施することができ、計量を迅速化することができる微生物計量装置が得られる。
【００４３】
また、検体接触手段を円盤状とすることで回転方向への検体接触手段の駆動を容易にし、光源、受光手段の両方若しくは少なくともどちらか一方の検出移動距離を最小限に抑えることができる微生物計量装置が得られる。
【００４４】
また、検体接触手段を多角形とすることで一方向への検体接触手段の駆動を容易にし、光源、受光手段、検体接触手段の少なくとも一つを移動することで微生物を計量できる微生物計量装置が得られる。
【００４５】
また、光源より発せられる光または検体接触手段より発せられた光の少なくともいずれか一方を反射板を使用し、集光することで、検体接触手段への効率の高い照射または受光手段での効率の高い検出が可能となる微生物計量装置が得られる。
【００４６】
また、光ファイバーを利用して光源からの励起光を導入することで、熱源となる光源を別部に設置することが可能となり、さらに検体接触手段が複雑な形状の場合でも常時一定の光量を検体接触手段へと導入することができる微生物計量装置が得られる。
【００４７】
また、光源集光手段に紫外線透過性レンズを使用することで紫外領域の励起波長の光量を減少させることなく検体接触手段へと導入することができる微生物計量装置が得られる。
【００４８】
また、検体接触手段の測定位置を示す手段を設けることで検出位置を認識させることができる装置が得られる。
【００４９】
また、検体接触手段の測定位置を示す手段を設けることで検体接触手段の大きさ、形状等に影響を受けずに検出位置を認識させることができる装置が得られる。
【００５０】
また、検体接触手段に測定位置を示す手段を設けることで検体接触手段の種類に応じて検出位置を認識させることができる微生物計量装置が得られる。
【００５１】
また、検体接触手段の測定位置を示す手段を磁気とすることで簡略かつ正確に検体接触手段の検出位置を認識させることができる微生物計量装置が得られる。
【００５２】
また、検体接触手段の測定位置を認識する手段を有することで検体接触手段の検出対象位置を調整することができる微生物計量装置が得られる。
【００５３】
また、検体接触手段の測定位置を認識する軌道位置から次の認識軌道位置までを一定の距離を保った状態で移動させる手段を有することで検体全体を検出する必要がなくなり、計量を迅速化できる微生物計量装置が得られる。
【００５４】
また、検体接触手段の測定位置を認識する軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとすることで培養法と相関性の高い計量が可能となる微生物計量装置が得られる。
【００５５】
また、検体接触手段に含まれる微生物から得られた信号を二値化した点座標として認識することで、容易で迅速に計量することができる微生物計量装置が得られる。
【００５６】
また、信号が得られた点座標のうち近隣した信号を一つの信号として認識することで培養法と相関性の高い計量が可能となる微生物計量装置が得られる。
【００５７】
【発明の実施の形態】
本発明は、被検体に含まれる微生物を計量する装置であり、フードスタンプのような形状かあるいはフィルム状など壁面や調理器具など容易に接触できる形状あるいは把手がついた構造などを有した検体接触手段に、予め、生細胞を発色させる第１の試薬と死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類を混入しておくものである。この検体接触手段は目的に応じて混入する試薬を変えることで検査対象を変えることができる。例えば、検査対象を生菌のみとした場合は第１の試薬だけを、殺菌効果を検証する場合は第１と第２の試薬を混入するなど測定したい目的、対象によって任意に選定することができる。検体接触手段は通常使われる培養するタイプであれば、直径４０ｍｍ程度の大きさであるが、そこに含まれる菌の大きさが１乃至５μｍと非常に小さく、従来使用されているＣＣＤカメラを使い、画像処理をおこなうと、必要な画素数が膨大になり、直接的な認識が困難になるため、１０００倍程度の拡大手段を用いないと認識できなかった。そこで、本発明者らは、検体接触手段の検体と接触させた面の中に含まれる菌の大きさに着目し、１乃至５μｍ角の面積（受光手段の輝度として測定できればできるだけ大きな面積が望ましいが、フォトダイオードと同じ程度の大きさ３０μｍ角以下が望ましい）に予め定められた波長域で励起光を照射し、その励起光によって発光する光量を測定し、その積算から微生物の数を計量することにしたものである。このとき、励起光を照射して、発光した蛍光の強度は時間とともに変化する。従って、一定の発光光量の範囲内での時間を設定し、そのときの光量で微生物の有無を判断する必要がある。具体的には、微生物以外の不純物は、蛍光を発しないが、励起光の散乱光など発し、受光時に影響を受けることがあるため、受光した光量がある一定値以上を示した場合を微生物と判断する。また、不純物の種類によっては微生物以上の蛍光を発する場合も想定されるため、設定した光量の範囲内のときに微生物と判断させ、基本的には、範囲内の光量を受光した場合を１個の微生物として計量する。そして、この励起光を照射する微小面積を連続的あるいは断続的に移動させ、例えば、従来法の寒天培地拡散法のデータと比較する場合には、直径４０ｍｍの面積全体をスキャンし、その面積での微生物の数を積算して計量することができる。従って、励起光による化合物の消光に伴う過少評価の発生を防止し、異物から発せられる発光による過大評価の発生を防止する能力を有するものであり、従来の培養法や抗体法と比べ、特殊な技術や設備を必要とせず、短時間で微生物の生死の確認ならびに生死菌数の計量をすることができる。
【００５８】
また、第１乃至第４の試薬は、できるだけ無害な試薬を選定することは当然である。しかし、本微生物計量装置は主に食品工場などで使用させることが多く、検体の対象が調理器具などの場合、例え無害であっても、その試薬を含んだ検体接触手段を接触させるのは、衛生上好ましくない。また、試薬の特性によっては励起光に照射する直前に検体に反応させた方が望ましい場合もあり、第１乃至第４の化合物は、検体接触手段とは別にフィルムなどに担持したり、容器に貯蔵し、検体接触手段に直前に添加した方が良い場合がある。本観点を踏まえた上で、例えば、検出試薬含有部には生死細胞の膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合する試薬の一つである４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを検体試薬含有部に保持し、検体試薬含有部から検体接触手段にて採取された微生物に浸透させる。また、同時に死細胞の膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合する試薬の一つであるプロピジウムイオダイドを用いて二重染色し、それぞれに特異的な波長の励起光を照射して発色させることで採取された微生物の生死を判定することができる。あるいは、６−カルボキシフルオレセインジアセテートのように細胞内に浸透し、生菌細胞内に存在するエステラーゼによって分解されることで発色する化合物に特異的な波長の励起光を照射して発色させることで生菌を直接検出することができる。また、特定微生物由来物質と反応する化合物を含有させた検体試薬含有部と微生物接触手段を用いることで、検体より採取された微生物の中に検出対象となる微生物がいるかどうかを迅速に確認できるという作用を有する。
【００５９】
また、被検体に存在する微生物を転写手段を利用することで検体接触手段へ効率良く付着させる。転写手段としては、粘性を有するもの格子状にて付着しやすいものなどが挙げられる。本転写手段を有する検体接触手段を用いて検出することで被検体に含まれる微生物の過少評価を防止できるという作用を有する。
【００６０】
また、検体が液体の場合でも検体を保管する保管槽を利用することで検出が可能となる。保管槽の例として、検体を添加する部位が薄層になっており、そこに検体を導入することで検体が広がり、検体に含まれる微生物が一定化される。それを検出するものである。あるいは、予め、細溝を保管槽に作製しておき、そこに液体の検体を流し込むことで、液体の検体を保管槽に広げることが可能となる。さらに保管槽に貯蔵された液状の検体が一定の厚みとなるようにした検体接触手段を使用することで、光源若しくは受光手段から検体までの距離を一定に保持し、誤差の少ない評価を実施することができるという作用を有する。
【００６１】
また、発色を蛍光とすることで、高感度に検出することが可能となり、微小な検体も高感度に検出することができるという作用を有する。
【００６２】
また、生細胞を発色させる化合物を微生物由来物質と反応することで発色する試薬とすることにより、その微生物由来物質の生産量を検出することで微生物の活性を評価することができる。また、その際、発色した微生物数を計量することによりその数を把握することができる作用を有する。
【００６３】
また、生死細胞、死細胞を発色させる試薬を核酸結合性の試薬とすることで、細胞内に保持されている核酸を検出でき、それに伴い一細胞レベルまで検出可能となり、存在する微生物数を計量することができる。
【００６４】
また、特定微生物由来物質に標的を置くことで、特定微生物を検出することができる。さらにその標的を酵素タンパク質とすることで高い感度で検出が可能となり、また、特定微生物の活性も把握できる。
【００６５】
また、受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けたことで励起光によって発生した蛍光範囲を拡大した状態で光電変換素子へ導入することが可能となるため高い検出感度を保持できるという作用を有する。
【００６６】
また、受光手段に含まれる複数の光電変換素子を線状に配置することによってＸ軸方向（配列方向）への移動を不要なものとし、Ｙ軸方向（移動方向）のみの移動によって一定範囲の検知を実施することが可能となり、計量を迅速に実施することができるという作用を有する。
【００６７】
また、検体接触手段を円盤状とし、その検体接触手段を可動させることで検体若しくは光源の回転による検出が可能となる。検出方法としては、例えば、光ディスク読み取り用装置が挙げられる。検体接触手段を設置し、回転させることで光源の移動を検体接触手段の半径のみで実施可能となる。それにより検出を自動化、迅速化することができるという作用を有する。
【００６８】
また、検体接触手段を多角形として、その検体接触手段を可動させることで検体接触手段上に含まれる微生物の検出が容易に可能となる。検出手段としては、例えば、スキャナーが挙げられる。検体接触手段を設置し、移動させることで、これにより検出を自動化、迅速化することができるという作用を有する。
【００６９】
また、光源より発せられる光の集光手段および／または受光手段への集光手段として反射板を設けることによって余計な光のロスを防止し、また、光を集めることで感度を高めることができるという作用を有する。
【００７０】
また、光源から発せられる光を光ファイバーを使用して検体接触手段へと導入する手段を有することで複雑な形状の検体接触手段でも安定した励起光を提供することができる。さらに、光ファイバーを使用することで光源部を別部に設けることが可能となる。これにより、発熱する光源を使用した場合でも、その発熱による検体接触手段および検体接触手段にて採取された微生物に対する負荷を最小限とすることができるという作用を有する。
【００７１】
また、紫外光を透過するレンズを使用することで光源に紫外光発生手段を使用でき、紫外領域の励起光でも安定的に検体接触手段へ提供できる。
【００７２】
また、装置若しくは検体接触手段に測定位置を示す部位を設け、受光手段に測定位置を認識する手段を設けることで光源または受光手段の少なくともいずれか一方が存在する位置を把握し、同位置の二重検出若しくは検出もれを防ぎ、過大若しくは過少評価を避けることができる。さらに、検体接触手段の測定位置を示す手段に磁気を用いることで簡易的かつ正確な位置認識が可能となり、過大若しくは過少評価を避けることができるという作用を有する。
【００７３】
また、検体接触手段の測定位置を認識する軌道を移動させる際、認識軌道位置から一定の距離を保った状態で次の認識軌道位置へ移動させることで検出もれを防止し、検体接触手段全体を検出することが可能となる。さらに、認識軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとすることで従来法の一つである培養法との相関性を高めることができるという作用を有する。これは、培養法においてコロニーが重複することによって一つのコロニーと認識する範囲を避ける事ができる最低限の距離である。
【００７４】
また、検体接触手段に含まれる微生物から得られた信号を、二値化した点座標として認識し、信号が得られた点座標の数を計測することにより、検体接触手段に含まれる微生物を容易にかつ迅速に計量することができる。さらにその二値化した点座標から輝度を求め、菌が保有する活性を計量することも可能となる。また、近隣した信号を一つの信号と認識することで培養法との相関性を高めることができる。さらに近隣した信号から検体接触手段に付着した付着物の形状を把握することができ、微生物以外の形状のものは計量から除去することが可能となり、精度を向上することができるという作用を有する。
【００７５】
以下、本発明の実施例について図面を参照しながら説明する。
【００７６】
【実施例】
以下に本発明の実施例１について説明する。
【００７７】
図１に示すように微生物計量装置に設置されている励起光の検体上における軌道は、検体接触手段１全体を網羅するものであることが望まれる。そのために検体の幅、長さを軌道Ａ２のように移動し、検出するものである。また、図２に示したように検体全体を検出するための軌道は円状のものも可能であるため軌道Ｂ３のように移動し、検出することも可能である。光源４は、検体接触手段上を各軌道に沿って移動させ、光源４より発した励起光によって生ずる蛍光を利用した微生物判断手段のモデルを図３に示した。検体から発せられた蛍光は蛍光を発した部位と相関して微生物判断手段５を形成する。微生物判断手段５には、不純物などから生ずる散乱光あるいは同励起光によって発生する蛍光などが混在しており、目的の微生物から発せられる蛍光に限定されたものではない場合が生ずる。そこで、しきい値を設けるものである。しきい値は、蛍光強度の上限６と下限７があり、その範囲内の蛍光を微生物由来のものとして認識し、積算する。これにより、微生物以外の不純物由来の蛍光を把握し、正確な計量を可能なものとしたものである。しきい値は、微生物が発する蛍光強度によって決定されるものである。また、微生物が近接している場合、微生物が発する蛍光から形成される波形は、図４に示したように隣接したものが得られる。この場合、隣接した微生物を従来法の一つである寒天培地拡散法で検出した場合、微生物の増殖とコロニーの拡大に伴い、コロニー同士が重層し、目視で確認する時点で一つのコロニーとして判断してしまう場合がある。そこで、本発明において波形８に示すような場合は、一つの微生物として検出するように設定した。これにより寒天培地拡散法との相関性を得ることができるものである。
【００７８】
また、検体接触手段１への励起光照射時間は、図５に示したように蛍光強度が消光しない時間の範囲で照射される。即ち、しきい値９の範囲である。
【００７９】
図６に示すように微生物計量装置は、光源４、光源集光手段としてのレンズ１０、受光部１１より成る。光源４から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルター１２で分光する。分光された励起光はプリズム１３を経て、光路を変化させられる。光路を変化した励起光はレンズ１０を経て検体接触手段１の表面に集光される。そこで励起光によって励起された微生物が有する蛍光は、再びプリズム１３を透過する。その際、蛍光はプリズム１３をそのまま透過し、受光部１１に到達する。受光部１１に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルター１４を経て、受光部１１に内蔵された光電変換素子１５に到達し、信号化され、認識される。また、図には示していないが、検体接触手段１若しくは微生物計量装置には、検体接触手段を移動する手段を備えており、検体接触手段１の蛍光発色を全て、若しくは一部を受光することができる。
【００８０】
光電変換素子１５に到達した蛍光は、微生物判断手段５において微生物若しくは異物と判断され、微生物と判断された蛍光は積算されて、その数量が計量される。
【００８１】
光源４より発生した励起光は、レンズ１０によって集光されるが、その際、レンズ１０によって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。この場合、微小な一定面積とは細菌や真菌などの大きさに基づいて設定した場合、一辺０．２μｍ乃至７．０μｍ程度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖した微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、この場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。
【００８２】
レンズ１０によって集光された励起光の照射時間は、蛍光を発する化合物の消光時間と励起光強度に依存する。化合物の種類によっては、自然界に存在する紫外光によっても分解する場合があり、２秒乃至３００秒前後の範囲内で励起光を照射することが望ましい。
【００８３】
発色後の輝度を認識する場合、図７に示したように蛍光発色した位置を「０」と「１」の二値化にて表現する。二値化した場合、隣接した発色を一つの発色源１６としてみなす。また、発色源の大きさおよびその輝度が設定の大きさと比較して相対的に大きく異なる場合、異物１７として認識し、検査対象外とみなすことで微生物として計量しない。隣接した発色の隣接距離としては、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養され、増殖した微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。
【００８４】
検体上に付着された微生物は、発色性化合物によって蛍光を発する。発色する化合物としては、微生物の生死にかかわらず、非特異的に微生物細胞内へ浸透し、微生物の核酸へ結合することで発色する試薬の一つである４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールや死細胞に非特異的に浸透し、微生物の核酸へ結合することで発色する試薬の一つであるプロピジウムイオダイドが挙げられる。その他にも発色させる試薬として６−カルボキシフルオレセインジアセテート、２'，７'ジクロロフルオレセインジアセテート、６−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）−３'，６'−０，０'−ジアセチルフルオレセイン、ジヒドロドローダミン、二酢酸フルオレセイン、二酢酸４−アジドフルオレセインなどが挙げられる。これらの発光は、細胞内の酵素活性に依存しており、生菌を染色することができる。また、大腸菌群などの特定微生物を染色する試薬として、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドなどが挙げられる。これらは、特定微生物が生産する酵素と特異的に反応してそれぞれ４−メチルウンベリフェロンに分解される。４−メチルウンベリフェロンは紫外光に対し、励起され蛍光を発する。紫外光によって励起された蛍光を検出することによって特定微生物の数若しくはその有無を検出することが可能となる。
【００８５】
本発明はこれら発色後の微生物を検出する手段である。各化合物は、異なる波長の最大励起波長を有し、励起された後、異なる波長の蛍光を発するため多重染色が可能となる。発色を検出する際、光源４の波長の幅が広いものである場合は、励起光分光フィルター１２によって励起波長を調整、分光することが可能となる。励起光分光フィルター１２は、目的の検出対象に応じて変えられるため、様々な蛍光試薬に対応できる。また、同時に、発色した蛍光波長の幅が広いものである場合は、目的の発色を検出するために蛍光分光フィルター１４を目的の検出対象に応じて変えることで様々な蛍光試薬に対応できる。
【００８６】
光源４としては、各種ダイオード、ハロゲンランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、ブラックライト、水銀ランプなどが挙げられる。これらの光源のうち最大励起波長が比較的限定されているダイオード、冷陰極管、ブラックライトなどは、前記励起光分光フィルター１２および蛍光分光フィルター１４を使用することなく実施できる場合がある。また、ハロゲンランプ、水銀ランプなどについては、励起光分光フィルター１２および蛍光分光フィルター１４を使用する必要がある場合がある。
【００８７】
プリズム１３およびレンズ１０は、必要に応じてそれぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスなどが挙げられる。これにより紫外光で励起される蛍光試薬などにも対応できる。検体接触手段１を設置する部位は回転能を有し、その上部に検体接触手段１を設置する。レンズ１０により集光された励起光は、検体接触手段１の外周部より中心部へ、若しくは、中心部より外周部へ、半径分の距離を移動する。その際、レンズ３により集光された励起光の位置が外周部に存在するときと中心部に存在するときの検体接触手段１の回転速度を変化させることによって、レンズ１０により集光された励起光が外周部に存在するときと中心部に存在するときの励起された化合物が発した蛍光のずれ、残像および残光の発生を防止することができる。
【００８８】
なお、集光した位置を認識する手段を設けることでレンズ１０によって集光された励起光の位置を認識し、集光が軌道から逸れないように、また、逸れた場合は再び軌道に戻すように設定されるものである。
【００８９】
なお、発色試薬は、細胞浸透性のものを挙げているが、細胞膜付着性、細胞壁付着性、糖鎖結合性、各官能基結合性、アミノ酸付着性、イオン感受性、酸素反応性などの発色試薬の場合でも同様に検出可能である。
【００９０】
なお、発色試薬は、励起光によって励起され蛍光を発するものを挙げているが、細胞を染色し、着色する能力の有る試薬の場合でも同様に検出可能である。
【００９１】
なお、励起光を照射する微小な一定面積は、正方形を含む多角形に限らず、円形、楕円形等でも可能であり、検体を照射できるものであればよい。
【００９２】
なお、検体接触手段に含有する化合物は多重染色を実施することも可能であるが、必ずしも各化合物を混合する必要は無い。例えば、一つの検体接触手段を染色化合物の数に相当する分割を行い、それぞれを検出するなども可能である。
【００９３】
なお、励起光若しくは蛍光を分光する手段として回折格子などを利用することも可能である。
【００９４】
なお、検体接触手段１の回転速度を調整することで蛍光の残像および残光を防ぐとしたが、励起光を照射するレンズ１０の移動速度を調整することで残像および残光を防ぐことも可能である。
【００９５】
なお、集光した位置を認識する手段は、必ずしも励起光の集光位置を直接認識する必要は無く、検体接触手段１上の軌道を把握するものであればよい。
【００９６】
以下に本発明の実施例２について説明する。
【００９７】
図８に示すように微生物計量装置は、検体接触手段１、光源４、反射板１８、レンズ１０、受光部１１より成る。光源４から発せられた励起光によって、検体中に存在する染色後の微生物から励起され、生じた蛍光を反射板１８によって光の方向を変化させ、レンズ１０によって集光し、受光部１１にて検出する。受光部１１に到達した蛍光は、微生物判断手段５において微生物若しくは異物と判断され、微生物と判断された蛍光は積算されて、その数量が計量される。光源４は、検体接触手段１をスキャンする。さらに、光源４の軌道に合わせて反射板１８を設置させる。
【００９８】
光源４より発生した励起光は、レンズ１０によって集光されるが、その際、励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。この場合、微小な一定面積とは細菌など微生物の大きさに基づいて設定した場合、一辺０．２μｍ乃至７．０μｍ程度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖された微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、この場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。
【００９９】
レンズ１０によって集光された励起光の照射時間は、蛍光を発する化合物の消光時間と励起光強度に依存する。化合物の種類によっては、自然界に存在する紫外光によっても分解する場合があり、２秒乃至３００秒前後の範囲内で照射することが望ましい。
【０１００】
光源４としては、各種ダイオード、ハロゲンランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、ブラックライトなどが挙げられる。
【０１０１】
反射板１８およびレンズ１０は、必要に応じて、それぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスなどが挙げられる。これにより紫外光によって励起される蛍光試薬などにも対応できる。
【０１０２】
なお、検体接触手段１への光源４より発せられる励起光の強度の減少若しくは外部光による蛍光への影響を防ぐために検体接触手段１を暗視野環境下に置くための暗視野板等を設置することも可能である。
【０１０３】
なお、光源４が移動するとは限らない。検体接触手段１を移動させ、付着した微生物を検出することも可能である。
【０１０４】
なお、光源４が内蔵されているとは限らない。外部に光源４を含む光源部を設け、そこから光ファイバー等を利用して装置内へ励起光を導入することも可能である。
【０１０５】
なお、光源の種類により、目的以外の波長を除去する手段を設けることも可能である。例えば、励起光分光フィルターや回折格子などが手段として挙げられる。
【０１０６】
なお、発せられる蛍光の種類により、目的以外の波長を除去する手段を設けることも可能である。例えば、蛍光分光フィルターや回折格子などが手段として挙げられる。
【０１０７】
なお、反射板１８の代わりにプリズム体などを利用することも可能である。
【０１０８】
以下に本発明の実施例３について説明する。
【０１０９】
図９に示すように検体接触手段１は、作業者の取り扱い性を向上するために把手部１９と検査対象から微生物を付着させるための検体接触部２０と検出開始点を認識するための検出開始線２１と検出軌道を認識するための検体認識軌道２２からなる。
【０１１０】
作業者は、把手部１９を手に取り、目的の検査対象へ数秒押し付ける。その際、検体接触部２０が破砕しない程度の強度と時間で実施する。検査対象より付着した微生物は、その状態あるいはその性質によって発色する化合物の添加若しくは検体接触部２０に予め含有されている化合物の浸透によって染色される。染色後の微生物を含む検体接触手段１の検出を開始する。また、検体接触手段１上に集光せしめた励起光の位置を認識させるため、検体接触手段１に予め設けられている検体認識軌道２２を検出し励起光の位置を認識するものである。図６記載のレンズ１０より集光された励起光は、検出開始線２１を開始点として、外周を移動する。外周移動後、再び検出開始線２１に到達後、図６記載のレンズ１０より集光された励起光は、一つ内側の検体認識軌道２２にずれ、その軌道上に含まれる発色数を認識する。これを繰り返しながら中心へ向かって励起光を移動させることによって検出を必要とする面積に含まれる微生物数を検出する。
【０１１１】
検体接触部２０に用いられる物質は、蛍光に影響しない物質が望ましい。また、被検体より微生物を効率良く接触するために粘着性のあるものが望ましい。例えば、アラビアゴム、アクリル樹脂など各種高分子や寒天のように適度の水分を含み、粘着性を有するものである。
【０１１２】
検出開始線２１は、直接検体接触手段へ刻み込まれたマーキングや励起光あるいは集光位置を認識できる反射性を有したマーカーなどが挙げられる。これは、検体認識軌道２２も同様であるが、このマーカーが蛍光に影響を与えないものを使用することが望ましい。
【０１１３】
なお、把手部は外周に存在するとは限らない。
【０１１４】
なお、検出開始点を認識するのは、線とは限らない。
【０１１５】
なお、検出軌道はらせん状や斜め方向でも構わない。
【０１１６】
なお、励起光の移動は外周からとは限らない。
【０１１７】
【発明の効果】
以上の実施例から明らかなように、本発明によれば被検体に存在する微生物のうち、その場に存在している全ての菌数、生菌数、死菌数、特定の菌の菌数若しくはその有無を、異なる波長の励起光で励起され、異なる波長の蛍光で蛍光を発する試薬を用いて同時に、かつ迅速に検出できる。さらに励起光による蛍光の消光を抑え、正確に検出できるようにしたものであり、しきい値を設けたことで、設定した範囲内の光量を受光した場合を１個の微生物として計量し、異物混入による過大評価を防止し、高い感度を保持した微生物計量装置を提供できる。
【０１１８】
また、各検出試薬を検出試薬含有部に含ませ、検体接触手段と分離したことで検体接触手段を直接被検体に付着させることが可能となり、対象が食品や医療器具などの場合の検出試薬付着防止という点で衛生状態を保持したものである。これにより、被検体への直接接触が可能なため高感度な微生物検出が可能となる微生物計量装置を提供できる。
【０１１９】
また、被検体から転写手段によって微生物を検体接触手段へ転写することで被検体に含まれる微生物を効率良く付着させることが可能となるため高感度な微生物計量装置を提供できる。
【０１２０】
また、液状の検体の場合でも、その検体を保管する保管槽を用いることで計量可能となり、さらに保管槽に貯蔵された液状の検体が一定の厚みとなるようにすることで検体より採取された微生物の拡散による過大若しくは過少評価を防止できるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２１】
また、発色を蛍光とすることで感度を高め、さらに異なる波長の蛍光を発する検出試薬を用いることで複数の菌を一度で検出できるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２２】
また、生菌検出化合物を微生物由来物質と反応する物質とすることで、微生物由来物質の生産量から微生物の活性を評価することができる。また、その際、発色した微生物数を計量することによりその数を把握することができるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。さらに別に異なる波長によって励起され、核酸結合性の化合物を利用することで、細胞内に保持されている核酸を染めることが可能となり、一細胞レベルまで正確に検出することができるという効果の有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２３】
また、特定微生物の生産する物質によって発色する化合物を利用することで特定微生物を検出することができ、さらにその標的を酵素タンパク質とすることで高い感度で検出が可能となり、また、特定微生物の活性も把握できるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２４】
また、受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けたことで高い検出感度を得ることができる。さらに、光電変換素子を線状に配置することで一方向へのスキャンで検体接触手段上に存在する微生物を検出することができ、微生物の計量を迅速化することができるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２５】
また、検体接触手段を円盤状とすることで回転方向への検体接触手段の駆動を容易にし、それにより検出速度の向上が可能となる。さらに光源、受光手段の少なくともどちらか一方の検体検出移動距離を最小限に抑えることができる。それに伴い、検出時間の迅速化および微生物計量装置の簡易化が可能になるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２６】
また、光源より発せられる励起光の検体への照射の微小面積を設定速度範囲内で可動させることで発色のずれや残像、残光を防止でき、それに伴い過大若しくは過少評価を防止することができるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２７】
また、光源より発せられる光または検体接触手段より発せられた光の少なくともいずれか一方を反射板を使用し、集光することで、検体接触手段への効率の高い照射または受光手段での効率の高い検出が可能になり、装置構成を簡易化することができるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２８】
また、光ファイバーを利用して光源からの励起光を導入することで、熱源となる光源を別部に設置することが可能となり、これにより検体接触手段に採取された微生物あるいは関連タンパク質等への熱の影響を防止し、誤差拡大の回避が可能となる。さらに検体接触手段が複雑な形状の場合でも常時、一定の光を検体接触手段へと導入することができ、より正確な計量が可能になるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１２９】
また、光源集光手段に紫外光透過性レンズを使用することで紫外領域の波長の光量を減少させることなく検体接触手段へと導入することができ、紫外領域の波長によって検出可能な化合物の計量ができるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１３０】
また、装置若しくは検体接触手段に測定位置を示す手段を設けることで検出位置を認識させることができ、誤検出の防止あるいは検体検出速度の調整ができる。さらに、検体認識手段の測定位置を示す手段に磁気を利用することで簡易かつ正確な検出が可能となるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１３１】
また、検体接触手段の測定位置を認識する軌道位置から次の認識軌道位置までを一定の距離を保った状態で移動させる手段を有することで検体全体を検出する必要がなくなり、迅速化が可能となる。また、各軌道間に位置する微生物の誤認識を防止し、より正確な計量を実施できる。さらに、各軌道間の距離を１０乃至５０μｍとすることで従来法との相関性を出すことができるという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【０１３２】
また、検体接触手段に含まれる微生物から得られた蛍光を「０」と「１」の二値化した点座標として認識することで、容易でかつ迅速に計量でき、その位置関係によって異物として認識されたものを対象外として除去し、同様にその位置関係として微生物として認識されたもののうち、従来法の寒天培地拡散法と比較した場合、近隣した微生物として認識されたものを一つ微生物として認識することで従来法と相関性を有するという効果を有する微生物計量装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の実施例１の励起光の検体上における軌道Ａの構成図
【図２】 同実施例１の励起光の検体上における軌道Ｂの構成図
【図３】 同実施例１の波形モデルを示す図
【図４】 同実施例１の微生物隣接存在時における波形モデルを示す図
【図５】 同実施例１の蛍光消光モデルを示す図
【図６】 同実施例１の微生物計量装置を示す図
【図７】 同実施例１の二値化モデルを示す図
【図８】 本発明の実施例２の微生物計量装置を示す図
【図９】 本発明の実施例３の検体接触手段を示す図
【図１０】 従来例の微生物測定装置の構成図
【符号の説明】
１ 検体接触手段
２ 軌道Ａ
３ 軌道Ｂ
４ 光源
５ 微生物判断手段
６ 上限
７ 下限
８ 波形
９ しきい値
１０ レンズ
１１ 受光部
１２ 励起光分光フィルター
１３ プリズム
１４ 蛍光分光フィルター
１５ 光電変換素子
１６ 発色源
１７ 異物
１８ 反射板
１９ 把手部
２０ 検体接触部
２１ 検出開始線
２２ 検体認識軌道
Claims (24)
- 生細胞とのみ反応して生細胞のみを発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、微生物由来のその微生物に固有の物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入された検体接触手段と、前記検体接触手段の一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、励起光照射時間を励起光により発光した蛍光強度が消光しない時間とし、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに微生物１個と判断する微生物判断手段と、０．２〜７μｍの大きさを検知できる受光手段または検体接触手段を連続または断続的に移動させる移動手段と、微生物判断手段から０．２〜７μｍの大きさの微生物１個と判断された信号を順次積算することで前記検体接触手段の微生物の数量を積算する手段を有する微生物計量装置。
- 生細胞とのみ反応して生細胞のみを発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、微生物由来のその微生物に固有の物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入された検出試薬含有部と検体接触手段と、前記検体接触手段の一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、励起光照射時間を励起光により発光した蛍光強度が消光しない時間とし、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに微生物１個と判断する微生物判断手段と、０．２〜７μｍの大きさを検知できる受光手段または検体接触手段を連続または断続的に移動させる移動手段と、微生物判断手段から０．２〜７μｍの大きさの微生物１個と判断された信号を順次積算することで前記検体接触手段の微生物の数量を積算する手段を有する微生物計量装置。
- 微生物を含むあるいは含んでいるかを検査する検体に前記検体接触手段の表面を接触させること、または検体に接触させた転写手段を前記検体接触手段の表面に接触させて検体の微生物を前記検体接触手段に転写させることを特徴とする前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 前記検体を液状の検体とし、前記検体接触手段をその検体を保管する保管槽とし、保管槽に貯蔵された液状の検体が一定の厚みとなるようにした前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 発色を蛍光とした前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 前記第１の試薬を微生物由来物質と反応することで発色する試薬とした前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 前記第２の試薬を核酸結合性の試薬とした前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 前記第３の試薬を核酸結合性の試薬とした前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 前記微生物由来物質を酵素タンパク質とした前記請求項６記載の微生物計量装置。
- 前記微生物由来のその微生物に固有の物質を酵素タンパク質とした前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 前記受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けた前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 前記複数の光電変換素子を線状に配置した前記請求項１１記載の微生物計量装置。
- 前記検体接触手段を円盤状とし、その検体接触手段を可動させることを特徴とした前記請求項１、２、１１、１２のいずれかに記載の微生物計量装置。
- 前記検体接触手段を測定する面積を多角形として、その検体接触手段を可動させることを特徴とした前記請求項１、２、１１、１２のいずれかに記載の微生物計量装置。
- 光源より発せられる光の集光手段および／または受光手段への集光手段として反射板を設けた前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 光源から発せられる光を光ファイバーを使用して検体接触手段へと導入する手段を有したことを特徴とする前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 紫外光を透過するレンズを光源集光手段として用いたことを特徴とする前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 検体接触手段の測定位置を示す手段を有した前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 前記検体接触手段の測定位置を示す手段に磁気を用いる前記請求項１８記載の微生物計量装置。
- 前記検体接触手段の測定位置を認識する手段を有した前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 検体接触手段の測定位置を認識する軌道を移動させる際、認識軌道位置から一定の距離を保った状態で次の認識軌道位置へ移動する手段を有した前記請求項２０記載の微生物計量装置。
- 認識軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとした前記請求項２１記載の微生物計量装置。
- 検体接触手段に含まれる微生物から得られた信号を、二値化した点座標として認識し、信号が得られた点座標の数を計測する機能を有した前記請求項１または２記載の微生物計量装置。
- 信号が得られた点座標のうち、近隣した信号を一つの信号として認識する機能を有した前記請求項２３記載の微生物計量装置。
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