JP4812962B2 - 特定微生物計量方法および特定微生物計量装置 - Google Patents
特定微生物計量方法および特定微生物計量装置 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定微生物（微生物の意味するところは少なくとも細菌と真菌を含む概念である）、即ち、特定の細菌類および真菌類等を含有するか含有する可能性のある液状検体から、特定微生物を発光させ、その計量を簡単にしかも迅速に行うことができる方法および装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、この種の特定微生物を計量する特定微生物計量方法に関するものとして、特開平７−１４０１４８号に記載されるように蛍光物質で標識された抗体を用いて特定微生物を発光検出するものが知られている。また、この方法によれば、非特異的に染色する試薬との併用で特定微生物と全微生物を把握することができる。
【０００３】
特定微生物計量装置は、食品工場で使用されることが多く、食中毒の原因となり得る大腸菌などの特定微生物の存在の有無を確認することは管理上の重要な要素になっている。また、最近のＨＡＣＣＰの導入によって、食品そのものの検査だけでなく、工場自体や作業行程の検査、例えば、壁・床面、まな板・包丁などの調理器具などの検査も行われており、食品そのものの管理及び環境の管理が重要になっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような従来の特定微生物計量方法では、抗体を使用するので感度の高い計測が行えるが、抗体を蛍光物質で標識化しなければならないので、その手間がかかるとともに費用的にも高くなる。また、この方法では特定微生物の生死を判別することはできない。また、抗体を蛍光標識しているため抗体の反応精度や時間などに課題があった。また、二次抗体を使用した場合、操作の煩雑性や安定性などに問題があり、温度管理や反応時間、操作手順など課題が存在していた。
【０００５】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を蛍光染色した後、この検体接触液を特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化した検体反応手段に接触させ、抗体に結合した蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたことを特徴とする特定微生物計量方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化した検体反応手段に接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を検体反応手段に固定化した抗体に結合させた後、生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を前記検体反応手段に接触させることで、抗体に結合した特定微生物を蛍光染色し、蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたことを特徴とする特定微生物計量方法を提供することを目的とする。
【０００７】
また、微生物由来物質を酵素タンパク質とした方法を提供することを目的とする。
【０００８】
また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質とした方法を提供することを目的とする。
【０００９】
また、検体反応手段を検体接触液をフローさせながら接触できるものとした方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、検体反応手段を液状検体をフローさせながら接触できるものとした方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、検体反応手段を間隙を挟んで互いに対向して配置された２つの電極と両電極を電位可変自在に短絡させることができる短絡部を有し、特定微生物に特異的に反応する抗体が一方の電極に固定化されたものとした方法を提供することを目的とする。
【００１２】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、生死細胞を発光させる核酸結合性の第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる核酸結合性の第２の試薬と、微生物由来物質と反応することで生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に接触させて得られる検体接触液を接触させるための、特定微生物に特異的に結合する抗体を固定化した検体反応手段と、前記検体反応手段の微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに特定微生物と判断する特定微生物判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、特定微生物判断手段から特定微生物と判断された信号から特定微生物の数量を積算する積算手段を有することを特徴とする特定微生物計量装置を提供することを目的とする。
【００１３】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を接触させるための、特定微生物に特異的に結合する抗体を固定化した検体反応手段と、生死細胞を発光させる核酸結合性の第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる核酸結合性の第２の試薬と、微生物由来物質と反応することで生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を収容した検出試薬含有部と、前記検体反応手段の微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに特定微生物と判断する特定微生物判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、特定微生物判断手段から特定微生物と判断された信号から特定微生物の数量を積算する積算手段を有することを特徴とする特定微生物計量装置を提供することを目的とする。
【００１４】
また、受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けた装置を提供することを目的とする。
【００１５】
また、複数の光電変換素子を線状に配置した装置を提供することを目的とする。
【００１６】
また、検体反応手段を円盤状とし、その検体反応手段を可動させることとした装置を提供することを目的とする。
【００１７】
また、検体反応手段を測定する面積を多角形として、その検体反応手段を可動させることとした装置を提供することを目的とする。
【００１８】
また、微小面積を移動させる移動手段として、光源、受光手段、検体反応手段のいずれか一つあるいは複数を移動させる駆動手段を設け、設定速度範囲内で可動させることとした装置を提供することを目的とする。
【００１９】
また、光源より発せられる光の集光手段および／または受光手段への集光手段として反射板を設けた装置を提供することを目的とする。
【００２０】
また、光源と微小面積の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けた装置を提供することを目的とする。
【００２１】
また、微小面積と受光手段の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けた装置を提供することを目的とする。
【００２２】
また、光源および／または受光手段に検体反応手段内の微小面積に焦点を合わせる自動焦点機能を備えた装置を提供することを目的とする。
【００２３】
また、光源と検体反応手段の距離を一定にし、微小面積を一定化する手段を有する装置を提供することを目的とする。
【００２４】
また、光源から発せられる光を光ファイバーを使用して検体反応手段へと導入する手段を有する装置を提供することを目的とする。
【００２５】
また、紫外光を透過するレンズを光源集光手段として用いた装置を提供することを目的とする。
【００２６】
また、検体反応手段の測定位置を示す手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００２７】
また、検体反応手段の測定位置を示す手段に磁気を用いる装置を提供することを目的とする。
【００２８】
また、検体反応手段の測定位置を認識する手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００２９】
また、検体反応手段の測定位置を認識する軌道を移動させる際、認識軌道位置から一定の距離を保った状態で次の認識軌道位置へ移動する手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００３０】
また、認識軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとした装置を提供することを目的とする。
【００３１】
また、検体反応手段に含まれる微生物から得られた信号を、二値化した点座標として認識し、信号が得られた点座標の数を計測する機能を有した装置を提供することを目的とする。
【００３２】
また、信号が得られた点座標のうち、近隣した信号を一つの信号として認識する機能を有した装置を提供することを目的とする。
【００３３】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の特定微生物計量方法は、上記目的を達成するため、生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を蛍光染色した後、この検体接触液を特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化した検体反応手段に接触させ、抗体に結合した蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたものである。そして、本発明によれば検体反応手段に捕捉される特定微生物の数若しくは有無を同時に、かつ迅速に把握することができる特定微生物計量方法が得られる。
【００３４】
本発明の第二の特定微生物計量方法は、上記目的を達成するため、特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化した検体反応手段に接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を検体反応手段に固定化した抗体に結合させた後、生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を前記検体反応手段に接触させることで、抗体に結合した特定微生物を蛍光染色し、蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたものである。そして、本発明によっても検体反応手段に捕捉される特定微生物の数若しくは有無を同時に、かつ迅速に把握することができる特定微生物計量方法が得られる。
【００３５】
また、微生物由来物質を酵素タンパク質としたことで、その反応性から特定微生物の生死を判別できる特定微生物計量方法が得られる。
【００３６】
また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたことで、その反応性から特定微生物の生死を判別できる特定微生物計量方法が得られる。
【００３７】
また、検体反応手段を検体接触液をフローさせながら接触できるものとしたことで、検体反応手段に固定化された抗体と蛍光染色された特定微生物との接触効率を向上させることができる特定微生物計量方法が得られる。
【００３８】
また、検体反応手段を液状検体をフローさせながら接触できるものとしたことで、検体反応手段に固定化された抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができる特定微生物計量方法が得られる。
【００３９】
また、検体反応手段を間隙を挟んで互いに対向して配置された２つの電極と両電極を電位可変自在に短絡させることができる短絡部を有し、特定微生物に特異的に反応する抗体が一方の電極に固定化されたものとしたことで、通常、微生物の表面が負の電荷に帯電している性質を利用し、抗体が固定化された電極が正側となるように電圧をかけることで、抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができる特定微生物計量方法が得られる。
【００４０】
本発明の第一の特定微生物計量装置は、上記目的を達成するため、生死細胞を発光させる核酸結合性の第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる核酸結合性の第２の試薬と、微生物由来物質と反応することで生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に接触させて得られる検体接触液を接触させるための、特定微生物に特異的に結合する抗体を固定化した検体反応手段と、前記検体反応手段の微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに特定微生物と判断する特定微生物判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、特定微生物判断手段から特定微生物と判断された信号から特定微生物の数量を積算する積算手段を有するものである。そして、本発明によれば検体反応手段に捕捉される特定微生物の数若しくは有無を同時に、かつ迅速に把握することができ、また、励起光の照射面積及び時間を最小限にすることで励起光による試薬の消光を抑えることができ、さらに、蛍光強度のしきい値を設けることで特定微生物と異物の区別が可能であり、一定面積に含まれる特定微生物の数量の計量を迅速かつ同時に行うことができる特定微生物計量装置が得られる。
【００４１】
本発明の第二の特定微生物計量装置は、上記目的を達成するため、特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を接触させるための、特定微生物に特異的に結合する抗体を固定化した検体反応手段と、生死細胞を発光させる核酸結合性の第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる核酸結合性の第２の試薬と、微生物由来物質と反応することで生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を収容した検出試薬含有部と、前記検体反応手段の微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに特定微生物と判断する特定微生物判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、特定微生物判断手段から特定微生物と判断された信号から特定微生物の数量を積算する積算手段を有するものである。そして、本発明によっても検体反応手段に捕捉される特定微生物の数若しくは有無を同時に、かつ迅速に把握することができ、また、励起光の照射面積及び時間を最小限にすることで励起光による試薬の消光を抑えることができ、さらに、蛍光強度のしきい値を設けることで特定微生物と異物の区別が可能であり、一定面積に含まれる特定微生物の数量の計量を迅速かつ同時に行うことができる特定微生物計量装置が得られる。
【００４２】
また、光電変換素子を利用することで迅速な計量が可能となり、さらに前段に集光レンズを設けることで高い感度の計量ができる特定微生物計量装置が得られる。
【００４３】
また、光電変換素子を線状に配置することで、一定範囲の検知を一度に実施することができ、計量を迅速化することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００４４】
また、検体反応手段を円盤状とすることで回転方向への検体反応手段の駆動を容易にし、光源、受光手段の両方若しくは少なくともどちらか一方の検出移動距離を最小限に抑えることができる特定微生物計量装置が得られる。
【００４５】
また、検体反応手段を測定する面積を多角形とすることで一方向への検体反応手段の駆動を容易にし、光源、受光手段、検体反応手段の少なくとも一つを移動することで特定微生物を計量できる特定微生物計量装置が得られる。
【００４６】
また、光源より発せられる励起光の検体への照射の微小面積を設定速度範囲内で可動させることで発光のずれや残像、残光を除去できる特定微生物計量装置が得られる。
【００４７】
また、光源より発せられる光または検体反応手段より発せられた光の少なくともいずれか一方を反射板を使用し、集光することで、検体反応手段への効率の高い照射または受光手段での効率の高い検出が可能となる特定微生物計量装置が得られる。
【００４８】
また、光源と微小面積の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けることで波長域の広い光源を使用した場合でも目的の励起波長を照射することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００４９】
また、微小面積と受光手段の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けることで波長域の広い発光の場合でも目的の蛍光波長を検出することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５０】
また、検体反応手段内の検出微小面積の焦点を自動的に合わせる機能を備えることで常時一定面積に存在する特定微生物の検出が可能となり、さらに作業者の作業性を向上させることができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５１】
また、光ファイバーを利用して光源からの励起光を導入することで、熱源となる光源を別部に設置することが可能となり、さらに検体反応手段が複雑な形状の場合でも常時一定の光量を検体反応手段へと導入することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５２】
また、光源集光手段に紫外線透過性レンズを使用することで紫外領域の励起波長の光量を減少させることなく検体反応手段へと導入することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５３】
また、検体反応手段の測定位置を示す手段を設けることで検出位置を認識させることができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５４】
また、検体反応手段の測定位置を示す手段を設けることで検体反応手段の大きさ、形状等に影響を受けずに検出位置を認識させることができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５５】
また、検体反応手段に測定位置を示す手段を設けることで検体反応手段の種類に応じて検出位置を認識させることができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５６】
また、検体反応手段の測定位置を示す手段を磁気とすることで簡略かつ正確に検体反応手段の検出位置を認識させることができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５７】
また、検体反応手段の測定位置を認識する手段を有することで検体反応手段の検出対象位置を調整することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５８】
また、検体反応手段の測定位置を認識する軌道位置から次の認識軌道位置までを一定の距離を保った状態で移動させる手段を有することで検体全体を検出する必要がなくなり、計量を迅速化できる特定微生物計量装置が得られる。
【００５９】
また、検体反応手段の測定位置を認識する軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとすることで培養法と相関性の高い計量が可能となる特定微生物計量装置が得られる。
【００６０】
また、検体反応手段に含まれる微生物から得られた信号を二値化した点座標として認識することで、容易で迅速に計量することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００６１】
また、信号が得られた点座標のうち近隣した信号を一つの信号として認識することで培養法と相関性の高い計量が可能となる特定微生物計量装置が得られる。
【００６２】
【発明の実施の形態】
本発明の第一の特定微生物計量方法は、液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を蛍光染色した後に抗体と結合させてこれを計量する方法である。特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に、生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を蛍光染色する。検体反応手段に特定微生物に特異的に結合する抗体を固定化しておくことで、蛍光染色された特定微生物を含有する検体接触液を検体反応手段に接触させれば、検体反応手段に蛍光染色された特定微生物を精度よく捕捉することができる。そして、抗体に結合した蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬として特定微生物の数を簡単に、迅速に、しかも正確に計量することができるという作用を有する。光学的測定手段としては、例えば、光量や輝点を指標にした公知の手段が挙げられ、このような手段によって、特定微生物を一個一個計数したり、予め作製した検量線をもとに光量から特定微生物の総数を計数したりすればよい。その概念の一例を図１１に示す。図１１に示したように、検体反応手段５１は、ガラス基板などの基板５２に特定微生物６１に特異的に結合する抗体５３を固定化したものからなる。液状検体が特定微生物６１を含有していた場合、液状検体に生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を接触させることで、特定微生物が試薬５４によって蛍光染色される。抗体５３はこの蛍光染色された特定微生物６１に抗原抗体反応によって結合し、蛍光染色された特定微生物６１は検体反応手段５１に捕捉される。そして、抗体５３に結合した蛍光染色された特定微生物６１を光学的測定手段により測定することにより、蛍光染色された特定微生物６１が捕捉された位置で発光を観察することができる。また、第１の試薬を核酸結合性の試薬としたことで、細胞内に存在する核酸の染色を指標としているため、染色後、一細胞レベルで検出できる。これにより特定微生物の生死細胞の数をさらに高精度に計量することができるという作用を有する。また、第２の試薬を核酸結合性の試薬としたことで、細胞内に存在する核酸の染色を指標としているため、染色後、一細胞レベルで検出できる。これにより特定微生物の死細胞の数をさらに高精度に計量することができるという作用を有する。また、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたことで、特定微生物の生細胞の代謝物と反応するため、その反応性より特定微生物の生死を判定できるという作用を有する。
【００６３】
本発明の第二の特定微生物計量方法は、液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を抗体と結合させた後に蛍光染色してこれを計量する方法である。特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化した検体反応手段に接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を検体反応手段に固定化した抗体に結合させる。その後、検体反応手段に生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を接触させると、抗体に結合した特定微生物が蛍光染色されるので、蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬として特定微生物の数を簡単に、迅速に、しかも正確に計量することができるという作用を有する。光学的測定手段としては上記のような手段が挙げられる。また、第１の試薬を核酸結合性の試薬としたことで、細胞内に存在する核酸の染色を指標としているため、染色後、一細胞レベルで検出できる。これにより特定微生物の生死細胞の数をさらに高精度に計量することができるという作用を有する。また、第２の試薬を核酸結合性の試薬としたことで、細胞内に存在する核酸の染色を指標としているため、染色後、一細胞レベルで検出できる。これにより特定微生物の死細胞の数をさらに高精度に計量することができるという作用を有する。また、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたことで、特定微生物の生細胞の代謝物と反応するため、その反応性より特定微生物の生死を判定できるという作用を有する。
【００６４】
また、微生物由来物質を酵素タンパク質としたことで、その反応性より特定微生物の生細胞の生死を判定できるという作用を有する。
【００６５】
また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたことで、その反応性より特定微生物の生死を判定できるという作用を有する。
【００６６】
また、検体反応手段を検体接触液をフローさせながら接触できるものとしたことで、検体反応手段に固定化された抗体と蛍光染色された特定微生物との接触効率を向上させることができるので、蛍光染色された特定微生物をより確実に検体反応手段に捕捉することができ、より精度のよい計量が可能になるという作用を有する。
【００６７】
また、検体反応手段を液状検体をフローさせながら接触できるものとしたことで、検体反応手段に固定化された抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができるので、特定微生物をより確実に検体反応手段に捕捉することができ、特定微生物を蛍光染色することで、より精度のよい計量が可能になるという作用を有する。
【００６８】
また、検体反応手段を間隙を挟んで互いに対向して配置された２つの電極と両電極を電位可変自在に短絡させることができる短絡部を有し、特定微生物に特異的に反応する抗体が一方の電極に固定化されたものとしたことで、抗体が固定化された電極が正側となるように電圧をかければ、通常、表面が負の電荷に帯電している特定微生物は、正側の電極の方向に移動して集まるので、抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができる。従って、特定微生物をより確実に検体反応手段に捕捉することができ、より精度のよい計量が可能になるという作用を有する。その概念の一例を図１２に示す。図１２に示したように、検体反応手段５１は、ガラス基板などの基板５２に特定微生物６１に特異的に結合する抗体５３を固定化したものからなるが、抗体５３は間隙を挟んで互いに対向して配置された２つの電極５７、５８の一方の電極５７に固定化されている。抗体５３が固定化された電極５７が正側となるように短絡部５９によって電圧をかければ、特定微生物６１が試薬５４によって既に蛍光染色されている場合は、検体接触液６２に含まれる、通常、表面が負の電荷に帯電している蛍光染色された特定微生物６１は、電極５７の方向に移動して集まる。従って、抗体５３と蛍光染色された特定微生物６１との接触効率を向上させることができる。なお、蛍光染色された特定微生物６１に抗体５３を結合させた後に、電極５８が正側となるように電圧を逆転してかければ、検査目的となる特定微生物以外の微生物が検体接触液６２に含まれていた場合、当該微生物は電極５８の方向に移動して集まるので、蛍光染色された特定微生物６１とその他の微生物との分離が容易になり、高い測定精度が確保される。抗体５３はこの蛍光染色された特定微生物６１に抗原抗体反応によって結合し、蛍光染色された特定微生物６１は検体反応手段５１に捕捉され、そして、抗体５３に結合した蛍光染色された特定微生物６１を光学的測定手段により測定することにより、蛍光染色された特定微生物６１が捕捉された位置で発光を観察することができる。
【００６９】
本発明の第一の特定微生物計量装置は、液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を蛍光染色した後に抗体と結合させてこれを計量する装置である。上記の液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を蛍光染色した後に抗体と結合させてこれを計量する方法を精度よく実施することができるという作用を有する。即ち、抗体に結合した蛍光染色された特定微生物が存在する検体反応手段に励起光を照射し、励起光によって発光する光に基づいて特定微生物の数を計測する。検体反応手段は、通常、直径４０ｍｍ程度の大きさであるが、そこに含まれる特定微生物の大きさが１乃至５μｍと非常に小さいので、従来使用されているＣＣＤカメラを使い、画像処理をおこなうと、必要な画素数が膨大になり、直接的な認識が困難になるため、１０００倍程度の拡大手段を用いないと認識できなかった。そこで、本発明者らは、検体反応手段に捕捉された特定微生物の大きさに着目し、１乃至５μｍ角の面積（受光手段の輝度として測定できればできるだけ大きな面積が望ましいが、フォトダイオードと同じ程度の大きさ３０μｍ角以下が望ましい）に予め定められた波長域で励起光を照射し、その励起光によって発光する光量を測定し、その積算から特定微生物の数を計量することにしたものである。このとき、励起光を照射して、発光した蛍光の強度は時間とともに変化する。従って、一定の発光光量の範囲内での時間を設定し、そのときの光量で特定微生物の有無を判断する必要がある。具体的には、特定微生物以外の不純物は、蛍光を発しないが、励起光の散乱光などを発し、受光時に影響を与えることがあるため、受光した光量がある一定値以上を示した場合を特定微生物と判断する。また、不純物の種類によっては特定微生物以上の蛍光を発する場合も想定されるため、設定した光量の範囲内のときに特定微生物と判断させ、基本的には、範囲内の光量を受光した場合を１個の特定微生物として計量する。そして、この励起光を照射する微小面積を連続的あるいは断続的に移動させ、例えば、従来法の寒天培地拡散法のデータと比較する場合には、直径４０ｍｍの面積全体をスキャンし、その面積での特定微生物の数を積算して計量することができる。従って、励起光による試薬の消光に伴う過少評価の発生を防止し、異物から発せられる発光による過大評価の発生を防止する能力を有するものであり、従来の培養法などと比べ、特殊な技術や設備を必要とせず、短時間で特定微生物の計量をすることができる。
【００７０】
本発明の第二の特定微生物計量装置は、液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を抗体と結合させた後に蛍光染色してこれを計量する装置である。上記の液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を抗体と結合させた後に蛍光染色してこれを計量する方法を精度よく実施することができるという作用を有する。即ち、抗体に結合した蛍光染色された特定微生物が存在する検体反応手段に励起光を照射し、励起光によって発光する光に基づいて特定微生物の数を計測する。第１乃至第４の試薬は、一つの検出試薬含有部に一緒に収容してもよいし、複数の検出試薬含有部に別々に収容してもよい。
【００７１】
また、受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けたことで励起光によって発生した蛍光範囲を拡大した状態で光電変換素子へ導入することが可能となるため高い検出感度を保持できるという作用を有する。
【００７２】
また、受光手段に含まれる複数の光電変換素子を線状に配置することによってＸ軸方向（配列方向）への移動を不要なものとし、Ｙ軸方向（移動方向）のみの移動によって一定範囲の検知を実施することが可能となり、計量を迅速に実施することができるという作用を有する。
【００７３】
また、検体反応手段を円盤状とし、その検体反応手段を可動させることで検体若しくは光源の回転による検出が可能となる。検出方法としては、例えば、光ディスク読み取り用装置が挙げられる。検体反応手段を設置し、回転させることで光源の移動を検体反応手段の半径のみで実施可能となる。それにより検出を自動化、迅速化することができるという作用を有する。
【００７４】
また、検体反応手段を測定する面積を多角形として、その検体反応手段を可動させることで検体反応手段上に含まれる特定微生物の検出が容易に可能となる。検出手段としては、例えば、スキャナーが挙げられる。検体反応手段を設置し、移動させることで、これにより検出を自動化、迅速化することができるという作用を有する。
【００７５】
また、微小面積を移動させる移動手段として、光源、受光手段、検体反応手段のいずれか一つ若しくは複数を移動させる駆動手段を設け、設定速度範囲内で可動させることで、可動時に生ずるずれ、残像の発生あるいは残光の発生を防止し、過大若しくは過少評価を防止できるという作用を有する。
【００７６】
また、光源より発せられる光の集光手段および／または受光手段への集光手段として反射板を設けることによって余計な光のロスを防止し、また、光を集めることで感度を高めることができるという作用を有する。
【００７７】
また、光源と微小面積の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けることによって励起光源から発せられる波長が幅の広いものであった場合でも、特定の励起波長を取り出すことが可能となる。さらに微小面積と受光手段の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けることによって励起光と同様に様々な波長を含む蛍光も特定の蛍光波長を取り出すことが可能となり、高い精度の計量が可能となるという作用を有する。
【００７８】
また、光源または受光手段の少なくともいずれか一方に検体反応手段内の微小面積に焦点を合わせる自動焦点機能を備えることで検体反応手段表面の形状に依存せず、安定な計量が可能となる。さらに自動焦点機能を備えたことで励起光の照射面積を一定に保つことが可能となり、検体反応手段で捕捉し、発光させた特定微生物へ与える負荷が最小限となり、過少評価を回避できるという作用を有する。
【００７９】
また、光源から発せられる光を光ファイバーを使用して検体反応手段へと導入する手段を有することで複雑な形状の検体反応手段でも安定した励起光を提供することができる。さらに、光ファイバーを使用することで光源部を別部に設けることが可能となる。これにより、発熱する光源を使用した場合でも、その発熱による検体反応手段および検体反応手段に捕捉された特定微生物に対する負荷を最小限とすることができるという作用を有する。
【００８０】
また、紫外光を透過するレンズを使用することで光源に紫外光発生手段を使用でき、紫外領域の励起光でも安定的に検体反応手段へ提供できる。
【００８１】
また、装置若しくは検体反応手段に測定位置を示す部位を設け、受光手段に測定位置を認識する手段を設けることで光源または受光手段の少なくともいずれか一方が存在する位置を把握し、同位置の二重検出若しくは検出もれを防ぎ、過大若しくは過少評価を避けることができる。さらに、検体反応手段の測定位置を示す手段に磁気を用いることで簡易的かつ正確な位置認識が可能となり、過大若しくは過少評価を避けることができるという作用を有する。
【００８２】
また、検体反応手段の測定位置を認識する軌道を移動させる際、認識軌道位置から一定の距離を保った状態で次の認識軌道位置へ移動させることで検出もれを防止し、検体反応手段全体を検出することが可能となる。さらに、認識軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとすることで従来法の一つである培養法との相関性を高めることができるという作用を有する。これは、培養法においてコロニーが重複することによって一つのコロニーと認識する範囲を避ける事ができる最低限の距離である。
【００８３】
また、検体反応手段に捕捉された特定微生物から得られた信号を、二値化した点座標として認識し、信号が得られた点座標の数を計測することにより、検体反応手段に捕捉された特定微生物を容易にかつ迅速に計量することができる。さらにその二値化した点座標から輝度を求め、特定微生物が保有する活性を計量することも可能となる。また、近隣した信号を一つの信号と認識することで培養法との相関性を高めることができる。さらに近隣した信号から検体反応手段に付着した付着物の形状を把握することができ、特定微生物以外の形状のものは計量から除去することが可能となり、精度を向上することができるという作用を有する。
【００８４】
以下、本発明の実施例について図面を参照しながら説明する。
【００８５】
【実施例】
以下に本発明の実施例１について説明する。
【００８６】
本発明の特定微生物計量方法における検査対象は、特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体である。液状検体は、水系のものであればどのようなものであってもよく、例えば、食品や調理器具などの洗浄液、食品に水を加えてすりつぶした後、固形分や油状物質を遠心分離やろ過を行うことによって分離して得られる上清液、調理器具を拭き取った綿棒などの洗浄液、調理室内の空気を界面活性剤含有水溶液に吹きつけた後の水溶液などが挙げられる。
【００８７】
検査目的となる特定微生物としては、食中毒の原因となり得る病原性の腸内細菌である大腸菌、大腸菌群細菌、赤痢菌、コレラ菌、サルモネラ菌、ビブリオ菌、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、ブドウ球菌、セレウス菌などが挙げられるが、食中毒以外の感染症の原因となり得る細菌、例えば、結核菌、肺炎双球菌、緑膿菌、レジオネラ菌などであってもよい。
【００８８】
特定微生物を蛍光染色するために使用される生死細胞を発光させる第１の試薬としては、例えば、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（誘導体であってもよい）のような生死細胞の膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合することで発光する試薬が挙げられる。死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬としては、例えば、プロピデュームイオダイド（誘導体であってもよい）のような死細胞の膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合することで発光する試薬が挙げられる。生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬としては、例えば、６−カルボキシフルオレセインジアセテート、２’，７’ジクロロフルオレセインジアセテート、６−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）−３’，６’−０，０’−ジアセチルフルオレセイン、ジヒドロドローダミン、二酢酸フルオレセイン、二酢酸４−アジドフルオレセイン（これらは誘導体であってもよい）のような細胞内に浸透し、生細胞内に存在する酵素タンパク質、例えば、エステラーゼによって分解されることで発光する試薬が挙げられる。特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する第４の試薬としては、例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（これらは誘導体であってもよい）が挙げられる。これらは、大腸菌や大腸菌群細菌が生産する酵素タンパク質であるβ−ガラクトシダーゼと特異的に反応することによって分解されて４−メチルウンベリフェロンを生成する。４−メチルウンベリフェロンは紫外光に対し、励起され蛍光を発する。第１乃至第４の試薬は、例えば、生理食塩水に溶解された状態で使用される。これらは、いずれか１種類の試薬を使用するだけでもよいし、２種類の試薬を使用するものであってもよいし、３種類の試薬を使用するものであってもよいし、全ての試薬を使用するものであってもよい。
【００８９】
本発明の特定微生物計量方法における検体反応手段は、ガラス基板などの基板に検査目的となる特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化したものからなる。なお、基板への抗体の固定化は、自体公知の方法によってなされる。概略を以下に説明する。まず、ガラス基板の場合、ガラス表面に長鎖アルキル基を導入する。これは、例えば、１０ｍＭオクタデシルトリクロロシラン／ベンゼン溶液からなる試薬中に、表面を強酸や有機溶媒などで清浄したガラス基板を浸漬することにより行うことができる。ガラス表面にアミノ基を導入してもよい。これは、例えば、１０ｍＭアミノプロピルトリエトキシシラン／ベンゼン溶液からなる試薬中に、表面を強酸や有機溶媒などで清浄したガラス基板を浸漬することにより行うことができる。ガラス表面に長鎖アルキル基を導入した場合、その表面は高い疎水性を有することになるが、抗体も疎水性を有するので、いわゆる疎水性相互作用により、ガラス表面に抗体が固定化される。ガラス表面にアミノ基を導入した場合、グルタルアルデヒドにて、ガラス表面のアミノ基と抗体のアミノ基を結合することにより、ガラス表面に抗体が固定化される。なお、抗体が固定化されていない部分には、測定精度に影響を及ぼしたりするようなタンパク質などが結合しないように、牛血清アルブミンやスキムドミルクやカゼインなどのような測定精度に影響を及ぼしたりすることのないタンパク質を結合し、ブロッキングしておくことが望ましい。
【００９０】
抗体の固定化は検体反応手段の全面に行ってもよいし、固定化領域を限定してもよい。固定化領域の限定は、抗体溶液をスポットするのに直径約１０乃至１００μｍのガラスキャピラリーを使用することで行うことができる。
【００９１】
検体反応手段には単一種類の特定微生物の計量を行うために単一種類の抗体を固定化してもよいし、複数種類の特定微生物の計量を同時に行うために複数種類の抗体を固定化領域を分割して固定化し、その領域を特定化しておいてもよい。
【００９２】
抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよいが、一般に、特異性に優れたモノクローナル抗体を使用することが望ましい。ポリクローナル抗体を使用する場合は、アフィニティー精製を行ったものを使用することが望ましい。抗体の作製方法に特段の制限はなく、特定微生物の抗原を使用した動物免疫による方法、必要とする抗体の抗体産生細胞の細胞融合による方法、必要とする抗体の遺伝子を使用した遺伝子工学的手法による方法などがある。食中毒の原因になり得る細菌のモノクローナル抗体は既に種々知られており、市販されているものもある。
【００９３】
本発明の第一の特定微生物計量方法においては、まず、第１乃至第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類を検査目的となる特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に接触させる。この接触条件、即ち、液状検体が検査目的となる特定微生物を含有している場合における特定微生物の蛍光染色条件は、例えば、室温でも可能であるが、３０℃前後で数分の反応時間のようなものでよい。
【００９４】
次に、第１乃至第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類を液状検体に接触させて得られる検体接触液を検体反応手段に接触させる。この接触条件、即ち、蛍光染色された特定微生物に抗体を結合させるための反応条件は、通常の抗原抗体反応条件でよく、例えば、３０℃前後で数分の反応時間のようなものでよい。
【００９５】
最後に、検体反応手段を蒸留水や生理食塩水などの洗浄液で洗浄して検査目的ではない微生物や夾雑物や未反応の第１乃至第４の試薬などを除去した後、光学的測定手段により、検体反応手段に捕捉された蛍光染色された特定微生物の数や有無を測定する。
【００９６】
本発明の第二の特定微生物計量方法においは、まず、検査目的となる特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を検体反応手段に接触させる。この接触条件、即ち、液状検体が検査目的となる特定微生物を含有している場合における特定微生物に抗体を結合させるための反応条件は、通常の抗原抗体反応条件でよく、例えば、３０℃前後で数分の反応時間のようなものでよい。
【００９７】
次に、必要に応じて検体反応手段を蒸留水や生理食塩水などの洗浄液で洗浄して検査目的ではない微生物や夾雑物などを除去した後、第１乃至第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類を検体反応手段に接触させる。この接触条件、即ち、検体反応手段に捕捉された特定微生物の蛍光染色条件は、例えば、室温でも可能であるが、３０℃前後で数分の反応時間のようなものでよい。
【００９８】
最後に、検体反応手段を蒸留水や生理食塩水などの洗浄液で洗浄して未反応の第１乃至第４の試薬などを除去した後、光学的測定手段により、検体反応手段に捕捉された蛍光染色された特定微生物の数や有無を測定する。
【００９９】
検体反応手段の全面に抗体を固定化した場合、図１に示すように特定微生物計量装置に設置されている励起光の検体反応手段上における軌道は、検体反応手段１全体を網羅するものであることが望まれる。そのために検体の幅、長さを軌道Ａ２のように移動し、検出するものである。また、図２に示したように検体反応手段全体を検出するための軌道は円状のものも可能であるため軌道Ｂ３のように移動し、検出することも可能である。光源４は、検体反応手段上を各軌道に沿って移動させる。光源４より発した励起光によって生ずる蛍光を利用した特定微生物判断手段のモデルを図３に示した。検体反応手段上から発せられた蛍光は蛍光を発した部位と相関して特定微生物判断手段５を形成する。特定微生物判断手段５には、不純物などから生ずる散乱光あるいは同励起光によって発生する蛍光などが混在しており、目的の特定微生物から発せられる蛍光に限定されたものではない場合が生ずる。そこで、しきい値を設けるものである。しきい値は、蛍光強度の上限６と下限７があり、その範囲内の蛍光を特定微生物由来のものとして認識し、積算する。これにより、特定微生物以外の不純物由来の蛍光を把握し、正確な計量を可能なものとしたものである。しきい値は、特定微生物が発する蛍光強度によって決定されるものである。また、特定微生物が近接している場合、特定微生物が発する蛍光から形成される波形は、図４に示したように隣接したものが得られる。この場合、隣接した特定微生物を従来法の一つである寒天培地拡散法で検出した場合、微生物の増殖とコロニーの拡大に伴い、コロニー同士が重層し、目視で確認する時点で一つのコロニーとして判断してしまう場合がある。そこで、本発明において波形８に示すような場合は、一つの特定微生物として検出するように設定した。これにより寒天培地拡散法との相関性を得ることができるものである。
【０１００】
また、検体反応手段１への励起光照射時間は、図５に示したように蛍光強度が消光しない時間の範囲で照射される。即ち、しきい値９の範囲である。
【０１０１】
図６に示すように特定微生物計量装置は、光源４、光源集光手段としてのレンズ１０、受光部１１を含む。光源４から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルター１２で分光する。分光された励起光はプリズム１３を経て、光路を変化させられる。光路を変化させられた励起光はレンズ１０を経て検体反応手段１の表面に集光される。そこで励起光によって励起された特定微生物が有する蛍光は、再びプリズム１３を透過する。その際、蛍光はプリズム１３をそのまま透過し、受光部１１に到達する。受光部１１に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルター１４を経て、受光部１１に内蔵された光電変換素子１５に到達し、信号化され、認識される。また、図には示していないが、検体反応手段１若しくは特定微生物計量装置には、検体反応手段を移動する手段を備えており、検体反応手段１の蛍光発光を全て、若しくは一部を受光することができる。
【０１０２】
光電変換素子１５に到達した蛍光は、特定微生物判断手段５において特定微生物若しくは異物と判断され、特定微生物と判断された蛍光は積算されて、その数量が計量される。
【０１０３】
光源４より発生した励起光は、レンズ１０によって集光されるが、その際、レンズ１０によって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。この場合、微小な一定面積とは特定微生物の大きさに基づいて設定した場合、一辺０．２μｍ乃至７．０μｍ程度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖した微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、この場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。
【０１０４】
レンズ１０によって集光された励起光の照射時間は、蛍光を発する試薬の消光時間と励起光強度に依存する。試薬の種類によっては、自然界に存在する紫外光によっても分解する場合があり、２秒乃至３００秒前後の範囲内で励起光を照射することが望ましい。
【０１０５】
発光後の輝度を認識する場合、図７に示したように蛍光発光した位置を「０」と「１」の二値化にて表現する。二値化した場合、隣接した発光を一つの発光源１６としてみなす。また、発光源の大きさおよびその輝度が設定の大きさと比較して相対的に大きく異なる場合、異物１７として認識し、検査対象外とみなすことで特定微生物として計量しない。隣接した発光の隣接距離としては、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養され、増殖した微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。
【０１０６】
発光を検出する際、光源４の波長の幅が広いものである場合は、励起光分光フィルター１２によって励起波長を調整、分光することが可能となる。励起光分光フィルター１２は、目的の検出対象に応じて変えられるため、様々な蛍光を発する試薬に対応できる。また、同時に、発光した蛍光波長の幅が広いものである場合は、目的の発光を検出するために蛍光分光フィルター１４を目的の検出対象に応じて変えることで様々な蛍光を発する試薬に対応できる。
【０１０７】
光源４としては、各種ダイオード、ハロゲンランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、ブラックライト、水銀ランプなどが挙げられる。これらの光源のうち最大励起波長が比較的限定されているダイオード、冷陰極管、ブラックライトなどは、前記励起光分光フィルター１２および蛍光分光フィルター１４を使用することなく実施できる場合がある。また、ハロゲンランプ、水銀ランプなどについては、励起光分光フィルター１２および蛍光分光フィルター１４を使用する必要がある場合がある。
【０１０８】
プリズム１３およびレンズ１０は、必要に応じてそれぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスなどが挙げられる。これにより紫外光で励起される試薬などにも対応できる。検体反応手段１を設置する部位は回転能を有し、その上部に検体反応手段１を設置する。レンズ１０により集光された励起光は、検体反応手段１の外周部より中心部へ、若しくは、中心部より外周部へ、半径分の距離を移動する。その際、レンズ３により集光された励起光の位置が外周部に存在するときと中心部に存在するときで検体反応手段１の回転速度を変化させることによって、レンズ１０により集光された励起光が外周部に存在するときと中心部に存在するときで励起された試薬が発した蛍光のずれ、残像および残光の発生を防止することができる。
【０１０９】
なお、集光した位置を認識する手段を設けることでレンズ１０によって集光された励起光の位置を認識し、集光が軌道から逸れないように、また、逸れた場合は再び軌道に戻すように設定されるものである。
【０１１０】
なお、励起光を照射する微小な一定面積は、正方形を含む多角形に限らず、円形、楕円形等でも可能であり、検体を照射できるものであればよい。
【０１１１】
なお、励起光若しくは蛍光を分光する手段として回折格子などを利用することも可能である。
【０１１２】
なお、検体反応手段１の回転速度を調整することで蛍光の残像および残光を防ぐこととしたが、励起光を照射するレンズ１０の移動速度を調整することで残像および残光を防ぐことも可能である。
【０１１３】
なお、集光した位置を認識する手段は、必ずしも励起光の集光位置を直接認識する必要は無く、検体反応手段１上の軌道を把握するものであればよい。
【０１１４】
以下に本発明の実施例２について説明する。
【０１１５】
図８に示す特定微生物計量装置は、検体反応手段１、光源４、反射板１８、レンズ１０、受光部１１を含む。光源４から発せられた励起光によって、検体反応手段１に捕捉された特定微生物から励起され、生じた蛍光を反射板１８によって光の方向を変化させ、レンズ１０によって集光し、受光部１１にて検出する。受光部１１に到達した蛍光は、特定微生物判断手段５において特定微生物若しくは異物と判断され、特定微生物と判断された蛍光は積算されて、その数量が計量される。光源４は、検体反応手段１をスキャンする。さらに、光源４の軌道に合わせて反射板１８を設置させる。
【０１１６】
光源４より発生した励起光は、レンズ１０によって集光されるが、その際、励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。この場合、微小な一定面積とは特定微生物の大きさに基づいて設定した場合、一辺０．２μｍ乃至７．０μｍ程度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖された微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、この場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。
【０１１７】
レンズ１０によって集光された励起光の照射時間は、蛍光を発する試薬の消光時間と励起光強度に依存する。試薬の種類によっては、自然界に存在する紫外光によっても分解する場合があり、２秒乃至３００秒前後の範囲内で照射することが望ましい。
【０１１８】
光源４としては、各種ダイオード、ハロゲンランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、ブラックライトなどが挙げられる。
【０１１９】
反射板１８およびレンズ１０は、必要に応じて、それぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスなどが挙げられる。これにより紫外光によって励起される試薬などにも対応できる。
【０１２０】
なお、検体反応手段１への光源４より発せられる励起光の強度の減少若しくは外部光による蛍光への影響を防ぐために検体反応手段１を暗視野環境下に置くための暗視野板等を設置することも可能である。
【０１２１】
なお、光源４が移動するとは限らない。検体反応手段１を移動させ、これに捕捉された特定微生物を検出することも可能である。
【０１２２】
なお、光源４が内蔵されているとは限らない。外部に光源４を含む光源部を設け、そこから光ファイバー等を利用して装置内へ励起光を導入することも可能である。
【０１２３】
なお、光源の種類により、目的以外の波長を除去する手段を設けることも可能である。例えば、励起光分光フィルターや回折格子などが手段として挙げられる。
【０１２４】
なお、発せられる蛍光の種類により、目的以外の波長を除去する手段を設けることも可能である。例えば、蛍光分光フィルターや回折格子などが手段として挙げられる。
【０１２５】
なお、反射板１８の代わりにプリズム体などを利用することも可能である。
【０１２６】
以下に本発明の実施例３について説明する。
【０１２７】
図９に示すように検体反応手段１は、着脱操作などについての作業者の取り扱い性を向上するために把手部１９と液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を捕捉するための検体反応部２０と検出開始点を認識するための検出開始線２１と検出軌道を認識するための検体認識軌道２２からなる。
【０１２８】
検体反応部に捕捉された蛍光染色された特定微生物は、それが捕捉された位置で蛍光を発する。また、検体反応手段１上に集光せしめた励起光の位置を認識させるため、検体反応手段１に予め設けられている検体認識軌道２２を検出し励起光の位置を認識するものである。図６に示したレンズ１０より集光された励起光は、検出開始線２１を開始点として、外周を移動する。外周移動後、再び検出開始線２１に到達後、図６に示したレンズ１０より集光された励起光は、一つ内側の検体認識軌道２２にずれ、その軌道上に含まれる発光数を認識する。これを繰り返しながら中心へ向かって励起光を移動させることによって検出を必要とする面積に含まれる特定微生物数を検出する。
【０１２９】
検出開始線２１は、直接検体反応手段へ刻み込まれたマーキングや励起光あるいは集光位置を認識できる反射性を有したマーカーなどが挙げられる。これは、検体認識軌道２２も同様であるが、このマーカーが蛍光に影響を与えないものを使用することが望ましい。
【０１３０】
なお、把手部は外周に存在するとは限らない。
【０１３１】
なお、検出開始点を認識するのは、線とは限らない。
【０１３２】
なお、検出軌道はらせん状や斜め方向でも構わない。
【０１３３】
なお、励起光の移動は外周からとは限らない。
【０１３４】
以下に本発明の実施例４について説明する。
【０１３５】
図１０は、検体反応手段を検体接触液・液状検体をフローさせながら接触できるものとした、当該検体反応手段の一例の概略図である。検体反応手段１は、検体接触液・液状検体を投入する投入口２３と過剰な検体接触液・液状検体や検体反応手段１内に予め含まれる空気を排出するための排出口２４を有するフローセルからなる。また、検体反応手段１は、少なくとも受光部１１が存在する方向の面が光透過面２５となっており、受光部１１で蛍光を検出できる構造となっている。光透過面２５と、その対面に位置している底面２６は、平行な位置関係に有り、傾斜を生じない構成を有している。この底面２６に特定微生物に特異的に結合する抗体が固定化されている。そして、光透過面２５と底面２６に２つの電極を配置し、両電極を電位可変自在に短絡させることができる短絡部２７で接続する。底面２６に配置された電極が正側となるように電圧をかければ、通常、表面が負の電荷に帯電している特定微生物は、底面２６の方向に移動して集まるので、抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができる。
【０１３６】
特定微生物が既に蛍光染色されている場合、投入口２３から蒸留水や生理食塩水などの洗浄液をフローセル内に供給して検査目的ではない微生物や夾雑物や未反応の第１乃至第４の試薬などを内部から除去した後、励起光を照射し、励起光によって発光する光に基づいて特定微生物の数を計測する。
【０１３７】
特定微生物が未だ蛍光染色されていない場合、必要に応じて投入口２３から蒸留水や生理食塩水などの洗浄液をフローセル内に供給して検査目的でない微生物や夾雑物などを内部から除去した後、投入口２３から第１乃至第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類を供給し、特定微生物を蛍光染色する。それから、投入口２３から蒸留水や生理食塩水などの洗浄液をフローセル内に供給して未反応の第１乃至第４の試薬などを内部から除去した後、励起光を照射し、励起光によって発光する光に基づいて特定微生物の数を計測する。
【０１３８】
上記構成により、特定微生物が検体反応手段１内に導入された際、光透過面２５と、その対面に位置している底面２６の間が一定の厚みに保持されているため、特定微生物が互いに重なり合うことなく、一定の範囲に拡散させることができる。これにより、重なり合いによる過少評価を防ぐことが可能となり、受光部１１による正確な計量が可能となる。
【０１３９】
なお、異物を除去するために投入口２３の前にフィルターを設けることで特定微生物を検出するための感度を向上することができる。
【０１４０】
なお、光透過面２５の構成を紫外線等の励起光に影響しないものとすることでその妨害を防ぐことができる。
【０１４１】
なお、光透過面２５と、その対面に位置している底面２６の距離を０．５乃至１５μｍの範囲内とすることで、特定微生物の重なりを防止し、正確な判別が可能となる。
【０１４２】
【発明の効果】
以上の実施例から明らかなように、本発明によれば、液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を検体反応手段に捕捉し、捕捉された特定微生物の数若しくは有無を同時に、かつ迅速に把握することができる特定微生物計量方法を提供できる。この方法は、生死細胞や死細胞を正確に測定することができるので、特定微生物による環境汚染状況をリアルタイムで把握でき、汚染の防止手段をいち早く対策することができるなどの利点を有する。
【０１４３】
また、第１の試薬を核酸結合性の試薬としたことで、液状検体に細胞の代謝物や夾雑物が存在している場合でも生死細胞を正確に、しかも短時間で測定することができる特定微生物計量方法を提供できる。
【０１４４】
また、第２の試薬を核酸結合性の試薬としたことで、液状検体に細胞の代謝物や夾雑物が存在している場合でも死細胞を正確に、しかも短時間で測定することができる特定微生物計量方法を提供できる。
【０１４５】
また、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたことで、生きている特定微生物の有無を確認することができる特定微生物計量方法を提供できる。また、微生物由来物質を酵素タンパク質としたことで、より高い感度で生きている特定微生物の有無を確認することができる特定微生物計量方法を提供できる。
【０１４６】
また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたことで、特定微生物の有無を容易に確認することができ、特定微生物をモニタリングすることができる特定微生物計量方法を提供できる。また、前処理などの必要がなくなり、さらに検査時間を短時間にすることができる特定微生物計量方法を提供できる。
【０１４７】
また、検体反応手段を検体接触液や液状検体をフローさせながら接触できるものとしたことで、検体反応手段に固定化された抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができる特定微生物計量方法を提供できる。
【０１４８】
また、検体反応手段を間隙を挟んで互いに対向して配置された２つの電極と両電極を電位可変自在に短絡させることができる短絡部を有し、特定微生物に特異的に反応する抗体が一方の電極に固定化されたものとしたことで、通常、微生物の表面が負の電荷に帯電している性質を利用し、抗体が固定化された電極が正側となるように電圧をかけることで、抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができる特定微生物計量方法を提供できる。
【０１４９】
本発明によれば、液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を計量する特定微生物計量装置を提供できる。この装置は、励起光による蛍光の消光を抑え、正確に特定微生物の数を計量することができるようにしたものであり、しきい値を設けたことで、異物混入による過大評価を防止し、高い感度を保持したものである。
【０１５０】
また、受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けたことで高い検出感度を得ることができる。さらに、光電変換素子を線状に配置することで一方向へのスキャンで検体反応手段上に存在する特定微生物を検出することができ、特定微生物の計量を迅速化することができるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５１】
また、検体反応手段を円盤状とすることで回転方向への検体反応手段の駆動を容易にし、それにより検出速度の向上が可能となる。さらに光源、受光手段の少なくともどちらか一方の検出移動距離を最小限に抑えることができる。それに伴い、検出時間の迅速化および特定微生物計量装置の簡易化が可能になるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５２】
また、光源より発せられる励起光の検体反応手段への照射の微小面積を設定速度範囲内で可動させることで発光のずれや残像、残光を防止でき、それに伴い過大若しくは過少評価を防止することができるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５３】
また、光源より発せられる光または検体反応手段より発せられた光の少なくともいずれか一方を反射板を使用し、集光することで、検体反応手段への効率の高い照射または受光手段での効率の高い検出が可能になり、装置構成を簡易化することができるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５４】
また、光源の波長を分光できる分光部と蛍光波長を分光できる分光部を設けることで、目的の波長を照射し、発せられた目的の蛍光波長の検出を可能とし、高感度な目的の検出が可能となる特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５５】
また、検体反応手段の表面を自動的に認識し、励起光の焦点を合わせることで検出位置を認識し、検体反応手段全体を検出することが可能となり、その検出に伴う、二重検出若しくは検出洩れを防ぐことで検体の過大若しくは過少評価を避けることができる特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５６】
また、光ファイバーを利用して光源からの励起光を導入することで、熱源となる光源を別部に設置することが可能となり、これにより検体反応手段に捕捉された特定微生物などへの熱の影響を防止し、誤差拡大の回避が可能となる。さらに検体反応手段が複雑な形状の場合でも常時、一定の光を検体反応手段へと導入することができ、より正確な計量が可能になるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５７】
また、光源集光手段に紫外光透過性レンズを使用することで紫外領域の波長の光量を減少させることなく検体反応手段へと導入することができ、紫外領域の波長によって検出可能な試薬に基づいた計量ができるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５８】
また、装置若しくは検体反応手段に測定位置を示す手段を設けることで検出位置を認識させることができ、誤検出の防止あるいは検出速度の調整ができる。さらに、検体反応手段の測定位置を示す手段に磁気を利用することで簡易かつ正確な検出が可能となるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５９】
また、検体反応手段の測定位置を認識する軌道位置から次の認識軌道位置までを一定の距離を保った状態で移動させる手段を有することで検体反応手段全体を検出する必要がなくなり、迅速化が可能となる。また、各軌道間に位置する微生物の誤認識を防止し、より正確な計量を実施できる。さらに、各軌道間の距離を１０乃至５０μｍとすることで従来法との相関性を出すことができるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１６０】
また、検体反応手段上から得られた蛍光を「０」と「１」の二値化した点座標として認識することで、特定微生物を容易にかつ迅速に計量でき、その位置関係によって異物として認識されたものを対象外として除去し、同様にその位置関係として特定微生物として認識されたもののうち、従来法の寒天培地拡散法と比較した場合、近隣した特定微生物として認識されたものを一つ特定微生物として認識することで従来法と相関性を有するという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の実施例１の励起光の検体反応手段上における軌道Ａの構成図
【図２】 同実施例１の励起光の検体反応手段上における軌道Ｂの構成図
【図３】 同実施例１の波形モデルを示す図
【図４】 同実施例１の特定微生物隣接存在時における波形モデルを示す図
【図５】 同実施例１の蛍光消光モデルを示す図
【図６】 同実施例１の特定微生物計量装置を示す図
【図７】 同実施例１の二値化モデルを示す図
【図８】 本発明の実施例２の特定微生物計量装置を示す図
【図９】 本発明の実施例３の検体反応手段を示す図
【図１０】 本発明の実施例４の検体反応手段を示す図
【図１１】 免疫アッセイ法の理論の一例を示す概念図
【図１２】 電極を利用した検体反応手段の一例を示す概念図
【符号の説明】
１ 検体反応手段
２ 軌道Ａ
３ 軌道Ｂ
４ 光源
５ 特定微生物判断手段
６ 上限
７ 下限
８ 波形
９ しきい値
１０ レンズ
１１ 受光部
１２ 励起光分光フィルター
１３ プリズム
１４ 蛍光分光フィルター
１５ 光電変換素子
１６ 発光源
１７ 異物
１８ 反射板
１９ 把手部
２０ 検体反応部
２１ 検出開始線
２２ 検体認識軌道
２３ 投入口
２４ 排出口
２５ 光透過面
２６ 底面
２７ 短絡部
５１ 検体反応手段
５２ 基板
５３ 抗体
５４ 試薬
５７ 電極
５８ 電極
５９ 短絡部
６１ 特定微生物
６２ 検体接触液
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定微生物（微生物の意味するところは少なくとも細菌と真菌を含む概念である）、即ち、特定の細菌類および真菌類等を含有するか含有する可能性のある液状検体から、特定微生物を発光させ、その計量を簡単にしかも迅速に行うことができる方法および装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、この種の特定微生物を計量する特定微生物計量方法に関するものとして、特開平７−１４０１４８号に記載されるように蛍光物質で標識された抗体を用いて特定微生物を発光検出するものが知られている。また、この方法によれば、非特異的に染色する試薬との併用で特定微生物と全微生物を把握することができる。
【０００３】
特定微生物計量装置は、食品工場で使用されることが多く、食中毒の原因となり得る大腸菌などの特定微生物の存在の有無を確認することは管理上の重要な要素になっている。また、最近のＨＡＣＣＰの導入によって、食品そのものの検査だけでなく、工場自体や作業行程の検査、例えば、壁・床面、まな板・包丁などの調理器具などの検査も行われており、食品そのものの管理及び環境の管理が重要になっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような従来の特定微生物計量方法では、抗体を使用するので感度の高い計測が行えるが、抗体を蛍光物質で標識化しなければならないので、その手間がかかるとともに費用的にも高くなる。また、この方法では特定微生物の生死を判別することはできない。また、抗体を蛍光標識しているため抗体の反応精度や時間などに課題があった。また、二次抗体を使用した場合、操作の煩雑性や安定性などに問題があり、温度管理や反応時間、操作手順など課題が存在していた。
【０００５】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を蛍光染色した後、この検体接触液を特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化した検体反応手段に接触させ、抗体に結合した蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたことを特徴とする特定微生物計量方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化した検体反応手段に接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を検体反応手段に固定化した抗体に結合させた後、生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を前記検体反応手段に接触させることで、抗体に結合した特定微生物を蛍光染色し、蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたことを特徴とする特定微生物計量方法を提供することを目的とする。
【０００７】
また、微生物由来物質を酵素タンパク質とした方法を提供することを目的とする。
【０００８】
また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質とした方法を提供することを目的とする。
【０００９】
また、検体反応手段を検体接触液をフローさせながら接触できるものとした方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、検体反応手段を液状検体をフローさせながら接触できるものとした方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、検体反応手段を間隙を挟んで互いに対向して配置された２つの電極と両電極を電位可変自在に短絡させることができる短絡部を有し、特定微生物に特異的に反応する抗体が一方の電極に固定化されたものとした方法を提供することを目的とする。
【００１２】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、生死細胞を発光させる核酸結合性の第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる核酸結合性の第２の試薬と、微生物由来物質と反応することで生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に接触させて得られる検体接触液を接触させるための、特定微生物に特異的に結合する抗体を固定化した検体反応手段と、前記検体反応手段の微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに特定微生物と判断する特定微生物判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、特定微生物判断手段から特定微生物と判断された信号から特定微生物の数量を積算する積算手段を有することを特徴とする特定微生物計量装置を提供することを目的とする。
【００１３】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を接触させるための、特定微生物に特異的に結合する抗体を固定化した検体反応手段と、生死細胞を発光させる核酸結合性の第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる核酸結合性の第２の試薬と、微生物由来物質と反応することで生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を収容した検出試薬含有部と、前記検体反応手段の微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに特定微生物と判断する特定微生物判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、特定微生物判断手段から特定微生物と判断された信号から特定微生物の数量を積算する積算手段を有することを特徴とする特定微生物計量装置を提供することを目的とする。
【００１４】
また、受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けた装置を提供することを目的とする。
【００１５】
また、複数の光電変換素子を線状に配置した装置を提供することを目的とする。
【００１６】
また、検体反応手段を円盤状とし、その検体反応手段を可動させることとした装置を提供することを目的とする。
【００１７】
また、検体反応手段を測定する面積を多角形として、その検体反応手段を可動させることとした装置を提供することを目的とする。
【００１８】
また、微小面積を移動させる移動手段として、光源、受光手段、検体反応手段のいずれか一つあるいは複数を移動させる駆動手段を設け、設定速度範囲内で可動させることとした装置を提供することを目的とする。
【００１９】
また、光源より発せられる光の集光手段および／または受光手段への集光手段として反射板を設けた装置を提供することを目的とする。
【００２０】
また、光源と微小面積の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けた装置を提供することを目的とする。
【００２１】
また、微小面積と受光手段の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けた装置を提供することを目的とする。
【００２２】
また、光源および／または受光手段に検体反応手段内の微小面積に焦点を合わせる自動焦点機能を備えた装置を提供することを目的とする。
【００２３】
また、光源と検体反応手段の距離を一定にし、微小面積を一定化する手段を有する装置を提供することを目的とする。
【００２４】
また、光源から発せられる光を光ファイバーを使用して検体反応手段へと導入する手段を有する装置を提供することを目的とする。
【００２５】
また、紫外光を透過するレンズを光源集光手段として用いた装置を提供することを目的とする。
【００２６】
また、検体反応手段の測定位置を示す手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００２７】
また、検体反応手段の測定位置を示す手段に磁気を用いる装置を提供することを目的とする。
【００２８】
また、検体反応手段の測定位置を認識する手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００２９】
また、検体反応手段の測定位置を認識する軌道を移動させる際、認識軌道位置から一定の距離を保った状態で次の認識軌道位置へ移動する手段を有した装置を提供することを目的とする。
【００３０】
また、認識軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとした装置を提供することを目的とする。
【００３１】
また、検体反応手段に含まれる微生物から得られた信号を、二値化した点座標として認識し、信号が得られた点座標の数を計測する機能を有した装置を提供することを目的とする。
【００３２】
また、信号が得られた点座標のうち、近隣した信号を一つの信号として認識する機能を有した装置を提供することを目的とする。
【００３３】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の特定微生物計量方法は、上記目的を達成するため、生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を蛍光染色した後、この検体接触液を特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化した検体反応手段に接触させ、抗体に結合した蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたものである。そして、本発明によれば検体反応手段に捕捉される特定微生物の数若しくは有無を同時に、かつ迅速に把握することができる特定微生物計量方法が得られる。
【００３４】
本発明の第二の特定微生物計量方法は、上記目的を達成するため、特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化した検体反応手段に接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を検体反応手段に固定化した抗体に結合させた後、生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を前記検体反応手段に接触させることで、抗体に結合した特定微生物を蛍光染色し、蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたものである。そして、本発明によっても検体反応手段に捕捉される特定微生物の数若しくは有無を同時に、かつ迅速に把握することができる特定微生物計量方法が得られる。
【００３５】
また、微生物由来物質を酵素タンパク質としたことで、その反応性から特定微生物の生死を判別できる特定微生物計量方法が得られる。
【００３６】
また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたことで、その反応性から特定微生物の生死を判別できる特定微生物計量方法が得られる。
【００３７】
また、検体反応手段を検体接触液をフローさせながら接触できるものとしたことで、検体反応手段に固定化された抗体と蛍光染色された特定微生物との接触効率を向上させることができる特定微生物計量方法が得られる。
【００３８】
また、検体反応手段を液状検体をフローさせながら接触できるものとしたことで、検体反応手段に固定化された抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができる特定微生物計量方法が得られる。
【００３９】
また、検体反応手段を間隙を挟んで互いに対向して配置された２つの電極と両電極を電位可変自在に短絡させることができる短絡部を有し、特定微生物に特異的に反応する抗体が一方の電極に固定化されたものとしたことで、通常、微生物の表面が負の電荷に帯電している性質を利用し、抗体が固定化された電極が正側となるように電圧をかけることで、抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができる特定微生物計量方法が得られる。
【００４０】
本発明の第一の特定微生物計量装置は、上記目的を達成するため、生死細胞を発光させる核酸結合性の第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる核酸結合性の第２の試薬と、微生物由来物質と反応することで生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に接触させて得られる検体接触液を接触させるための、特定微生物に特異的に結合する抗体を固定化した検体反応手段と、前記検体反応手段の微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに特定微生物と判断する特定微生物判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、特定微生物判断手段から特定微生物と判断された信号から特定微生物の数量を積算する積算手段を有するものである。そして、本発明によれば検体反応手段に捕捉される特定微生物の数若しくは有無を同時に、かつ迅速に把握することができ、また、励起光の照射面積及び時間を最小限にすることで励起光による試薬の消光を抑えることができ、さらに、蛍光強度のしきい値を設けることで特定微生物と異物の区別が可能であり、一定面積に含まれる特定微生物の数量の計量を迅速かつ同時に行うことができる特定微生物計量装置が得られる。
【００４１】
本発明の第二の特定微生物計量装置は、上記目的を達成するため、特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を接触させるための、特定微生物に特異的に結合する抗体を固定化した検体反応手段と、生死細胞を発光させる核酸結合性の第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる核酸結合性の第２の試薬と、微生物由来物質と反応することで生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を収容した検出試薬含有部と、前記検体反応手段の微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに特定微生物と判断する特定微生物判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、特定微生物判断手段から特定微生物と判断された信号から特定微生物の数量を積算する積算手段を有するものである。そして、本発明によっても検体反応手段に捕捉される特定微生物の数若しくは有無を同時に、かつ迅速に把握することができ、また、励起光の照射面積及び時間を最小限にすることで励起光による試薬の消光を抑えることができ、さらに、蛍光強度のしきい値を設けることで特定微生物と異物の区別が可能であり、一定面積に含まれる特定微生物の数量の計量を迅速かつ同時に行うことができる特定微生物計量装置が得られる。
【００４２】
また、光電変換素子を利用することで迅速な計量が可能となり、さらに前段に集光レンズを設けることで高い感度の計量ができる特定微生物計量装置が得られる。
【００４３】
また、光電変換素子を線状に配置することで、一定範囲の検知を一度に実施することができ、計量を迅速化することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００４４】
また、検体反応手段を円盤状とすることで回転方向への検体反応手段の駆動を容易にし、光源、受光手段の両方若しくは少なくともどちらか一方の検出移動距離を最小限に抑えることができる特定微生物計量装置が得られる。
【００４５】
また、検体反応手段を測定する面積を多角形とすることで一方向への検体反応手段の駆動を容易にし、光源、受光手段、検体反応手段の少なくとも一つを移動することで特定微生物を計量できる特定微生物計量装置が得られる。
【００４６】
また、光源より発せられる励起光の検体への照射の微小面積を設定速度範囲内で可動させることで発光のずれや残像、残光を除去できる特定微生物計量装置が得られる。
【００４７】
また、光源より発せられる光または検体反応手段より発せられた光の少なくともいずれか一方を反射板を使用し、集光することで、検体反応手段への効率の高い照射または受光手段での効率の高い検出が可能となる特定微生物計量装置が得られる。
【００４８】
また、光源と微小面積の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けることで波長域の広い光源を使用した場合でも目的の励起波長を照射することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００４９】
また、微小面積と受光手段の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けることで波長域の広い発光の場合でも目的の蛍光波長を検出することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５０】
また、検体反応手段内の検出微小面積の焦点を自動的に合わせる機能を備えることで常時一定面積に存在する特定微生物の検出が可能となり、さらに作業者の作業性を向上させることができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５１】
また、光ファイバーを利用して光源からの励起光を導入することで、熱源となる光源を別部に設置することが可能となり、さらに検体反応手段が複雑な形状の場合でも常時一定の光量を検体反応手段へと導入することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５２】
また、光源集光手段に紫外線透過性レンズを使用することで紫外領域の励起波長の光量を減少させることなく検体反応手段へと導入することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５３】
また、検体反応手段の測定位置を示す手段を設けることで検出位置を認識させることができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５４】
また、検体反応手段の測定位置を示す手段を設けることで検体反応手段の大きさ、形状等に影響を受けずに検出位置を認識させることができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５５】
また、検体反応手段に測定位置を示す手段を設けることで検体反応手段の種類に応じて検出位置を認識させることができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５６】
また、検体反応手段の測定位置を示す手段を磁気とすることで簡略かつ正確に検体反応手段の検出位置を認識させることができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５７】
また、検体反応手段の測定位置を認識する手段を有することで検体反応手段の検出対象位置を調整することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００５８】
また、検体反応手段の測定位置を認識する軌道位置から次の認識軌道位置までを一定の距離を保った状態で移動させる手段を有することで検体全体を検出する必要がなくなり、計量を迅速化できる特定微生物計量装置が得られる。
【００５９】
また、検体反応手段の測定位置を認識する軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとすることで培養法と相関性の高い計量が可能となる特定微生物計量装置が得られる。
【００６０】
また、検体反応手段に含まれる微生物から得られた信号を二値化した点座標として認識することで、容易で迅速に計量することができる特定微生物計量装置が得られる。
【００６１】
また、信号が得られた点座標のうち近隣した信号を一つの信号として認識することで培養法と相関性の高い計量が可能となる特定微生物計量装置が得られる。
【００６２】
【発明の実施の形態】
本発明の第一の特定微生物計量方法は、液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を蛍光染色した後に抗体と結合させてこれを計量する方法である。特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に、生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を蛍光染色する。検体反応手段に特定微生物に特異的に結合する抗体を固定化しておくことで、蛍光染色された特定微生物を含有する検体接触液を検体反応手段に接触させれば、検体反応手段に蛍光染色された特定微生物を精度よく捕捉することができる。そして、抗体に結合した蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬として特定微生物の数を簡単に、迅速に、しかも正確に計量することができるという作用を有する。光学的測定手段としては、例えば、光量や輝点を指標にした公知の手段が挙げられ、このような手段によって、特定微生物を一個一個計数したり、予め作製した検量線をもとに光量から特定微生物の総数を計数したりすればよい。その概念の一例を図１１に示す。図１１に示したように、検体反応手段５１は、ガラス基板などの基板５２に特定微生物６１に特異的に結合する抗体５３を固定化したものからなる。液状検体が特定微生物６１を含有していた場合、液状検体に生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を接触させることで、特定微生物が試薬５４によって蛍光染色される。抗体５３はこの蛍光染色された特定微生物６１に抗原抗体反応によって結合し、蛍光染色された特定微生物６１は検体反応手段５１に捕捉される。そして、抗体５３に結合した蛍光染色された特定微生物６１を光学的測定手段により測定することにより、蛍光染色された特定微生物６１が捕捉された位置で発光を観察することができる。また、第１の試薬を核酸結合性の試薬としたことで、細胞内に存在する核酸の染色を指標としているため、染色後、一細胞レベルで検出できる。これにより特定微生物の生死細胞の数をさらに高精度に計量することができるという作用を有する。また、第２の試薬を核酸結合性の試薬としたことで、細胞内に存在する核酸の染色を指標としているため、染色後、一細胞レベルで検出できる。これにより特定微生物の死細胞の数をさらに高精度に計量することができるという作用を有する。また、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたことで、特定微生物の生細胞の代謝物と反応するため、その反応性より特定微生物の生死を判定できるという作用を有する。
【００６３】
本発明の第二の特定微生物計量方法は、液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を抗体と結合させた後に蛍光染色してこれを計量する方法である。特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化した検体反応手段に接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を検体反応手段に固定化した抗体に結合させる。その後、検体反応手段に生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を接触させると、抗体に結合した特定微生物が蛍光染色されるので、蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬として特定微生物の数を簡単に、迅速に、しかも正確に計量することができるという作用を有する。光学的測定手段としては上記のような手段が挙げられる。また、第１の試薬を核酸結合性の試薬としたことで、細胞内に存在する核酸の染色を指標としているため、染色後、一細胞レベルで検出できる。これにより特定微生物の生死細胞の数をさらに高精度に計量することができるという作用を有する。また、第２の試薬を核酸結合性の試薬としたことで、細胞内に存在する核酸の染色を指標としているため、染色後、一細胞レベルで検出できる。これにより特定微生物の死細胞の数をさらに高精度に計量することができるという作用を有する。また、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたことで、特定微生物の生細胞の代謝物と反応するため、その反応性より特定微生物の生死を判定できるという作用を有する。
【００６４】
また、微生物由来物質を酵素タンパク質としたことで、その反応性より特定微生物の生細胞の生死を判定できるという作用を有する。
【００６５】
また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたことで、その反応性より特定微生物の生死を判定できるという作用を有する。
【００６６】
また、検体反応手段を検体接触液をフローさせながら接触できるものとしたことで、検体反応手段に固定化された抗体と蛍光染色された特定微生物との接触効率を向上させることができるので、蛍光染色された特定微生物をより確実に検体反応手段に捕捉することができ、より精度のよい計量が可能になるという作用を有する。
【００６７】
また、検体反応手段を液状検体をフローさせながら接触できるものとしたことで、検体反応手段に固定化された抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができるので、特定微生物をより確実に検体反応手段に捕捉することができ、特定微生物を蛍光染色することで、より精度のよい計量が可能になるという作用を有する。
【００６８】
また、検体反応手段を間隙を挟んで互いに対向して配置された２つの電極と両電極を電位可変自在に短絡させることができる短絡部を有し、特定微生物に特異的に反応する抗体が一方の電極に固定化されたものとしたことで、抗体が固定化された電極が正側となるように電圧をかければ、通常、表面が負の電荷に帯電している特定微生物は、正側の電極の方向に移動して集まるので、抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができる。従って、特定微生物をより確実に検体反応手段に捕捉することができ、より精度のよい計量が可能になるという作用を有する。その概念の一例を図１２に示す。図１２に示したように、検体反応手段５１は、ガラス基板などの基板５２に特定微生物６１に特異的に結合する抗体５３を固定化したものからなるが、抗体５３は間隙を挟んで互いに対向して配置された２つの電極５７、５８の一方の電極５７に固定化されている。抗体５３が固定化された電極５７が正側となるように短絡部５９によって電圧をかければ、特定微生物６１が試薬５４によって既に蛍光染色されている場合は、検体接触液６２に含まれる、通常、表面が負の電荷に帯電している蛍光染色された特定微生物６１は、電極５７の方向に移動して集まる。従って、抗体５３と蛍光染色された特定微生物６１との接触効率を向上させることができる。なお、蛍光染色された特定微生物６１に抗体５３を結合させた後に、電極５８が正側となるように電圧を逆転してかければ、検査目的となる特定微生物以外の微生物が検体接触液６２に含まれていた場合、当該微生物は電極５８の方向に移動して集まるので、蛍光染色された特定微生物６１とその他の微生物との分離が容易になり、高い測定精度が確保される。抗体５３はこの蛍光染色された特定微生物６１に抗原抗体反応によって結合し、蛍光染色された特定微生物６１は検体反応手段５１に捕捉され、そして、抗体５３に結合した蛍光染色された特定微生物６１を光学的測定手段により測定することにより、蛍光染色された特定微生物６１が捕捉された位置で発光を観察することができる。
【００６９】
本発明の第一の特定微生物計量装置は、液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を蛍光染色した後に抗体と結合させてこれを計量する装置である。上記の液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を蛍光染色した後に抗体と結合させてこれを計量する方法を精度よく実施することができるという作用を有する。即ち、抗体に結合した蛍光染色された特定微生物が存在する検体反応手段に励起光を照射し、励起光によって発光する光に基づいて特定微生物の数を計測する。検体反応手段は、通常、直径４０ｍｍ程度の大きさであるが、そこに含まれる特定微生物の大きさが１乃至５μｍと非常に小さいので、従来使用されているＣＣＤカメラを使い、画像処理をおこなうと、必要な画素数が膨大になり、直接的な認識が困難になるため、１０００倍程度の拡大手段を用いないと認識できなかった。そこで、本発明者らは、検体反応手段に捕捉された特定微生物の大きさに着目し、１乃至５μｍ角の面積（受光手段の輝度として測定できればできるだけ大きな面積が望ましいが、フォトダイオードと同じ程度の大きさ３０μｍ角以下が望ましい）に予め定められた波長域で励起光を照射し、その励起光によって発光する光量を測定し、その積算から特定微生物の数を計量することにしたものである。このとき、励起光を照射して、発光した蛍光の強度は時間とともに変化する。従って、一定の発光光量の範囲内での時間を設定し、そのときの光量で特定微生物の有無を判断する必要がある。具体的には、特定微生物以外の不純物は、蛍光を発しないが、励起光の散乱光などを発し、受光時に影響を与えることがあるため、受光した光量がある一定値以上を示した場合を特定微生物と判断する。また、不純物の種類によっては特定微生物以上の蛍光を発する場合も想定されるため、設定した光量の範囲内のときに特定微生物と判断させ、基本的には、範囲内の光量を受光した場合を１個の特定微生物として計量する。そして、この励起光を照射する微小面積を連続的あるいは断続的に移動させ、例えば、従来法の寒天培地拡散法のデータと比較する場合には、直径４０ｍｍの面積全体をスキャンし、その面積での特定微生物の数を積算して計量することができる。従って、励起光による試薬の消光に伴う過少評価の発生を防止し、異物から発せられる発光による過大評価の発生を防止する能力を有するものであり、従来の培養法などと比べ、特殊な技術や設備を必要とせず、短時間で特定微生物の計量をすることができる。
【００７０】
本発明の第二の特定微生物計量装置は、液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を抗体と結合させた後に蛍光染色してこれを計量する装置である。上記の液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を抗体と結合させた後に蛍光染色してこれを計量する方法を精度よく実施することができるという作用を有する。即ち、抗体に結合した蛍光染色された特定微生物が存在する検体反応手段に励起光を照射し、励起光によって発光する光に基づいて特定微生物の数を計測する。第１乃至第４の試薬は、一つの検出試薬含有部に一緒に収容してもよいし、複数の検出試薬含有部に別々に収容してもよい。
【００７１】
また、受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けたことで励起光によって発生した蛍光範囲を拡大した状態で光電変換素子へ導入することが可能となるため高い検出感度を保持できるという作用を有する。
【００７２】
また、受光手段に含まれる複数の光電変換素子を線状に配置することによってＸ軸方向（配列方向）への移動を不要なものとし、Ｙ軸方向（移動方向）のみの移動によって一定範囲の検知を実施することが可能となり、計量を迅速に実施することができるという作用を有する。
【００７３】
また、検体反応手段を円盤状とし、その検体反応手段を可動させることで検体若しくは光源の回転による検出が可能となる。検出方法としては、例えば、光ディスク読み取り用装置が挙げられる。検体反応手段を設置し、回転させることで光源の移動を検体反応手段の半径のみで実施可能となる。それにより検出を自動化、迅速化することができるという作用を有する。
【００７４】
また、検体反応手段を測定する面積を多角形として、その検体反応手段を可動させることで検体反応手段上に含まれる特定微生物の検出が容易に可能となる。検出手段としては、例えば、スキャナーが挙げられる。検体反応手段を設置し、移動させることで、これにより検出を自動化、迅速化することができるという作用を有する。
【００７５】
また、微小面積を移動させる移動手段として、光源、受光手段、検体反応手段のいずれか一つ若しくは複数を移動させる駆動手段を設け、設定速度範囲内で可動させることで、可動時に生ずるずれ、残像の発生あるいは残光の発生を防止し、過大若しくは過少評価を防止できるという作用を有する。
【００７６】
また、光源より発せられる光の集光手段および／または受光手段への集光手段として反射板を設けることによって余計な光のロスを防止し、また、光を集めることで感度を高めることができるという作用を有する。
【００７７】
また、光源と微小面積の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けることによって励起光源から発せられる波長が幅の広いものであった場合でも、特定の励起波長を取り出すことが可能となる。さらに微小面積と受光手段の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けることによって励起光と同様に様々な波長を含む蛍光も特定の蛍光波長を取り出すことが可能となり、高い精度の計量が可能となるという作用を有する。
【００７８】
また、光源または受光手段の少なくともいずれか一方に検体反応手段内の微小面積に焦点を合わせる自動焦点機能を備えることで検体反応手段表面の形状に依存せず、安定な計量が可能となる。さらに自動焦点機能を備えたことで励起光の照射面積を一定に保つことが可能となり、検体反応手段で捕捉し、発光させた特定微生物へ与える負荷が最小限となり、過少評価を回避できるという作用を有する。
【００７９】
また、光源から発せられる光を光ファイバーを使用して検体反応手段へと導入する手段を有することで複雑な形状の検体反応手段でも安定した励起光を提供することができる。さらに、光ファイバーを使用することで光源部を別部に設けることが可能となる。これにより、発熱する光源を使用した場合でも、その発熱による検体反応手段および検体反応手段に捕捉された特定微生物に対する負荷を最小限とすることができるという作用を有する。
【００８０】
また、紫外光を透過するレンズを使用することで光源に紫外光発生手段を使用でき、紫外領域の励起光でも安定的に検体反応手段へ提供できる。
【００８１】
また、装置若しくは検体反応手段に測定位置を示す部位を設け、受光手段に測定位置を認識する手段を設けることで光源または受光手段の少なくともいずれか一方が存在する位置を把握し、同位置の二重検出若しくは検出もれを防ぎ、過大若しくは過少評価を避けることができる。さらに、検体反応手段の測定位置を示す手段に磁気を用いることで簡易的かつ正確な位置認識が可能となり、過大若しくは過少評価を避けることができるという作用を有する。
【００８２】
また、検体反応手段の測定位置を認識する軌道を移動させる際、認識軌道位置から一定の距離を保った状態で次の認識軌道位置へ移動させることで検出もれを防止し、検体反応手段全体を検出することが可能となる。さらに、認識軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとすることで従来法の一つである培養法との相関性を高めることができるという作用を有する。これは、培養法においてコロニーが重複することによって一つのコロニーと認識する範囲を避ける事ができる最低限の距離である。
【００８３】
また、検体反応手段に捕捉された特定微生物から得られた信号を、二値化した点座標として認識し、信号が得られた点座標の数を計測することにより、検体反応手段に捕捉された特定微生物を容易にかつ迅速に計量することができる。さらにその二値化した点座標から輝度を求め、特定微生物が保有する活性を計量することも可能となる。また、近隣した信号を一つの信号と認識することで培養法との相関性を高めることができる。さらに近隣した信号から検体反応手段に付着した付着物の形状を把握することができ、特定微生物以外の形状のものは計量から除去することが可能となり、精度を向上することができるという作用を有する。
【００８４】
以下、本発明の実施例について図面を参照しながら説明する。
【００８５】
【実施例】
以下に本発明の実施例１について説明する。
【００８６】
本発明の特定微生物計量方法における検査対象は、特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体である。液状検体は、水系のものであればどのようなものであってもよく、例えば、食品や調理器具などの洗浄液、食品に水を加えてすりつぶした後、固形分や油状物質を遠心分離やろ過を行うことによって分離して得られる上清液、調理器具を拭き取った綿棒などの洗浄液、調理室内の空気を界面活性剤含有水溶液に吹きつけた後の水溶液などが挙げられる。
【００８７】
検査目的となる特定微生物としては、食中毒の原因となり得る病原性の腸内細菌である大腸菌、大腸菌群細菌、赤痢菌、コレラ菌、サルモネラ菌、ビブリオ菌、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、ブドウ球菌、セレウス菌などが挙げられるが、食中毒以外の感染症の原因となり得る細菌、例えば、結核菌、肺炎双球菌、緑膿菌、レジオネラ菌などであってもよい。
【００８８】
特定微生物を蛍光染色するために使用される生死細胞を発光させる第１の試薬としては、例えば、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（誘導体であってもよい）のような生死細胞の膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合することで発光する試薬が挙げられる。死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬としては、例えば、プロピデュームイオダイド（誘導体であってもよい）のような死細胞の膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合することで発光する試薬が挙げられる。生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬としては、例えば、６−カルボキシフルオレセインジアセテート、２’，７’ジクロロフルオレセインジアセテート、６−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）−３’，６’−０，０’−ジアセチルフルオレセイン、ジヒドロドローダミン、二酢酸フルオレセイン、二酢酸４−アジドフルオレセイン（これらは誘導体であってもよい）のような細胞内に浸透し、生細胞内に存在する酵素タンパク質、例えば、エステラーゼによって分解されることで発光する試薬が挙げられる。特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する第４の試薬としては、例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（これらは誘導体であってもよい）が挙げられる。これらは、大腸菌や大腸菌群細菌が生産する酵素タンパク質であるβ−ガラクトシダーゼと特異的に反応することによって分解されて４−メチルウンベリフェロンを生成する。４−メチルウンベリフェロンは紫外光に対し、励起され蛍光を発する。第１乃至第４の試薬は、例えば、生理食塩水に溶解された状態で使用される。これらは、いずれか１種類の試薬を使用するだけでもよいし、２種類の試薬を使用するものであってもよいし、３種類の試薬を使用するものであってもよいし、全ての試薬を使用するものであってもよい。
【００８９】
本発明の特定微生物計量方法における検体反応手段は、ガラス基板などの基板に検査目的となる特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化したものからなる。なお、基板への抗体の固定化は、自体公知の方法によってなされる。概略を以下に説明する。まず、ガラス基板の場合、ガラス表面に長鎖アルキル基を導入する。これは、例えば、１０ｍＭオクタデシルトリクロロシラン／ベンゼン溶液からなる試薬中に、表面を強酸や有機溶媒などで清浄したガラス基板を浸漬することにより行うことができる。ガラス表面にアミノ基を導入してもよい。これは、例えば、１０ｍＭアミノプロピルトリエトキシシラン／ベンゼン溶液からなる試薬中に、表面を強酸や有機溶媒などで清浄したガラス基板を浸漬することにより行うことができる。ガラス表面に長鎖アルキル基を導入した場合、その表面は高い疎水性を有することになるが、抗体も疎水性を有するので、いわゆる疎水性相互作用により、ガラス表面に抗体が固定化される。ガラス表面にアミノ基を導入した場合、グルタルアルデヒドにて、ガラス表面のアミノ基と抗体のアミノ基を結合することにより、ガラス表面に抗体が固定化される。なお、抗体が固定化されていない部分には、測定精度に影響を及ぼしたりするようなタンパク質などが結合しないように、牛血清アルブミンやスキムドミルクやカゼインなどのような測定精度に影響を及ぼしたりすることのないタンパク質を結合し、ブロッキングしておくことが望ましい。
【００９０】
抗体の固定化は検体反応手段の全面に行ってもよいし、固定化領域を限定してもよい。固定化領域の限定は、抗体溶液をスポットするのに直径約１０乃至１００μｍのガラスキャピラリーを使用することで行うことができる。
【００９１】
検体反応手段には単一種類の特定微生物の計量を行うために単一種類の抗体を固定化してもよいし、複数種類の特定微生物の計量を同時に行うために複数種類の抗体を固定化領域を分割して固定化し、その領域を特定化しておいてもよい。
【００９２】
抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよいが、一般に、特異性に優れたモノクローナル抗体を使用することが望ましい。ポリクローナル抗体を使用する場合は、アフィニティー精製を行ったものを使用することが望ましい。抗体の作製方法に特段の制限はなく、特定微生物の抗原を使用した動物免疫による方法、必要とする抗体の抗体産生細胞の細胞融合による方法、必要とする抗体の遺伝子を使用した遺伝子工学的手法による方法などがある。食中毒の原因になり得る細菌のモノクローナル抗体は既に種々知られており、市販されているものもある。
【００９３】
本発明の第一の特定微生物計量方法においては、まず、第１乃至第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類を検査目的となる特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に接触させる。この接触条件、即ち、液状検体が検査目的となる特定微生物を含有している場合における特定微生物の蛍光染色条件は、例えば、室温でも可能であるが、３０℃前後で数分の反応時間のようなものでよい。
【００９４】
次に、第１乃至第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類を液状検体に接触させて得られる検体接触液を検体反応手段に接触させる。この接触条件、即ち、蛍光染色された特定微生物に抗体を結合させるための反応条件は、通常の抗原抗体反応条件でよく、例えば、３０℃前後で数分の反応時間のようなものでよい。
【００９５】
最後に、検体反応手段を蒸留水や生理食塩水などの洗浄液で洗浄して検査目的ではない微生物や夾雑物や未反応の第１乃至第４の試薬などを除去した後、光学的測定手段により、検体反応手段に捕捉された蛍光染色された特定微生物の数や有無を測定する。
【００９６】
本発明の第二の特定微生物計量方法においは、まず、検査目的となる特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を検体反応手段に接触させる。この接触条件、即ち、液状検体が検査目的となる特定微生物を含有している場合における特定微生物に抗体を結合させるための反応条件は、通常の抗原抗体反応条件でよく、例えば、３０℃前後で数分の反応時間のようなものでよい。
【００９７】
次に、必要に応じて検体反応手段を蒸留水や生理食塩水などの洗浄液で洗浄して検査目的ではない微生物や夾雑物などを除去した後、第１乃至第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類を検体反応手段に接触させる。この接触条件、即ち、検体反応手段に捕捉された特定微生物の蛍光染色条件は、例えば、室温でも可能であるが、３０℃前後で数分の反応時間のようなものでよい。
【００９８】
最後に、検体反応手段を蒸留水や生理食塩水などの洗浄液で洗浄して未反応の第１乃至第４の試薬などを除去した後、光学的測定手段により、検体反応手段に捕捉された蛍光染色された特定微生物の数や有無を測定する。
【００９９】
検体反応手段の全面に抗体を固定化した場合、図１に示すように特定微生物計量装置に設置されている励起光の検体反応手段上における軌道は、検体反応手段１全体を網羅するものであることが望まれる。そのために検体の幅、長さを軌道Ａ２のように移動し、検出するものである。また、図２に示したように検体反応手段全体を検出するための軌道は円状のものも可能であるため軌道Ｂ３のように移動し、検出することも可能である。光源４は、検体反応手段上を各軌道に沿って移動させる。光源４より発した励起光によって生ずる蛍光を利用した特定微生物判断手段のモデルを図３に示した。検体反応手段上から発せられた蛍光は蛍光を発した部位と相関して特定微生物判断手段５を形成する。特定微生物判断手段５には、不純物などから生ずる散乱光あるいは同励起光によって発生する蛍光などが混在しており、目的の特定微生物から発せられる蛍光に限定されたものではない場合が生ずる。そこで、しきい値を設けるものである。しきい値は、蛍光強度の上限６と下限７があり、その範囲内の蛍光を特定微生物由来のものとして認識し、積算する。これにより、特定微生物以外の不純物由来の蛍光を把握し、正確な計量を可能なものとしたものである。しきい値は、特定微生物が発する蛍光強度によって決定されるものである。また、特定微生物が近接している場合、特定微生物が発する蛍光から形成される波形は、図４に示したように隣接したものが得られる。この場合、隣接した特定微生物を従来法の一つである寒天培地拡散法で検出した場合、微生物の増殖とコロニーの拡大に伴い、コロニー同士が重層し、目視で確認する時点で一つのコロニーとして判断してしまう場合がある。そこで、本発明において波形８に示すような場合は、一つの特定微生物として検出するように設定した。これにより寒天培地拡散法との相関性を得ることができるものである。
【０１００】
また、検体反応手段１への励起光照射時間は、図５に示したように蛍光強度が消光しない時間の範囲で照射される。即ち、しきい値９の範囲である。
【０１０１】
図６に示すように特定微生物計量装置は、光源４、光源集光手段としてのレンズ１０、受光部１１を含む。光源４から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルター１２で分光する。分光された励起光はプリズム１３を経て、光路を変化させられる。光路を変化させられた励起光はレンズ１０を経て検体反応手段１の表面に集光される。そこで励起光によって励起された特定微生物が有する蛍光は、再びプリズム１３を透過する。その際、蛍光はプリズム１３をそのまま透過し、受光部１１に到達する。受光部１１に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルター１４を経て、受光部１１に内蔵された光電変換素子１５に到達し、信号化され、認識される。また、図には示していないが、検体反応手段１若しくは特定微生物計量装置には、検体反応手段を移動する手段を備えており、検体反応手段１の蛍光発光を全て、若しくは一部を受光することができる。
【０１０２】
光電変換素子１５に到達した蛍光は、特定微生物判断手段５において特定微生物若しくは異物と判断され、特定微生物と判断された蛍光は積算されて、その数量が計量される。
【０１０３】
光源４より発生した励起光は、レンズ１０によって集光されるが、その際、レンズ１０によって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。この場合、微小な一定面積とは特定微生物の大きさに基づいて設定した場合、一辺０．２μｍ乃至７．０μｍ程度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖した微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、この場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。
【０１０４】
レンズ１０によって集光された励起光の照射時間は、蛍光を発する試薬の消光時間と励起光強度に依存する。試薬の種類によっては、自然界に存在する紫外光によっても分解する場合があり、２秒乃至３００秒前後の範囲内で励起光を照射することが望ましい。
【０１０５】
発光後の輝度を認識する場合、図７に示したように蛍光発光した位置を「０」と「１」の二値化にて表現する。二値化した場合、隣接した発光を一つの発光源１６としてみなす。また、発光源の大きさおよびその輝度が設定の大きさと比較して相対的に大きく異なる場合、異物１７として認識し、検査対象外とみなすことで特定微生物として計量しない。隣接した発光の隣接距離としては、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養され、増殖した微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。
【０１０６】
発光を検出する際、光源４の波長の幅が広いものである場合は、励起光分光フィルター１２によって励起波長を調整、分光することが可能となる。励起光分光フィルター１２は、目的の検出対象に応じて変えられるため、様々な蛍光を発する試薬に対応できる。また、同時に、発光した蛍光波長の幅が広いものである場合は、目的の発光を検出するために蛍光分光フィルター１４を目的の検出対象に応じて変えることで様々な蛍光を発する試薬に対応できる。
【０１０７】
光源４としては、各種ダイオード、ハロゲンランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、ブラックライト、水銀ランプなどが挙げられる。これらの光源のうち最大励起波長が比較的限定されているダイオード、冷陰極管、ブラックライトなどは、前記励起光分光フィルター１２および蛍光分光フィルター１４を使用することなく実施できる場合がある。また、ハロゲンランプ、水銀ランプなどについては、励起光分光フィルター１２および蛍光分光フィルター１４を使用する必要がある場合がある。
【０１０８】
プリズム１３およびレンズ１０は、必要に応じてそれぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスなどが挙げられる。これにより紫外光で励起される試薬などにも対応できる。検体反応手段１を設置する部位は回転能を有し、その上部に検体反応手段１を設置する。レンズ１０により集光された励起光は、検体反応手段１の外周部より中心部へ、若しくは、中心部より外周部へ、半径分の距離を移動する。その際、レンズ３により集光された励起光の位置が外周部に存在するときと中心部に存在するときで検体反応手段１の回転速度を変化させることによって、レンズ１０により集光された励起光が外周部に存在するときと中心部に存在するときで励起された試薬が発した蛍光のずれ、残像および残光の発生を防止することができる。
【０１０９】
なお、集光した位置を認識する手段を設けることでレンズ１０によって集光された励起光の位置を認識し、集光が軌道から逸れないように、また、逸れた場合は再び軌道に戻すように設定されるものである。
【０１１０】
なお、励起光を照射する微小な一定面積は、正方形を含む多角形に限らず、円形、楕円形等でも可能であり、検体を照射できるものであればよい。
【０１１１】
なお、励起光若しくは蛍光を分光する手段として回折格子などを利用することも可能である。
【０１１２】
なお、検体反応手段１の回転速度を調整することで蛍光の残像および残光を防ぐこととしたが、励起光を照射するレンズ１０の移動速度を調整することで残像および残光を防ぐことも可能である。
【０１１３】
なお、集光した位置を認識する手段は、必ずしも励起光の集光位置を直接認識する必要は無く、検体反応手段１上の軌道を把握するものであればよい。
【０１１４】
以下に本発明の実施例２について説明する。
【０１１５】
図８に示す特定微生物計量装置は、検体反応手段１、光源４、反射板１８、レンズ１０、受光部１１を含む。光源４から発せられた励起光によって、検体反応手段１に捕捉された特定微生物から励起され、生じた蛍光を反射板１８によって光の方向を変化させ、レンズ１０によって集光し、受光部１１にて検出する。受光部１１に到達した蛍光は、特定微生物判断手段５において特定微生物若しくは異物と判断され、特定微生物と判断された蛍光は積算されて、その数量が計量される。光源４は、検体反応手段１をスキャンする。さらに、光源４の軌道に合わせて反射板１８を設置させる。
【０１１６】
光源４より発生した励起光は、レンズ１０によって集光されるが、その際、励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。この場合、微小な一定面積とは特定微生物の大きさに基づいて設定した場合、一辺０．２μｍ乃至７．０μｍ程度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖された微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、この場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。
【０１１７】
レンズ１０によって集光された励起光の照射時間は、蛍光を発する試薬の消光時間と励起光強度に依存する。試薬の種類によっては、自然界に存在する紫外光によっても分解する場合があり、２秒乃至３００秒前後の範囲内で照射することが望ましい。
【０１１８】
光源４としては、各種ダイオード、ハロゲンランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、ブラックライトなどが挙げられる。
【０１１９】
反射板１８およびレンズ１０は、必要に応じて、それぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスなどが挙げられる。これにより紫外光によって励起される試薬などにも対応できる。
【０１２０】
なお、検体反応手段１への光源４より発せられる励起光の強度の減少若しくは外部光による蛍光への影響を防ぐために検体反応手段１を暗視野環境下に置くための暗視野板等を設置することも可能である。
【０１２１】
なお、光源４が移動するとは限らない。検体反応手段１を移動させ、これに捕捉された特定微生物を検出することも可能である。
【０１２２】
なお、光源４が内蔵されているとは限らない。外部に光源４を含む光源部を設け、そこから光ファイバー等を利用して装置内へ励起光を導入することも可能である。
【０１２３】
なお、光源の種類により、目的以外の波長を除去する手段を設けることも可能である。例えば、励起光分光フィルターや回折格子などが手段として挙げられる。
【０１２４】
なお、発せられる蛍光の種類により、目的以外の波長を除去する手段を設けることも可能である。例えば、蛍光分光フィルターや回折格子などが手段として挙げられる。
【０１２５】
なお、反射板１８の代わりにプリズム体などを利用することも可能である。
【０１２６】
以下に本発明の実施例３について説明する。
【０１２７】
図９に示すように検体反応手段１は、着脱操作などについての作業者の取り扱い性を向上するために把手部１９と液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を捕捉するための検体反応部２０と検出開始点を認識するための検出開始線２１と検出軌道を認識するための検体認識軌道２２からなる。
【０１２８】
検体反応部に捕捉された蛍光染色された特定微生物は、それが捕捉された位置で蛍光を発する。また、検体反応手段１上に集光せしめた励起光の位置を認識させるため、検体反応手段１に予め設けられている検体認識軌道２２を検出し励起光の位置を認識するものである。図６に示したレンズ１０より集光された励起光は、検出開始線２１を開始点として、外周を移動する。外周移動後、再び検出開始線２１に到達後、図６に示したレンズ１０より集光された励起光は、一つ内側の検体認識軌道２２にずれ、その軌道上に含まれる発光数を認識する。これを繰り返しながら中心へ向かって励起光を移動させることによって検出を必要とする面積に含まれる特定微生物数を検出する。
【０１２９】
検出開始線２１は、直接検体反応手段へ刻み込まれたマーキングや励起光あるいは集光位置を認識できる反射性を有したマーカーなどが挙げられる。これは、検体認識軌道２２も同様であるが、このマーカーが蛍光に影響を与えないものを使用することが望ましい。
【０１３０】
なお、把手部は外周に存在するとは限らない。
【０１３１】
なお、検出開始点を認識するのは、線とは限らない。
【０１３２】
なお、検出軌道はらせん状や斜め方向でも構わない。
【０１３３】
なお、励起光の移動は外周からとは限らない。
【０１３４】
以下に本発明の実施例４について説明する。
【０１３５】
図１０は、検体反応手段を検体接触液・液状検体をフローさせながら接触できるものとした、当該検体反応手段の一例の概略図である。検体反応手段１は、検体接触液・液状検体を投入する投入口２３と過剰な検体接触液・液状検体や検体反応手段１内に予め含まれる空気を排出するための排出口２４を有するフローセルからなる。また、検体反応手段１は、少なくとも受光部１１が存在する方向の面が光透過面２５となっており、受光部１１で蛍光を検出できる構造となっている。光透過面２５と、その対面に位置している底面２６は、平行な位置関係に有り、傾斜を生じない構成を有している。この底面２６に特定微生物に特異的に結合する抗体が固定化されている。そして、光透過面２５と底面２６に２つの電極を配置し、両電極を電位可変自在に短絡させることができる短絡部２７で接続する。底面２６に配置された電極が正側となるように電圧をかければ、通常、表面が負の電荷に帯電している特定微生物は、底面２６の方向に移動して集まるので、抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができる。
【０１３６】
特定微生物が既に蛍光染色されている場合、投入口２３から蒸留水や生理食塩水などの洗浄液をフローセル内に供給して検査目的ではない微生物や夾雑物や未反応の第１乃至第４の試薬などを内部から除去した後、励起光を照射し、励起光によって発光する光に基づいて特定微生物の数を計測する。
【０１３７】
特定微生物が未だ蛍光染色されていない場合、必要に応じて投入口２３から蒸留水や生理食塩水などの洗浄液をフローセル内に供給して検査目的でない微生物や夾雑物などを内部から除去した後、投入口２３から第１乃至第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類を供給し、特定微生物を蛍光染色する。それから、投入口２３から蒸留水や生理食塩水などの洗浄液をフローセル内に供給して未反応の第１乃至第４の試薬などを内部から除去した後、励起光を照射し、励起光によって発光する光に基づいて特定微生物の数を計測する。
【０１３８】
上記構成により、特定微生物が検体反応手段１内に導入された際、光透過面２５と、その対面に位置している底面２６の間が一定の厚みに保持されているため、特定微生物が互いに重なり合うことなく、一定の範囲に拡散させることができる。これにより、重なり合いによる過少評価を防ぐことが可能となり、受光部１１による正確な計量が可能となる。
【０１３９】
なお、異物を除去するために投入口２３の前にフィルターを設けることで特定微生物を検出するための感度を向上することができる。
【０１４０】
なお、光透過面２５の構成を紫外線等の励起光に影響しないものとすることでその妨害を防ぐことができる。
【０１４１】
なお、光透過面２５と、その対面に位置している底面２６の距離を０．５乃至１５μｍの範囲内とすることで、特定微生物の重なりを防止し、正確な判別が可能となる。
【０１４２】
【発明の効果】
以上の実施例から明らかなように、本発明によれば、液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を検体反応手段に捕捉し、捕捉された特定微生物の数若しくは有無を同時に、かつ迅速に把握することができる特定微生物計量方法を提供できる。この方法は、生死細胞や死細胞を正確に測定することができるので、特定微生物による環境汚染状況をリアルタイムで把握でき、汚染の防止手段をいち早く対策することができるなどの利点を有する。
【０１４３】
また、第１の試薬を核酸結合性の試薬としたことで、液状検体に細胞の代謝物や夾雑物が存在している場合でも生死細胞を正確に、しかも短時間で測定することができる特定微生物計量方法を提供できる。
【０１４４】
また、第２の試薬を核酸結合性の試薬としたことで、液状検体に細胞の代謝物や夾雑物が存在している場合でも死細胞を正確に、しかも短時間で測定することができる特定微生物計量方法を提供できる。
【０１４５】
また、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたことで、生きている特定微生物の有無を確認することができる特定微生物計量方法を提供できる。また、微生物由来物質を酵素タンパク質としたことで、より高い感度で生きている特定微生物の有無を確認することができる特定微生物計量方法を提供できる。
【０１４６】
また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたことで、特定微生物の有無を容易に確認することができ、特定微生物をモニタリングすることができる特定微生物計量方法を提供できる。また、前処理などの必要がなくなり、さらに検査時間を短時間にすることができる特定微生物計量方法を提供できる。
【０１４７】
また、検体反応手段を検体接触液や液状検体をフローさせながら接触できるものとしたことで、検体反応手段に固定化された抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができる特定微生物計量方法を提供できる。
【０１４８】
また、検体反応手段を間隙を挟んで互いに対向して配置された２つの電極と両電極を電位可変自在に短絡させることができる短絡部を有し、特定微生物に特異的に反応する抗体が一方の電極に固定化されたものとしたことで、通常、微生物の表面が負の電荷に帯電している性質を利用し、抗体が固定化された電極が正側となるように電圧をかけることで、抗体と特定微生物との接触効率を向上させることができる特定微生物計量方法を提供できる。
【０１４９】
本発明によれば、液状検体に含まれるか含まれる可能性のある特定微生物を計量する特定微生物計量装置を提供できる。この装置は、励起光による蛍光の消光を抑え、正確に特定微生物の数を計量することができるようにしたものであり、しきい値を設けたことで、異物混入による過大評価を防止し、高い感度を保持したものである。
【０１５０】
また、受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けたことで高い検出感度を得ることができる。さらに、光電変換素子を線状に配置することで一方向へのスキャンで検体反応手段上に存在する特定微生物を検出することができ、特定微生物の計量を迅速化することができるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５１】
また、検体反応手段を円盤状とすることで回転方向への検体反応手段の駆動を容易にし、それにより検出速度の向上が可能となる。さらに光源、受光手段の少なくともどちらか一方の検出移動距離を最小限に抑えることができる。それに伴い、検出時間の迅速化および特定微生物計量装置の簡易化が可能になるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５２】
また、光源より発せられる励起光の検体反応手段への照射の微小面積を設定速度範囲内で可動させることで発光のずれや残像、残光を防止でき、それに伴い過大若しくは過少評価を防止することができるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５３】
また、光源より発せられる光または検体反応手段より発せられた光の少なくともいずれか一方を反射板を使用し、集光することで、検体反応手段への効率の高い照射または受光手段での効率の高い検出が可能になり、装置構成を簡易化することができるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５４】
また、光源の波長を分光できる分光部と蛍光波長を分光できる分光部を設けることで、目的の波長を照射し、発せられた目的の蛍光波長の検出を可能とし、高感度な目的の検出が可能となる特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５５】
また、検体反応手段の表面を自動的に認識し、励起光の焦点を合わせることで検出位置を認識し、検体反応手段全体を検出することが可能となり、その検出に伴う、二重検出若しくは検出洩れを防ぐことで検体の過大若しくは過少評価を避けることができる特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５６】
また、光ファイバーを利用して光源からの励起光を導入することで、熱源となる光源を別部に設置することが可能となり、これにより検体反応手段に捕捉された特定微生物などへの熱の影響を防止し、誤差拡大の回避が可能となる。さらに検体反応手段が複雑な形状の場合でも常時、一定の光を検体反応手段へと導入することができ、より正確な計量が可能になるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５７】
また、光源集光手段に紫外光透過性レンズを使用することで紫外領域の波長の光量を減少させることなく検体反応手段へと導入することができ、紫外領域の波長によって検出可能な試薬に基づいた計量ができるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５８】
また、装置若しくは検体反応手段に測定位置を示す手段を設けることで検出位置を認識させることができ、誤検出の防止あるいは検出速度の調整ができる。さらに、検体反応手段の測定位置を示す手段に磁気を利用することで簡易かつ正確な検出が可能となるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１５９】
また、検体反応手段の測定位置を認識する軌道位置から次の認識軌道位置までを一定の距離を保った状態で移動させる手段を有することで検体反応手段全体を検出する必要がなくなり、迅速化が可能となる。また、各軌道間に位置する微生物の誤認識を防止し、より正確な計量を実施できる。さらに、各軌道間の距離を１０乃至５０μｍとすることで従来法との相関性を出すことができるという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【０１６０】
また、検体反応手段上から得られた蛍光を「０」と「１」の二値化した点座標として認識することで、特定微生物を容易にかつ迅速に計量でき、その位置関係によって異物として認識されたものを対象外として除去し、同様にその位置関係として特定微生物として認識されたもののうち、従来法の寒天培地拡散法と比較した場合、近隣した特定微生物として認識されたものを一つ特定微生物として認識することで従来法と相関性を有するという効果を有する特定微生物計量装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の実施例１の励起光の検体反応手段上における軌道Ａの構成図
【図２】 同実施例１の励起光の検体反応手段上における軌道Ｂの構成図
【図３】 同実施例１の波形モデルを示す図
【図４】 同実施例１の特定微生物隣接存在時における波形モデルを示す図
【図５】 同実施例１の蛍光消光モデルを示す図
【図６】 同実施例１の特定微生物計量装置を示す図
【図７】 同実施例１の二値化モデルを示す図
【図８】 本発明の実施例２の特定微生物計量装置を示す図
【図９】 本発明の実施例３の検体反応手段を示す図
【図１０】 本発明の実施例４の検体反応手段を示す図
【図１１】 免疫アッセイ法の理論の一例を示す概念図
【図１２】 電極を利用した検体反応手段の一例を示す概念図
【符号の説明】
１ 検体反応手段
２ 軌道Ａ
３ 軌道Ｂ
４ 光源
５ 特定微生物判断手段
６ 上限
７ 下限
８ 波形
９ しきい値
１０ レンズ
１１ 受光部
１２ 励起光分光フィルター
１３ プリズム
１４ 蛍光分光フィルター
１５ 光電変換素子
１６ 発光源
１７ 異物
１８ 反射板
１９ 把手部
２０ 検体反応部
２１ 検出開始線
２２ 検体認識軌道
２３ 投入口
２４ 排出口
２５ 光透過面
２６ 底面
２７ 短絡部
５１ 検体反応手段
５２ 基板
５３ 抗体
５４ 試薬
５７ 電極
５８ 電極
５９ 短絡部
６１ 特定微生物
６２ 検体接触液
Claims (28)
- 生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を蛍光染色した後、この検体接触液を特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化した検体反応手段に接触させ、抗体に結合した蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたことを特徴とする特定微生物計量方法。
- 特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を特定微生物に特異的に反応する抗体を固定化した検体反応手段に接触させることで、液状検体が特定微生物を含有する場合は特定微生物を検体反応手段に固定化した抗体に結合させた後、生死細胞を発光させる第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第２の試薬と、生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を前記検体反応手段に接触させることで、抗体に結合した特定微生物を蛍光染色し、蛍光染色された特定微生物を光学的測定手段により測定し、第１の試薬を核酸結合性の試薬とし、第２の試薬を核酸結合性の試薬とし、第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発光する試薬としたことを特徴とする特定微生物計量方法。
- 微生物由来物質を酵素タンパク質とした請求項１または２記載の特定微生物計量方法。
- 特定微生物由来物質を酵素タンパク質とした請求項１乃至３のいずれかに記載の特定微生物計量方法。
- 検体反応手段を検体接触液をフローさせながら接触できるものとした請求項１、３乃至４のいずれかに記載の特定微生物計量方法。
- 検体反応手段を液状検体をフローさせながら接触できるものとした請求項２乃至４のいずれかに記載の特定微生物計量方法。
- 検体反応手段を間隙を挟んで互いに対向して配置された２つの電極と両電極を電位可変自在に短絡させることができる短絡部を有し、特定微生物に特異的に反応する抗体が一方の電極に固定化されたものとした請求項１乃至６のいずれかに記載の特定微生物計量方法。
- 生死細胞を発光させる核酸結合性の第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる核酸結合性の第２の試薬と、微生物由来物質と反応することで生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体に接触させて得られる検体接触液を接触させるための、特定微生物に特異的に結合する抗体を固定化した検体反応手段と、前記検体反応手段の微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに特定微生物と判断する特定微生物判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、特定微生物判断手段から特定微生物と判断された信号から特定微生物の数量を積算する積算手段を有することを特徴とする特定微生物計量装置。
- 特定微生物を含有するか含有する可能性のある液状検体を接触させるための、特定微生物に特異的に結合する抗体を固定化した検体反応手段と、生死細胞を発光させる核酸結合性の第１の試薬と、死細胞を前記発光と異なる波長で発光させる核酸結合性の第２の試薬と、微生物由来物質と反応することで生細胞を前記発光と異なる波長で発光させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発光と異なる波長で発光する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中で複数種類を収容した検出試薬含有部と、前記検体反応手段の微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに特定微生物と判断する特定微生物判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、特定微生物判断手段から特定微生物と判断された信号から特定微生物の数量を積算する積算手段を有することを特徴とする特定微生物計量装置。
- 受光手段を少なくとも一つの光電変換素子とし、励起光によって発光した光を集光する集光レンズを前記光電変換素子の前段に設けた請求項８または９記載の特定微生物計量装置。
- 複数の光電変換素子を線状に配置した請求項１０記載の特定微生物計量装置。
- 検体反応手段を円盤状とし、その検体反応手段を可動させることとした請求項８乃至１１のいずれかに記載の特定微生物計量装置。
- 検体反応手段を測定する面積を多角形として、その検体反応手段を可動させることとした請求項８乃至１１のいずれかに記載の特定微生物計量装置。
- 微小面積を移動させる移動手段として、光源、受光手段、検体反応手段のいずれか一つあるいは複数を移動させる駆動手段を設け、設定速度範囲内で可動させることとした請求項８乃至１３のいずれかに記載の特定微生物計量装置。
- 光源より発せられる光の集光手段および／または受光手段への集光手段として反射板を設けた請求項８乃至１４のいずれかに記載の特定微生物計量装置。
- 光源と微小面積の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けた請求項８乃至１５のいずれかに記載の特定微生物計量装置。
- 微小面積と受光手段の間に特定の波長のみを透過させる分光部を設けた請求項８乃至１６のいずれかに記載の特定微生物計量装置。
- 光源および／または受光手段に検体反応手段内の微小面積に焦点を合わせる自動焦点機能を備えた請求項８乃至１７のいずれかに記載の特定微生物計量装置。
- 光源と検体反応手段の距離を一定にし、微小面積を一定化する手段を有する請求項８乃至１８のいずれかに記載の特定微生物計量装置。
- 光源から発せられる光を光ファイバーを使用して検体反応手段へと導入する手段を有する請求項８乃至１９のいずれかに記載の特定微生物計量装置。
- 紫外光を透過するレンズを光源集光手段として用いた請求項８乃至２０のいずれかに記載の特定微生物計量装置。
- 検体反応手段の測定位置を示す手段を有した請求項８乃至２１のいずれかに記載の特定微生物計量装置。
- 検体反応手段の測定位置を示す手段に磁気を用いる請求項２２記載の特定微生物計量装置。
- 検体反応手段の測定位置を認識する手段を有した請求項８乃至２３のいずれかに記載の特定微生物計量装置。
- 検体反応手段の測定位置を認識する軌道を移動させる際、認識軌道位置から一定の距離を保った状態で次の認識軌道位置へ移動する手段を有した請求項２４記載の特定微生物計量装置。
- 認識軌道位置から次の認識軌道位置までの距離を１０乃至５０μｍとした請求項２５記載の特定微生物計量装置。
- 検体反応手段に含まれる微生物から得られた信号を、二値化した点座標として認識し、信号が得られた点座標の数を計測する機能を有した請求項８乃至２６のいずれかに記載の特定微生物計量装置。
- 信号が得られた点座標のうち、近隣した信号を一つの信号として認識する機能を有した請求項２７記載の特定微生物計量装置。
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