JP5422870B2 - 微生物数計測方法 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光染色され取得された２種類の蛍光波長の異なる微生物の蛍光画像より、生きている微生物の数即ち生菌数、死んでいる微生物の数即ち死菌数、検体中に含まれるゴミなどの微生物以外の異物の数を計測する微生物数計測方法に関する。

従来この種の微生物の検出方法としては特許文献１に示されたものが知られている。

以下この種の微生物検出方法について説明していく。

この方法は、１種類のＤＮＡ結合性蛍光色素を用いて、染色した試料中の微生物を含む蛍光スペクトル画像より、各ピクセルについて蛍光スペクトルを取得し、取得した試料の蛍光スペクトルの波形成分と、対照微生物蛍光スペクトル、夾雑物蛍光スペクトル、及びバックグラウンド蛍光スペクトルの波形成分とを比較して微生物の存在を検出する微生物検出方法が記載されている。
特開２００２−２９１４９９号公報

しかしながら、上記特許文献１のような従来の微生物検出方法では、微生物の存在は把握できても、検体中にいた微生物が、生きているものがどれくらいいるか、死んでいるものかどれくらいいるかがわからないという課題があり、検体中に存在している生きた微生物の数、死んだ微生物の数を明確にさせることが要求されている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、微生物の生死を判別するために２種類の蛍光試薬で染色し、蛍光染色された微生物の２種類の波長の異なる蛍光画像により、生きている微生物の数即ち生菌と死んでいる微生物の数即ち死菌を正確に計測する微生物数計測方法を提供することを目的としている。

本発明の微生物数計測方法は、上記目的を達成するため、全ての微生物を染色する総菌試薬と死んだ微生物を染色する死菌試薬の２種類の蛍光染色試薬で染色された微生物を含む検体の蛍光を撮影した蛍光波長の異なる総菌が撮影された蛍光画像Ａと死菌が撮影された蛍光画像Ｂの２種類の蛍光画像を用い、その撮影した蛍光画像から蛍光発光点数を計測し、計測した結果を表示し、同一発光点を撮影した波長の異なる２種類以上の蛍光画像の同一蛍光発光点の座標のずれを補正する位置補正をし、撮影した蛍光波長の異なる２種類の蛍光画像を位置補正して得られた蛍光画像の発光点の座標にある蛍光波長の異なる総菌が撮影された蛍光画像Ａと死菌が撮影された蛍光画像Ｂの２種類の蛍光画像上の発光点の有無または輝度値の大小により、生菌または／および死菌または／および異物の識別を行い、蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値より大きいと生菌と判定し、蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値より大きいと死菌と判定し、蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値と等しいと判断された場合は、実験により生菌になるか、死菌になるかを決定し、微生物の個数を計測する、としたものである。

これにより、蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値より大きいと生菌と判定し、蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値より大きいと死菌と判定し、蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値と等しいと判断された場合は、実験により生菌になるか、死菌になるかを決定し、微生物の個数を計測し、２種類の蛍光画像の蛍光発光点位置補正をすることで、正確に生きた微生物即ち生菌または／および死んだ微生物即ち死菌または／および異物とを識別し生菌または／および死菌または／および異物を識別し、生菌または／および死菌または／および異物の個数を正確に計測する微生物数計測方法を提供できる。

また他の手段は、位置補正実行時に、撮影した蛍光画像と、位置補正した蛍光画像を切り替えて表示をするとしたものである。

これにより、位置補正のできばえを確認できる微生物数計測方法が提供でき、位置補正量を確認できることとなる。

また、他の手段は同一発光点を撮影するために、２種類の励起光で蛍光する蛍光染色試薬の蛍光粒子による蛍光画像を用いて位置補正を実行するとしたものである。

これにより、正確な位置補正ができる微生物数計測方法が提供できる。

また他の手段は位置補正機能を、蛍光波長の異なる２種類の蛍光画像の発光点の重なり率で判定するとしたものである。

これにより、数値的に位置補正を実行できる微生物数計測方法を提供でき、位置補正をした結果の正確さがわかることとなる。

また他の手段は重なり率が、基準を下回った場合、再度位置補正ができるとしたものである。

これにより、位置補正を計測中に不具合が発生した場合でも、再度位置補正を行えることで、確実な位置補正ができる微生物数計測方法が提供できる。

また他の手段は、蛍光画像撮影装置ごとに、位置補正データを持たせるとしたものである。

これにより、計測装置間で位置補正データが違っていても、再度位置補正行わず、過去に行った位置補正データを用いて微生物の計測ができる微生物数計測方法を提供できる。

また他の手段は、一度位置補正を行えば、自動で位置補正データを適用できるようにしたものである。

これにより、計測の度に位置補正を行わずにすむ微生物数計測方法を提供できる。

また他の手段は、蛍光試薬が有する蛍光波長と違う波長の蛍光波長が撮影された蛍光画像中の発光点を微生物以外の異物であると判定するとしたものである。

これにより、菌と微生物以外の異物の分離性能を向上できる微生物数計測方法を提供できる。

また、他の手段は、位置補正された画像から、蛍光波長の異なる２種類の画像上の同一発光点の各画像輝度値の比を用いて生菌か、死菌かを判定するとしたものである。

これにより、生菌、死菌の判別精度の高い微生物数計測システムが提供できる。

また他の手段は、複数の画像の蛍光点情報を取得する作業の進行状況を、表示するとしたものである。

これにより、計測の進行度合いを視覚的に確認できる微生物数計測方法が提供できる。

また、他の手段は、撮影画像の検体の名称を入力するとしたものである。

これにより、検体名を簡単に記憶できる微生物数計測方法が提供できる。

また、他の手段は、蛍光画像を撮影した検体のろ過した量を入力するとしたものである。

これにより、検体のろ過量か簡単に記憶でき、ろ過量に応じた微生物数の１ｍｌあたりの換算数の計測を可能にした微生物数計測方法が提供できる。

また、他の手段は、蛍光画像を撮影した検体の希釈した倍率を入力するとしたものである。

これにより、希釈倍率を簡単に記憶でき、希釈倍率に応じた微生物数の１ｍｌあたりの換算数の計測を可能にした微生物数計測方法が提供できる。

また、他の手段は、計測した各画像の座標データ、輝度データなどの各種データを保管するとしたものである。

これにより、保管したデータを再度利用して、微生物数を計測する各サンプルに共通に適用できるパラメーターを設定できる微生物数計測方法が提供できる。

また、他の手段は、微生物数の計測中に、画像、位置補正後の画像重ね合わせ画像を表示するとしたものである。

これにより、画像の良否、位置補正のでき映え等を目視確認できる微生物数計測方法が提供できる。

また、他の手段は、全ての微生物を蛍光染色する総菌試薬と微生物のうち死んだ微生物を蛍光染色する死菌試薬で染色した微生物を含む検体の蛍光画像において、前記総菌試薬の蛍光発光画像の発光点の輝度値と、前記死菌試薬の蛍光画像の蛍光発光点の輝度値をそれぞれＸＹの座標としてグラフ化するとしたものである。

これにより、生菌、死菌をグラフ上の点として確認することのできる微生物数計測方法が提供できる。

また、他の手段は、微生物数計測に使用した蛍光画像を保存するとしたものである。

これにより、蛍光画像にあった最適計測パラメーターを再設定できる微生物数計測方法が提供できる。

また、他の手段は、計測処理中の画像を表示するとしたものである。

これにより、画像を見ながら、発光点の計測結果を確認できる微生物数計測方法が提供できる。

また、他の手段は、計測結果の一覧を表示するとしたものである。

これにより、計測結果のまとめが簡単にできる微生物数計測方法が提供できる。

また、他の手段は、計測結果が正常に得たれたかどうかを表示するとしたものである。

これにより、全ての計測終了後に計測結果の判定が簡単にできる微生物数計測方法が提供できる。

また、他の手段は、計測結果にどのような異常があったかを表示するとしたものである。

これにより、全てのサンプル計測後に計測が正確かどうかの判定が簡単にできる微生物数計測方法が提供できる。

本発明の微生物数計測方法によれば、蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値より大きいと生菌と判定し、蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値より大きいと死菌と判定し、蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値と等しいと判断された場合は、実験により生菌になるか、死菌になるかを決定し、微生物の個数を計測し、蛍光画像中から検出した微生物が、生きているか死でいるかを正確に判別することでき、生きた微生物即ち生菌の数量、死んだ微生物即ち死菌の数量を正確に計測できるという効果を有する微生物数計測方法を提供できる。

本発明の請求項１記載の発明は、本発明の微生物数計測方法は、上記目的を達成するため、全ての微生物を染色する総菌試薬と死んだ微生物を染色する死菌試薬の２種類の蛍光染色試薬で染色された微生物を含む検体の蛍光を撮影した蛍光波長の異なる総菌が撮影された蛍光画像Ａと死菌が撮影された蛍光画像Ｂの２種類の蛍光画像を用い、その撮影した蛍光画像から蛍光発光点数を計測し、計測した結果を表示し、同一発光点を撮影した波長の異なる２種類以上の蛍光画像の同一蛍光発光点の座標のずれを補正する位置補正をし、撮影した蛍光波長の異なる２種類の蛍光画像を位置補正して得られた蛍光画像の発光点の座標にある蛍光波長の異なる総菌が撮影された蛍光画像Ａと死菌が撮影された蛍光画像Ｂの２種類の蛍光画像上の発光点の有無または輝度値の大小により、生菌または死菌または異物の識別を行い、蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値より大きいと生菌と判定し、蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値より大きいと死菌と判定し、蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値と等しいと判断された場合は、実験により生菌になるか、死菌になるかを決定し、微生物の個数を計測することで、蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値より大きいと生菌と判定し、蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値より大きいと死菌と判定し、蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値と等しいと判断された場合は、実験により生菌になるか、死菌になるかを決定し、微生物の個数を計測し、２種類の蛍光画像の蛍光発光点の位置の補正により、正確に、生きた微生物即ち生菌または／および死んだ微生物即ち死菌または／および微生物以外の異物とを識別し、生菌または／および死菌または／および異物の個数を正確に計測できるという作用を有する。

また、請求項２記載の発明は、位置補正実行時に、撮影した蛍光画像と、位置補正した蛍光画像を切り替えて表示をすることで、原画像である撮影した蛍光画像と位置補正した蛍光画像の２種類の蛍光画像の発光点のずれ具合を目視できるという作用を有する。

また、請求項３記載の発明は、同一発光点を撮影するために、２種類の励起光で蛍光する蛍光染色試薬の蛍光粒子による蛍光画像を用いて位置補正を実行することで、同一発光点のみ位置補正ができるという作用を有する。

また、請求項４記載の発明は、位置補正を、蛍光波長の異なる２種類の蛍光画像の発光点の重なり率で判定することで、位置補正の精度を数字で判定できるという作用を有する。

また、請求項５記載の発明は、重なり率が、基準を下回った場合、再度位置補正ができることで、間違った位置補正をやり直すことができるという作用を有する。

また、請求項６記載の発明は、蛍光画像撮影装置ごとに、位置補正データを持たせることで、位置補正データの呼びだしができるという作用を有する。

また、請求項７記載の発明は、蛍光画像撮影装置ごとに、一度位置補正を行えば、自動で位置補正データを適用できるようにしたことにより、再度位置補正をすることを不要にできるという作用を有する。

また、請求項８記載の発明は、異物判定を蛍光試薬が有する蛍光波長と違う波長の蛍光波長が撮影された蛍光画像中の発光点を異物と判定することにより、画像中の異物を取り除くことができるという作用を有する。

また、請求項９記載の発明は、位置補正された画像から、蛍光波長の異なる２種類の画像上の同一発光点の各画像輝度値の比を用いて生菌か、死菌かを判定することで、生菌か死菌かを正確に判定できるという作用を有する。

また、請求項１０記載の発明は、複数の蛍光画像の蛍光点情報を取得する作業の進行状況を、表示することにより、計測の進行が確認できるという作用を有する。

また、請求項１１記載の発明は、計測する蛍光画像の検体の名称を入力することにより、検体名を電子データとして保存できるという作用を有する。

また、請求項１２記載の発明は、蛍光画像を撮影した検体のろ過した量を入力することにより、ろ過量を電子データとして使用できるという作用を有する。

また、請求項１３記載の発明は、蛍光画像を撮影した検体の希釈した倍率を入力することにより、検体の希釈倍率を電子データとして使用できるという作用を有する。

また、請求項１４記載の発明は、計測した各蛍光画像の各蛍光発光点座標データ、輝度データなどの各種データを保管することにより、保存したデータを再度使用できるという作用を有する。

また、請求項１５記載の発明は、微生物数の計測中に、画像、位置補正後の画像重ね合わせ画像を表示することにより、計測中に各画像の同一発光点が確認できるという作用を有する。

また、請求項１６記載の発明は、全ての微生物を蛍光染色する総菌試薬と微生物のうち死んだ微生物を蛍光染色する死菌試薬で染色した微生物を含む検体の蛍光画像において、前記総菌試薬の蛍光発光画像の発光点の輝度値と、前期死菌試薬の蛍光画像の蛍光発光点の輝度値をそれぞれＸＹの座標としてグラフ化することにより、生菌死菌をグラフ上に表示できるという作用を有する。

また、請求項１７記載の発明は、微生物数計測に使用した画像を保存することで、画像を再表示できるという作用を有する。

また、請求項１８記載の発明は、計測処理中の画像を表示できるようにすることで、計測画像を確認できるという作用を有する。

また、請求項１９記載の発明は、計測結果の一覧を表示できることで、計測結果を確認できるという作用を有する。

また、請求項２０記載の発明は、計測結果が正常に得たれたかどうかを表示することで、計測結果の正確性を確認できるという作用を有する。

また、請求項２１記載の発明は、計測結果にどのような異常があったかを表示することで、計測画像の異常の有無を確認できるという作用を有する。

（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１の微生物数計測方法の構成図の一例である。

図１に示すように、微生物数計測方法は、微生物数の計数を目的として、計測対象の検体をフィルターにてろ過を行い、２種類の蛍光染色試薬を用いて蛍光染色し、蛍光染色された微生物を含む検体を励起光Ａを照射し、蛍光分光フィルターＡを介して撮影した蛍光画像Ａ１と、励起光Ｂを照射し、蛍光分光フィルターＢを介して撮影した蛍光画像Ｂ２を用い、前記蛍光画像Ａ１及び前記蛍光画像Ｂ２から一定値以上の輝度値をもつ蛍光発光点を検出する発光点検出機能３と発光点の面積を抽出し、面積の大小により発光点を分類する発光点面積分類機能４と蛍光発光点を輝度値で分類する発光点輝度値分類機能５と蛍光発光点数を計測する発光点数計測機能６と、計測した結果を表示する表示機能７と、同一発光点を撮影した波長の異なる２種類以上の蛍光画像の同一蛍光発光点の座標のずれを補正し補正した蛍光画像Ｃを作成する位置補正機能８とを備え、撮影した微生物を含む蛍光波長の異なる２種類の蛍光画像を位置補正して得られた蛍光画像の発光点の座標にある蛍光波長の異なる２種類の蛍光画像上の発光点の有無により、生菌または死菌または異物の識別を行い微生物の個数を計測する構成としたものである。

ここで、異物とは、生菌、死菌などの微生物以外の発光点をいい、例えば、ゴミ、金属粉、繊維屑などの微生物ではないものをいう。生菌とは、生きた微生物をいい、例えば、生きた細菌類などをいう。死菌とは、死んだ微生物をいい、例えば、死んだ細菌類などをいう。

これらの構成により、位置補正機能を使用することで蛍光波長の異なる２種類の蛍光画像中の発光点の有無または輝度値の大小を比較することにより、正確に計測対象の検体中の生きた微生物即ち生菌および／または死んだ微生物即ち死菌および／または検体中の異物のそれぞれの個数を推測することができる。

具体的には、蛍光画像Ａ１、蛍光画像Ｂ２での同一発光点の位置ずれを補正し、同一発光点が重なった蛍光画像Ｃを作成し、新たに作成した蛍光画像Ｃ中の蛍光発光点における座標上の点について発光点検出機能３により輝度値で計測対象物を検出し、発光点面積分類機能４で発光点面積の解析を行い菌と異物を分類し、さらに、発光点輝度値分類機能５で蛍光画像Ａ１と蛍光画像Ｂ２の有無または輝度値の大小により、その発光点が生菌かまたは死菌かまたは異物かを判定する。

そこで、生菌、死菌、異物の判定方法の一例を次に示す。発光点面積識別機能４により蛍光画像Ｃで検出された、蛍光発光点の蛍光画像Ａ１または蛍光画像Ｂ２における発光点面積で規定した菌面積値より大きいと異物と判定する。

このとき、蛍光発光点検出機能で使用する一定値は実験より数値を決定するものであり、値としては、ノイズと区別するために輝度値１５程度に設定するとよい。菌面積値としては、菌の大きさと発光による菌の膨張を考慮して約３８万画素の画像であれば、面積値３０ピクセル以下程度と規定するとよい。

さらに、菌と判定された発光点は、発光点輝度値分類機能５により蛍光画像Ａ１の輝度値と蛍光画像Ｂ２の輝度値の有無または大小により生菌か、死菌かに分離される。

分離の方法の一例を示すと、全ての微生物を染色する総菌試薬で総ての微生物即ち総菌の蛍光が観察でき、微生物の中で死んだ微生物を染色する死菌試薬で全ての死菌が観察できるとき、総菌が撮影された画像を蛍光画像Ａ１とし、死菌が撮影された画像を蛍光画像Ｂ２として、蛍光画像Ａ１の蛍光発光点の輝度値が、蛍光画像Ｂ２の蛍光発光点の輝度値より大きいと生菌と判定し、蛍光画像Ｂ２の蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ａ１の蛍光発光点の輝度値より大きいと死菌と判定する。蛍光画像Ａ１の蛍光発光点の輝度値が、蛍光画像Ｂ２の蛍光発光点の輝度値と等しい場合は、実験により生菌になるか、死菌になるかを決定する。

このときの蛍光発光点の輝度値の定義としては、蛍光発光点の最大値とする場合、蛍光発光点の各画素の輝度値の合計値とする場合、蛍光発光点の各画素の輝度値の平均値（（蛍光発光点の各画素の輝度値の合計）／（蛍光発光点画素数（面積）））のとする場合がある。

蛍光染色試薬、励起光、蛍光分光フィルターの組み合わせの例を以下に示す。

蛍光染色試薬がＤＡＰＩ、プロピディウムイオダイド（ＰＩ）のとき、励起光Ａは、ＵＶ光（波長３７５ｎｍ程度）、励起光Ｂは緑色光（波長５３０ｎｍ程度）を使用し、前記ＵＶ光を照射したときは、蛍光分光フィルターＡは青色光（波長４６０ｎｍ程度）のみを透過するフィルターとし、このフィルターを介して撮影した蛍光画像を蛍光画像Ａとし、前記緑色光を照射したときは、蛍光分光フィルターＢは赤色光（波長６２０ｎｍ程度）のみを透過するフィルターとし、このフィルターを介して撮影した蛍光画像を蛍光画像Ｂとする例と、蛍光染色試薬がＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯＸ ＯＲＥＮＧＥのとき、励起光Ａは、青色光（波長４７０ｎｍ程度）、励起光Ｂは緑色光（波長５３０ｎｍ程度）を使用し、前記青色光を照射したときは、蛍光分光フィルターＡは緑光（波長５２０ｎｍ程度）のみを透過するフィルターとし、このフィルターを介して撮影した蛍光画像を蛍光画像Ａ１とし、前記緑色光を照射したときは、蛍光分光フィルターＢは赤色光（波長５９０ｎｍ程度）のみを透過するフィルターとし、このフィルターを介して撮影した蛍光画像を蛍光画像Ｂ２とする例などがあげられるが、蛍光分光フィルター、励起光、蛍光分光フィルターなどそれぞれの特性にあわせて各種選定可能である。

また、位置補正機能８の動作としては、励起光Ａ、励起光Ｂどちらでも蛍光発光する樹脂製の蛍光ビーズを用いて実施する。それぞれの励起光、それぞれのフィルターで蛍光画像を撮影し、蛍光発光点を一致させるように画像をずらし、もっとも多くの発光点が重なるずらし量が位置補正値となる。この画像処理作業を位置補正機能８が実施する。

このとき使用する蛍光ビーズの一例として、Ｄｕｋｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＲｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅがある。

さらに、表示機能７としては、パソコンなどに付属する液晶モニター等で行う。

表示機能内容の一例として、計測の進行状況の表示がある。また、他の例としては、計測結果を一覧表示、計測結果が正常かどうかの表示、さらに計測結果の異常の有無の表示等もあり、計測の進行状況が目で確認でき、計測結果のまとめがしやすくなり、計測結果の正確性を確認できることで利便性を高くできる。

このようにして、蛍光波長の異なる２種類の蛍光画像を重ね合わせ、輝度値、面積等の発光点情報を解析することで、蛍光画像中の蛍光発光点を生菌、死菌、夾雑物などの異物に分離でき、かつ蛍光画像中の生菌数または／および死菌数または／および夾雑物などの異物数を正確に計測することができ、また利便性の高い微生物数計測方法が提供できる。

（実施の形態２）
実施の形態１と同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。

図２は、本発明の実施の形態２の微生物数計測方法の構成図の一例である。図２に示すように、図１に対して、撮影した蛍光画像とその撮影した蛍光画像を位置補正した蛍光画像を、切り替えて表示する表示切替機能９を追加した構成としたものである。

この表示切替機能は、計測に使用する蛍光波長の異なる２種類の蛍光画像と、この計測、撮影した蛍光波長の異なる２種類の蛍光画像の座標位置を補正した結果の位置補正した蛍光画像を随時切り替えて表示できるようにしたものである。

例えば、蛍光画像Ａ１をパソコン上の画面に表示しているとき、表示画像の横に各画像の表示切り替えボタンを設け、このボタンをクリックすることで、パソコンの画面に表示している画像を、蛍光画像Ａ１または蛍光画像Ｂ２または蛍光画像Ｃというように切り替えて表示するようにして行われる。

この構成により、計測、撮影した蛍光画像Ａ１と蛍光画像Ｂ２と、位置補正を行ったあとの蛍光画像Ｃを切り替えて表示でき、計測処理画像がうまく位置補正できているかどうかが確認でき、位置補正に失敗があった場合すばやく見つけることができる微生物数計測方法が提供できる。

（実施の形態３）
実施の形態１または２と同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。

図３は、本発明の実施の形態２に対して、位置補正機能８に位置補正のできばえを重なり率で判定する重なり率判定機能１０を追加した構成図の一例である。

重なり率判定機能は、以下のようにして行われる。

励起光Ａ、励起光Ｂどちらでも蛍光発光する前記蛍光粒子の蛍光画像の蛍光画像Ａ１と蛍光画像Ｂ２を撮影し、この２枚の画像の点が重なるように画像を位置補正し、蛍光画像Ａ１と蛍光画像Ｂ２の発光点が重なっている割合を計算する機能としておこなわれる。

また、一致率の判定基準を設けることで、一致率が基準を下回ったとき、再度位置補正をおこなえるようにできる。こうすることで、正確に位置補正を行った状態で正確な計測ができるようになる。判定の基準値としては、蛍光粒子中の異物の混入を考慮すれば、９５％程度が妥当な数値である。

この計算結果が、規定値を上回ったとき蛍光画像Ａ１、蛍光画像Ｂ２の位置補正が完了したことになり、重なり率判定機能１０をもちいることで、位置補正の完了を数値的判断で実行することが可能となり、一致率の判定基準を設けたことでより正確な微生物の計測ができる微生物数計測方法が提供できる。

（実施の形態４）
実施の形態１乃至３のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。

図４は、本発明の実施の形態４の微生物数計測方法の構成図の一例である。図４に示すように、図３に対して、位置補正データを微生物数計測方法内に持たせる位置補正データ保存機能１１を追加した構成としたものである。

位置補正データとして、あげられるのが、位置補正の補正値、一致率、位置補正に使用した画像の各発光点の、輝度値、面積、位置補正に使用した蛍光画像Ａ１、蛍光画像Ｂ２、位置補正結果を表現した蛍光画像Ｃなどがある。

計測結果に疑問を生じたときに、これらのデータ、特に位置補正の補正値を調査することで、位置補正画像を調査することで計測が正確であったかどうかの判定が可能となる。

また、蛍光画像撮影装置ごとに位置補正を一度行えば、自動で計測画像にあった位置補正データを自動で適用できる構成も備えることで、計測の迅速化が図れる。

自動で位置補正データを適用する方法としては、計測画像に計測した蛍光画像撮影装置のラベルをつけ、位置補正データにも同じラベルをつけておくことで、画像と位置補正データのラベルが一致したデータを計測画像、位置補正データとして計測をおこなうようにする。

このように、位置補正データ保存機能１１を設け、過去データを参照できるようにしたこと、位置補正データを自動で適用できるようにしたことで、計測結果の信憑性を評価でき、計測の迅速性を向上させた微生物数計測方法が提供できる。

（実施の形態５）
実施の形態１乃至４のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。図５は、本発明の実施の形態５の微生物数計測方法の構成図の一例である。図５に示すように、図４に対して、異物判定を蛍光試薬が有する蛍光波長と違う波長の蛍光波長が撮影された蛍光画像ＡＢ１２中の発光点を異物と判定する異物判定機能１３を備えた構成としたものである。

本構成による異物判定機能１３は、次のようにして実現される。

前記励起光Ａを検体に照射し、前記蛍光分光フィルターＢで撮影した画像を蛍光画像ＡＢ１２とする。蛍光画像ＡＢ１２は、蛍光画像Ａ１との位置補正を行う必要があり、補正量については、蛍光画像Ｂ２の撮影時と同じ蛍光分光フィルターを使用するため、蛍光画像Ａと蛍光画像Ｂとの位置補正量と同じ補正量となる。このとき、蛍光画像ＡＢ１２には、励起光Ａで蛍光する蛍光試薬による発光波長より長い波長の蛍光発光した発光点が撮影される。蛍光画像ＡＢ１２に写っている発光点は、蛍光試薬による蛍光発光ではないので、これらは、全て異物として計数できる。また、異物判定機能は、蛍光画像ＡＢ１２と蛍光画像Ａ１、蛍光画像Ｂ２と同じ位置にある発光点を蛍光画像Ａ１及び蛍光画像Ｂ２から選出し、菌として計測しないようにする機能をもつ。

このように、蛍光画像ＡＢ１２と異物判定機能１３を用いることで、生菌または死菌または異物とをさらに正確に分類し、生菌数または／および死菌数または／および異物数の計測ができる微生物数計測方法が提供できる。

（実施の形態６）
実施の形態１乃至５のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。図６は、本発明の実施の形態６の微生物数計測方法の構成図の一例である。図６に示すように、図５に対して、位置補正された画像から、２種類の画像上の同一発光点の各画像輝度値の比を用いて生菌か、死菌かを判定する生死菌判定機能１４を備えた構成としたものである。

この生死菌判定機能は、画像を計測することで得られた蛍光画像Ａ１と蛍光画像Ｂ２の同一発光点の輝度値を蛍光画像Ａ１の輝度値と蛍光画像Ｂ２の輝度値の比（蛍光画像Ａ１の発光点輝度値／蛍光画像Ｂ２の発光点輝度値）を計算し、１以上であれば生菌とし、１未満であれば死菌とすることで行われる。

また、前記輝度値の比をグラフに表示する機能を備えた構成とすることで、生菌死菌の区別がより視認性の良いものとなる。

このように輝度値の比を用いることで、発光しているという情報以上に生菌死菌の判別を行いやすく正確に生菌か死菌かを判別できる微生物数計測装置が提供できる。

（実施の形態７）
実施の形態１乃至６のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。図７は、本発明の実施の形態６の微生物数計測方法の構成図の一例である。図７に示すように、図６に対して、検体の名称、検体のろ過量、検体の希釈倍率などの計測検体情報の検体情報入力機能１５を追加したものである。

計測検体情報は、微生物計測方法が動作するパソコンの表示画面より入力される。

計測検体情報が入力できることで、計測検体情報が簡単に呼び出せ、情報の再利用、情報の加工などが簡単に行える。

このような構成とすることで、利便性の高い微生物数計測方法が提供できる。

（実施の形態８）
実施の形態１乃至７のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。図８は、本発明の実施の形態７の微生物数計測方法の構成図の一例である。図８に示すように、図６に対して、計測した各画像の発光点の座標データ、輝度データ、面積データ、画像データ等の発光点情報を保管する発光点情報保管機能１６を追加した構成としたものである。

この発光点情報保管機能１６は、画像を計測することで得られた発光点に関する情報を微生物計測方法が動作しているパソコン内もしくは、付属の記憶装置または、ネットワーク上の記憶装置に保管するようにしたものである。

また、菌計測用パラメーターを変更するためのパラメーター変更画面表示機能を備えた構成にすることで、パラメーターの変更は容易となる微生物計測方法がていきょうできる。

この菌計測用パラメーター変更画面表示機能は、発光点検出用の輝度値、異物と菌を識別する面積値、位置補正時の重なり率などを本微生物計測方法が動作しているパソコンの画面上に計測パラメーターとして表示しこの表示された数値を変更することで行うことができるにする。

このような構成とすることで、データの再利用が可能となり、計測パラメーターの再検討、再設定も容易にできる有用性の高い微生物数計測システムが提供できる。

本発明の実施の形態１の微生物数計測方法の構成を示す図 本発明の実施の形態２の微生物数計測方法の構成を示す図 本発明の実施の形態３の微生物数計測方法の構成を示す図 本発明の実施の形態４の微生物数計測方法の構成を示す図 本発明の実施の形態５の微生物数計測方法の構成を示す図 本発明の実施の形態６の微生物数計測方法の構成を示す図 本発明の実施の形態７の微生物数計測方法の構成を示す図 本発明の実施の形態８の微生物数計測方法の構成を示す図

符号の説明

１ 蛍光画像Ａ
２ 蛍光画像Ｂ
３ 発光点検出機能
４ 発光点面積分類機能
５ 発光点輝度値分類機能
６ 発光点数計測機能
７ 表示機能
８ 位置補正機能
９ 表示切替機能
１０ 重なり率判定機能
１１ 位置補正データ保存機能
１２ 蛍光画像ＡＢ
１３ 異物判定機能
１４ 生死菌判定機能
１５ 検体情報入力機能
１６ 発光点情報保管機能

Claims (21)

1. 全ての微生物を染色する総菌試薬と死んだ微生物を染色する死菌試薬の２種類の蛍光染色試薬で染色された微生物を含む検体の蛍光を撮影した蛍光波長の異なる総菌が撮影された蛍光画像Ａと死菌が撮影された蛍光画像Ｂの２種類の蛍光画像を用い、その撮影した蛍光画像から蛍光発光点数を計測し、計測した結果を表示し、同一発光点を撮影した波長の異なる２種類以上の蛍光画像の同一蛍光発光点の座標のずれを補正する位置補正をし、撮影した蛍光波長の異なる２種類の蛍光画像を位置補正して得られた蛍光画像の発光点の座標にある蛍光波長の異なる総菌が撮影された蛍光画像Ａと死菌が撮影された蛍光画像Ｂの２種類の蛍光画像上の発光点の有無または、輝度値の大小により生菌または／および死菌または／および異物の識別を行い、蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値より大きいと生菌と判定し、蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値より大きいと死菌と判定し、蛍光画像Ａの蛍光発光点の輝度値が蛍光画像Ｂの蛍光発光点の輝度値と等しいと判断された場合は、実験により生菌になるか、死菌になるかを決定し、微生物の個数を計測する微生物数計測方法。
2. 位置補正実行時に、撮影した蛍光画像と、位置補正した蛍光画像を切り替えて表示をする請求項１に記載の微生物数計測方法。
3. 同一発光点を撮影するために、２種類の励起光で蛍光する蛍光染色試薬の蛍光粒子による蛍光画像を用いて位置補正を実行する請求項１または２に記載の微生物数計測方法。
4. 位置補正を、蛍光波長の異なる２種類の蛍光画像の発光点の重なり率で判定する請求項１乃至３のいずれかに記載の微生物数計測方法。
5. 重なり率が、基準を下回った場合、再度位置補正ができる請求項１乃至４のいずれかに記載の微生物数計測方法。
6. 蛍光画像撮影装置ごとに、位置補正データを持たせる請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物数計測方法。
7. 一度位置補正を行えば、自動で位置補正データを適用できるようにした請求項１乃至６のいずれかに記載の微生物数計測方法。
8. 蛍光試薬が有する蛍光波長と違う波長の蛍光波長が撮影された蛍光画像中の発光点を異物と判定する請求項１乃至７のいずれかに記載の微生物数計測方法。
9. ２種類の励起光で撮影し、位置補正された蛍光波長の異なる２種類の蛍光画像上の同一発光点の輝度値の比を用いて生菌かまたは死菌かを判定する請求項１乃至８のいずれかに記載の微生物数計測方法。
10. 複数の蛍光画像の蛍光発光点情報を取得する作業の進行状況を、表示する請求項１乃至９のいずれかに記載の微生物数計測方法。
11. 計測する蛍光画像の検体の名称を入力する請求項１乃至１０のいずれかに記載の微生物数計測方法。
12. 蛍光画像を撮影した検体のろ過した量を入力する請求項１乃至１１のいずれかに記載の微生物数計測方法。
13. 蛍光画像を撮影した検体の希釈した倍率を入力する請求項１乃至１２のいずれかに記載の微生物数計測方法。
14. 計測した各蛍光画像の各蛍光発光点の座標データ、輝度データなどの各種データを保管する請求項１乃至１３のいずれかに記載の微生物数計測方法。
15. 微生物数の計測中に、蛍光画像と位置補正後の蛍光画像の重ね合わせ画像を表示する請求項１乃至１４のいずれかに記載の微生物数計測方法。
16. 全ての微生物を蛍光染色する総菌試薬と微生物のうち死んだ微生物を蛍光染色する死菌試薬で染色した微生物を含む検体の蛍光画像において、前記総菌試薬の蛍光発光画像の発光点の輝度値と、前期死菌試薬の蛍光画像の蛍光発光点の輝度値をそれぞれＸＹの座標としてグラフ化する請求項１乃至１５のいずれかに記載の微生物数計測方法。
17. 微生物計測に使用した蛍光画像を保存する請求項１乃至１６のいずれかに記載の微生物数計測方法。
18. 計測処理中の画像を表示できる請求項１乃至１７のいずれかに記載の微生物数計測方法。
19. 計測結果の一覧を表示できる請求項１乃至１８のいずれかに記載の微生物数計測方法。
20. 計測結果が正常に得られたかどうかを表示する請求項１乃至１９のいずれかに記載の微生物数計測方法。
21. 計測結果にどのような異常があったかを表示する請求項１乃至２０のいずれかに記載の微生物数計測方法。
    

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