JP5218328B2

JP5218328B2 - 微生物検出装置

Info

Publication number: JP5218328B2
Application number: JP2009187195A
Authority: JP
Inventors: 浩介石井; 肇坂野
Original assignee: IHI Corp
Current assignee: IHI Corp
Priority date: 2009-08-12
Filing date: 2009-08-12
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2029-08-12
Also published as: JP2011036188A

Description

本発明は、試料の画像から微生物を検出する微生物検出装置に関する。

現在、顕微鏡による微生物の検出時には、蛍光染色法が用いられている。この蛍光染色法として、微生物の持つＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid）やＲＮＡ（Ribonucleic acid）を蛍光染色することで生物のみを染色するＤＡＰＩ（4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride）染色法やアクリジンオレンジ染色法、核酸の配列から特定微生物を染め分けるＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）法、蛍光染色した抗体を用いる方法、蛍光染色したファージを用いる方法等の多くの方法が存在する。このような蛍光染色法では、蛍光染色した標的微生物に励起光を照射して蛍光を発光させることで、標的微生物を観察／検出する。しかしながら、標的微生物が含まれる試料中には、標的微生物に類似した色で自家蛍光するものが存在することが多く、経験値の高い熟練した技術者でないと、試料中から標的微生物とそれ以外のものとを判別することが難しい。

下記特許文献１には、標的微生物のみを選択的に検出する発明として、蛍光色素で染色した微生物が含まれる試料のスペクトル画像を取得し、当該スペクトル画像の各ピクセルのスペクトルと、標的微生物の蛍光スペクトル、夾雑物のスペクトル及び背景のスペクトルとを比較し、比較結果に基づいて標的微生物を検出する微生物検出方法が開示されている。なお、上記スペクトル画像は、各ピクセルについてスペクトル情報を得ることができる画像である。このスペクトル画像は、蛍光顕微鏡に異なる光路長の光路を設け、各光路を通過した試料からの反射光に基づいて生成される。

特開２００２−２９１４９９号公報

しかしながら、上記特許文献１の技術では、スペクトル画像を得るために光路長が異なる２つの光路を備えた高価な顕微鏡が必要になる。また、既存の顕微鏡を使用した場合でも、１つの視野に対して、光路長を変化させて大量の画像をわざわざ撮像しなければならない為、多大な労力が必要となる。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、高価な顕微鏡または多大な労力を必要とせずに微生物のみを選択的に検出することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明では、微生物検出装置に係る第１の解決手段として、試料の画像から蛍光染色した標的微生物を検出する微生物検出装置であって、前記標的微生物の蛍光色（第１の色）を抽出した第１の試料画像を、前記第１の色以外の色を抽出した第２の試料画像で除算して除算画像を作成する除算画像作成手段と、前記第１の試料画像を第２の試料画像で減算して減算画像を作成する減算画像作成手段と、前記除算画像と前記減算画像とを乗算して乗算画像を作成する乗算画像作成手段と、前記乗算画像から、前記第１の色について設けられた所定の条件を満たす色彩領域を前記標的微生物として検出する検出手段とを具備するという手段を採用する。

本発明では、微生物検出装置に係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、前記検出手段は、前記色彩領域のうち標的微生物の形態的特徴の基準を満たさない色彩領域を除外して前記標的微生物を検出するという手段を採用する。

本発明では、微生物検出装置に係る第３の解決手段として、上記第１または第２の解決手段において、前記検出手段は、前記色彩領域のエッジ平均値を算出し、前記エッジ平均値を基準に設けられた上限値及び下限値の範囲外の前記色彩領域を除外して前記標的微生物を検出するという手段を採用する。

本発明によれば、乗算画像では、試料の画像中の標的微生物と思われる第１の色の強度が高くかつ第２の色の強度が低い色彩領域が強調され、このような乗算画像において所定の条件を満足する色彩領域が標的微生物として検出される。したがって、本発明によれば、従来技術のような２つの光路を備えた高価な顕微鏡を必要とすることなく、また２つの光路の光路長差を変化させた多数の画像を撮像することなく、少数の画像の画像処理によって標的微生物のみを選択的に検出することができる。

本発明の一実施形態に係る微生物検出装置Ｓの概略構成図である。本発明の一実施形態に係る微生物検出装置Ｓの演算装置Ｂの機能ブロック図である。本発明の一実施形態に係る微生物検出装置Ｓの演算装置Ｂの動作を示すフローチャートである。本発明の一実施形態に係る微生物検出装置ＳのＧ画像及びＲ画像を示す模式図である。本発明の一実施形態に係る微生物検出装置ＳのＧ画像及びＲ画像の各ドットの輝度値の例を示す模式図である。本発明の一実施形態に係る微生物検出装置Ｓの除算画像及び減算画像を示す模式図である。本発明の一実施形態に係る微生物検出装置Ｓの乗算画像を示す模式図である。

以下、図面を参照して、本発明の一実施形態について説明する。
本実施形態に係る微生物検出装置Ｓは、図１に示すように、蛍光顕微鏡Ａ、演算装置Ｂ及びインタフェースケーブルＣから構成されている。この微生物検出装置Ｓは、ＦＩＳＨ法によって蛍光染色されたレジオネラ菌を含む試料の画像（試料画像）からレジオネラ菌を検出するものである。

なお、演算装置Ｂは、本実施形態における除算画像作成手段、減算画像作成手段、乗算画像作成手段及び検出手段である。また、上記ＦＩＳＨ法とは、標的微生物の核酸、例えばｒＲＮＡ（ribosome Ribonucleic acid）の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドにＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）等の蛍光色素を共有結合させたプローブを標的微生物に選択的に結合させることで、標的微生物を選択的に染色して検出する方法である。

蛍光顕微鏡Ａは、落射型の蛍光顕微鏡であり、ステージ上に取り付けられたスライドガラスＳＧに対向して対物レンズが配置されている。また、蛍光顕微鏡Ａでは、対物レンズを介した観察光軸上には、三眼鏡筒ユニットを介して接眼レンズユニットが配置されるとともに、結像レンズユニットを介して電子カメラが配置されている。この電子カメラは、インタフェースケーブルＣを介して演算装置Ｂに接続され、試料画像をインタフェースケーブルＣを介して演算装置Ｂに出力する。さらに、蛍光顕微鏡Ａは、落射照明光学系が設けられており、当該落射照明光学系によってスライドガラスＳＧ上の試料に励起光を照射する。

演算装置Ｂは、所定の微生物検出プログラムを搭載したデスクトップ型またはノート型のパーソナルコンピュータであり、インタフェースケーブルＣを介して蛍光顕微鏡Ａに接続されている。この演算装置Ｂは、上記微生物検出プログラムに基づいて、インタフェースケーブルＣを介して蛍光顕微鏡Ａから入力された試料画像に所定の画像処理を施すことによりレジオネラ菌を検出する。このような演算装置Ｂは、図２に示すように、表示部１、操作部２、顕微鏡接続Ｉ／Ｆ部３、記憶部４及び演算部５から構成されている。

表示部１は、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）ディスプレイまたは液晶ディスプレイであり、演算部５による制御の下で各種画面を表示する。
操作部２は、マウス等のポインティングデバイス及びキーボードから構成され、ユーザから受け付けた操作指示を演算部５に出力する。

顕微鏡接続Ｉ／Ｆ部３は、インタフェースケーブルＣを介して蛍光顕微鏡Ａに接続され、蛍光顕微鏡Ａとの間で各種信号の送受信を行う。
記憶部４は、ＲＯＭ（Read Only Memory）及びＲＡＭ（Random Access Memory）から構成されており、演算装置Ｂの動作を制御するために演算部５によって実行される微生物検出プログラムを記憶している。

演算部５は、上記記憶部４に記憶された微生物検出プログラム及び操作部２から入力される操作指示に基づいて、インタフェースケーブルＣ及び顕微鏡接続Ｉ／Ｆ部３を介して蛍光顕微鏡Ａから入力された試料画像に所定の画像処理を施す。なお、この演算部５の画像処理の詳細については、以下に演算装置Ｂの動作として説明する。

次に、演算装置Ｂの動作ついて、図３を参照して説明する。
まず、試料からレジオネラ菌を検出しようとするユーザは、ＦＩＳＨ法によって試料中のレジオネラ菌を蛍光染色する。ユーザは、この蛍光染色が完了すると、上記試料を載せたスライドガラスＳＧを蛍光顕微鏡Ａに取り付け、波長４９５ｎｍの青色の励起光をスライドガラスＳＧ上の試料に対して照射させることで、レジオネラ菌に結合したプローブに波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発光させる。

ユーザは、レジオネラ菌が緑色蛍光を発すると、蛍光顕微鏡Ａの焦点調整等を行うことにより電子カメラがレジオネラ菌を含む試料のカラー画像を鮮明に撮像可能な状態になった上で、電子カメラに試料のカラー画像を撮像させる。さらに演算装置Ｂの操作部２を操作することにより上記カラー画像に基づくレジオネラ菌の検出処理を演算装置Ｂに開始させる。

演算部５は、操作部２からレジオネラ菌検出指示を受け付けると、カラー画像にＲＧＢ分解処理（色彩分解処理）（Ｒ：レッド、Ｇ：グリーン、Ｂ：ブルー）を施し、カラー画像からＧ画像（第１の試料画像）及びＲ画像（第２の試料画像）を作成する（ステップＳ１）。Ｇ画像は、カラー画像の緑色成分、つまりレジオネラ菌が発する蛍光色を抽出した画像であり、Ｒ画像は、カラー画像の赤色成分、つまりレジオネラ菌が発する蛍光色以外の色成分を抽出した画像である。また、このＲ画像は、試料に含まれる多くの夾雑物が発する色（赤色）に合致する。

図４は、本微生物検出装置ＳのＧ画像及びＲ画像を示す模式図であるが、この図４では、輝度値が低いほどドット模様の密度が高くなっている。すなわち、図４の（ａ）に示すＧ画像では、レジオネラ菌ｌｇが最も高い輝度を示し、図４の（ｂ）に示すＲ画像では、夾雑物ｉｐが最も高い輝度を示している。

演算部５は、上記ステップＳ１の後に、Ｇ画像の各ドットの輝度値を、Ｒ画像の対応するドットの輝度値で除算して各ドットの除算値を算出し、各ドットの除算値に基づく除算画像を作成する（ステップＳ２）。

上記ステップＳ２の処理について、図５を参照して具体的に説明する。
演算部５は、ステップＳ２において、図５の（ａ）のＧ画像の（１，１）ドット目の輝度値「１２０」を、図５の（ｂ）のＲ画像の（１，１）ドット目の輝度値「１００」で除算して除算値「１．２」を算出し、除算値「１．２」を除算画像の（１，１）ドット目の輝度値にする。次に、演算部５は、Ｇ画像の（２，１）ドット目の輝度値「１００」を、Ｒ画像の（２，１）ドット目の輝度値「８０」で除算して除算値「１．２５」を算出し、除算値「１．２５」を除算画像の（２，１）ドット目の輝度値にする。

そして、演算部５は、その他のドットも同様に除算値を算出し、各ドットの除算値に基づく除算画像を作成する。なお、演算部５は、ステップＳ２において、必要に応じてオフセット調整を実行したり、または適切な係数を乗算してもよい。

演算部５は、ステップＳ２の後に、Ｇ画像の各ドットの輝度値を、Ｒ画像の対応するドットの輝度値で減算して各ドットの減算値を算出し、各ドットの減算値に基づく減算画像を作成する（ステップＳ３）。

上記ステップＳ３の処理について、図５を参照して具体的に説明する。
演算部５は、ステップＳ３において、図５の（ａ）のＧ画像の（１，１）ドット目の輝度値「１２０」を、図５の（ｂ）のＲ画像の（１，１）ドット目の輝度値「１００」で減算して減算値「２０」を算出し、減算値「２０」を減算画像の（１，１）ドット目の輝度値とする。次に、演算部５は、Ｇ画像の（２，１）ドット目の輝度値「１００」を、Ｒ画像の（２，１）ドット目の輝度値「８０」で減算して減算値「２０」を算出し、減算値「２０」を減算画像の（２，１）ドット目の輝度値とする。

そして、演算部５は、その他のドットも同様に減算値を算出して、各ドットの減算値に基づく減算画像を作成する。なお、演算部５は、ステップＳ３において、必要に応じてオフセット調整を実行したり、または適切な係数を乗算してもよい。
上述した除算画像では、図６の（ａ）に示すように、レジオネラ菌ｌｇが最も高い輝度を示し、夾雑物ｉｐは背景ｂｋと同じぐらいの輝度を示す。また、減算画像では、図６の（ｂ）に示すように、レジオネラ菌ｌｇが最も高い輝度を示し、夾雑物ｉｐは背景ｂｋよりも低い輝度を示す。

演算部５は、ステップＳ３の後に、上記除算画像及び減算画像のレジオネラ菌程度の大きさの色彩領域を強調（背景を平滑化）するために、メディアンフィルタ処理（Ｎ×Ｎの円形もしくは正方形領域の中央値を算出するフィルタ）で除算画像及び減算画像のノイズを除去する（ステップＳ４）。上記色彩領域とは、近似する色のドットが集合したものである。

なお、演算部５は、ステップＳ４において、必要に応じてオフセット調整を実行したり、または適切な係数を乗算してもよい。また、ステップＳ４において、平滑化する前の除算画像及び減算画像にレジオネラ菌よりも細かいノイズが存在する場合に、当該画像にサイズの小さなメディアンフィルタ処理を施すことで、レジオネラ菌の菌体内の輝度差を改善してもよい。

演算部５は、ステップＳ４の後に、ＬＯＧ（Laplasian of Gaussian）フィルタ処理で、背景を平滑化した除算画像及び減算画像の色彩領域のエッジを強調する（ステップＳ５）。なお、演算部５は、ステップＳ５において、必要に応じてオフセット調整を実行したり、または適切な係数を乗算してもよい。

演算部５は、ステップＳ５の後に、上記除算画像の各ドットの輝度値と、減算画像の対応するドットの輝度値とを乗算して各ドットの乗算値を算出し、各ドットの乗算値に基づく乗算画像を作成する（ステップＳ６）。具体的に、演算部５は、ステップＳ６において、除算画像の（１，１）ドット目の輝度値を、減算画像の（１，１）ドット目の輝度値で乗算して乗算値を算出し、同様にその他のドットの乗算値も算出し、各ドットの乗算値に基づく乗算画像を作成する。
図７は、本実施形態に係る微生物検出装置Ｓの乗算画像を示す模式図である。乗算画像では、図７に示すように、レジオネラ菌ｌｇのような緑色波長域の輝度値が高くかつ赤色波長域の輝度値が低い色彩領域が明確になる。

演算部５は、ステップＳ６の後に、上記乗算画像から、レジオネラ菌の蛍光の緑色に基づいて設けられたしきい値を満たす色彩領域を取り出した画像を作成する（ステップＳ７）。なお、演算部５が、上記ステップＳ７において、乗算画像からレジオネラ菌を取り出す精度を向上させるために、複数のしきい値を設けることが好ましい。

演算部５は、ステップＳ７の後に、取り出した各色彩領域のエッジを１次微分エッジ検出法に基づいて検出し、各色彩領域の個別のエッジ強度の平均値（個別エッジ強度平均値）を算出し、全ての個別エッジ強度平均値から全ての色彩領域のエッジ強度の平均値（エッジ強度平均値）を算出する。そして、演算部５は、当該エッジ強度平均値を基準にエッジ上限値及びエッジ下限値を設け、個別エッジ平均値がエッジ上限値及びエッジ下限値の範囲（エッジ基準値）内の色彩領域のみを残す、すなわちエッジ上限値及びエッジ下限値の範囲外の色彩領域を画像から除外する（ステップＳ８）。
これは、レジオネラ菌の全体が均一的に蛍光を発するため、エッジの蛍光が強力または微弱な色彩領域をレジオネラ菌でないとして除外するためである。

演算部５は、ステップＳ８の後に、まれに試料中に存在する強力な緑色粒子を除外するために、上記ステップＳ１において作成したＧ画像からレジオネラ菌の蛍光よりも強力な輝度値を有する領域を抽出し、当該領域と位置が一致する色彩領域をステップＳ８において作成した画像から除外する。さらに、演算部５は、上記ステップＳ３〜Ｓ７の過程でＲ画像の極端に暗い領域から生じた擬似粒子を除外するために、上記ステップＳ１において作成したＲ画像から周囲より極端に暗い領域を抽出し、当該領域と位置が一致する色彩領域をステップＳ８において作成した画像から除外する（ステップＳ９）。

演算部５は、ステップＳ９の後に、レジオネラ菌の形態的特徴の基準を満たさない色彩領域を、ステップＳ９において作成した画像から除外する（ステップＳ１０）。なお、レジオネラ菌の形態的特徴とは、略楕円形であるレジオネラ菌の長軸、短軸のサイズ等である。ステップＳ１０によって、レジオネラ菌に似た蛍光特性を持つ夾雑物を除外することができる。

演算部５は、ステップＳ１０の後に、ステップＳ１０において作成した画像に残った色彩領域をレジオネラ菌として検出し、当該色彩領域の数を計数することで、画像中のレジオネラ菌の数を割り出す（ステップＳ１１）。

以上のように、本実施形態によれば、演算部５が、Ｇ画像及びＲ画像から除算画像及び減算画像を作成し、除算画像及び減算画像を乗算することで乗算画像を作成し、レジオネラ菌の蛍光の緑色について設けられた条件を満たす色彩領域を乗算画像から取り出す。乗算画像では、試料の画像中のレジオネラ菌と思われる緑色波長域の輝度値が高くかつ赤色波長域の輝度値が低い色彩領域が強調される。
したがって、本実施形態によれば、所定の条件としてのしきい値を満たす乗算画像の色彩領域をレジオネラ菌として検出するので、従来技術のような２つの光路を備えた高価な顕微鏡を必要とすることなく、また２つの光路の光路長差を変化させた多数の画像を撮像することなく、少数の画像の画像処理によってレジオネラ菌のみを選択的に検出することができる。

以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることなく、例えば以下のような変形が考えられる。
（１）上記実施形態では、ＦＩＳＨ法によって標的微生物であるレジオネラ菌を染色したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、核酸染色法及び抗体染色法等のＦＩＳＨ法以外の蛍光染色法によってレジオネラ菌を染色するようにしてもよい。

（２）上記実施形態では、カラー画像にＲＧＢ分解処理を施すことで、Ｇ画像及びＲ画像を作成したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、観察者が、蛍光フィルタを使って試料を撮影することで、Ｇ画像及びＲ画像を作成することが考えられる。そして、演算装置Ｂが、このようなＧ画像及びＲ画像を用いて上記処理を実行するようにしてもよい。

（３）上記実施形態では、第１の試料画像としてＧ画像を用い、第２の試料画像としてＲ画像を用いたが、本発明はこれに限定されない。
上記実施形態では、レジオネラ菌が緑色の蛍光を発するため、第１の試料画像としてＧ画像を用いている。また、多くの夾雑物が赤色を発するために、第２の試料画像としてＲ画像を用いている。これによって、夾雑物を除外して、レジオネラ菌のみを検出することができる。例えば、レジオネラ菌が、青色の蛍光を発する場合には、第１の試料画像としてＢ（ブルー）画像を用いるようにしてもよい。すなわち、本発明では、第１の試料画像として標的微生物が発する色の波長域の画像を使用し、第２の試料画像として標的微生物が発する色彩の波長域以外の画像を使用するようにすればよい。

（４）上記実施形態では、色彩領域のエッジの検出に１次微分エッジ検出法を用いたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、１次微分エッジ検出法の代わりに２次微分エッジ検出法で色彩領域のエッジを検出するようにしてもよい。

Ｓ…微生物検出装置、Ａ…蛍光顕微鏡、Ｂ…演算装置、Ｃ…インタフェースケーブル、１…表示部、２…操作部、３…顕微鏡接続Ｉ／Ｆ部、４…記憶部、５…演算部

Claims

試料の画像から蛍光染色した標的微生物を検出する微生物検出装置であって、
前記標的微生物の蛍光色（第１の色）を抽出した第１の試料画像を、前記第１の色以外の色を抽出した第２の試料画像で除算して除算画像を作成する除算画像作成手段と、
前記第１の試料画像を第２の試料画像で減算して減算画像を作成する減算画像作成手段と、
前記除算画像と前記減算画像とを乗算して乗算画像を作成する乗算画像作成手段と、
前記乗算画像から、前記第１の色について設けられた所定の条件を満たす色彩領域を前記標的微生物として検出する検出手段と
を具備することを特徴とする微生物検出装置。
前記検出手段は、前記色彩領域のうち標的微生物の形態的特徴の基準を満たさない色彩領域を除外して前記標的微生物を検出することを特徴とする請求項１に記載の微生物検出装置。
前記検出手段は、前記色彩領域のエッジ平均値を算出し、前記エッジ平均値を基準に設けられた上限値及び下限値の範囲外の前記色彩領域を除外して前記標的微生物を検出することを特徴とする請求項１または２に記載の微生物検出装置。