KR20210122261A - 스펙트럼 언믹싱 - Google Patents
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Abstract
세포 함유 생물학적 샘플 또는 기타 관심 샘플을 현미경적으로 그리고 형광적으로 이미지화하기 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 색수차를 나타내는 현미경 대물 렌즈 또는 기타 광학 요소를 사용하여 다른 파장에서 형광단 또는 기타 조영제의 이미지를 획득할 수 있다. 그런 다음 획득된 이미지를 사용하여 서로 보정하고, 예를 들어, 장파장의 형광단의 혼선으로 인해 발생하는 단파장 형광단의 이미지의 아티팩트를 제거한다. 단파장의 형광단에 대응하는 초점 거리에서 취해진 장파장의 이미지를 취하여 이를 사용하여 단파장의 이미지에서 장파장의 형광단의 활성을 감산한다. 단파장의 초점 거리로 설정된 현미경을 사용하여 장파장의 이미지를 취할 수 있다. 대안적으로, 현미경이 장파장의 초점 거리로 설정되어 있을 때 취해진 장파장 이미지에 흐리게 하는 필터(blurring filter) 또는 다른 방법을 적용함으로써 장파장 이미지를 시뮬레이션할 수 있다.
Description
상호 참조
본 출원은 미국 특허 출원 번호 16/264819(출원일: 2019년 2월 1일, 전체 내용이 본 명세서에 기재된 것처럼 병합됨)의 우선권을 주장한다.
세포(예를 들어, 배양된 세포, 외식된 조직 샘플)는 적용된 조건에 대한 세포의 반응을 평가하기 위해 다양한 배지에서 인큐베이션되고 다양한 조건(예를 들어, 온도, 용존 가스 레벨, 복사선, 습도, 첨가 물질, 전기장 또는 자기장, 바이러스, 미생물)에 노출될 수 있다. 적용된 조건에 대한 세포의 반응을 측정하여 약물 또는 치료의 효능을 평가하고, 물질(예를 들어, 실험 약물 또는 치료)의 독성을 평가하고, 세포의 유전자 변형 효과를 조사하고, 세포 및/또는 세포로부터 형성된 조직의 대사체학, 구조 또는 기타 특성을 조사하고, 또는 일부 다른 정보를 결정할 수 있다. 이러한 평가는 인큐베이터로부터 샘플을 제거하고 (예를 들어, 형광 현미경이나 일부 다른 이미지화 장치를 사용하여) 샘플을 이미지화하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 이미지화는 샘플을 파괴시킬 수 있는 조영제 또는 화학 시약을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 그러나 이 방법은 이미지화되는 샘플을 교란시켜서, 시간 경과에 따른 샘플의 모집단의 반응을 평가하기 위해 각기 다른 시간 기간 동안 다수의 샘플 세트를 인큐베이션할 것을 요구한다.
본 발명의 일 양태는 방법으로서, (i) 제1 시간 기간 동안 제1 여기 파장의 광으로 샘플을 조명하는 단계; (ii) 상기 제1 시간 기간 동안, 제1 초점 설정에 따라 이미저(imager)를 동작시켜 제1 방출 파장의 광을 상기 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 상기 샘플의 제1 이미지를 획득하는 단계; (iii) 제2 시간 기간 동안 제2 여기 파장의 광으로 상기 샘플을 조명하는 단계; (iv) 상기 제2 시간 기간 동안, 제2 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시켜 제2 방출 파장의 광을 상기 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 상기 샘플의 제2 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제2 초점 설정은 상기 제1 초점 설정과 다른, 상기 제2 이미지를 획득하는 단계; (v) 상기 샘플의 제3 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제3 이미지는, 상기 제1 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제2 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제2 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제3 이미지를 획득하는 단계; 및 (vi) 상기 제1 이미지로부터 상기 제3 이미지의 일부를 제거함으로써 상기 샘플의 개선된 제1 이미지를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 (i) 광원; (ii) 이미저; 및 (iii) 하나 이상의 프로세서를 포함하는 제어기를 포함하는 시스템에 관한 것이다. 상기 제어기는, (a) 제1 시간 기간 동안 상기 광원을 동작시켜 제1 여기 파장의 광으로 샘플을 조명하는 단계; (b) 상기 제1 시간 기간 동안 제1 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시켜 제1 방출 파장의 광을 상기 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 상기 샘플의 제1 이미지를 획득하는 단계; (c) 제2 시간 기간 동안 상기 광원을 동작시켜 제2 여기 파장의 광으로 상기 샘플을 조명하는 단계; (d) 상기 제2 시간 기간 동안 제2 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시켜 제2 방출 파장의 광을 상기 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 상기 샘플의 제2 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제2 초점 설정은 상기 제1 초점 설정과 다른, 상기 제2 이미지를 획득하는 단계; (e) 상기 샘플의 제3 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제3 이미지는, 상기 제1 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제2 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제2 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제3 이미지를 획득하는 단계; 및 (f) 상기 제1 이미지로부터 상기 제3 이미지의 일부를 제거함으로써 상기 샘플의 개선된 제1 이미지를 생성하는 단계를 포함하는 제어기 동작을 수행하도록 프로그래밍된다.
본 발명의 또 다른 양태는 적어도 컴퓨터 판독 가능 명령어를 저장하도록 구성된 비-일시적인 컴퓨터 판독 가능 매체로서, 상기 명령어는 컴퓨팅 디바이스의 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때 상기 컴퓨팅 디바이스로 하여금 본 명세서에 기재된 방법 중 하나 이상의 방법을 수행하는 컴퓨터 동작을 수행하게 하는, 비-일시적인 컴퓨터 판독 가능 매체에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 (i) 하나 이상의 프로세서; 및 (ii) 적어도 컴퓨터 판독 가능 명령어를 저장하도록 구성된 비-일시적인 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함하는 시스템으로서, 상기 명령어는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 시스템으로 하여금 본 명세서에 설명된 방법 중 하나 이상의 방법을 수행하게 하는, 시스템에 관한 것이다.
이들 및 다른 양태, 장점 및 대안은 적절한 경우 첨부 도면을 참조하여 다음의 상세한 설명을 읽음으로써 이 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다. 또한, 본 '발명의 내용'란 및 본 명세서의 다른 곳에 제공된 설명은 본 발명을 제한하는 것이 아니라 본 발명을 예시하는 것으로서 청구된 주제를 설명하기 위해 의도된 것으로 이해된다.
도 1a는 예시적인 조영제의 여기 및 방출 스펙트럼을 도시한다.
도 1b는 예시적인 조영제의 여기 및 방출 스펙트럼을 도시한다.
도 1c는 예시적인 조영제의 여기 스펙트럼을 도시한다.
도 1d는 예시적인 조영제의 여기 및 방출 스펙트럼을 도시한다.
도 2는 샘플의 예시적인 현미경 이미지를 도시한다.
도 3a는 현미경 이미지화 시스템의 요소를 단면으로 도시한다.
도 3b는 현미경 이미지화 시스템의 요소를 단면으로 도시한다.
도 3c는 현미경 이미지화 시스템의 요소를 단면으로 도시한다.
도 4a는 샘플의 예시적인 현미경 이미지를 도시한다.
도 4b는 샘플의 예시적인 현미경 이미지를 도시한다.
도 5는 예시적인 자동화된 샘플 이미지화 디바이스의 요소를 도시한다.
도 6은 예시적인 방법의 흐름도이다.
도 1b는 예시적인 조영제의 여기 및 방출 스펙트럼을 도시한다.
도 1c는 예시적인 조영제의 여기 스펙트럼을 도시한다.
도 1d는 예시적인 조영제의 여기 및 방출 스펙트럼을 도시한다.
도 2는 샘플의 예시적인 현미경 이미지를 도시한다.
도 3a는 현미경 이미지화 시스템의 요소를 단면으로 도시한다.
도 3b는 현미경 이미지화 시스템의 요소를 단면으로 도시한다.
도 3c는 현미경 이미지화 시스템의 요소를 단면으로 도시한다.
도 4a는 샘플의 예시적인 현미경 이미지를 도시한다.
도 4b는 샘플의 예시적인 현미경 이미지를 도시한다.
도 5는 예시적인 자동화된 샘플 이미지화 디바이스의 요소를 도시한다.
도 6은 예시적인 방법의 흐름도이다.
방법 및 시스템의 예들이 본 명세서에 설명된다. "예시적인", "실시예" 및 "설명적인"이라는 단어는 본 명세서에서 "실시예, 예시 또는 설명을 위한 것으로서 제공되는" 것을 의미하는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 "예시적인", "실시예" 또는 "설명적인"으로 제공된 임의의 실시형태 또는 특징은 반드시 다른 실시형태 또는 특징보다 바람직하거나 유리한 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 본 명세서에 설명된 예시적인 실시형태는 본 발명을 제한하는 것으로 의도된 것이 아니다. 개시된 시스템 및 방법의 특정 양태는 매우 다양한 다른 구성으로 배열 및 조합될 수 있는 것으로 쉽게 이해된다.
I.
개요
샘플의 이미지화를 용이하게 하기 위해 조영제를 샘플에 첨가할 수 있다. 이러한 샘플은 관심 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 포함할 수 있다. 조영제는 형광 염료, 비형광 염료 또는 안료, 적절한 파장에서 표면 플라즈몬 공명을 나타내는 나노막대 또는 기타 전도성 요소, 라만 염료, 또는 샘플 및/또는 샘플 내 물질의 이미지화를 개선하기 위한 기타 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 조영제(들)는 샘플 내의 관심 물질에 특이적으로 결합하거나 관심 물질과 상호 작용하도록 (예를 들어, 항체를 사용하여) 기능화될 수 있다. 예를 들어, 조영제는 단백질, 특정 세포의 표면 마커, DNA/RNA/등의 특정 서열, 또는 샘플 내의 일부 다른 관심 물질 또는 요소에 특이적으로 결합하거나 이와 상호 작용하도록 기능화될 수 있다.
조영제는 샘플과 그 내용물의 전체적인 가시성을 향상시킬 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 광학적으로 구별 가능한 다수의 조영제를 사용하면 다수의 다른 조영제를 독립적으로 이미지화하는 것을 용이하게 할 수 있다. 이러한 다수의 다른 조영제는 여기 스펙트럼, 방출 스펙트럼, 또는 이러한 독립적인 이미지화를 용이하게 하는 다른 특성과 관련하여 상이할 수 있다. 이러한 이미지화는 각기 다른 시점에서 다른 조영제의 각기 다른 여기 파장의 광을 제공함으로써 수행될 수 있다.
일부 실시예에서, 다른 조영제를 완전히 구별하는 것이 어려울 수 있다. 예를 들어, 샘플에서 녹색 형광단을 여기시키는 데 사용되는 여기 파장은 샘플에서 적색 형광단을 더 적은 정도로 여기시킬 수도 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 제1 조영제(예를 들어, 녹색 형광단)로부터의 광을 검출하는 데 사용된 센서는 또한 다른 조영제(예를 들어, 적색 형광단)에 의해 방출된 광에 민감할 수 있다. 다른 실시예에서, 주황색 및 근적외선 형광단, 녹색, 주황색 및 근적외선 형광단, 또는 일부 다른 형광단 세트가 샘플에 존재할 수 있다. 다른 조영제 사이의 이러한 "혼선(cross-talk)"은 다른 조영제의 광학적 특성에 대한 유사성, 검출 장치의 제한 또는 기타 인자와 관련될 수 있다. 예를 들어, 다수의 다른 형광단에서 방출되는 광에 민감한 단일 광 검출기는 예를 들어, 장치의 비용, 크기 및/또는 복잡성을 줄이기 위해 샘플을 이미지화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 다른 형광단은 각기 다른 시점에서 다른 형광단의 각기 다른 여기 파장의 광을 제공함으로써 독립적으로 이미지화될 수 있다.
그러나, 이러한 실시예에서, 형광단 중 둘 이상의 형광단이 특정 여기 파장의 광에 반응할 수 있다. 예를 들어, 장파장의 형광단(예를 들어, 적색 형광단)과 단파장의 형광단(예를 들어, 녹색 형광단)이 샘플에 존재할 수 있다. 둘 다에서 방출되는 광이 이미지화된다. 단파장의 형광단을 이미지화하기 위해 단파장의 형광단의 여기 파장의 광을 제공하여 샘플을 조명할 수 있다. 예를 들어, 단파장 형광단의 여기 스펙트럼에서 피크 근처의 파장의 광이 제공될 수 있다. 그러나, 제공된 광에 의해 장파장의 형광단을 (예를 들어, 더 적은 정도로) 여기시킬 수도 있다. 이것은 단파장의 형광단의 여기 스펙트럼의 피크와 중첩하는 긴 꼬리(long tail)를 가진 장파장의 형광단의 여기 스펙트럼 때문일 수 있다. 이러한 예에서, 단파장의 형광단의 이미지는 장파장의 형광단에서 방출된 광과 관련된 아티팩트를 포함할 수 있다.
이 문제를 해결하기 위해, 장파장의 아티팩트를 포함하는 단파장의 형광단의 이미지로부터 장파장의 형광단의 이미지를 제거할 수 있다. 예를 들어, 형광단의 흡수 및 재방출 특성의 차이를 고려하기 위해 크기 조정된 후 단파장 이미지로부터 장파장 이미지를 감산할 수 있다. 이 해법은 샘플을 이미지화하는 데 사용되는 광학 시스템이 최소한의 색수차를 나타내는 실시예에서 잘 동작할 수 있다. 예를 들어, 샘플을 이미지화하는 데 사용되는 현미경이 샘플의 다수의 다른 형광단으로부터 방출된 광을 동시에 초점에 맞추는 시나리오에서. 그러나 광학 시스템이 샘플의 다른 조영제에서 방출되는 광의 파장 사이에 색수차를 나타내는 경우, 다른 이미지(예를 들어, 또한 적색 형광단으로부터 수신된 광을 나타내는 녹색 형광단 이미지)로부터 아티팩트를 제거하는 데 사용되는 이미지(예를 들어, 적색 형광단 이미지)는 보정될 이미지에 표시된 아티팩트 광과는 다른 초점 설정에 있을 수 있다.
이 문제를 해결하기 위해, 아티팩트를 제거할 이미지와 동일한 초점 설정에서 샘플의 하나 이상의 추가 이미지를 획득할 수 있다. 예를 들어, 녹색 형광단에서 방출되는 광이 초점에 맞도록 하는 초점 설정에서 녹색 형광단의 여기 파장의 광으로 샘플을 조명함으로써 샘플을 녹색 형광단의 표적 이미지를 취할 수 있다. 예를 들어, 샘플을 이미지화하는 데 사용되는 현미경과 샘플 사이의 거리는 녹색 형광단 방출 광을 초점을 맞춰 이미지화하도록 설정될 수 있다. 이 이미지는 샘플의 적색 형광단에서 방출되는 광을 더 포함할 수 있다. 이 적색 형광단 광은 이미지화 장치의 색수차로 인해 초점이 맞지 않는 표적 이미지에 존재할 수 있다는 것이 주목된다. 그런 다음 표적 이미지로부터 아티팩트 이미지를 제거하여 인공 적색 형광단 광을 제거할 수 있다. 이 아티팩트 이미지는 표적 이미지를 얻는 데 사용된 것과 동일한 초점 설정에서 적색 형광단의 여기 파장의 광으로 샘플을 조명함으로써 획득될 수 있다. 예를 들어, 녹색 형광단으로부터 방출되는 광이 초점에 맞도록 하는 초점 설정에서. 대안적으로, 아티팩트 이미지는 적색 형광단의 초점 이미지를 흐리게 하거나, 일부 이미지 처리 기술을 적용하여 다른 초점 설정을 사용하여 취해진 이미지에서 표적 이미지를 획득하는 데 사용된 초점 설정의 효과를 시뮬레이션함으로써 획득될 수 있다. 예를 들어, 이미지는 적색 형광단에서 방출되는 광을 초점을 맞춰 이미지화하는 초점 설정을 사용하여 취해진다.
Ⅱ.
예시적인 이미지화
샘플을 이미지화하는 것은 샘플을 조명하는 것과, 샘플로부터 응답으로 반사되거나, 산란되거나, 흡수되고, 형광적으로 재방출되거나, 방출되는 광을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 조명은 단일 파장 또는 파장 범위에서 제공될 수 있다. 예를 들어, 조명은 샘플에서 형광 염료 또는 다른 형광단의 여기 스펙트럼의 피크에 대응하는 파장으로 제공될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조명은 다수의 파장/파장 범위에서 및/또는 광범위한 파장에 걸쳐 제공될 수 있다. 예를 들어, 조명은 가시 파장 범위에 걸친 광의 파장을 포함하는 백색 광일 수 있다.
광을 검출하는 것은 카메라 또는 다른 이미저, 예를 들어, 단일 채널 광검출기, 평면 푸리에 캡처 어레이, 단일 픽셀 이미저, 또는 일부 다른 이미저 생성 장치를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 이미저는 단일 파장 또는 파장 범위의 광을 검출하도록 구성되거나 동작될 수 있다. 예를 들어, 샘플에서 형광 염료 또는 다른 형광단의 방출 스펙트럼의 피크에 대응하는 파장에서. 대안적으로, 이미저는 다수의 파장/파장 범위의 광을 검출하도록 구성되거나 동작될 수 있다. 예를 들어, 샘플에서 다수의 형광단의 방출 스펙트럼에서 피크에 대응하는 파장에서 및/또는 광범위한 파장에 걸쳐. 광을 검출하는 것은 이미지 정보의 단일 "채널", 예를 들어, 파장 범위에 걸쳐 수신된 광의 단색 이미지를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 광을 검출하는 것은 이미지 정보, 예를 들어, 녹색 파장(들)의 광의 "녹색" 이미지, 청색 파장(들)의 광의 "청색" 이미지, 및 적색 파장(들)의 광의 "적색" 이미지의 다수의 "채널"을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 수신된 광은 샘플을 조명하는 데 사용되는 광을 거부하거나, 샘플에서 인공 자가 형광을 거부하거나, 샘플의 다른 형광 염료에서 나오는 광을 거부하도록 필터링되거나, 일부 다른 고려 사항에 따라 필터링될 수 있다.
샘플 내 특정 조영제를 이미지화하기 위해, 조명이 제공될 수 있고, 조영제가 조명과 상호 작용하여 조영제로부터 응답으로 방출된 광이 이미지화될 수 있다. 조영제가 형광단을 함유하는 예에서, 조명은 형광단에 대한 여기 스펙트럼의 피크 근처 및/또는 형광단에 대한 일부 다른 여기 파장에서 제공될 수 있다. 그런 다음 형광단에 대한 방출 스펙트럼의 피크 근처 및/또는 형광단에 대한 일부 다른 방출 파장의 광은 샘플 내 조영제를 이미지화하기 위해 검출될 수 있다. 이러한 검출은 하나 이상의 대역통과 필터, 저역통과 필터, 고역통과 필터, 또는 광학 필터, 프리즘, 격자, 광섬유의 다른 유형 또는 조합, 또는 방출 파장(들)의 광을 선택적으로 검출하고 여기 파장(들)의 여기 광을 거부하는 것을 용이하게 하는 다른 요소를 갖는 현미경을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
도 1a는 제1 예시적인 형광단(예를 들어, "녹색" 형광단)에 대한 여기 스펙트럼(110ex) 및 방출 스펙트럼(110em)을 도시한다. 여기 스펙트럼(110ex)과 방출 스펙트럼(110em)은 각기 다른 파장에서 각각의 피크를 갖는다. 여기 스펙트럼(110ex)과 방출 스펙트럼(110em)은 각각 제1 형광단이 광자에 의해 여기되고 이러한 여기에 응답하여 광자 파장의 함수로서 광자를 방출할 가능성을 나타낸다. 따라서, 조명이 제1 형광단을 여기시키는 효율을 증가시키기 위해, 여기 스펙트럼(110ex)의 피크 근처의 파장에서 광이 제공될 수 있다. 이러한 조명의 예는 제1 여기 광(120)에 의해 예시된다. 파장과 관련하여 제1 형광단의 여기 스펙트럼(110ex)과 여기 광(120) 사이의 중첩이 도 1a에서 음영으로 예시된다.
추가적인 인자를 사용하여 이러한 제1 형광단을 여기시키는 데 사용되는 광의 특정 범위의 파장을 선택할 수 있다. 예를 들어, 이미지화되는 샘플에 다른 형광단이 존재하면, 파장의 범위는 제1 형광단이 여기되는 정도를 증가시키면서 다른 형광단이 여기되는 정도를 감소시키도록 선택될 수 있다. 이것은 다른 형광단이 여기 광에 대해 최소한으로 수용하는 파장 범위를 선택하고/하거나 제1 형광단의 여기 스펙트럼의 피크 근처의 파장 범위를 선택함으로써 달성될 수 있다.
여기 광의 다수의 파장은 샘플 내 각기 다른 다수의 형광단을 여기시켜 형광단을 독립적으로 이미지화하는 것을 촉진하도록 제공될 수 있다. 샘플 내 다른 형광단에서 생성된 이미지 간의 "혼선"을 줄이기 위해(즉, 다른 형광단의 활성으로 인해 발생하는 제1 형광단의 이미지의 양을 줄이기 위해), 샘플에서 방출된 광을 각기 다른 파장에서 이미지화할 수 있다. 예를 들어, 샘플에서 방출된 광은 형광단의 각기 다른 방출 스펙트럼의 피크에 대응하는 다른 파장에서 이미지화될 수 있다. 이것은 예를 들어 색상 및/또는 초분광 카메라 또는 기타 이미저를 사용함으로써, 서로 다른 방출 파장으로 조정된 각각의 광학 필터가 있는 다수의 카메라 또는 기타 이미저를 사용함으로써, 단일 카메라 또는 다른 이미저에 결합된 광학 필터 세트를 작동시킴으로써, 또는 일부 다른 방식으로 달성될 수 있다.
도 1b는 제2 예시적인 형광단(예를 들어, "적색" 형광단)에 대한 여기 스펙트럼(140ex) 및 방출 스펙트럼(140em)을 도시한다. 여기 스펙트럼(140ex)과 방출 스펙트럼(140em)은 각기 다른 파장에서 각각의 피크를 갖는다. 조명이 제2 형광단을 여기시키는 효율을 증가시키기 위해 여기 스펙트럼(140ex)의 피크 근처의 파장의 광을 제공할 수 있다. 이러한 조명의 예는 제2 여기 광(150)에 의해 예시된다. 파장과 관련하여 제2 형광단의 여기 스펙트럼(140ex)과 여기 광(150) 사이의 중첩이 도 1b에서 음영으로 예시된다. 제2 형광단은 제1 형광단보다 장파장의 광자에 의해 여기되고, 이러한 조명에 응답하여, 제1 형광단보다 장파장의 광을 방출한다는 것이 주목된다. 따라서, 제2 형광단은 또한 "장파장 형광단"으로 지칭될 수 있고, 제1 형광단은 "단파장 형광단"으로 지칭될 수 있다.
일부 사용 사례에서, 단일 카메라 또는 다른 이미저를 사용하여 다수의 다른 파장에서 검출하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 이미저는 다수의 다른 형광단의 방출 스펙트럼의 피크에 대응하는 다수의 다른 파장 대역 내의 광을 검출하도록 구성될 수 있다. 이것은 이미저의 비용을 줄이고, 이미저의 부피, 선형 치수(들), 전력 요구사항 및/또는 질량을 줄이고, 이미저의 견고성을 높이고, 이미저가 더 까다로운 환경 조건에서 동작하게 하고, 이미저를 디바이스의 작동 갠트리에 장착할 수 있게 하고, 또는 일부 다른 목표를 용이하게 하기 위해 수행될 수 있다.
그러나, 이러한 사용 사례에서, 제1 형광단에서 취해진 이미지는 샘플에 존재하는 제1 형광단 및 다른 형광단에서 방출된 광자를 모두 포함할 수 있다. 이는 샘플에 있는 다수의 형광단의 여기 스펙트럼이 파장과 관련하여 제공된 조명과 중첩하기 때문일 수 있다. 도 1c는 제1 형광단을 여기하기 위해 제공된 제1 조명(120)뿐만 아니라, 제1 형광단의 여기 스펙트럼(110ex) 및 제2 형광단의 여기 스펙트럼(140ex)을 보여준다. 이 둘 모두의 여기 스펙트럼(110ex, 140ex)은 제1 조명(120)과 중첩되고 따라서 두 형광단은 제1 조명(120)에 응답하여 광을 방출할 가능성이 높으며, 제1 형광단은 제1 형광단의 여기 스펙트럼(110ex)과 제1 조명(120) 사이의 중첩이 훨씬 더 큰 것으로 인해 제2 형광단보다 상당히 더 많은 광을 샘플의 형광단의 양에 비례하여 방출할 가능성이 있다고 생각된다.
전술한 바와 같이, 다수의 다른 형광단으로부터 다수의 다른 파장의 광을 동시에 검출하도록 구성된 이미저를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 이미저는 이미지화될 형광단 각각에 대해 하나 이상의 통과대역을 갖도록 구성된 하나 이상의 광학 필터를 포함할 수 있다. 하나 이상의 통과대역의 각각의 통과대역은 각각의 형광단의 방출 스펙트럼에서 각각의 피크에 대응할 수 있다. 이것은 제1 형광단의 방출 스펙트럼(110em)의 피크에 대응하는 제1 대역통과(165a), 및 제2 형광단의 방출 스펙트럼(140em)의 피크에 대응하는 제2 대역통과(165b)를 포함하는, 도 1d의 이중 대역통과 필터(160)에 의해 예시된다. 이러한 이중 대역통과 필터는 예를 들어, 샘플에 제공된 제1 조명(120)과 제2 조명(150)의 제거를 개선하고/하거나 원치 않는 광학 잡음의 다른 소스의 제거를 개선하기 위해, 제공된 하나 이상의 브래그 반사기 또는 기타 요소를 포함할 수 있다.
그러나, 도 1c와 관련하여 논의된 바와 같이, 이러한 사용 사례에서 다른 형광단 "채널" 사이의 "혼선"은 제1 형광단에 대한 이미지가 샘플 내의 다른 형광단을 나타내는 내용물을 포함하는 결과를 초래할 수 있다. 이러한 제1 형광단이 아닌 내용물은 제1 형광단 이미지에서 "아티팩트"로 간주될 수 있다. 이러한 "아티팩트"가 독립적으로 이미지화될 수 있는 다른 형광단의 존재로 인한 경우, "아티팩트"를 제거하고 샘플 내 제1 형광단의 양과 분포에 대한 보다 정확한 이미지를 생성하기 위해 제1 형광단 이미지로부터 이러한 다른 형광단의 이미지를 획득하고 제거할 수 있다. 이러한 제거는 예를 들어, 제공된 조명에 대한 형광단의 감도 차이, 형광단의 방출 강도의 차이, 형광단의 양자 효율의 차이, 형광단의 각기 다른 방출 파장의 광에 대한 이미저의 감도 차이 등을 고려하기 위해 제1 형광단 이미지로부터 제2 형광단 이미지를 감산하기 전에 제2 형광단 이미지를 크기 축소하는 것을 포함할 수 있다.
도 2는 이러한 예시적인 이미지 처리 절차를 도시한다. 제1 이미지(210)는 제1 형광단의 여기 파장의 광(예를 들어, 제1 조명(120))으로 제1 형광단 및 제2 형광단을 함유하는 샘플을 조명함으로써 취해진 것이다. 또한 제2 형광단은 광에 의해 여기되어, 제1 이미지(210)는 제1 형광단의 존재와 관련된 제1 내용물(215a) 및 제2 형광단의 존재와 관련된 제2 내용물(215b)을 포함한다. 제2 이미지(220)는 제2 형광단의 여기 파장의 광(예를 들어, 제2 조명(150))으로 샘플을 조명함으로써 취해진 것이다. 따라서, 제2 이미지(220)는 제2 형광단의 존재와 관련된 내용물(225a)을 포함한다. 여기 광에 대한 형광단의 감도의 차이를 고려하기 위해 제2 이미지(220)를 (예를 들어, 도 2 도시된 바와 같이, 제시된 α%로) 크기 축소하고 제1 이미지(210)로부터 제거하여 제2 형광단의 효과가 감소된 개선된 이미지(230)를 생성한다. 따라서, 개선된 이미지(230)는 제1 형광단의 존재와 관련된 내용물(235a)만을 포함한다.
2개의 형광단만을 포함하는 시나리오가 위에서 논의되었지만, 임의의 수의 별개의 조영제가 샘플에 존재할 수 있고 별도로 이미지화될 수 있다. 이러한 이미지화는 이미지화를 위해 샘플을 조명할 때 다른 형광단 "채널" 간의 원치 않는 혼선 효과를 줄이기 위해 이미지를 크기 조정하고 서로 감산하는 것을 포함할 수 있다. 실제로, 샘플에서 각기 다른 형광단을 나타내는 다수의 다른 이미지를 가중하고 결합하여, 샘플 내 다른 형광단으로부터 감소된 효과를 나타내면서 샘플의 특정 형광단의 "보정된" 이미지를 생성할 수 있다.
다른 형광단(또는 샘플의 다른 내용물)을 나타내는 이미지 채널 사이의 "혼선"이 채널로부터 채널로(예를 들어, 장파장의 형광단의 이미지 채널로부터 단파장의 형광단으로) 하나의 방향으로만 흐르는 경우, 체인에서 단파장의 이미지로부터 장파장의 이미지를 제거함으로써 보정된 이미지를 생성할 수 있다. 예를 들어, 제2 단파장의 형광단의 제2 이미지로부터 제1 최장파장의 형광단의 제1 이미지를 제거하여(예를 들어, 크기 조정하고 감산하여) 제2 형광단의 보정된 제2 이미지를 생성할 수 있다. 이 보정된 제2 이미지를 제3 최단파장의 형광단의 제3 이미지로부터 제거하여 제3 형광단의 보정된 제3 이미지를 생성할 수 있다. 대안적으로(그리고 수학적으로 동등하게), 보정되지 않은 제2 이미지의 일부를 제거하고 제1 이미지의 일부를 보정되지 않은 제3 이미지에 추가하거나 포함시킴으로써 보정된 제3 이미지를 생성할 수 있다.
이미지 채널 간의 혼선이 더 복잡한 상황에서, 샘플 내 개별 형광단(또는 기타 조영제 또는 기타 관심 내용물)의 보정된 이미지를 생성하기 위해 다른 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법은 각각의 형광단의 여기 파장의 광으로 샘플을 조명하고 및/또는 샘플로부터 응답으로 방출된 각각의 형광단의 방출 파장의 광을 이미지화함으로써 각각의 형광단에 대해 샘플의 각각의 이미지를 획득하는 것을 포함할 수 있다. 가중 선형 조합 또는 다른 형광단의 이미지(특정 형광단의 이미지를 포함함)의 일부 다른 유형의 조합에 기초하여 특정 형광단의 보정된 이미지를 생성할 수 있다. 이러한 조합에 사용되는 가중치는 다른 이미지 채널 간의 혼선의 크기를 정의하는 실험적으로 결정된 인자에 기초하여 결정될 수 있다. 이러한 방법은 혼선 인자가 채널 쌍 사이에 강한 비대칭을 나타내는 예에서 위의 방법과 수학적으로 동등할 수 있다. 예를 들어, 단파장의 형광단 채널이 장파장의 형광단으로부터 아티팩트를 나타낼 수 있지만 그 반대는 아니다.
III.
색수차
많은 광학 시스템은 파장 의존 방식으로 광을 초점 맞추거나 조작한다. 예를 들어, 광학 시스템은 적색 파장의 광을 초점을 맞춰 이미지화하도록 구성될 수 있는 반면, 녹색 파장의 광은 초점이 맞지 않게 수신될 수 있다. 이미지에 대한 이러한 파장 의존 영향은 종종 "색수차"라고 지칭된다. 색수차는 하나 이상의 파장 의존 광학 특성을 갖는 이미지화 시스템(예를 들어, 현미경)의 하나 이상의 요소에 의해 발생할 수 있다. 즉, 렌즈의 재료, 회절 격자의 구조, 또는 이미지화 시스템의 일부 다른 요소는 색 분산을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 렌즈의 굴절률은 파장의 함수로 변할 수 있다. 따라서, 렌즈는 파장에 따라 달라지는 초점 거리를 갖는다.
광학 시스템은 파장 범위에 걸쳐 및/또는 개별 파장 세트 사이에서 색수차를 감소시키거나 기능적으로 제거하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 광학 시스템은 샘플 내 형광 조영제 세트의 각각의 방출 파장에 대응하는 파장 세트 사이의 색수차를 감소시키도록 설계될 수 있다. 이것은 낮은 분산 재료를 사용함으로써, 광학 시스템의 전체 분산 효과를 줄이기 위해 다수의 렌즈 또는 기타 광학 요소를 사용함으로써, 파장 세트 각각에서 전체 시스템의 초점 거리(또는 기타 광학 특성)를 일치시키기 위해 다수의 렌즈 또는 기타 광학 요소를 사용함으로써, 거울이나 다른 반사 초점 요소를 사용함으로써, 또는 일부 다른 수단을 사용함으로써 수행될 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 이미지화 시스템이 더 커지게 하고, 더 무겁게 하고, 추가 요소를 가지게 하고, 더 많은 비용이 들게 하고, 기계적 충격이나 움직임에 덜 탄력적이게 하고, 습도 또는 기타 환경 조건에 대한 탄력성이 떨어지게 하고, 조립 및/또는 유지 관리를 어렵게 하고, 또는 일부 다른 방식으로 감소되게 할 수 있다.
도 3a는 색수차를 나타내는 대물렌즈(310)를 도시한다. 대물렌즈(310)는 샘플(305)로부터 제1 거리(d1)에 위치된다. 거리(d1)는 제1 파장(320)(예를 들어, 적색 파장)의 광을 대물렌즈(310)가 일부인 광학 시스템(예를 들어, 현미경)에 의해 초점을 맞춰 이미지화할 수 있는 거리이다. 즉, 대물렌즈(310)가 샘플(305)로부터 제1 거리(d1)에 위치될 때, 제1 파장(320)의 광은 제1 파장(320)의 광을 초점을 맞춰 이미지를 획득할 수 있도록 전하 결합 디바이스, CMOS 이미지 센서, 또는 일부 다른 이미지 센서에 초점을 맞춰 제공된다. 액추에이터를 사용하여 대물렌즈(310)와 샘플(305) 사이의 거리를 제어할 수 있다.
그러나, 대물렌즈(310)의 색수차로 인해 샘플(305)로부터 방출된 다른 파장의 광은 초점에 맞게 이미지화되지 않을 수 있다. 도 3b는 제1 거리(d1)만큼 샘플(305)로부터 분리된 대물렌즈(310)를 도시한다. 그러나, 이 거리에서, 샘플(305)로부터 수신된 제2 파장(330)(예를 들어, 녹색 파장)의 광은 색수차로 인해 초점에서 벗어나 이미지화된다. 따라서, 대물렌즈(310)가 샘플(305)로부터 제1 거리(d1)만큼 분리된 동안 샘플(305)에 대해 취해진 임의의 이미지에서는 제2 파장(330)의 광이 흐리거나 초점이 맞지 않는 것으로 묘사된다. 초점이 맞춰진 제2 파장(330)의 광을 이미지화하기 위해, 대물렌즈(310)는 제2 파장에서 대물렌즈(310)의 초점 거리에 대응하는 다른 거리로 이동될 수 있다. 대안적으로, 대물렌즈(310)는 제2 파장에 대한 대물렌즈(310)의 초점 거리를 조정하기 위해 일부 다른 방식으로 작동될 수 있다. 이것은 하나 이상의 렌즈, 격자, 거울 또는 대물렌즈의 다른 요소를 회전, 변형 또는 이동하는 것, 액체 렌즈를 작동시키는 것, 대물렌즈(310)의 액정 또는 다른 재료의 굴절률을 전자적으로 또는 다른 방식으로 제어하는 것, 또는 제2 파장에 대해 대물렌즈(310)의 초점 거리를 제어하기 위해 일부 다른 수단을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
도 3c는 샘플(305)로부터 제2 거리(d2)로 작동된 대물렌즈(310)를 도시한다. 거리(d2)는 제2 파장(330)의 광을 대물렌즈(310)가 일부인 광학 시스템에 의해 초점을 맞춰 이미지화할 수 있는 거리이다. 즉, 대물렌즈(310)가 샘플(305)로부터 제2 거리(d2)에 위치될 때, 제2 파장(330)의 광은 제2 파장(330)의 광을 초점을 맞춰 이미지를 획득할 수 있도록 전하 결합 디바이스, CMOS 이미지 센서, 또는 일부 다른 이미지 센서에 초점을 맞춰 제공된다.
도 3a 내지 도 3c는 축척에 맞게 그려진 것이 아니며 단지 설명을 위한 실시예로서 의도된 것임이 주목된다. 도 3a 내지 도 3c에 도시된 대물렌즈, 초점 거리, 샘플 및/또는 샘플 용기, 또는 기타 요소의 상대적 크기는 내부에 묘사된 크기 및/또는 비율과 유사하거나 상이할 수 있다.
색수차를 나타내는 대물렌즈 또는 기타 광학 시스템을 사용하여 색상 간의 혼선을 포함하는 이미지를 취하는 경우 이러한 이미지로부터 아티팩트를 제거하는 프로세스는 수정을 필요로 할 수 있다. 이것은 특정 이미지가 다른 형광단의 다른 파장의 광을 나타내는 내용물을 포함할 수 있지만 다른 파장의 광은 다른 레벨의 초점이 맞지 않는 흐림 효과로 이미지화되었기 때문이다. 예를 들어, 샘플 내 적색 형광단에서 방출되는 광에 대해 초점을 맞춰 제1 이미지를 취할 수 있다. 그런 다음 샘플 내 녹색 형광단에서 방출된 광을 초점을 맞춰 샘플의 제2 이미지를 취할 수 있다. 그러나 색수차 및 이미지 채널 간의 혼선으로 인해 제2 이미지는 샘플에서 방출되는 적색 광과 관련된 초점이 맞지 않는 내용물을 더 포함한다. 따라서, 제2 이미지로부터 제1 이미지를 감산하면 적색 광 아티팩트를 제거하는 것이 아니라 제1 이미지와 제2 이미지에서 적색 광을 수집하는 데 사용되는 초점 설정 간의 불일치로 인해 추가 아티팩트를 초래할 수 있다.
이러한 시나리오는 도 4a에 예시되어 있다. 제1 이미지(410a)는 제1 형광단(예를 들어, 녹색 형광단)의 여기 파장에서 샘플을 조명하고, 제1 형광단의 방출 파장의 광을 초점을 맞춰 이미지화하도록 응답으로 방출된 광을 이미지화함으로써 획득된다. 이미지 채널 사이의 혼선으로 인해, 제1 이미지(410a)는 샘플 내의 제2 형광단의 존재와 관련된 아티팩트(415a)를 포함한다. 색수차로 인해 제2 형광단 아티팩트(415a)는 초점이 맞지 않는다.
제2 이미지(420a)는 제2 형광단(예를 들어, 적색 형광단)의 여기 파장에서 샘플을 조명하고, 제2 형광단의 방출 파장의 광을 초점을 맞춰 이미지화하도록 응답으로 방출된 광을 이미지화함으로써 획득된다. 그 결과, 제2 이미지(420a)는 샘플 내의 제2 형광단의 존재와 관련된 초점이 맞는 내용물(425a)을 포함한다. 제1 이미지(410a)로부터 아티팩트를 제거하기 위해 제2 이미지(420a)의 일부를 제1 이미지(410a)로부터 제거하였다. 특히, 제2 이미지는 α%로 크기 조정되어 제1 이미지(410a)로부터 감산되었다. 그러나, 이미지(410a, 420a)를 획득하는 데 사용된 이미저의 색수차로 인해, 결과적으로 생성된 보정된 이미지(430a)는 수정된 아티팩트(435a)를 포함한다.
색수차의 영향을 보상하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 4a의 제1 이미지(410a)로부터 아티팩트를 제거하기 위해, 제2 형광단에 대한 여기 광으로 샘플을 조명하는 동안 제1 이미지(410a)를 획득하는 데 사용된 제1 초점 설정에서 취해진 샘플의 추가 이미지를 샘플에서 취할 수 있다. 제1 이미지(410a)를 획득하는 데 사용된 것과 동일한 초점 설정에서 취해진 이러한 이미지는 제1 이미지(410a)에 존재하는 제2 형광단 광과 동일한 정도로 흐려진 제2 형광단 광을 포함할 수 있다. 따라서, 추가 이미지는 제1 이미지(410a)로부터 추가 이미지의 일부를 제거함으로써 제1 형광단의 개선된 제1 이미지를 생성하는 데 사용될 수 있다.
이것은 제1 이미지(410a)를 도시하는 도 4b에 예시되어 있다. 제1 이미지(410a)는 전술한 바와 같이, 제1 형광단의 제1 여기 파장에서 샘플을 조명하고, 제1 형광단의 방출 파장의 광을 초점을 맞춰 이미지화하도록 제1 초점 설정(예를 들어, 제1 이미저-샘플 거리)에서 응답으로 방출된 광을 이미지화함으로써 획득된다. 이미지 채널 간의 혼선으로 인해, 제1 이미지(410a)는 샘플 내의 제2 형광단의 존재와 관련된 아티팩트(415a)를 포함한다. 색수차로 인해, 제2 형광단 아티팩트(415a)는 초점이 맞지 않는다.
제3 이미지(420b)는 제2 형광단의 제2 여기 파장에서 샘플을 조명하고, 제1 이미지(410a)를 획득하는 데 사용된 것과 동일한 제1 초점 설정에서 응답으로 방출된 광을 이미지화함으로써 획득된다. 그 결과 제3 이미지(420b)는 샘플 내 제2 형광단의 존재와 관련된 초점이 벗어난 내용물(425b)을 포함한다. 동일한 초점 설정이 제1 이미지(410a) 및 제3 이미지(420b)를 획득하는 데 사용되었기 때문에, 제3 이미지(420b)의 제2 형광단 내용물(425b)은 제1 이미지(410a)의 아티팩트(415a)와 동일한 방식으로 흐려진다. 그 결과 제1 이미지(410a)로부터 제3 이미지(420b)의 일부를 제거함으로써 제1 이미지(410a)로부터의 아티팩트를 제거하여, 제2 형광단 아티팩트의 존재와 관련하여, 도 4a의 보정된 이미지(430a)에 비해 개선된 제2 보정된 이미지(430b)를 생성할 수 있다.
전술한 바와 같이, 적절한 초점 설정에서 샘플을 재이미지화함으로써 추가적인 아티팩트-보정 이미지를 획득할 수 있다. 따라서, 제1 형광단에서 방출되는 광의 파장에 적합한 제1 초점 설정에서 취해진 제1 형광단의 제1 이미지를 보정하기 위해, 샘플 내 다른 형광단의 추가 이미지 세트를 제1 초점 설정을 사용하여 취할 수 있다. 그런 다음, 예를 들어, 다양한 이미지 채널 간의 혼선 정도를 나타내는 혼선 인자와 관련된 가중치를 갖는 가중 조합에 따라 제1 이미지와 추가 이미지를 결합함으로써 제1 형광단의 보정된 이미지를 생성할 수 있다.
그러나, 이러한 접근 방식은 추가 이미지를 취할 것을 요구한다. 이는 샘플을 이미지화하는 데 추가 시간을 필요로 할 뿐만 아니라 샘플을 이미지화하기 위해 샘플에 추가 조명을 제공하는 광표백 또는 기타 원치 않는 효과의 양을 증가시킬 수 있다. 이러한 효과는 필요한 총 이미지 수가 이미지 채널 수의 제곱에 비례하므로 수많은 형광 이미지 채널이 필요한 경우 특히 클 수 있다. 대안으로, 이러한 이미지를 시뮬레이션할 수 있다. 예를 들어, 제3 이미지(420b)는 제1 초점 설정의 사용을 시뮬레이션함으로써 제2 이미지(420a)로부터 획득될 수 있다. 대안적인 초점 설정을 시뮬레이션하면 이미저를 사용하여 추가 이미지를 취할 필요가 없어서 시간을 절약하고 광표백 효과를 줄이거나 기타 이점을 제공할 수 있는 이점이 있다.
이러한 시뮬레이션은 제1 이미지(410a) 및 제2 이미지(420a)를 획득하는 데 사용된 이미저의 모델을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 시뮬레이션은 가우시안 커널 또는 필터를 제2 이미지(420a)에 적용하거나 또는 제2 이미지(420a)에 일부 다른 흐리게 하는 작업을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 이미지를 흐리게 하는 데 사용되는 가우시안 또는 기타 흐리게 하는 커널은 이미지(410a, 420b)를 획득하는 데 사용되는 이미저의 속성으로부터 이론적으로 또는 실험적으로 결정된 폭 또는 기타 파라미터를 가질 수 있다. 예를 들어, 비-등각 가우시안은 제2 이미지(420a)를 흐리게 하는 데 사용될 수 있다. 비-등각 가우시안의 방향, 주축의 폭 및 부축의 폭은 제1 초점 설정에 따라 이미지화될 때 제2 형광단에서 방출되는 광에 대해 이미저의 광학 효과를 모방하도록 지정될 수 있다. 전체 이미지를 흐리게 하는 데 사용되는 단일 가우시안 또는 기타 흐리게 하는 기능 또는 이러한 흐리게 하는 기능의 속성은 (예를 들어, 이미지를 얻는 데 사용되는 이미저의 광학 속성을 보다 정확하게 시뮬레이션하기 위해) 이미지 내의 위치에 따라 변할 수 있다.
IV.
예시적인 시스템
자동화된 이미지화 시스템은 시간에 따라 복수의 다른 스캔 기간 동안 샘플 용기의 각각의 웰(well)에서 복수의 생물학적 샘플의 이미지(예를 들어, 형광 활성 이미지)를 자동화된 방식으로 획득하는 데 사용될 수 있다. 자동화된 이미지화 시스템에 의해 각각의 스캔 기간 동안 각 샘플에 대해 이미지 세트를 취할 수 있고, 예를 들어, 이미지 세트는 3분 스캔 기간 동안 초당 3개의 이미지 속도로 취해질 수 있다. 그런 다음 이미지는 예를 들어, 본 명세서에 설명된 방법에 따라, 샘플에 대한 일부 정보를 결정하기 위해 분석될 수 있다. 이미지 채널 간의 혼선이 이러한 아티팩트를 유발할 때 샘플의 형광단 또는 다른 내용물의 개선되고 감소된 아티팩트 이미지의 생성을 용이하게 하기 위해 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 예를 들어, 각기 다른 초점 거리와 여기 광 파장에서 이미지를 취할 수 있다.
이러한 자동화된 이미지화 시스템을 사용하면 수동 이미지화에 비해 생성된 이미지의 타이밍, 위치 및 이미지 파라미터와 관련하여 일관성을 증가시킬 뿐만 아니라 생물학적 샘플을 이미지화하는 인건비를 크게 줄일 수 있다. 또한, 이러한 자동화된 이미지화 시스템은 인큐베이터 내에서 동작하도록 구성될 수 있어서 이미지화를 위해 인큐베이터로부터 샘플을 제거할 필요가 없다. 따라서, 샘플의 성장 환경을 보다 일관되게 유지할 수 있다. 추가적으로, 자동화된 이미지화 시스템이 (예를 들어, 정지 이미지화 장치로 이미지화할 샘플 용기를 이동시키는 것이 아니라) 샘플 용기에 대해 현미경 또는 기타 이미지화 장치를 이동시키는 역할을 하는 경우 샘플의 이동 관련 교란을 감소시킬 수 있다. 이것은 샘플의 성장과 발달을 개선하고 움직임과 관련된 혼란을 줄일 수 있다.
이러한 자동화된 이미지화 시스템은 스캔 동안 24시간 초과, 3일 초과, 30일 초과, 또는 더 긴 일정 시간 기간으로 분리된 하나 이상의 이미지를 획득하도록 동작할 수 있다. 스캔은 지정된 속도로, 예를 들어, 하루에 한번, 하루에 한번 초과, 하루에 두 번 초과, 또는 하루에 세 번 초과하여 발생하도록 지정될 수 있다. 스캔은 적어도 2번, 적어도 3번 또는 더 많은 일정 수의 스캔이 24시간 내에 발생하도록 지정될 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 스캔에서 얻은 데이터를 (예를 들어, 본 명세서에 설명된 방법에 따라) 분석하고 이 데이터를 사용하여 추가 스캔의 타이밍을 결정할 수 있다(예를 들어, 샘플 내에서 발생할 것으로 예측되는 개별 이벤트의 발생을 검출하기 위해 스캔의 속도, 지속 시간, 이미지 캡처 속도 또는 일부 다른 속성을 증가시시킬 수 있다).
이러한 자동화된 이미지화 시스템을 사용하면 장기간에 걸쳐 다수의 시점에서 동일한 생물학적 샘플의 이미지화를 용이하게 할 수 있다. 따라서, 개별 세포 및/또는 세포 네트워크의 발달 및/또는 거동을 시간에 따라 분석할 수 있다. 예를 들어, 세포 세트, 세포의 일부 또는 기타 활성 객체(active object)를 단일 샘플 내에서, 다른 넓은 간격의 시간 기간 동안 수행된 스캔 내에서 식별할 수 있다. 그런 다음 스캔 동안 동일한 활성 객체(들)를 식별하기 위해 이들 식별된 객체 세트를 스캔 간에 비교할 수 있다. 따라서, 개별 세포 또는 세포 일부의 거동을 시간별로, 일별로, 주별로 또는 월별로 추적하고 분석할 수 있다.
도 5는 이러한 자동화된 이미지화 시스템(500)의 요소들을 도시한다. 자동화된 이미지화 시스템(500)은 자동화된 이미지화 시스템(500)의 다른 요소들이 부착되는 프레임(510)을 포함한다. 프레임(510)은 인큐베이터 내에 맞도록 구성(예를 들어, 크기 조정)될 수 있다. 자동화된 이미지화 시스템(500)은 프레임(510)에 결합된 샘플 용기 트레이(530) 내에 제거 가능하게 배치된 샘플 용기(520)를 포함한다. 샘플 용기 트레이(530)는 제거 가능하고/하거나 제거 가능한 삽입물을 포함하여 다양한 다른 샘플 용기(예를 들어, 다양한 산업 표준 샘플 용기)를 쉽게 잡을 수 있다. 시스템(500)은 이미지화 장치(540)가 샘플 용기(520)(예를 들어, 예시적인 웰(525))의 개별 웰의 내용물의 이미지를 획득하도록 동작할 수 있도록 샘플 용기(520)에 대해 이미지화 장치(540)를 위치시키도록 구성된 작동 갠트리(550)를 추가로 포함한다.
이미지화 장치(540)는 현미경, 형광 이미저, 2광자 이미지화 시스템, 위상차 이미지화 시스템, 하나 이상의 조명 소스, 하나 이상의 광학 필터, 및/또는 샘플 용기(520) 내에 포함된 샘플을 용이하게 이미지화하도록 구성된 기타 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 이미지화 장치(540)는 샘플 용기(520)의 양측에 배치된 요소(예를 들어, 생물학적 샘플을 용이하게 위상차 이미지화하기 위해 간섭성, 편광성, 단색성 또는 달리 지정된 조명 광의 조명 소스)를 포함한다. 이러한 예에서, 샘플 용기(520)의 양측에 있는 요소는 각기 다른 갠트리에, 동일한 갠트리에 결합될 수 있으며, 및/또는 샘플 용기(520)의 일측에 있는 요소는 샘플 용기(520)에 대해 이동하지 못할 수 있다.
작동 갠트리(550)는, 프레임(510) 및 이미지화 장치(540)에 결합되고, 샘플 용기(520) 내에서 복수의 다른 샘플을 용이하게 이미지화하기 위해 샘플 용기(520)에 대해 적어도 두 개의 방향으로 장치(540)의 위치를 제어하도록 구성된다. 작동 갠트리(550)는 또한, 샘플 용기(520)를 향하거나 샘플 용기로부터 멀어지는 제3 방향으로 이미지화 장치(540)의 위치를 제어하여 이미지화 장치(540)를 사용하여 획득된 이미지의 초점을 용이하게 제어하고/하거나 이미지화 장치(540)를 사용하여 이미지화될 수 있는 샘플 용기(520) 내의 재료의 깊이를 제어하도록 구성될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 이미지화 장치(540)는 이미지화 장치(540)의 초점 거리를 제어하기 위해 하나 이상의 액추에이터를 포함할 수 있다. 이미지화 장치(540)는 하나 이상의 모터, 압전 요소, 액체 렌즈, 또는 이미지화 장치(540)의 초점 설정을 용이하게 제어하기 위한 다른 액추에이터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이미지화 장치(540)는 이미지화 장치(540)와 이미지화되는 샘플 사이의 거리를 제어하도록 구성된 액추에이터를 포함할 수 있다. 이것은 이미지를 초점을 맞춰 취하는 것을 보장하기 위해 및/또는 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 이미지 보정 방법을 용이하게 하기 위해 다양한 다른 초점 설정에서 이미지를 취할 수 있도록 수행될 수 있다.
작동 갠트리(550)는 샘플 용기(520)에 대해 (예를 들어, 샘플 용기(520)의 특정 웰(들)에 대해) 이미지화 장치(540)의 절대 위치 및/또는 상대 위치를 용이하게 검출하도록 구성된 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 작동 갠트리(550)는 인코더, 제한 스위치, 및/또는 다른 위치 감지 요소를 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 이미지화 장치(540) 또는 시스템의 다른 요소는 샘플 용기(520)에 대한 이미지화 장치(540)의 절대 위치 및/또는 상대 위치를 결정하기 위해 샘플 용기(520) 및/또는 샘플 용기 트레이(530)의 기준 마크 또는 기타 특징을 검출하도록 구성될 수 있다.
계산 기능(예를 들어, 작동 갠트리(550) 및/또는 이미지화 장치(540)를 동작시켜 지정된 시간 기간 동안 샘플 용기(520) 내의 샘플을 이미지화하고, 거리 이미지를 생성하고/하거나 본 명세서에 설명된 일부 다른 방법을 수행하는 기능)은 하나 이상의 컴퓨팅 시스템에 의해 수행될 수 있다. 이러한 컴퓨팅 시스템은 자동화된 이미지화 시스템(예를 들어, 500)에 통합될 수 있고, (예를 들어, 직접 유선 또는 무선 연결을 통해, 로컬 네트워크를 통해, 및/또는 인터넷을 통한 보안 연결을 통해 연결됨으로써) 이러한 자동화된 이미지화 시스템과 연관될 수 있고/있거나, 일부 다른 형태(예를 들어, 자동화된 이미지화 시스템과 통신하고/하거나 생물학적 샘플의 이미지 저장소에 액세스할 수 있는 클라우드 컴퓨팅 시스템)를 취할 수 있다. 이러한 컴퓨팅 시스템은 통신 인터페이스, 사용자 인터페이스, 프로세서 및 데이터 저장 매체를 포함할 수 있으며, 이들 모두는 시스템 버스, 네트워크 또는 기타 연결 메커니즘에 의해 함께 통신 가능하게 연결될 수 있다.
통신 인터페이스는 컴퓨팅 시스템이 전기, 자기, 전자기, 광학 또는 기타 신호의 아날로그 또는 디지털 변조를 사용하여 다른 디바이스, 액세스 네트워크, 및/또는 전송 네트워크와 통신할 수 있도록 기능할 수 있다. 따라서, 통신 인터페이스는 평범한 구 전화 서비스(Plain Old Telephone Service: POTS) 통신 및/또는 인터넷 프로토콜(IP) 또는 기타 패킷화된 통신과 같은 회선 교환 및/또는 패킷 교환 통신을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 통신 인터페이스는 무선 액세스 네트워크 또는 액세스 포인트와의 무선 통신을 위해 배열된 칩셋 및 안테나를 포함할 수 있다. 또한, 통신 인터페이스는 이더넷, 범용 직렬 버스(Universal Serial Bus: USB) 또는 고선명 멀티미디어 인터페이스(High-Definition Multimedia Interface: HDMI) 포트와 같은 유선 인터페이스의 형태를 취하거나 이를 포함할 수 있다. 통신 인터페이스는 또한 WiFi, 블루투스(BLUETOOTH)
, 지구 위치 시스템(Global Positioning System: GPS) 또는 광역 무선 인터페이스(예를 들어, WiMAX 또는 3GPP LTE(Long-Term Evolution))와 같은 무선 인터페이스의 형태를 취하거나 이를 포함할 수 있다. 그러나, 다른 형태의 물리 계층 인터페이스 및 기타 유형의 표준 또는 독점 통신 프로토콜이 통신 인터페이스를 통해 사용될 수 있다. 더욱이, 통신 인터페이스는 다수의 물리적 통신 인터페이스(예를 들어, WiFi 인터페이스, 블루투스
인터페이스 및 광역 무선 인터페이스)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 통신 인터페이스는 컴퓨팅 시스템이 다른 디바이스, 원격 서버, 액세스 네트워크 및/또는 전송 네트워크와 통신할 수 있도록 기능할 수 있다. 예를 들어, 통신 인터페이스는 생물학적 샘플(예를 들어, 형광 활성 이미지)의 이미지 표시를 전송 및/또는 수신하고, 거리 이미지의 표시, 이러한 이미지 내의 활성 객체의 위치 세트, 및/또는 본 명세서에 설명된 방법을 사용하여 이러한 이미지로부터 생성된 활성 객체로부터 결정된 시변 활동 추적 또는 일부 다른 정보를 전송하는 기능을 할 수 있다.
이러한 컴퓨팅 시스템의 사용자 인터페이스는 컴퓨팅 시스템이 사용자와 상호 작용할 수 있도록 하는, 예를 들어, 사용자로부터 입력을 수신하고 및/또는 사용자에게 출력을 제공할 수 있도록 하는 기능을 할 수 있다. 따라서, 사용자 인터페이스는 키패드, 키보드, 터치 감지 또는 존재 감지 패널, 컴퓨터 마우스, 트랙볼, 조이스틱, 마이크로폰 등과 같은 입력 구성 요소를 포함할 수 있다. 사용자 인터페이스는 또한 예를 들어 존재 감지 패널과 결합될 수 있는 디스플레이 스크린과 같은 하나 이상의 출력 구성 요소를 포함할 수 있다. 디스플레이 스크린은 CRT, LCD 및/또는 LED 기술, 또는 현재 알려졌거나 나중에 개발될 기타 기술에 기초할 수 있다. 사용자 인터페이스는 또한 스피커, 스피커 잭, 오디오 출력 포트, 오디오 출력 디바이스, 이어폰 및/또는 기타 유사한 디바이스를 통해 가청 출력(들)을 생성하도록 구성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 사용자 인터페이스는 비디오 또는 다른 이미지(예를 들어, 특정 생물학적 샘플의 특정 스캔 동안 생성된 이미지의 비디오)를 사용자에게 제공하는 역할을 하는 디스플레이를 포함할 수 있다. 추가적으로, 사용자 인터페이스는 컴퓨팅 디바이스의 구성 및 동작을 용이하게 하는 하나 이상의 버튼, 스위치, 노브, 및/또는 다이얼을 포함할 수 있다. 이러한 버튼, 스위치, 노브 및/또는 다이얼 중 일부 또는 전부는 터치 감지 또는 존재 감지 패널의 기능으로 구현될 수 있다. 사용자 인터페이스는 사용자가 자동화된 이미지화 시스템에 포함된 샘플 유형을 지정하거나, 샘플을 이미지화하기 위한 스케줄을 지정하거나, 시스템에서 수행할 이미지 분할 및/또는 분석 파라미터를 지정하거나, 또는 자동화된 이미지화 시스템을 동작시키기 위한 일부 다른 명령 또는 파라미터를 입력할 수 있도록 할 수 있다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법의 일부는 응용 분야에 따라 다른 디바이스에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 시스템의 다른 디바이스는 디바이스 간의 통신을 위해 다른 양의 계산 자원(예를 들어, 메모리, 프로세서 사이클) 및 다른 정보 대역폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 디바이스는 작동 갠트리, 이미지화 장치 또는 다른 요소를 동작시켜 다양한 초점 설정 및/또는 여기 광 파장에 따라 복수의 다른 스캔 기간 동안 생물학적 샘플의 이미지를 생성할 수 있는 임베디드 프로세서(들)일 수 있다. 그런 다음 제2 디바이스는 제1 디바이스로부터 이미지 정보를 제1 디바이스로부터 (예를 들어, 인터넷을 통해, 전용 유선 링크를 통해) 수신하고, 수신된 이미지 데이터에 본 명세서에 설명된 이미지 처리 및 분석 방법을 수행할 수 있다. 본 명세서에 설명된 방법의 다른 부분은 이러한 고려 사항에 따라 할당될 수 있다.
V.
예시적인 방법
도 6은 다른 형광단에 대한 이미지 채널 사이에 혼선이 있을 때 다른 형광단(또는 샘플 내 기타 관심 물질)에서 취해진 이미지를 보정하는 방법(600)의 흐름도이다. 방법은 색수차를 나타내는 이미지를 획득하는 데 사용되는 이미저(예를 들어, 현미경)에 유용할 수 있다.
방법(600)은 제1 시간 기간 동안 제1 여기 파장의 광으로 샘플을 조명하는 단계(610)를 포함한다. 방법(600)은 제1 시간 기간 동안 제1 초점 설정에 따라 이미저를 동작시켜 제1 방출 파장의 광을 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 샘플의 제1 이미지를 획득하는 단계(620)를 추가로 포함한다. 이것은 액추에이터(예를 들어, 이미저의 액추에이터, 이미저의 위치를 제어하도록 구성된 갠트리의 액추에이터)를 동작시켜 이미저와 샘플 사이의 거리를 제1 초점 설정에 대응하는 제1 거리로 설정하는 것을 포함할 수 있다.
방법(600)은 제2 시간 기간 동안 제2 여기 파장의 광으로 샘플을 조명하는 단계(630)를 추가로 포함한다. 방법(600)은 제2 시간 기간 동안 제2 초점 설정에 따라 이미저를 동작시켜 제2 방출 파장의 광을 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 샘플의 제2 이미지를 획득하는 단계(640)를 더 포함하고, 여기서 제2 초점 설정은 제1 초점 설정과 다르다. 이것은 액추에이터를 동작시켜 이미저와 샘플 사이의 거리를, 제1 거리와 다르고 제2 초점 설정에 대응하는 제2 거리로 설정하는 것을 포함할 수 있다.
방법(600)은 샘플의 제3 이미지를 획득하는 단계(650)를 더 포함하고, 여기서 제3 이미지는, 제1 초점 설정에 따라 이미지화되고 제2 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 제2 방출 파장의 샘플을 나타낸다. 이것은 제3 시간 기간 동안 제2 여기 파장의 광으로 샘플을 조명하고, 제1 초점 설정에 따라 이미저를 동작시켜 샘플의 제3 이미지를 획득하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제3 이미지는, 제2 이미지에 기초하여, 예를 들어, 제2 이미지를 흐리게 함으로써 또는 제2 이미지에 일부 다른 이미지 처리를 적용함으로써 제1 초점 설정의 효과를 시뮬레이션함으로써 획득될 수 있다.
방법(600)은 제1 이미지로부터 제3 이미지의 일부를 제거함으로써 샘플의 개선된 제1 이미지를 생성하는 단계(660)를 추가로 포함한다. 이것은 제1 이미지로부터 제2 이미지의 크기 조정된 버전을 감산하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 개선된 제1 이미지를 생성하는 단계는 각기 다른 여기 파장에서 추가 형광단(또는 샘플 내에 다른 관심 내용물)에 대해 제1 초점 설정에 따라 획득된 제1 이미지, 제3 이미지 및 다수의 추가 이미지의 조합(예를 들어, 가중 선형 조합)을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
방법(600)은 추가적인 요소 또는 특징을 포함할 수 있다.
VI.
결론
앞서 설명된 상세한 설명은 첨부 도면을 참조하여 개시된 시스템, 디바이스 및 방법의 다양한 특징 및 기능을 설명한다. 도면에서, 유사한 기호는 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 일반적으로 유사한 구성 요소를 식별한다. 상세한 설명, 도면 및 청구범위에 설명된 예시적인 실시형태는 본 발명을 제한하는 것으로 의도된 것이 아니다. 본 명세서에 제시된 주제의 범위를 벗어나지 않으면서, 다른 실시형태가 이용될 수 있고, 다른 변경이 이루어질 수 있다. 본 명세서에 일반적으로 설명되고 도면에 예시된 본 발명의 양태는 매우 다양한 다른 구성으로 배열, 대체, 결합, 분리 및 설계될 수 있으며, 이들 모두는 본 명세서에서 명시적으로 고려되는 것으로 쉽게 이해된다.
본 명세서에서 논의되고 도면에 도시된 메시지 흐름도, 시나리오 및 흐름도 중 일부 또는 전부와 관련하여, 각 단계, 블록 및/또는 통신은 예시적인 실시형태에 따라 정보의 처리 및/또는 정보의 전송을 나타낼 수 있다. 대안적인 실시형태는 이러한 예시적인 실시형태의 범위 내에 포함된다. 이러한 대안적인 실시형태에서, 예를 들어, 단계, 블록, 전송, 통신, 요청, 응답 및/또는 메시지로 설명된 기능은 도시되거나 논의된 순서와 다르게 실행될 수 있고, 관련된 기능에 따라 예를 들어 실질적으로 동시에 또는 역순으로 실행될 수 있다. 또한 더 많거나 더 적은 단계, 블록 및/또는 기능은 본 명세서에서 논의된 메시지 흐름도, 시나리오 및 순서도 중 임의의 것과 함께 사용될 수 있고, 이러한 메시지 흐름도, 시나리오 및 순서도는 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합될 수 있다.
정보의 처리를 나타내는 단계 또는 블록은 본 명세서에 설명된 방법 또는 기술의 특정 논리 기능을 수행하도록 구성될 수 있는 회로부에 대응할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 정보의 처리를 나타내는 단계 또는 블록은 모듈, 세그먼트 또는 프로그램 코드(관련 데이터를 포함함)의 일부에 대응할 수 있다. 프로그램 코드는 방법 또는 기술에서 특정 논리적 기능 또는 동작을 구현하기 위해 프로세서에 의해 실행 가능한 하나 이상의 명령어를 포함할 수 있다. 프로그램 코드 및/또는 관련 데이터는 디스크 드라이브, 하드 드라이브 또는 기타 저장 매체를 포함하는 저장 디바이스와 같은 임의의 유형의 컴퓨터 판독 가능 매체에 저장될 수 있다.
컴퓨터 판독 가능 매체는 또한 레지스터 메모리, 프로세서 캐시, 및/또는 랜덤 액세스 메모리(RAM)와 같은 단기간 동안 데이터를 저장하는 컴퓨터 판독 가능 매체와 같은 비-일시적인 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함할 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 매체는 또한 예를 들어, 판독 전용 메모리(ROM), 광 디스크 또는 자기 디스크 및/또는 컴팩트 디스크 판독 전용 메모리(CD-ROM)와 같은 보조 또는 영구적인 장기 저장 매체와 같은, 장기간 동안 프로그램 코드 및/또는 데이터를 저장하는 비-일시적인 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함할 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 매체는 또한 임의의 다른 휘발성 또는 비휘발성 저장 시스템일 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 매체는 예를 들어 컴퓨터 판독 가능 저장 매체 또는 유형적인 저장 디바이스로 간주될 수 있다.
더욱이, 하나 이상의 정보 전송을 나타내는 단계 또는 블록은 동일한 물리적 디바이스의 소프트웨어 및/또는 하드웨어 모듈 사이의 정보 전송에 대응할 수 있다. 그러나, 다른 정보 전송이 다른 물리적 디바이스의 소프트웨어 모듈 및/또는 하드웨어 모듈 간에 이루어질 수 있다.
다양한 양태 및 실시형태가 본 명세서에 개시되었지만, 다른 양태 및 실시형태는 이 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다. 본 명세서에 개시된 다양한 양태 및 실시형태는 예시를 위한 것일 뿐, 본 발명을 제한하는 것으로 의도된 것이 아니고, 진정한 범위는 다음 청구범위에 의해 제시된다.
Claims (20)
- 방법으로서,
제1 시간 기간 동안 제1 여기 파장의 광으로 샘플을 조명하는 단계;
상기 제1 시간 기간 동안, 제1 초점 설정에 따라 이미저(imager)를 동작시켜 제1 방출 파장의 광을 상기 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 상기 샘플의 제1 이미지를 획득하는 단계;
제2 시간 기간 동안 제2 여기 파장의 광으로 상기 샘플을 조명하는 단계;
상기 제2 시간 기간 동안, 제2 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시켜 제2 방출 파장의 광을 상기 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 상기 샘플의 제2 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제2 초점 설정은 상기 제1 초점 설정과 다른, 상기 제2 이미지를 획득하는 단계;
상기 샘플의 제3 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제3 이미지는, 상기 제1 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제2 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제2 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제3 이미지를 획득하는 단계; 및
상기 제1 이미지로부터 상기 제3 이미지의 일부를 제거함으로써 상기 샘플의 개선된 제1 이미지를 생성하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 샘플의 제3 이미지를 획득하는 단계는,
제3 시간 기간 동안 상기 제2 여기 파장의 광으로 상기 샘플을 조명하는 단계; 및
상기 제3 시간 기간 동안, 상기 제1 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시켜 상기 샘플의 제3 이미지를 획득하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 샘플의 제3 이미지를 획득하는 단계는 상기 샘플의 제2 이미지의 사본을 수정하여 상기 이미저의 동작을 시뮬레이션하여 상기 제1 초점 설정에 따라 상기 제3 이미지를 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 샘플의 제2 이미지의 사본을 수정하는 것은 상기 샘플의 제2 이미지를 흐리게 하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 특정 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시키는 것은 상기 이미저의 구성 요소와 상기 샘플 사이의 거리를 조정하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 복수의 세포를 포함하는 생물학적 샘플인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 형광단을 상기 샘플에 도입하는 단계를 더 포함하고, 상기 제1 형광단은 상기 제1 여기 파장에 대응하는 여기 파장을 갖고, 상기 제1 방출 파장에 대응하는 방출 파장을 갖고, 상기 제2 형광단은 상기 제2 여기 파장에 대응하는 여기 파장을 갖고, 상기 제2 방출 파장에 대응하는 방출 파장을 갖는, 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플의 제4 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제4 이미지는, 상기 제2 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제1 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제1 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제4 이미지를 획득하는 단계; 및
상기 제2 이미지와 상기 제4 이미지의 가중 조합을 생성함으로써 상기 샘플의 개선된 제2 이미지를 생성하는 단계
를 더 포함하고;
상기 샘플의 개선된 제1 이미지를 생성하는 단계는 상기 제1 이미지와 상기 제3 이미지의 가중 조합을 생성하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
제3 시간 기간 동안 제3 여기 파장의 광으로 상기 샘플을 조명하는 단계;
상기 제3 시간 기간 동안, 제3 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시켜 제3 방출 파장의 광을 상기 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 상기 샘플의 제4 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제3 초점 설정은 상기 제1 초점 설정 및 상기 제2 초점 설정과 다른, 상기 제4 이미지를 획득하는 단계;
상기 샘플의 제5 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제5 이미지는, 상기 제2 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제3 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제3 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제5 이미지를 획득하는 단계;
상기 제2 이미지로부터 상기 제5 이미지의 일부를 제거함으로써 상기 샘플의 개선된 제2 이미지를 생성하는 단계; 및
상기 샘플의 제6 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제6 이미지는, 상기 제1 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제3 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제3 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제6 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하고,
상기 샘플의 개선된 제1 이미지를 생성하는 단계는 상기 제6 이미지의 일부를 상기 제1 이미지에 포함하는 단계
를 더 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
제3 시간 기간 동안 제3 여기 파장의 광으로 상기 샘플을 조명하는 단계;
상기 제3 시간 기간 동안, 제3 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시켜 제3 방출 파장의 광을 상기 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 상기 샘플의 제4 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제3 초점 설정은 상기 제1 초점 설정 및 상기 제2 초점 설정과 다른, 상기 제4 이미지를 획득하는 단계;
상기 샘플의 개선된 제4 이미지를 생성하는 단계로서,
상기 샘플의 제5 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제5 이미지는, 상기 제3 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제1 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제1 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제5 이미지를 획득하는 단계;
상기 샘플의 제6 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제6 이미지는, 상기 제3 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제2 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제2 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제6 이미지를 획득하는 단계; 및
상기 제4 이미지, 상기 제5 이미지 및 상기 제6 이미지의 가중 조합을 생성하는 단계
에 의해 상기 샘플의 개선된 제4 이미지를 생성하는 단계;
상기 샘플의 개선된 제2 이미지를 생성하는 단계로서,
상기 샘플의 제7 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제7 이미지는, 상기 제2 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제1 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제1 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제7 이미지를 획득하는 단계;
상기 샘플의 제8 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제8 이미지는, 상기 제2 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제3 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제3 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제8 이미지를 획득하는 단계; 및
상기 제2 이미지, 상기 제7 이미지 및 상기 제8 이미지의 가중 조합을 생성하는 단계
에 의해 상기 샘플의 개선된 제2 이미지를 생성하는 단계
를 더 포함하고;
상기 샘플의 개선된 제1 이미지를 생성하는 단계는,
상기 샘플의 제9 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제9 이미지는, 상기 제1 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제3 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제3 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제9 이미지를 획득하는 단계; 및
상기 제1 이미지, 상기 제3 이미지 및 상기 제9 이미지의 가중 조합을 생성하는 단계
를 포함하는, 방법. - 시스템으로서,
광원;
이미저; 및
제어기
를 포함하되, 상기 제어기는 하나 이상의 프로세서를 포함하고, 상기 제어기는,
제1 시간 기간 동안 상기 광원을 동작시켜 제1 여기 파장의 광으로 샘플을 조명하는 단계;
상기 제1 시간 기간 동안 제1 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시켜 제1 방출 파장의 광을 상기 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 상기 샘플의 제1 이미지를 획득하는 단계;
제2 시간 기간 동안 상기 광원을 동작시켜 제2 여기 파장의 광으로 상기 샘플을 조명하는 단계;
상기 제2 시간 기간 동안 제2 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시켜 제2 방출 파장의 광을 상기 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 상기 샘플의 제2 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제2 초점 설정은 상기 제1 초점 설정과 다른, 상기 제2 이미지를 획득하는 단계;
상기 샘플의 제3 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제3 이미지는, 상기 제1 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제2 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제2 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제3 이미지를 획득하는 단계; 및
상기 제1 이미지로부터 상기 제3 이미지의 일부를 제거함으로써 상기 샘플의 개선된 제1 이미지를 생성하는 단계
를 포함하는 제어기 동작을 수행하도록 프로그래밍된, 시스템. - 제11항에 있어서, 상기 샘플의 제3 이미지를 획득하는 단계는,
제3 시간 기간 동안 상기 광원을 동작하여 상기 제2 여기 파장의 광으로 상기 샘플을 조명하는 단계; 및
상기 제3 시간 기간 동안 상기 제1 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시켜 상기 샘플의 제3 이미지를 획득하는 단계
를 포함하는, 시스템. - 제11항에 있어서, 상기 샘플의 제3 이미지를 획득하는 단계는 상기 샘플의 제2 이미지의 사본을 수정하여 상기 이미저의 동작을 시뮬레이션하여 상기 제1 초점 설정에 따라 상기 제3 이미지를 획득하는 단계를 포함하는, 시스템.
- 제13항에 있어서, 상기 샘플의 제2 이미지의 사본을 수정하는 것은 상기 샘플의 제2 이미지를 흐리게 하는 것을 포함하는, 시스템.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이미저에 기계적으로 결합된 액추에이터를 더 포함하고, 특정 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시키는 것은 상기 액추에이터를 동작시켜 상기 이미저의 구성 요소와 상기 샘플 사이의 거리를 조정하는 것을 포함하는, 시스템. - 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 복수의 세포를 포함하는 생물학적 샘플인, 시스템.
- 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어기 동작은,
상기 샘플의 제4 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제4 이미지는, 상기 제2 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제1 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제1 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제4 이미지를 획득하는 단계; 및
상기 제2 이미지와 상기 제4 이미지의 가중 조합을 생성함으로써 상기 샘플의 개선된 제2 이미지를 생성하는 단계
를 더 포함하고;
상기 샘플의 개선된 제1 이미지를 생성하는 단계는 상기 제1 이미지와 상기 제3 이미지의 가중 조합을 생성하는 단계를 포함하는, 시스템. - 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어기 동작은,
제3 시간 기간 동안 상기 광원을 동작시켜 제3 여기 파장의 광으로 상기 샘플을 조명하는 단계;
상기 제3 시간 기간 동안 제3 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시켜 제3 방출 파장의 광을 상기 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 상기 샘플의 제4 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제3 초점 설정은 상기 제1 초점 설정 및 제2 초점 설정과 다른, 상기 제4 이미지를 획득하는 단계;
상기 샘플의 제5 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제5 이미지는, 상기 제2 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제3 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제3 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제5 이미지를 획득하는 단계;
상기 제2 이미지로부터 상기 제5 이미지의 일부를 제거함으로써 상기 샘플의 개선된 제2 이미지를 생성하는 단계; 및
상기 샘플의 제6 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제6 이미지는, 상기 제1 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제3 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제3 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제6 이미지를 획득하는 단계
를 더 포함하고;
상기 샘플의 개선된 제1 이미지를 생성하는 단계는 상기 제6 이미지의 일부를 상기 제1 이미지에 포함시키는 단계를 더 포함하는, 시스템. - 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어기 동작은,
제3 시간 기간 동안 제3 여기 파장의 광으로 상기 샘플을 조명하는 단계;
상기 제3 시간 기간 동안 제3 초점 설정에 따라 상기 이미저를 동작시켜 제3 방출 파장의 광을 상기 이미저에 의해 초점을 맞춰 이미지화하여 상기 샘플의 제4 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제3 초점 설정은 상기 제1 초점 설정 및 상기 제2 초점 설정과 다른, 상기 제4 이미지를 획득하는 단계;
상기 샘플의 개선된 제4 이미지를 생성하는 단계로서,
상기 샘플의 제5 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제5 이미지는, 상기 제3 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제1 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제1 방출 파장의 광을 나타내는, 상기 제5 이미지를 획득하는 단계;
상기 샘플의 제6 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제6 이미지는, 상기 제3 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제2 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제2 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제6 이미지를 획득하는 단계; 및
상기 제4 이미지, 상기 제5 이미지 및 상기 제6 이미지의 가중 조합을 생성하는 단계
에 의해 상기 샘플의 개선된 제4 이미지를 생성하는 단계;
상기 샘플의 개선된 제2 이미지를 획득하는 단계로서,
상기 샘플의 제7 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제7 이미지는, 상기 제2 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제1 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제1 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제7 이미지를 획득하는 단계;
상기 샘플의 제8 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제8 이미지는, 상기 제2 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제3 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제3 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제8 이미지를 획득하는 단계; 및
상기 제2 이미지, 상기 제7 이미지 및 상기 제8 이미지의 가중 조합을 생성하는 단계
에 의해 상기 샘플의 개선된 제2 이미지를 생성하는 단계
를 더 포함하고;
상기 샘플의 개선된 제1 이미지를 생성하는 단계는,
상기 샘플의 제9 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 제9 이미지는, 상기 제1 초점 설정에 따라 이미지화되고 상기 제3 여기 파장의 광에 의해 조명될 때 상기 제3 방출 파장의 샘플을 나타내는, 상기 제9 이미지를 획득하는 단계; 및
상기 제1 이미지, 상기 제3 이미지 및 상기 제9 이미지의 가중 조합을 생성하는 단계를 포함하는, 시스템. - 적어도 컴퓨터 판독 가능 명령어를 저장하도록 구성된 비-일시적인 컴퓨터 판독 가능 매체로서, 상기 명령어는 컴퓨팅 디바이스의 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때 상기 컴퓨팅 디바이스로 하여금 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 제어기 동작을 수행하게 하는, 비-일시적인 컴퓨터 판독 가능 매체.
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