CN113508289A - 光谱分解 - Google Patents

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N·霍尔茨
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Abstract

本发明提供了用于对携带细胞的生物样品或其它感兴趣的样品进行显微和荧光成像的系统和方法。显示色差的显微镜物镜或其它光学元件可以用于获得不同波长的荧光团或其它造影剂的图像。所获得的图像随后用于相互校正，例如，以移除较短波长荧光团的图像中由来自较长波长荧光团的串扰引起的伪影。在对应于所述较短波长荧光团的焦距处拍摄的较长波长图像被拍摄并用于减去较短波长图像中的所述较长波长荧光团的活性。所述较长波长图像可以使用设置为较短波长焦距的显微镜被拍摄。替代地，所述较长波长图像可以通过对当所述显微镜设置为较长波长焦距时拍摄的较长波长图像应用模糊滤波器或其它方法被模拟。

Description

光谱分解
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年2月1日提交的美国专利申请序列号16/264819的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
细胞(例如，培养细胞、移植组织样品)可以在多种培养基中温育，并暴露于多种条件(例如，温度、溶解气体水平、辐射、湿度、添加的物质、电场或磁场、病毒、微生物)以评估细胞对所应用的条件的反应。可以测量细胞对所应用的条件的反应以评估药物或治疗的功效，评估物质(例如，实验药物或治疗)的毒性，研究细胞遗传修饰的作用，研究由其形成的细胞和/或组织的代谢组学、结构或其它特性，或测定其它信息。此评估可以包括从培养箱中取出样品并对样品成像(例如，使用荧光显微镜或其它成像设备)。该成像可以包括添加造影剂或化学试剂，其可导致样品的破坏。但是，此方法会干扰正在成像的样品，因此需要在相应不同的持续时间内温育多个样品集合以评估随时间推移样品群体的反应。
发明内容
本公开的一个方面涉及一种方法，其包括：(i)在第一时间段期间用第一激发波长的光照射样品；(ii)在第一时间段期间，根据第一聚焦设置来操作成像器，使得第一发射波长的光被成像器聚焦成像，以获得样品的第一图像；(iii)在第二时间段期间用第二激发波长的光照射样品；(iv)在第二时间段期间，根据第二聚焦设置来操作成像器，使得第二发射波长的光被成像器聚焦成像，以获得样品的第二图像，其中第二聚焦设置不同于第一聚焦设置；(v)获得样品的第三图像，其中第三图像表示当根据第一聚焦设置而成像并由第二激发波长的光照射时处于第二发射波长的样品；以及(vi)通过从第一图像中移除第三图像的一部分来生成样品的改进的第一图像。
本公开的另一方面涉及一种系统，其包括：(i)光源；(ii)成像器；以及(iii)包括一个或多个处理器的控制器。控制器被编程为执行控制器操作，包括：(a)在第一时间段期间操作光源以用第一激发波长的光照射样品；(b)在第一时间段期间，根据第一聚焦设置来操作成像器，使得第一发射波长的光被成像器聚焦成像，以获得样品的第一图像；(c)在第二时间段期间操作光源以用第二激发波长的光照射样品；(d)在第二时间段期间，根据第二聚焦设置来操作成像器，使得第二发射波长的光被成像器聚焦成像，以获得样品的第二图像，其中第二聚焦设置不同于第一聚焦设置；(e)获得样品的第三图像，其中第三图像表示当根据第一聚焦设置而成像并由第二激发波长的光照射时处于第二发射波长的样品；以及(f)通过从第一图像中移除第三图像的一部分来生成样品的改进的第一图像。
本公开的又另一方面涉及一种非暂时性计算机可读介质，其被配置成存储至少计算机可读指令，所述计算机可读指令在由计算装置的一个或多个处理器执行时使所述计算装置执行计算机操作实施本文所述的一种或多种方法。
本公开的又另一方面涉及一种系统，其包括：(i)一个或多个处理器；和(ii)一种非暂时性计算机可读介质，其被配置成存储至少计算机可读指令，计算机可读指令在由一个或多个处理器执行时使系统执行本文所述的一种或多种方法。
所属领域的一般技术人员通过适当地参考附图阅读以下详细描述将明白这些以及其它方面、优势和替代方案。此外，应理解，在本发明内容部分和本文其它地方提供的描述打算通过实例而非限制的方式说明所要求的主题。
附图说明
图1A描绘了实例造影剂的激发和发射光谱。
图1B描绘了实例造影剂的激发和发射光谱。
图1C描绘了实例造影剂的激发光谱。
图1D描绘了实例造影剂的激发和发射光谱。
图2描绘了样品的实例显微图像。
图3A以横截面描绘了显微成像系统的元件。
图3B以横截面描绘了显微成像系统的元件。
图3C以横截面描绘了显微成像系统的元件。
图4A描绘了样品的实例显微图像。
图4B描绘了样品的实例显微图像。
图5描绘了实例自动样品成像装置的元件。
图6是实例方法的流程图。
具体实施方式
本文描述方法和系统的实例。应理解，词语“示范性”、“实例”和“说明性”在本文中用来表示“充当实例、例子或说明”。本文中被描述为“示范性”、“实例”或“说明性”的任何实施例或特征不一定被解释为比其它实施例或特征优选或有利。此外，本文描述的示范性实施例不意味是限制性的。容易理解的是，所公开的系统和方法的一些方面可以以多种不同的配置来布置和组合。
I.概述
可以向样品中添加造影剂以便于对样品成像。此样品可以包括含有感兴趣的细胞的生物样品。造影剂可以包括荧光染料、非荧光染料或颜料、纳米棒或在适当波长下表现出表面等离子体共振的其它导电元件、拉曼染料或改进样品和/或样品内物质的成像的其它物质。在一些实例中，造影剂可被官能化(例如，用抗体)以特异性结合或以其它方式与样品内的感兴趣的物质相互作用。例如，造影剂可被官能化以与蛋白质、特定细胞的表面标记、特定细胞的表面标记、DNA/RNA/等的特定序列，或样品内的一些其它感兴趣的物质或元素特异性结合或以其它方式相互作用。
造影剂可以提高样品及其内容物的整体可见性。附加地或替代地，光学可区分的多种造影剂可用于促进对多种不同造影剂的独立成像。此类多种不同的造影剂可以在激发光谱、发射光谱或其它特性方面不同，以促进此独立成像。此成像可以通过在相应不同的时间点提供不同造影剂的相应不同激发波长的光来实现。
在一些实例中，可能难以完全区分不同的造影剂。例如，用于激发样品中的绿色荧光团的激发波长也可以较小程度地激发样品中的红色荧光团。附加地或替代地，用于检测来自第一造影剂(例如，绿色荧光团)的光的传感器也可以对由另一造影剂(例如，红色荧光团)发射的光敏感。在其它实例中，样品中可存在橙色和近红外荧光团、绿色、橙色和近红外荧光团或一些其它荧光团组。不同造影剂之间的这种“串扰”可能与在不同造影剂的光学特性方面的相似性、检测设备的局限性或其它因素有关。例如，可以使用对由多个不同荧光团发射的光敏感的单个光检测器来对样品成像，以便例如降低设备的成本、大小和/或复杂性。在此实例中，不同的荧光团可以通过在相应不同的时间点提供不同荧光团的相应不同激发波长的光而独立成像。
然而，在此实例中，多于一种的荧光团可响应特定激发波长的光。例如，较长波长荧光团(例如，红色荧光团)和较短波长荧光团(例如，绿色荧光团)可存在于样品中。从两者发射的光将被成像。为了使较短波长荧光团成像，可提供较短波长荧光团的激发波长的光以照射样品。例如，可以提供波长接近较短波长荧光团的激发光谱中的峰值的光。然而，较长波长荧光团也可能被所提供的光激发(例如，以较低的程度)。这可能是由于较长波长荧光团的激发光谱具有与较短波长荧光团的激发光谱的峰值重叠的长尾。在此实例中，较短波长荧光团的图像可以包括与从较长波长荧光团发射的光相关的伪影。
为了解决这个问题，可以从包括较长波长伪影的较短波长荧光团的图像中移除较长波长荧光团的图像。例如，在进行缩放以考虑荧光团的吸收和再发射特性的差异之后，可以从较短波长图像中减去较长波长图像。在用于对样品成像的光学系统表现出最小色差的实例中，该解决方案可以很好地工作。例如，在显微镜用于对样品进行成像的情况下，从样品中的多个不同荧光团发出的光同时聚焦。然而，在光学系统在由样品中的不同造影剂发射的光的波长之间表现出色差的情况下，用于从另一图像(例如，还表现出从红色荧光团接收的光的绿色荧光团图像)移除伪影的图像(例如，红色荧光团图像)可处于与待校正的图像中表示的伪影光不同的聚焦设置。
为了解决这个问题，可以在与移除伪影的图像相同的聚焦设置下获得样品的一个或多个附加图像。例如，可以通过用处于绿色荧光团的激发波长和聚焦设置的光照射样品来获取绿色荧光团的目标图像，使得从绿色荧光团发射的光处于聚焦。例如，可以设置样品和用于对样品成像的显微镜之间的距离，使得绿色荧光团发射光聚焦成像。该图像还可以包括从样品中的红色荧光团发射的光。注意，由于成像设备的色差，该红色荧光团光将出现在失焦的目标图像中。然后可以从目标图像中移除伪影图像以移除伪影红色荧光团光。该伪影图像可通过用红色荧光团的激发波长和用于获得目标图像的相同聚焦设置的光照射样品来获得。例如，在使得从绿色荧光团发射的光聚焦的聚焦设置下。替代地，可通过模糊红色荧光团的聚焦图像或以其它方式应用一些图像处理技术以模拟用于获得使用另一聚焦设置拍摄的图像中的目标图像的聚焦设置的效应来获得伪影图像。例如，使用聚焦设置拍摄的图像使得从红色荧光团发射的光聚焦成像。
II.实例成像
对样品成像可以包括照射样品和检测从样品响应地反射、散射、吸收和荧光地再发射或以其它方式从样品发射的光。可以以单一波长或波长范围提供照射。例如，可以在对应于样品中荧光染料或其它荧光团的激发光谱的峰值的波长处提供照射。附加地或替代地，可以在多个波长/波长范围和/或在宽的波长范围上提供照射。例如，照射可以是包括跨越可见波长范围的光波长的白光。
检测光可以包括使用照相机或其它成像器，例如单通道光电检测器、平面傅立叶捕获阵列、单像素成像器或一些其它成像器生成设备。成像器可被配置成或操作以检测单个波长或波长范围的光。例如，在对应于样品中荧光染料或其它荧光团的发射光谱峰值的波长处。替代地，成像器可被配置成或操作以检测多个波长/波长范围的光。例如，在对应于样品中的多个荧光团的发射光谱峰值的波长处，和/或跨越宽范围的波长。检测光可以包括检测图像信息的单个“通道”，例如，在一定波长范围内接收的光的单色图像。替代地，检测光可以包括检测图像信息的多个“通道”，例如，绿色波长的光的“绿色”图像、蓝色波长的光的“蓝色”图像和红色波长的光的“红色”图像。所接收的光可以被过滤以拒绝用于照射样品的光、拒绝样品中的人工自发荧光、拒绝来自样品中的其它荧光染料的光，或根据一些其它考虑。
为了使样品中的特定造影剂成像，可以提供与造影剂相互作用的照射，然后可以使从造影剂响应地发射的光成像。在造影剂含有荧光团的实例中，可以在荧光团的激发光谱的峰值附近和/或在荧光团的一些其它激发波长处提供照射。然后可以检测荧光团发射光谱的峰值附近和/或荧光团的一些其它发射波长处的光以使样品中的造影剂成像。此检测可以包括使用具有一个或多个带通滤波器、低通滤波器、高通滤波器，或其它类型或组合的滤光器、棱镜、光栅、光纤，或其它元件的显微镜，以便于选择性地检测发射波长的光并拒绝激发波长的激发光。
图1A绘示了第一实例荧光团(例如，“绿色”荧光团)的激发光谱110ex和发射光谱110em。激发光谱110ex和发射光谱110em两者在相应不同的波长处具有相应峰值。激发光谱110ex和发射光谱110em分别表示第一荧光团被光子激发的可能性以及响应于此激发而发射光子作为光子波长的函数的可能性。因此，为了增加照射激发第一荧光团的效率，可在激发光谱110ex的峰值附近的波长处提供光。第一激发光120绘示了此照射的实例。激发光120与第一荧光团的激发光谱110ex之间在波长方面的重叠在图1A中通过阴影绘示。
可使用其它因素来选择用于激发此第一荧光团的光的特定波长范围。例如，如果其它荧光团存在于正在成像的样品中，可以选择波长范围以降低其它荧光团被激发的程度(通过)同时增加第一荧光团被激发的程度。这可以通过选择其它荧光团对激发光的接受程度最低的波长范围和/或通过选择第一荧光团的激发光谱的峰值附近的波长范围来实现。
可以提供多个此波长的激发光以激发样品中的相应多个不同荧光团，从而促进其独立成像。为了减少样品中不同荧光团生成的图像之间的“串扰”(即，减少由其它荧光团的活性引起的第一荧光团的图像量)，可以以相应不同的波长对样品发射的光进行成像。例如，从样品发射的光可以在对应于荧光团的相应不同发射光谱峰值的不同波长处成像。这可以例如通过使用彩色和/或高光谱照相机或其它成像器、通过使用具有调谐到不同发射波长的相应滤光器的多个照相机或其它成像器、通过致动联接到单个照相机或其它成像器的一组滤光器，或以某种其它方式来实现。
图1B绘示了第二实例荧光团(例如，“红色”荧光团)的激发光谱140ex和发射光谱140em。激发140ex和发射140em光谱两者在相应不同的波长处具有相应峰值。为了提高照射激发第二荧光团的效率，可以在激发光谱140ex的峰值附近的波长处提供光。第二激发光150绘示了此照射的实例。激发光150与第二荧光团的激发光谱140ex之间在波长方面的重叠在图1B中通过阴影绘示。注意，第二荧光团被波长比第一荧光团长的光子激发，并且响应于此照射，发射波长比第一荧光团长的光。因此，第二荧光团也可称为“较长波长荧光团”，第一荧光团可称为“较短波长荧光团”。
在一些使用情况下，使用单个照相机或其它成像器来检测多个不同波长可能是有利的。例如，成像器可被配置成检测对应于多个不同荧光团的发射光谱峰值的多个不同波长带内的光。这样做是为了减少成像器的成本，减少成像器的体积、线性尺寸、功率要求和/或质量，增加成像器的耐用性，以允许成像器在更具挑战性的环境条件下操作，允许成像器安装在装置的致动台架上，或促进一些其它目标。
然而，在此类使用情况下，拍摄的第一荧光团的图像可以包括由第一荧光团和存在于样品中的其它荧光团发射的光子。这可能是由于样品中的多个荧光团的激发光谱在波长方面与所提供的照射重叠。图1C示出了第一荧光团110ex和第二荧光团140ex的激发光谱，以及被提供用于激发第一荧光团的第一照射120。激发光谱110ex，140ex两者均与第一照射120重叠，且因此两个荧光团均可能响应于第一照射120而发射光，但因为第一照射120与第一荧光团的激发光谱110ex之间的重叠大得多，因此第一荧光团将可能发射与样品中的荧光团的量成比例的基本上比第二荧光团更多的光。
如上所述，使用被配置成同时检测来自多个不同荧光团的多个不同波长的光的成像器是有利的。例如，成像器可以包括一个或多个滤光器，其被配置成对于每个待成像的荧光团具有一个或多个通带。一个或多个通带中的每个通带可以对应于每个荧光团的发射光谱中的相应峰值。这由图1D的双带通滤波器160绘示，其包括对应于第一荧光团的发射光谱110em的峰值的第一带通165a和对应于第二荧光团的发射光谱140em的峰值的第二带通165b。这种双带通滤波器可以包括一个或多个布拉格反射器或其它元件，例如用于提高对提供给样品的第一照射120和第二照射150的抑制和/或提高对其它不希望的光学噪声源的抑制。
然而，如关于图1C所论述，在这种使用情况下不同荧光团“通道”之间的“串扰”可产生第一荧光团的图像，其包括表示样品中其它荧光团的内容。此类非第一荧光团内容可以被认为是第一荧光团图像中的“伪影”。在此类“伪影”是由于存在可独立成像的其它荧光团的情况下，可获得此类其它荧光团的图像并将其从第一荧光团图像中移除，以便移除“伪影”并生成样品中第一荧光团的量和分布的更准确图像。这种移除可以包括在从第一荧光团图像中减去第二荧光团图像之前按比例缩小第二荧光团图像，以便解决例如荧光团对所提供的照射的灵敏度的差异、荧光团的发射强度的差异、荧光团的量子效率的差异、成像器对荧光团的相应不同发射波长的光的灵敏度的差异等。
图2绘示了此实例图像处理过程。通过用处于第一荧光团的激发波长的光(例如，第一光120)照射含有第一荧光团和第二荧光团的样品来拍摄第一图像210。第二荧光团也被光激发，因此第一图像210含有与第一荧光团的存在相关的第一内容215a和与第二荧光团的存在相关的第二内容215b。通过用第二荧光团的激发波长的光(例如，第二光150)照射样品来拍摄第二图像220。因此，第二图像220含有与第二荧光团的存在相关的内容225a。将第二图像220缩放(例如，缩放至指定的α％，如图2中所示)以考虑荧光团对激发光的灵敏度的差异，并将其从第一图像210中移除以生成改进的图像230，其中第二荧光团的效应降低。因此，改进的图像230仅含有与第一荧光团的存在相关的内容235a。
虽然上面已经讨论了仅含有两个荧光团的情况，但是在样品中可以存在任意数量的不同造影剂，并且可以单独成像。此成像可以包括缩放和相减图像，以减少当照射样品用于成像时不同荧光团“通道”之间的串扰的不良影响。实际上，可以对表示样品中相应不同荧光团的多个不同图像进行加权和组合，以生成样品中特定荧光团的“校正”图像，同时表现出来自样品中其它荧光团的降低的效应。
在表示不同荧光团(或样品的其它内容)的图像通道之间的“串扰”仅在通道之间的一个方向上流动(例如，从较长波长荧光团的图像通道到较短波长荧光团)的情况下，可通过从链中的较短波长图像中移除较长波长图像来生成经校正的图像。例如，可从第二较短波长荧光团的第二图像移除(例如，缩放和减去)第一最长波长荧光团的第一图像以生成第二荧光团的经校正第二图像。然后可从第三最短波长荧光团的第三图像中移除该经校正的第二图像以生成第三荧光团的经校正的第三图像。替代地(并且在数学上等效地)，可以通过移除未校正的第二图像的一部分并且将第一图像的一部分添加到或以其它方式包括到未校正的第三图像中来生成经校正的第三图像。
在图像通道之间的串扰更复杂的情况下，可以使用其它方法来生成样品中的各个荧光团(或其它造影剂或其它感兴趣的内容)的校正图像。此类方法可以包括，对于荧光团中的每一个，通过用相应荧光团的激发波长的光照射样品和/或在相应荧光团的发射波长下响应地从样品发射的成像光来获得样品的相应图像。然后可以基于不同荧光团的图像(包括特定荧光团的图像)的加权线性组合或某一其它类型的组合生成特定荧光团的经校正的图像。可以基于定义不同图像通道之间串扰幅度的实验确定的因素来确定用于此组合的权重。此方法可以在数学上等效于在其中串扰因子在信道对之间表现出强不对称性的实例中的上述方法。例如，在较短波长荧光团通道可能表现出来自较长波长荧光团的伪影的情况下，但反之则不然。
III.色差
许多光学系统以波长相关的方式聚焦或以其它方式操纵光。例如，光学系统可被配置成将红色波长的光聚焦成像，而绿色波长的光将被接收到失焦。这种波长相关性对图像的影响通常被称为“色差”。色差可由成像系统(例如，显微镜)的具有一个或多个波长相关光学性质的一个或多个元件引起。即，透镜的材料、衍射光栅的结构，或成像系统的一些其它元件可以表现出色散。例如，透镜的折射率可以作为波长的函数而变化。因此，透镜将具有取决于波长的焦距。
光学系统可被设计成减少或功能性地消除波长范围内和/或离散波长组之间的色差。例如，可以将光学系统设计成减小对应于样品中一组荧光造影剂的相应发射波长的一组波长之间的色差。这可以通过使用较少色散的材料、通过使用多个透镜或其它光学元件来减小光学系统的整体色散效应、通过使用多个透镜或其它光学元件来匹配整个系统在一组波长中的每一个波长处的焦距(或其它光学特性)、通过使用反射镜或其它反射聚焦元件，或通过一些其它方式来实现。然而，这些方法可能会导致成像系统变得更大、更重、有附加的元件、成本更高、对机械冲击或运动的弹性更差、对湿度或其它环境条件的弹性更差、更难以组装和/或维护，或者以其它方式被削弱。
图3A描绘了表现出色差的物镜310。物镜310位于距样品305第一距离d1处。距离d1使得第一波长320(例如，红色波长)的光可以通过物镜310是其一部分的光学系统(例如，显微镜)聚焦成像。即，当物镜310位于距样品305的第一距离d1处时，第一波长320的光被聚焦地提供给电荷耦合装置、CMOS图像传感器或一些其它图像传感器，使得可以获得第一波长320的光的聚焦图像。可以采用致动器来控制物镜310与样品305之间的距离。
然而，由于物镜310的色差，从样品305发射的其它波长的光可能无法聚焦成像。图3B绘示了与样品305分开第一距离d1的物镜310。然而，在该距离处，从样品305接收的第二波长330(例如，绿色波长)的光由于色差而成像失焦。因此，当物镜310与样品305分开第一距离d1时，从样品305拍摄的任何图像将第二波长330的光描绘为模糊的或以其它方式失焦的。为了使第二波长的光330聚焦成像，可以将物镜310移动到与第二波长的物镜310的焦距对应的不同距离。替代地，物镜310可以以某种其它方式被致动，以针对第二波长调节物镜310的焦距。这可以包括旋转、变形或移动物镜的一个或多个透镜、光栅、反射镜或其它元件，致动液体透镜，以电子方式或以其它方式控制物镜310的液晶或其它材料的折射率，或使用一些其它方式来控制物镜310对于第二波长的焦距。
图3C描绘了已经被致动到距样品305第二距离d2的物镜310。距离d2使得第二波长330的光可以通过物镜310是其一部分的光学系统聚焦成像。即，当物镜310位于距样品305的第二距离d2处时，第二波长330的光被聚焦地提供给电荷耦合装置、CMOS图像传感器或一些其它图像传感器，使得可以获得第二波长330的光的聚焦图像。
注意，图3A-C未按比例绘制，并且仅旨在作为说明性实例。物镜的相对大小、其焦距、样品和/或样品容器，或图3A-C中描述的其它元件的相对大小可以与其中描绘的大小和/或比例相似或不同。
在使用表现出色差的物镜或其它光学系统拍摄包括颜色之间的串扰的图像的情况下，用于从此类图像中移除伪影的过程可能需要修改。这是由于这样的事实：虽然特定图像可以包括表示来自不同荧光团的不同波长的光的内容，但是来自不同波长的光将以不同程度的失焦模糊进行成像。例如，可以对从样品中的红色荧光团发射的光进行对焦拍摄第一幅图像。然后可以拍摄样品的第二图像，使得从样品中的绿色荧光团发射的光聚焦。然而，由于图像通道之间的色差和串扰，第二图像也将包括与从样品发射的红光相关的失焦内容。因此，从第二图像中减去第一图像可能导致由于用于收集第一图像和第二图像中的红光的聚焦设置之间的不匹配而生成附加伪影，而不是移除红光伪影。
在图4A中绘示了此情况。通过在第一荧光团(例如，绿色荧光团)的激发波长下照射样品且使响应发射的光成像，使得在第一荧光团的发射波长下的光聚焦成像而获得第一图像410a。由于图像通道之间的串扰，第一图像410a包括与样品中第二荧光团的存在相关的伪影415a。由于色差，第二荧光团伪影415a失焦。
通过在第二荧光团(例如，红色荧光团)的激发波长下照射样品并使响应发射的光成像，使得在第二荧光团的发射波长下的光聚焦成像而获得第二图像420a。结果，第二图像420a包括与样品中第二荧光团的存在相关的对焦内容425a。为了尝试从第一图像410a中移除伪影，已经从第一图像410a中移除第二图像420a的一部分。具体地，第二图像已被缩放至α％并从第一图像410a中减去。然而，由于用于获得图像410a、420a的成像器中的色差，所得到的经校正的图像430a包括经修改的伪影435a。
为了补偿色差的影响，可以采用各种方法。例如，为了从图4A的第一图像410a中移除伪影，可从样品中拍摄在用于获得第一图像410a的第一聚焦设置下但在用第二荧光团的激发光照射样品时拍摄的样品的附加图像。已经在与用于获得第一图像410a相同的聚焦设置下拍摄的此图像将包括第二荧光团光，但模糊到与存在于第一图像410a中的第二荧光团光相同的程度。因此，通过从第一图像410a移除附加图像的一部分，附加图像可用于生成第一荧光团的改进的第一图像。
这在图4B中绘示，其示出了第一图像410a。如上所述，通过在第一荧光团的第一激发波长下照射样品并在第一聚焦设置(例如，第一成像器－样品距离)下使响应发射的光成像，使得在第一荧光团的发射波长下的光聚焦成像而获得第一图像410a。由于图像通道之间的串扰，第一图像410a包括与样品中第二荧光团的存在相关的伪影415a。由于色差，第二荧光团伪影415a失焦。
通过在第二荧光团的第二激发波长照射样品并在与用于获得第一图像410a的相同的第一聚焦设置下使响应发射的光成像而获得第三图像420b。结果，第三图像420b包括与样品中第二荧光团的存在相关的失焦内容425b。由于使用相同的聚焦设置来获得第一图像410a和第三图像420b，因此以与第一图像410a中的伪影415a相同的方式模糊第三图像420b的第二荧光团内容425b。结果，可以通过从第一图像410a中移除第三图像420b的一部分来移除来自第一图像410a的伪影，以生成第二经校正的图像430b，其相对于图4A的经校正的图像430a，第二荧光团伪影的存在得到改善。
如上所述，可以通过将样品重新成像为适当的聚焦设置来获得附加的伪影校正图像。因此，为了校正在适合于从第一荧光团发射的光的波长的第一聚焦设置下拍摄的第一荧光团的第一图像，可使用第一聚焦设置拍摄样品中的其它荧光团的一组附加图像。然后可通过组合第一图像和附加图像，例如根据其权重与描述各种图像信道之间的串扰程度的串扰因子相关的加权组合生成第一荧光团的经校正图像。
然而，这种方法需要拍摄附加的图像。这可能需要额外的时间来对样品进行成像，以及增加光漂白的量或为样品提供额外照射以对其进行成像的其它不需要的影响。当需要大量荧光图像通道时，这些效果尤其显著，因为所需图像的总数与图像通道数量的平方成比例。作为替代方案，可以模拟此类图像。例如，可以通过模拟第一聚焦设置的使用从第二图像420a获得第三图像420b。模拟替代的聚焦设置具有不需要使用成像器拍摄附加图像的益处，这可以节省时间、减少光漂白的影响，或提供其它益处。
此模拟可以包括使用用于获得第一图像410a和第二图像420a的成像器的模型。此模拟可以包括将高斯核或滤波器应用于第二图像420a或对第二图像420a执行一些其它模糊操作。用于模糊图像的高斯或其它模糊核可以具有从用于获得图像410a、420b的成像器的特性理论上或实验上确定的宽度或其它参数。例如，可以使用非等距高斯来模糊第二图像420a。可以指定非等轴高斯的方向、长轴宽度和短轴宽度以模拟当根据第一聚焦设置而成像时成像器的光学器件对从第二荧光团发射的光的影响。所应用的用于模糊整个图像的单个高斯或其它模糊函数，或者此模糊函数的特性可以随图像内的位置而变化(例如，以更准确地模拟用于获得图像的成像器的光学特性)。
IV.实例系统
可以采用自动化成像系统以自动化方式在多个不同的扫描周期期间随时间获得样品容器的相应孔中的多个生物样品的图像(例如，荧光活性图像)。可以由自动化成像系统在每个扫描周期内拍摄每个样品的图像集合，例如，在三分钟的扫描周期内以每秒三张图像的速率拍摄图像集合。然后可以例如根据本文所述的方法来分析图像以测定关于样品的一些信息。可以如本文其它地方所述，例如，在相应不同的焦距和激发光波长下拍摄图像，以便于当图像通道之间的串扰引起此类伪影时，生成荧光团或样品的其它内容的改进的、减少的伪影图像。
与手动成像相比，使用这种自动化成像系统可以显著减少对生物样品进行成像的人员成本，并且可以提高生成的图像在时序、定位和图像参数方面的一致性。此外，这种自动化成像系统可以配置为在培养箱内操作，从而无需从培养箱中取出样品进行成像。因此，可以更始终维持样品的生长环境。另外，在自动化成像系统用于相对于样品容器移动显微镜或其他成像设备(而不是例如移动要由静态成像设备成像的样品容器)的情况下，可以减少样品的与移动动有关的干扰。这可以改善样品的生长和发展，并减少与移动有关的混乱。
此自动化成像系统可操作以在间隔大于二十四小时、大于三天、大于三十天或更长一段时间的扫描期间获得一个或多个图像。可以指定扫描以指定速率发生，例如，每天一次、每天多于一次、每天多于两次或每天多于三次。可以指定扫描，使得在二十四小时周期内至少发生两次、至少三次或更多次的扫描。在一些实例中，可以分析(例如，根据本文所述的方法)来自一次或多次扫描的数据，并将其用于测定额外扫描的时序(例如，以提高速率、持续时间、图像采集速率或一些其他特性)以检测离散事件的发生，离散事件预计会在样品内发生。
这种自动化成像系统的使用可以促进在长时间周期内在多个时间点对相同生物样品的成像。因此，可以随时间推移分析单个细胞和/或细胞网络的发展和/或表现。例如，可以在单个样品内，在不同的、宽间隔的时间周期内进行的扫描中，标识细胞集合、细胞部分或其他活性对象。然后可以在扫描之间比较这些标识出的对象集合，以在整个扫描中标识出相同的(一个或多个)活性对象。因此，可以在数小时、数天、数周或数月内跟踪和分析单个细胞或细胞部分的表现。
图5绘示了这种自动化成像系统500的元件。自动化成像系统500包括框架510，自动化成像系统500的其它元件附接到该框架。框架510可以被配置(例如，确定尺寸)以便安装在培养箱内。自动化成像系统500包括样品容器520，其可移除地放置在联接到框架510的样品容器托盘530内。样品容器托盘530可以是可移除的和/或可以包括可移除的插入件以便于容纳多种不同的样品容器(例如，各种工业标准样品容器)。系统500另外包括被配置成相对于样品容器520定位成像设备540的致动台架550，使得成像设备540可以操作以获得样品容器520的各个孔(例如，实例孔525)的内容的图像。
成像设备540可以包括显微镜、荧光成像器、双光子成像系统、相衬成像系统、一个或多个照射源、一个或多个滤光器和/或被配置成便于对含在样品容器520内的样品进行成像的其它元件。在一些实例中，成像设备540包括安置在样品容器520的两侧上的元件(例如，相干、偏振、单色或其它指定的照射光源，以便于例如生物样品的相衬成像)。在此类实例中，样品容器520两侧上的元件可以联接到相应不同的台架、联接到相同的台架，和/或样品容器520一侧上的元件可以相对于样品容器520不可移动。
致动台架550联接到框架510和成像设备540，并被配置成控制设备540相对于样品容器520在至少两个方向上的位置，以便于对样品容器520内的多个不同样品进行成像。致动台架550还可被配置成在朝向和远离样品容器520的第三方向上控制成像设备540的位置，以便于控制使用成像设备540获得的图像的聚焦和/或控制可以使用成像设备540成像的在样品容器520内的材料深度。附加地或替代地，成像设备540可以包括一个或多个致动器以控制成像设备540的焦距。成像设备540可以包括一个或多个马达、压电元件、液体透镜或其它致动器，以便于控制成像设备540的聚焦设置。例如，成像设备540可以包括被配置成控制成像设备540与被成像的样品之间的距离的致动器。这样做是为了确保聚焦拍摄图像和/或允许在各种不同的聚焦设置下拍摄图像，以便于本文别处描述的图像校正方法。
致动台架550可以包括被配置成便于检测成像设备540相对于样品容器520(例如，相对于样品容器520的特定孔)的绝对和/或相对位置的元件。例如，致动台架550可以包括编码器、限位开关和/或其它位置感测元件。附加地或替代地，成像设备540或系统的其它元件可以被配置成检测样品容器520和/或样品容器托盘530的准标或其它特征，以便确定成像设备540相对于样品容器520的绝对和/或相对位置。
计算功能(例如，操作致动台架550和/或成像设备540以在指定时间段期间对样品容器520内的样品进行成像、生成距离图像和/或执行本文所述的一些其它方法的功能)可以由一个或多个计算系统执行。此计算系统可以被集成到自动化成像系统(例如，500)中，可以与此自动化成像系统相关联(例如，通过经由直接有线或无线连接、经由本地网络和/或经由因特网上的安全连接来连接)，和/或可以采取某种其它形式(例如，与自动化成像系统通信和/或可以访问生物样品的图像存储区的云计算系统)。这种计算系统可以包括通信接口、用户接口、处理器和数据存储装置，所有这些都可以通过系统总线、网络或其它连接机构以通信方式链接在一起。
通信接口可以起到允许计算系统使用电、磁、电磁、光或其他信号的模拟或数字调制与其他装置、接入网络和/或传输网络进行通信。因此，通信接口可以促进电路交换和/或包交换通信，例如普通老式电话服务(POTS)的通信和/或因特网协议(IP)或其它封包通信。例如，通信接口可以包括被布置成与无线接入网络或接入点的无线通信的芯片组和天线。此外，通信接口可以采取或包括以下形式：有线接口，例如以太网、通用串行总线(USB)或高清多媒体接口(HDMI)端口。通信接口还可以采取无线接口的形式或包括无线接口，如WiFi、蓝牙
Figure BDA0003222221730000151
全球定位
Figure BDA0003222221730000152
(GPS)或广域无线接口(例如，WiMAX或3GPP长期演进(LTE))。然而，其它形式的物理层接口和其它类型的标准或专用通信协议可以用于以上通信接口。此外，通信接口可以包括多个物理通信接口(例如，WiFi接口、蓝牙
Figure BDA0003222221730000153
接口和广域无线接口)。
在一些实施例中，通信接口可以起到允许计算系统与其它装置、远程服务器、接入网络和/或传输网络进行通信。例如，通信接口可用于传输和/或接收生物样品的图像(例如，荧光活动图像)的指示、传输距离图像的指示、活动对象在此类图像内的一组位置，和/或使用本文描述的方法从此类图像生成从此类活动对象确定的时变活动迹线，或一些其它信息。
这种计算系统的用户接口可以起到允许计算系统与用户进行交互，例如以接收来自用户的输入和/或提供输出给用户。因此，用户接口可以包括输入组件，例如小键盘、键盘、触敏或对存在敏感的面板、计算机鼠标、跟踪球、操纵杆、麦克风等。用户接口还可以包括一个或多个输出组件，例如可例如与对存在敏感的面板组合的显示屏。显示屏可以基于CRT、LCD和/或LED技术，或其它目前已知或后续开发的技术。用户接口还可以被配置成经由扬声器、扬声器插孔、音频输出端口、音频输出装置、耳机和/或其它类似装置生成可听输出。
在一些实施例中，用户接口可以包括用于将本视频或其他图像呈现给用户的显示器(例如，特定的生物样品的特定扫描期间生成的图像的视频)。此外，用户接口可以包括一个或多个按钮、开关、旋钮和/或促进计算装置的配置和操作的拨号盘。可以有可能的是，这些按钮、开关、旋钮和/或拨号盘中的一些或全部实施为对触控或存在敏感的面板上的功能。用户接口可以允许用户指定包含在自动化成像系统内的样品类型、指定样品成像的时间表、指定要由系统执行的图像分割和/或分析的参数，或输入用于操作自动化成像系统的一些其它命令或参数。
在一些实例中，根据应用场合，本文描述的方法的部分可以由不同的装置执行。例如，系统的不同的装置可以具有不同量的计算资源(例如，存储器、处理器周期)和装置之间的通信的不同的信息带宽。例如，第一装置可以是嵌入式处理器，其可以操作致动台架、成像设备或其它元件以根据不同的聚焦设置和/或激发光波长在多个不同的扫描周期期间生成生物样品的图像。然后，第二装置可以从第一装置接收(例如，经由因特网，经由专用有线链路)来自第一装置的图像信息，并对接收到的图像数据执行本文所述的图像处理和分析方法。本文描述的方法的不同部分可以根据此类考虑进行分配。
V.实例方法
图6是用于在不同荧光团的图像通道之间存在串扰时校正从不同荧光团(或样品中的其它感兴趣物质)拍摄的图像的方法600的流程图。该方法对于用于获得呈现色差的图像的成像器(例如，显微镜)是有益的。
方法600包括在第一时间段期间用第一激发波长的光照射样品(610)。方法600另外包括，在第一时间段期间，根据第一聚焦设置来操作成像器，使得第一发射波长的光被成像器聚焦成像，以获得样品的第一图像(620)。这可包括操作致动器(例如，成像器的致动器，被配置成控制成像器的位置的台架的致动器)以将成像器与样品之间的距离设置为对应于第一聚焦设置的第一距离。
方法600另外包括在第二时间段期间用第二激发波长的光照射样品(630)。方法600进一步包括，在第二时间段期间，根据第二聚焦设置来操作成像器，使得第二发射波长的光被成像器聚焦成像，以获得样品的第二图像，其中第二聚焦设置不同于第一聚焦设置(640)。这可以包括操作致动器以将成像器与样品之间的距离设置为不同于第一距离且对应于第二聚焦设置的第二距离。
方法600进一步包括获得样品的第三图像，其中第三图像表示当根据第一聚焦设置而成像并由第二激发波长的光照射时处于第二发射波长的样品(650)。这可以包括，在第三时间段期间，用第二激发波长的光照射样品，并根据第一聚焦设置来操作成像器以获得样品的第三图像。替代地，可以基于第二图像获得第三图像，例如，通过模糊第二图像或通过对第二图像应用一些其它图像处理来模拟第一聚焦设置的效果。
方法600另外包括通过从第一图像中移除第三图像的一部分来生成样品的改进的第一图像(660)。这可以包括从第一图像中减去第二图像的缩放版本。在一些实例中，生成改进的第一图像可以包括生成第一图像、第三图像和根据第一聚焦设置在相应不同的激发波长下获得的附加荧光团(或样品中其它感兴趣的内容)的多个附加图像的组合(例如，加权线性组合)。
方法600可以包括附加的元件或特征。
VI.结论
以上详细描述参考随附图式描述所公开系统、装置和方法的各种特征和功能。除非上下文另外表明，否则在附图中，相似的符号通常标识相似的组件。在详细说明、附图以及权利要求书中描述的说明性实施例并不打算具有限制性。在不脱离本文呈现的主题的范围的情况下，可以利用其它实施例，并且可以做出其它改变。将容易理解，可以在多种不同配置中安排、替代、组合、分开并且设计如本文一般所述并且在附图中说明的本发明的各方面，所有配置明确地涵盖在本文中。
关于附图中以及如本文所讨论的任何或所有消息流程图式、场景和流程图，根据实例实施例，每个步骤、区块和/或通信可以表示信息的处理和/或信息的传输。替代实施例包括在这些实例实施例的范围内。在这些替代实施例中，例如，取决于步骤、区块、传输、通信、请求、反应和/或消息所描述的功能可以不按所显示或所讨论的顺序执行，包括取决于所涉及的功能以基本上同时或相反的顺序进行。此外，更多或更少的步骤，区块和/或功能可以与本文讨论的任何消息流程图式、场景和流程图一起使用，并且这些消息流程图式、场景和流程图可以彼此部分或全部组合。
表示信息处理的步骤或区块可以对应于可以被配置为执行本文所述的方法或技术的特定逻辑功能的电路。替代地或附加地，表示信息处理的步骤或区块可以对应于程序代码(包括相关数据)的模块、区段或部分。程序代码可以包括一个或多个可由处理器执行的指令，用于在方法或技术中实现指定的逻辑功能或动作。程序代码和/或相关数据可以存储在任何类型的计算机可读介质上，例如存储装置，包括磁盘驱动器、硬盘驱动器或其他存储介质。
计算机可读介质还可以包括非暂时性计算机可读介质，例如存储短时间周期的数据的计算机可读介质，例如寄存器存储器、处理器高速缓存器和/或随机存取存储器(RAM)。计算机可读介质还可以包括用于存储较长时间周期的程序代码和/或数据的非暂时性计算机可读介质，例如二级或永久性长期存储装置，例如只读存储器(ROM)、光盘或磁盘和/或例如光盘只读存储器(CD-ROM)。计算机可读媒体还可以是任何其它易失性或非易失性存储器系统。可以认为计算机可读介质是例如计算机可读存储介质，或有形的存储装置。
此外，表示一个或多个信息传输的步骤或区块可以对应于相同物理装置中的软件和/或硬件模块之间的信息传输。然而，其它信息传输可以在不同物理装置中的软件模块和/或硬件模块之间。
虽然本文中已公开了各个方面和实施例，但是其它方面和实施例将对所属领域的技术人员显而易见。本文所公开的各个方面和实施例是出于说明的目的并且不打算是限制性的，其中真实的范围由所附权利要求书指示。

Claims (20)

1.一种方法，其包含：
在第一时间段期间用第一激发波长的光照射样品；
在所述第一时间段期间，根据第一聚焦设置来操作成像器，使得第一发射波长的光被所述成像器聚焦成像，以获得所述样品的第一图像；
在第二时间段期间用第二激发波长的光照射所述样品；
在所述第二时间段期间，根据第二聚焦设置来操作所述成像器，使得第二发射波长的光被所述成像器聚焦成像，以获得所述样品的第二图像，其中所述第二聚焦设置不同于所述第一聚焦设置；
获得所述样品的第三图像，其中所述第三图像表示当根据所述第一聚焦设置而成像并由所述第二激发波长的光照射时处于所述第二发射波长的所述样品；以及
通过从所述第一图像中移除所述第三图像的一部分来生成所述样品的改进的第一图像。
2.根据权利要求1所述的方法，其中获得所述样品的所述第三图像包含：
在第三时间段期间用所述第二激发波长的光照射所述样品；以及
在所述第三时间段期间，根据所述第一聚焦设置来操作所述成像器以获得所述样品的所述第三图像。
3.根据权利要求1所述的方法，其中获得所述样品的所述第三图像包含修改所述样品的所述第二图像的副本以模拟操作所述成像器以根据所述第一聚焦设置来获得所述第三图像。
4.根据权利要求3所述的方法，其中修改所述样品的所述第二图像的所述副本包含使所述样品的所述第二图像模糊。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中根据特定聚焦设置来操作所述成像器包含调整所述成像器的组件与所述样品之间的距离。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述样品是包含多个细胞的生物样品。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其进一步包含：
将第一荧光团和第二荧光团引入到所述样品中，其中所述第一荧光团具有对应于所述第一激发波长的激发波长和对应于所述第一发射波长的发射波长，并且其中所述第二荧光团具有对应于所述第二激发波长的激发波长和对应于所述第二发射波长的发射波长。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其进一步包含：
获得所述样品的第四图像，其中所述第四图像表示当根据所述第二聚焦设置而成像并由所述第一激发波长的光照射时处于所述第一发射波长的所述样品；以及
通过生成所述第二图像和所述第四图像的加权组合来生成所述样品的改进的第二图像；
其中生成所述样品的改进的第一图像包含生成所述第一图像和所述第三图像的加权组合。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其进一步包含：
在第三时间段期间用第三激发波长的光照射所述样品；
在所述第三时间段期间，根据第三聚焦设置来操作所述成像器，使得第三发射波长的光被所述成像器聚焦成像，以获得所述样品的第四图像，其中所述第三聚焦设置不同于所述第一聚焦设置和所述第二聚焦设置；
获得所述样品的第五图像，其中所述第五图像表示当根据所述第二聚焦设置而成像并由所述第三激发波长的光照射时处于所述第三发射波长的所述样品；
通过从所述第二图像中移除所述第五图像的一部分来生成所述样品的改进的第二图像；以及
获得所述样品的第六图像，其中所述第六图像表示当根据所述第一聚焦设置而成像并由所述第三激发波长的光照射时处于所述第三发射波长的所述样品；
其中生成所述样品的改进的第一图像进一步包括将所述第六图像的一部分包括到所述第一图像中。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其进一步包含：
在第三时间段期间用第三激发波长的光照射所述样品；
在所述第三时间段期间，根据第三聚焦设置来操作所述成像器，使得第三发射波长的光被所述成像器聚焦成像，以获得所述样品的第四图像，其中所述第三聚焦设置不同于所述第一聚焦设置和所述第二聚焦设置；
通过以下方式生成所述样品的改进的第四图像：
获得所述样品的第五图像，其中所述第五图像表示当根据所述第三聚焦设置而成像并由所述第一激发波长的光照射时处于所述第一发射波长的所述样品；
获得所述样品的第六图像，其中所述第六图像表示当根据所述第三聚焦设置而成像并由所述第二激发波长的光照射时处于所述第二发射波长的所述样品；以及
生成所述第四图像、所述第五图像和所述第六图像的加权组合；
通过以下方式生成所述样品的改进的第二图像：
获得所述样品的第七图像，其中所述第七图像表示当根据所述第二聚焦设置而成像并由所述第一激发波长的光照射时处于所述第一发射波长的所述样品；
获得所述样品的第八图像，其中所述第八图像表示当根据所述第二聚焦设置而成像并由所述第三激发波长的光照射时处于所述第三发射波长的所述样品；以及
生成所述第二图像、所述第七图像和所述第八图像的加权组合；
其中生成所述样品的改进的第一图像包含：
获得所述样品的第九图像，其中所述第九图像表示当根据所述第一聚焦设置而成像并由所述第三激发波长的光照射时处于所述第三发射波长的所述样品；以及
生成所述第一图像、所述第三图像和所述第九图像的加权组合。
11.一种系统，其包含：
光源；
成像器；以及
控制器，其中所述控制器包含一个或多个处理器，其中所述控制器被编程以执行控制器操作，所述控制器操作包括：
在第一时间段期间操作所述光源以用第一激发波长的光照射样品；
在所述第一时间段期间，根据第一聚焦设置来操作所述成像器，使得第一发射波长的光被所述成像器聚焦成像，以获得所述样品的第一图像；
在第二时间段期间操作所述光源以用第二激发波长的光照射所述样品；
在所述第二时间段期间，根据第二聚焦设置来操作所述成像器，使得第二发射波长的光被所述成像器聚焦成像，以获得所述样品的第二图像，其中所述第二聚焦设置不同于所述第一聚焦设置；
获得所述样品的第三图像，其中所述第三图像表示当根据所述第一聚焦设置而成像并由所述第二激发波长的光照射时处于所述第二发射波长的所述样品；以及
通过从所述第一图像中移除所述第三图像的一部分来生成所述样品的改进的第一图像。
12.根据权利要求11所述的系统，其中获得所述样品的所述第三图像包含：
在第三时间段期间操作所述光源以用所述第二激发波长的光照射所述样品；以及
在所述第三时间段期间，根据所述第一聚焦设置来操作所述成像器以获得所述样品的所述第三图像。
13.根据权利要求11所述的系统，其中获得所述样品的所述第三图像包含修改所述样品的所述第二图像的副本以模拟操作所述成像器以根据所述第一聚焦设置来获得所述第三图像。
14.根据权利要求13所述的系统，其中修改所述样品的所述第二图像的所述副本包含使所述样品的所述第二图像模糊。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的系统，其进一步包含：
机械地联接到所述成像器的致动器，其中根据特定聚焦设置来操作所述成像器包含操作所述致动器以调整所述成像器的组件与所述样品之间的距离。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的系统，其中所述样品是包含多个细胞的生物样品。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的系统，其中所述控制器操作进一步包含：
获得所述样品的第四图像，其中所述第四图像表示当根据所述第二聚焦设置而成像并由所述第一激发波长的光照射时处于所述第一发射波长的所述样品；以及
通过生成所述第二图像和所述第四图像的加权组合来生成所述样品的改进的第二图像；
其中生成所述样品的改进的第一图像包含生成所述第一图像和所述第三图像的加权组合。
18.根据权利要求11至16中任一项所述的系统，其中所述控制器操作进一步包含：
在第三时间段期间操作所述光源以用第三激发波长的光照射所述样品；
在所述第三时间段期间，根据第三聚焦设置来操作所述成像器，使得第三发射波长的光被所述成像器聚焦成像，以获得所述样品的第四图像，其中所述第三聚焦设置不同于所述第一聚焦设置和所述第二聚焦设置；
获得所述样品的第五图像，其中所述第五图像表示当根据所述第二聚焦设置而成像并由所述第三激发波长的光照射时处于所述第三发射波长的所述样品；
通过从所述第二图像中移除所述第五图像的一部分来生成所述样品的改进的第二图像；以及
获得所述样品的第六图像，其中所述第六图像表示当根据所述第一聚焦设置而成像并由所述第三激发波长的光照射时处于所述第三发射波长的所述样品；
其中生成所述样品的改进的第一图像进一步包括将所述第六图像的一部分包括到所述第一图像中。
19.根据权利要求11至16中任一项所述的系统，其中所述控制器操作进一步包含：
在第三时间段期间用第三激发波长的光照射所述样品；
在所述第三时间段期间，根据第三聚焦设置来操作所述成像器，使得第三发射波长的光被所述成像器聚焦成像，以获得所述样品的第四图像，其中所述第三聚焦设置不同于所述第一聚焦设置和所述第二聚焦设置；
通过以下方式生成所述样品的改进的第四图像：
获得所述样品的第五图像，其中所述第五图像表示当根据所述第三聚焦设置而成像并由所述第一激发波长的光照射时处于所述第一发射波长的所述样品；
获得所述样品的第六图像，其中所述第六图像表示当根据所述第三聚焦设置而成像并由所述第二激发波长的光照射时处于所述第二发射波长的所述样品；以及
生成所述第四图像、所述第五图像和所述第六图像的加权组合；
通过以下方式生成所述样品的改进的第二图像：
获得所述样品的第七图像，其中所述第七图像表示当根据所述第二聚焦设置而成像并由所述第一激发波长的光照射时处于所述第一发射波长的所述样品；
获得所述样品的第八图像，其中所述第八图像表示当根据所述第二聚焦设置而成像并由所述第三激发波长的光照射时处于所述第三发射波长的所述样品；以及
生成所述第二图像、所述第七图像和所述第八图像的加权组合；
其中生成所述样品的改进的第一图像包含：
获得所述样品的第九图像，其中所述第九图像表示当根据所述第一聚焦设置而成像并由所述第三激发波长的光照射时处于所述第三发射波长的所述样品；以及
生成所述第一图像、所述第三图像和所述第九图像的加权组合。
20.一种非暂时性计算机可读介质，其被配置成至少存储计算机可读指令，所述计算机可读指令在由计算装置的一个或多个处理器执行时使所述计算装置执行控制器操作以执行根据权利要求1至10中任一项所述的方法。
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