CN114730067A - 显微镜装置、分光器和显微镜系统 - Google Patents

显微镜装置、分光器和显微镜系统 Download PDF

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Abstract

一种显微镜装置，包括：开口部(31)，具有第一狭缝和第二狭缝，多束光穿过第一狭缝和第二狭缝，该多束光来自观察对象并且分别由具有不同波长的多束照射光发射至观察对象而产生；色散元件，对穿过开口部(31)的多束光中的每束的波长进行色散；以及成像元件(32)，接收由色散元件色散了波长的多束光。该成像元件(32)接收多束经波长色散的光，使得穿过第二狭缝的零阶光和穿过第一狭缝的一阶光彼此不重叠。

Description

显微镜装置、分光器和显微镜系统
技术领域
本公开涉及显微镜装置、分光器和显微镜系统。
背景技术
通常，关于用于获取观察对象的成像数据的技术，例如，存在用于病理图像获取或成像细胞术的荧光显微术。作为在定量和多色分析中优异的方法，已经提出了利用荧光染色的各种图像诊断方法。
因为多重化更容易、并且因为可以获得详细的诊断信息，所以荧光显微术比通过着色进行的染色更有利。在除用于病理诊断的荧光成像之外的荧光成像中，颜色的数量的增加使得可以一次检查样品中出现的各种抗原。在一般的荧光成像中，以染料的吸收波长(激励波长)发射激励光，并且使用带通滤波器选择性地捕获从发射光产生的染料光谱。在存在多种颜色的情况下，吸收波长(激励波长)根据染料而变化。因此，采用通过针对各染料改变滤波器来进行捕捉的方法。然而，染料的吸收光谱以及发射光谱是宽的并且彼此重叠。所以，在使用多种颜色进行染色的情况下，在一个激励波长激励多种染料。此外，相邻染料的荧光溢出到带通滤波器中，并且发生颜色混合(荧光的重叠)。
另一方面，已知一种通过以时分方式改变激励光的波长和待检测的荧光的波长来进行拍摄的方法。然而，该方法具有拍摄时间随着颜色数量增加而线性增加的问题。作为考虑到上述情况的观察方法，存在使用多束激励光和多个狭缝的荧光显微镜。根据该方法，能够一次射出多束激励光，可以通过一次扫描取得由所有的激励产生的荧光的数据。
现有技术文献
专利文献1：日本专利公开号4452850
非专利文献1：Edward C.Stack,“Multiplexed immunohistochemistry,imaging,and quantitation:A review,with an assessment of Tyramide signalamplification,multispectral imaging and multiplex analysis”,Methods 70(2014)46-58
发明内容
本发明要解决的问题
然而，上述使用多束激励光和多个狭缝的传统荧光显微镜具有以下问题：例如，在成像单元中，穿过一个狭缝的光的一阶光与穿过其他狭缝的光的零阶光彼此重叠，并且不能获得精确的成像数据。
因此，已经鉴于上述情况做出了本公开，并且提出了一种显微镜装置、分光器和显微镜系统，其能够在利用具有不同波长的多条照射光照射观察对象并且使得来自观察对象的多束光通过多个狭缝然后进行波长色散的情况下，通过成像单元获得准确的成像数据。
问题的解决方案
为了解决上述问题，根据本公开的显微镜装置包括：开口部，包括第一狭缝和第二狭缝，来自观察对象的多束光穿过该第一狭缝和第二狭缝，该多束光由具有不同波长的多束照射光发射到观察对象而产生；色散元件，对穿过开口部的多束光进行波长色散；以及成像元件，接收由色散元件波长色散的多束光。成像元件执行光接收，使得针对经波长色散的多束光，穿过第二狭缝的光的零阶光与穿过第一狭缝的光的一阶光彼此不重叠。
附图说明
图1是示出根据实施方式的荧光观察装置的示意性框图。
图2是示出根据本实施方式的荧光观察装置中的光学系统的示例的图。
图3是衍射光栅的光散射的说明图。
图4是根据本实施方式的用作观察对象的病理样本的示意图。
图5是示出本实施方式的向观察对象射出的线状照明光的状态的示意图。
图6是图2中的光谱成像单元30的放大图。
图7是示出本实施方式中的成像单元中的狭缝#1的零阶光和一阶光以及狭缝#2的零阶光和一阶光的位置的曲线图。
图8是示出本实施方式中的第一示例的图表。
图9是示出由本实施方式中的成像单元提供的成像数据的视场的示意图。
图10是示出本实施方式中的第二示例的图表。
图11是示出本实施方式中的衍射效率的模拟示例的曲线图。
图12是示出本实施方式中的第三示例的图表。
图13是示出本实施方式中的第四示例的图表。
图14是示出本实施方式中的第五示例的图表。
图15是示出本实施方式中的第六示例的图表。
图16是示出本实施方式中的第七示例的图表。
图17是用于描述本实施方式中要观察的波长范围的限制的曲线图。
图18是用于描述本实施方式中的二阶光的数据校正的曲线图。
图19是用于描述本实施方式中的二阶光的数据校正的具体示例的曲线图。
图20是用于描述本实施方式中的负一阶光的数据校正的曲线图。
图21是用于描述本实施方式中的数据校正的具体示例的图表。
具体实施方式
在下文中，将参考附图详细描述本公开的实施方式。在本实施方式中，将描述从观察目标观察荧光的荧光观察装置作为显微镜装置的示例。
首先，参照图1和图2对本实施方式的荧光观察装置100的结构进行说明。图1是示出根据本实施方式的荧光观察装置100的示意性框图。图2是示出本实施方式的荧光观察装置100的光学系统的示例的图。
本实施方式的荧光观察装置100具有观察单元1。观察单元1具有激励单元10、载物台20、光谱成像单元30(以下也被称为分光镜)。激励单元10(照射单元)用具有不同波长的多束照射光照射观察目标。例如，激励单元10使用以平行且空间分离的状态布置的具有不同波长的多束线状照明光照射用作观察目标的病理样本(病理样本)。
这里，平行且空间分离的状态是指多束线状照明光具有不同的轴并且平行的状态。具有不同轴线意味着不在同一轴线上，并且这些轴线之间的距离不受特别限制。平行不限于严格意义上的平行，并且包括大致平行的状态。例如，可能存在由诸如透镜的光学系统引起的失真或者由于制造公差而与平行状态的偏差，并且这种情况也被认为是平行的。
载物台20是用于支撑病理样本的基座。光谱成像单元30获取以线形式激励的病理样本的荧光光谱(光谱数据)。
荧光观察装置100还包括处理单元2。基于通过观察单元1获取的病理样本的荧光光谱(在下文中，也被称作样本S)，处理单元2通常形成病理样本的图像或者输出荧光光谱的分布。本文中所提及的图像是指构成光谱的染料、源自样本的自发荧光等的成分比、从波形转换的RGB(红色、绿色和蓝色)颜色、在特定波长带中的亮度分布等。
激励单元10和光谱成像单元30经由诸如物镜44的观察光学系统40连接至载物台20。观察光学系统40具有通过聚焦机构60维持最佳聚焦的功能。另外，也可以在观察光学系统40上连接用于进行暗视场观察、明视场观察等的非荧光观察单元70。
此外，荧光观察装置100可连接至控制激励单元10、光谱成像单元30、扫描机构50、聚焦机构60、非荧光观察单元70等的控制单元80。
激励单元10包括可以输出具有多个激励波长Ex1、Ex2、…的光的多束光源L1、L2、…。多束光源中的每一个通常包括发光二极管(LED)、激光二极管(LD)、水银灯等，并且每束光以线形式被照射并且发射至载物台20上的样品S。
在此，图4是根据本实施方式的用作观察对象的病理样本的示意图。另外，图5是表示本实施方式中的线状照明光照射到观察对象的的状态的示意图。样品S通常包括载玻片，该载玻片包括观察对象Sa，例如，如图4所示的组织切片，但是可以是另一种形式。观察目标Sa是生物样品，诸如核酸、细胞、蛋白质、细菌和病毒。样品S(观察目标Sa)用多束荧光团染色。观察单元1以期望的放大倍率放大并观察样本S。当放大图4中的部分A时，如图5中所示，在照明区域中布置多束线状照明光(在所示示例中为两个(Ex1和Ex2))。光谱成像单元30的拍摄区域R1、R2被布置成与相应的照明区域重叠。两束线状照明光Ex1和Ex2在Z轴方向上平行发射，并且被布置成在Y轴方向上彼此分开预定距离(Δy)。
此外，光谱成像单元30包括开口部31、成像元件32、棱镜33、反射镜34和衍射光栅35。图2所示的开口部31具有多个狭缝，由多个照射光产生的来自观察对象的多束光通过该狭缝。拍摄区域R1、R2分别与开口部31的狭缝相对应。即，配置与线状照明光的条数相同数量的光谱成像单元30的狭缝。
第一线状照明光Exl的波长与第二线状照明光Ex2的波长彼此不同。经由观察光学系统40在光谱成像单元30中观察由线状照明光Ex1和Ex2激励的线状荧光。
成像元件32(成像单元)对通过衍射光栅35(分光元件)进行波长色散的多束光(荧光等)进行成像(接收)。作为成像元件32，采用诸如电荷耦合器件(CCD)成像仪和互补金属氧化物半导体(CMOS)成像仪的二维成像仪。
光谱成像单元30使用成像元件32的一个方向(例如，垂直方向)上的像素阵列作为波长的通道，从每个行照明光Ex1和Ex2获取荧光的光谱数据(x，λ)。所获得的光谱数据(x，λ)以明确光谱数据是通过在哪个激励波长下激励而获得的数据的状态记录在处理单元2中。
处理单元2(校正单元)对从成像元件32接收到的成像数据进行处理。例如，处理单元2由在计算机中使用的硬件元件(诸如，中央处理单元(CPU)、随机存取存储器(RAM)和只读存储器(ROM))以及所需的程序(软件)来实现。代替CPU或除CPU之外，可以使用诸如现场可编程门阵列(FPGA)、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)等的可编程逻辑器件(PLD)。
处理单元2包括存储单元21。存储单元21存储表示多束线状照明光Ex1、Ex2的波长与成像元件32接收到的荧光的相关性的光谱数据。作为存储单元21，使用诸如非易失性半导体存储器和硬盘驱动器的存储装置，并且存储单元21具有存储在其中的用于样本S的自发荧光的标准光谱和用于对样本S进行染色的染料本身的标准光谱。成像元件32接收到的光谱数据(x，λ)被存储在存储单元21中。在实施方式中，存储样本S的自发荧光和染料本身的标准光谱的存储单元和存储由成像元件32获取的样本S的光谱数据(测量光谱)的存储单元由共同存储单元21构成，但是本公开不限于此，并且它们可由单独的存储单元构成。另外，关于分别从多个波长色散光获得的光信息，处理单元2可以基于从通过第二狭缝的光获得的光信息来校正从通过第一狭缝的光获得的光信息(将在下面描述细节)。
此外，如图2所示，二向色镜42和带通滤波器45插入光路的中间，使得激励光(Ex1和Ex2)无法到达成像元件32。
衍射光栅35布置在开口部31与成像元件32之间的光路上。衍射光栅35是对已经穿过开口部31的多个狭缝的多束光进行波长色散的波长色散元件的示例。衍射光栅35由于光的相干性而引起波长色散。通常，衍射光栅具有以下优点：波长色散对波长的依赖性基本上固定，并且容易基于光栅间距设计波长色散。即，通过使用衍射光栅35，能够容易地设计光入射到成像元件32时如何产生波长色散。
另外，衍射光栅35例如是槽的截面形状为锯齿状的闪耀衍射光栅(闪耀光栅)。通过使用闪耀衍射光栅，可以获得特定等级的大量光。例如，可以抑制二阶光的波长成分。因此，即使其他狭缝的二阶光与特定狭缝的一阶光重叠，也能够将颜色混合的影响抑制得较小，并且能够精确地获得各狭缝的光谱。另外，通过闪耀衍射光栅，可以将负的一阶光抑制得比一阶光小。因此，例如，即使特定狭缝的一阶光与其他狭缝#2的负的一阶光重叠，也可以减小负的一阶光的影响。
这里，图3是衍射光栅的光色散的说明图。当使用衍射光栅时，例如，响应于入射光(波长λ1至λ2)生成负的三阶光至三阶光。在下文中，将详细描述传统技术的问题。
在使用多束激励光和多个狭缝的荧光显微镜中，需要利用分光镜对激励光进行分光、并且使用一阶光或者负的一阶光来执行观察。然而，实际上，生成了未色散的零阶光和不期望的高阶光(二阶光以上)。然后，由于穿过多个狭缝的各束光被色散，从其他狭缝获得的衍射光与从成像单元中的特定狭缝获得的衍射光的区域重叠，并且不能获得精确的光谱。以往，在很多分光镜中，对于1个分光元件形成1个狭缝，因此，该问题不明显。
例如，将考虑存在两个狭缝的情况作为示例。理想地，两束分散的一阶光(或负的一阶光)的图像将被投射在成像器(成像元件)上。然而，实际上，生成了零阶光和高阶光，因此并不总是仅获取理想的一阶光图像。例如，来自狭缝#1的光的零阶光可能与来自狭缝#2的光的一阶光(或负的一阶光)重叠，或者来自狭缝#1的光的高阶光(例如，二阶光)和来自狭缝#2的光的一阶光(或负的一阶光)可能彼此重叠。在以这种方式发生这种重叠的情况下，无法精确地测量要观察的一阶光(或负的一阶光)的光谱。
在这种情况下，在本实施方式中，将描述一种方法，其中，通过避免或减少这种重叠，成像单元可获取精确的(比传统技术更精确的)成像数据。
返回图1和图2，观察单元1还包括扫描机构50。扫描机构50随着时间来改变观察对象被照射光照射的位置。例如，扫描机构50可以使多束线状照明光Ex1和Ex2在载物台20上沿Y轴的方向(即，线状照明光Ex1和Ex2的布置方向)扫描。通过驱动扫描机构50，成像元件32随着时间在扫描方向上对多束波长色散光连续地进行成像，并且处理单元2处理从成像元件32接收的成像数据以获取观察对象的二维数据或三维数据。
具体地，通过使用扫描机构50，在样本S(观察目标Sa)上空间分离Δy并且在不同激励波长下激励的染料光谱(荧光光谱)可以在Y轴方向上被连续地记录。
注意，在上述示例中，虽然用作激励光的线状照明光的条数是两条，但是线状照明光的条数不限于两条，并且可以是三条、四条或五条或更多条。此外，每束线状照明光可包括被选择为使得颜色分离性能尽可能不劣化的多个激励波长。
接着，参照图2对观察单元1的详情进行说明。激励单元10包括多个(在本示例中为四个)激励光源L1、L2、L3和L4。激励光源L1至L4包括分别输出具有405nm、488nm、561nm和645nm的波长的激光的激光源。
激励单元10还包括多个准直透镜11、激光线滤波器12、二向色镜13a、13b和13c、均化器14、聚光透镜15和入射狭缝16，以便对应于相应的激励光源L1至L4。
从激励光源L1发射的激光和从激励光源L3发射的激光由准直透镜11准直，穿过用于切割各个波长带的边缘的激光线滤波器12，并且由二向色镜13a制成同轴的。两束同轴激光通过均化器14(诸如复眼透镜)和聚光透镜15被进一步光束成形，以变成线状照明光Ex1。
类似地，从激励光源L2发射的激光和从激励光源L4发射的激光由二向色镜13b和13c制成同轴的，并且变成具有与线状照明光Ex1的轴不同的轴的线状照明光Ex2。线状照明光束Exl和Ex2形成了在入射狭缝16(共轭狭缝)中以Δy分开的不同轴线状照明光(原始图像)，该入射狭缝16具有线状照明光束Exl和Ex2可以通过的多个狭缝。注意，在本实施方式中，描述了四个激光器被制作成两个同轴激光器和两个不同轴激光器的示例，但是可替代地，两个激光器可被制作成两个不同轴激光器，或者四个激光器可被制作成四个不同轴激光器。
通过观察光学系统40将初级图像发射至载物台20上的样品S。观察光学系统40包括聚光透镜41、二向色镜42和43、物镜44、带通滤波器45以及聚光透镜46(成像透镜)。线状照明光片Ex1和Ex2由与物镜44配对的聚光透镜41准直，由二向色镜42和43反射，穿过物镜44，并且发射到样本S。
如图5中所示的照明光形成在样本S的表面上。由这些照明光激励的荧光被物镜44会聚，由二向色镜43反射，穿过二向色镜42和切断激励光的带通滤波器45，由聚光透镜46再次会聚，并且入射在光谱成像单元30上。
开口部31被布置在聚光透镜46的聚光点处，并且具有与激励线的数量相同的数量的狭缝。从穿过开口部31的两束激励线导出的荧光光谱被棱镜33和反射镜34反射，然后被衍射光栅35波长分离，再次被反射镜34反射，然后入射到成像元件32上。
载物台20和扫描机构50构成X-Y载物台，并且在X轴的方向和Y轴的方向上移动样本S以获取样本S的荧光图像。在整个载玻片成像(WSI)中，重复在Y轴的方向上扫描样本S，然后在X轴的方向上移动，并且进一步在Y轴的方向上扫描样本S的操作。
非荧光观察单元70包括光源71、二向色镜43、物镜44、聚光透镜72、成像元件73等。图2的非荧光观察系统是使用暗视场照明的观察系统。
光源71布置在载物台20下方，并且使用来自线状照明光Ex1和Ex2的相对侧的照明光照射载物台20上的样品S。在暗场照明的情况下，光源71从物镜44的数值孔径(NA)的外部照明样本S，并且由样本S衍射的光(暗场图像)由成像元件73经由物镜44、二向色镜43和聚光透镜72拍摄。通过使用暗场照明，即使明显透明的样品(诸如荧光标记的样品)也能够以对比度观察到。
注意，该暗场图像可与荧光同时观察并用于实时聚焦。在这种情况下，可以选择不影响荧光观察的波长作为照明波长。非荧光观察单元70不限于获取暗场图像的观察系统，并且可以包括可以获取诸如明场图像、相位差图像、相位图像和在线全息图像的非荧光图像的观察系统。例如，作为获取非荧光图像的方法，可以采用诸如Schlieren方法、相位差对比度方法、偏振观察方法和落射照明方法的各种观察方法。照明光源的位置不限于载物台下方的位置，并且光源可位于载物台上方或物镜周围。此外，不仅可以采用实时进行聚焦控制的方法，而且可以采用诸如预先记录聚焦坐标(Z坐标)的预聚焦映射方法的其他方法。
由成像元件32获取的荧光光谱被输出到处理单元2。除了存储单元21之外，处理单元2还包括数据校准单元22和图像形成单元23。数据校准单元22对存储单元21中存储的光谱数据进行校正。图像形成单元23基于光谱数据和多束线状照明光Ex1和Ex2之间的间隔Δy形成样本S的荧光图像。
显示单元3显示由处理单元2生成的各种信息。显示单元3可以包括例如整体附接到处理单元2的监视器，或者可以是连接到处理单元2的显示装置。显示单元3包括例如诸如液晶装置和有机EL装置的显示元件、以及触摸传感器，并且用作允许拍摄条件输入和设置并且显示拍摄的图像等的用户界面(UI)。
以下，详细说明利用成像元件32得到准确的成像数据的观察单元1的结构。观察单元1被配置为：针对多束波长色散光，在成像元件32中特定光的零阶光与其他光的一阶光不重叠。另外，优选的是，多个波长色散光中的至少一束波长色散光的一阶光的波长频带为400nm至800nm中的部分或全部。其原因是主要用于生物体的荧光观察的荧光的波长为400nm至800nm。然而，波长带不限于此。
图6是图2中的光谱成像单元30的放大图。这里，将描述采用Offner类型作为光谱成像单元30的情况的示例。此外，图7是示出本实施方式中的成像单元(成像元件32)中的狭缝#1(第一狭缝)的零阶光和一阶光以及狭缝#2(第二狭缝)的零阶光和一阶光的位置的曲线图。横轴表示成像元件32的Y坐标位置，纵轴表示光强度(I)。应注意，例如，穿过狭缝#1的光的零阶光被称为“狭缝#1的零阶光”，并且同样适用于其他光。
反射镜34是在内侧具有曲率半径为R的反射面的凹面反射镜。此外，衍射光栅35是在外侧具有曲率半径为R/2的反射表面的反射型衍射光栅(凸镜)。而且，两个狭缝(狭缝#1和狭缝#2)设置在开口部31中。狭缝#1和狭缝#2之间的距离被称为L。
成像元件32中的狭缝#1的零阶光的y坐标位置被称为y1。成像元件32中的狭缝#2的零阶光的y坐标位置被称为y2。
成像元件32中的狭缝#1的一阶光的y坐标位置被称为y11至y12，并且其波长带被称为λmin1至λmax1。成像元件32中的狭缝#2的一阶光的y坐标位置被称为y21至y22，并且其波长带被称为λmin2至λmax2。衍射级称为m。
在这种情况下，y11、y12、y21和y22被表示为以下提供的式子(1)至(4)。
Figure BDA0003652950750000111
Figure BDA0003652950750000112
Figure BDA0003652950750000113
Figure BDA0003652950750000114
此外，考虑一阶光，由于建立了衍射级m＝1，所以y11、y12、y21和y22被表示为以下提供的式子(5)至(8)。
Figure BDA0003652950750000121
Figure BDA0003652950750000122
Figure BDA0003652950750000123
Figure BDA0003652950750000124
这里，图8是示出本实施方式中的第一示例的图表。在第一示例中，观察单元1被配置，使得在成像元件32中狭缝#2的零阶光位于狭缝#1的零阶光与狭缝#1一阶光之间。此外，建立L＝y2-y1。
其条件如下提供的式子(9)所示。
Figure BDA0003652950750000125
当从式子(9)的各项减去y1时，获得以下提供的式子(10)，这也是狭缝距离L的条件。
Figure BDA0003652950750000126
如上所述，根据第一示例，对于狭缝#1和#2，由于在成像元件32中一个狭缝的零阶光与其他狭缝的一阶光不重叠，所以在成像元件32中可获得精确的成像数据。即，可以获得更精确的一阶光的衍射数据(具有较少的噪声)。
在此，图9是示出由本实施方式的成像单元(成像元件32)提供的成像数据的视场的示意图。在本实施方式中，狭缝距离等于或小于由物镜44和聚光透镜46限定的、由成像元件32提供的成像数据的视场直径。此外，第一示例具有如下配置：在下面的第二到第七示例中，狭缝#1与#2之间的狭缝距离可以是最短的。在视场中更靠近中心的区域处的成像性能更好。由于狭缝距离可较短，因此可进一步提高成像性能。
具体地，在生物的荧光观察中，经常使用具有大约400nm至800nm的荧光峰的荧光团(例如，荧光团Indo-1在大约400nm是荧光的，并且APC Alexa Fluor 750在大约800nm是荧光的)。因此，在多个波长色散光中的至少一个波长色散光的一阶光的波长频带为400至800nm的一部分或全部的情况下，能够提高生物体的荧光观察的精度。
注意，虽然例示了使用一阶光的配置，但是同样适用于使用负一阶光的情况。
接下来，将描述第二示例。图10是示出实施方式中的第二示例的图表。第二示例是在成像元件32中，观察单元1被配置使得狭缝#2的零阶光相对于狭缝#1的一阶光位于二阶光侧的示例。
其条件如下提供的式子(11)所示。
Figure BDA0003652950750000131
另外，在从式子(11)的各项减去y1、观察用视场的直径为D的情况下，狭缝距离L(＝y2-y1)的条件如下面的式子(12)所示。
Figure BDA0003652950750000132
如上所述，根据第二示例，关于狭缝#1和#2，由于在成像元件32中一个狭缝的零阶光与其他狭缝的一阶光不重叠，所以在成像元件32中可获得精确的成像数据。即，可以获得更精确的一阶光的衍射数据(具有较少的噪声)。
另外，如上所述，通过使用闪耀衍射光栅作为衍射光栅35，能够得到特定等级的大量光。例如，可以抑制二阶光的波长成分。因此，例如，狭缝#1的二阶光的一部分与狭缝#2的一阶光重叠，但是影响可以较小。
此处，图11是示出本实施方式中的衍射效率的模拟示例的曲线图。显然，一阶光的衍射效率高，二阶光的衍射效率和三阶光的衍射效率低。注意，虽然二阶光的衍射效率在短波长侧稍微高，但是影响小，因为，如图10所示，狭缝#1的二阶光与狭缝#2的一阶光重叠的部分在长波长侧。因此，颜色混合的影响可以很小，并且可以获得精确的光谱。另外，在使用闪耀衍射光栅的情况下，可以使负的一阶光相对于负的三阶光的衍射效率小到可以忽略。
此外，第二示例具有这样的配置，其中，尽管狭缝#1与#2之间的狭缝距离不像第一示例那样短，但是狭缝#1与#2之间的狭缝距离可以比下面的第三示例至第七示例短，并且可以实现高的图像形成性能。
在下文中，将描述第三至第七示例，但是由于它们与第一或第二示例中的那些相似，所以将省去式子的描述。
将描述第三示例。图12是示出本实施方式中的第三示例的曲线图。第三示例是与第二示例相比，观察单元1被配置使得狭缝#1的二阶光不与狭缝#2的一阶光重叠，狭缝#1的三阶光与狭缝#2的一阶光重叠的示例。
通常，衍射光的衍射效率越低，阶越高。因此，由于不是狭缝#1的二阶光而是狭缝#1的三阶光与狭缝#2的一阶光重叠，因此可以进一步提高成像数据的精度。注意，可以在能够确保充分的图像形成性能的范围内确定狭缝距离。
接下来，将描述第四示例。图13是示出本实施方式中的第四示例的图表。图表本身与图10中的图表相似。这里，考虑通过数据校正抑制在狭缝之间混合高阶光的影响的方法。例如，预先评估(计算)与狭缝#1(区域A)的一阶光和狭缝#2(区域B)的一阶光重叠的高阶光的波长和强度。通过基于该评估校正颜色混合部分的数据，即使在发生颜色混合的情况下也可获得精确的光谱。
虽然这里已经描述了多个狭缝之间的颜色混合，但是二阶光和一阶光可以在一个狭缝中彼此重叠。这可以通过预先评估重叠部分并且与上述方法类似地执行数据校正，或者通过使用用于来自观察对象的荧光的光学滤波器限制到达成像元件32的波长带来处理。这些可以组合。
接下来，将描述第五示例。图14是示出本实施方式中的第五示例的图表。上面已经描述了狭缝的数量为两个的情况，但是狭缝的数量可以是三个或更多个。图14中的示例示出在第一示例中狭缝的数量为三个的情况。狭缝#1的一阶光布置在狭缝#2的零阶光与狭缝#3的零阶光之间。
注意，三个一阶光的距离不一定相同，并且可以被设置为不同。因此，狭缝距离不一定相同，也可以不同。
如上所述，根据第五示例，即使在狭缝为3个的情况下，特定狭缝的零阶光与其他狭缝的一阶光也不重叠，因此在成像元件32中可以得到准确的成像数据。即，可以获得更精确的一阶光的衍射数据(具有较少的噪声)。
接下来，将描述第六示例。图15是示出实施方式中的第六示例的图表。图15中的示例示出在第一示例中狭缝的数量为四个的情况。狭缝#2的一阶光布置在狭缝#3的零阶光与狭缝#4的零阶光之间。
如上所述，根据第六示例，即使在狭缝数为4的情况下，由于特定狭缝的零阶光与其他狭缝的一阶光也不重叠，因此在成像元件32中可以得到准确的成像数据。即，可以获得更精确的一阶光的衍射数据(具有较少的噪声)。注意，在狭缝的数量为五个以上的情况下可以实现同样的情况。
接下来，将描述第七示例。图16是示出实施方式中的第七示例的曲线图。在图16的示例中，狭缝#2的零阶光布置在狭缝#1的二阶光的区域中，并且狭缝#3的零阶光布置在狭缝#2的二阶光的区域中。
注意，三个一阶光的距离不必相同，并且可以被设置为不同。因此，狭缝距离不必相同，并且可以不同。
如上所述，根据第七示例，由于即使在狭缝的数量为三个的情况下，特定狭缝的零阶光与其他狭缝的一阶光也不重叠，因此在成像元件32中可以获得精确的成像数据。即，可以获得更精确的一阶光的衍射数据(具有较少的噪声)。注意，在狭缝的数量为四个以上的情况下可以实现同样的情况。
接下来，图17是用于描述本实施方式中要观察的波长范围的限制的曲线图。观察单元1可还包括光学滤波器，该光学滤波器仅允许获得的荧光之中的预定波长范围内的光通过。
来自观察目标的实际荧光可以在宽带上扩散。在这种情况下，通过使用光学滤波器或者调整光接收元件的灵敏度可以限制要观察的波长范围。具体地，例如，可想到以下方法(A)至(C)。
(A)在发射光谱的一部分中布置滤波器以限制波长。
(B)使用光接收元件的灵敏度特性以限制要观察的波长。
(C)合并方法(A)和(B)。
通过使用这些方法，例如，如图17中所示，可以限制并且获取区域B1中的荧光作为区域B2中的数据。
接下来，图18是用于描述本实施方式中的二阶光的数据校正的曲线图。横轴表示波长，纵轴表示光的强度。处理单元2可以相对于同一光从一阶光的量来估计二阶光的生成量。
通过预先获取衍射光栅35的衍射特性，例如，可以根据狭缝#1的一阶光的量来估计狭缝#1的二阶光的生成量。即，例如，在狭缝#2的一阶光与狭缝#1的二阶光重叠的情况下，可以通过数据处理更精确地获取狭缝#2的一阶光的信号。
具体地，虽然二阶光的效率不同于一阶光的效率，但是二阶光的波形(其与一阶光的波形相同的波形)出现在二倍于一阶光的波长的波长区域中。因此，通过预先评估二阶光相对于一阶光的出现率，可以计算在实际测定中产生了多少二阶光。在以下提供的式子(13)中，左侧指示二阶光的强度，右侧的第一项指示一阶光的强度，右侧的第二项指示二阶光的出现率。
I2(2λ)＝I1(λ)×η2(λ) (13)
这样，通过根据一阶光的测量结果高精度地计算(估计)二阶光，可以进行高精度的数据校正。
接下来，图19是用于描述本实施方式中的二阶光的数据校正的具体示例的曲线图。将描述二阶光出现率评估方法的示例。例如，将遮挡要评估的二阶光区域的光的滤波器放置在具有宽的发射波长特性的光源(诸如卤素灯)中。该光被分别引入分光镜的狭缝中。由此，可以评估二阶光与一阶光的比率，并且可以评估二阶光的出现率。
在图19的(a)中，附图标记C1表示原始光源光谱，附图标记C2表示滤波后的光源光谱，附图标记C3表示二阶光出现率评估区域。而且，在图19的(b)中，附图标记C4表示滤波后的光源光谱，并且附图标记C5表示滤波后的光源的二阶光。参考符号C5与参考符号C4的比率是二阶光的出现率。
此外，作为该方法的替代，例如，还存在使用从高亮度白光源连续提取单色波长的方法来推导每个波长的二阶光的出现率的方法。
接下来，图20是用于描述本实施方式中的负的一阶光的数据校正的曲线图。虽然负一的阶光的效率不同于一阶光的效率，但是负的一阶光的波形(其与一阶光的波形相同的波形z)关于零阶光对称地出现。通过预先评估负的一阶光与一阶光的出现率，可以计算出在实际测定中产生了多少负的一阶光。在以下提供的式子(14)中，左侧指示负的一阶光的强度，右侧的第一项指示一阶光的强度，右侧的第二项指示负的一阶光的出现率。
I-1(λ)＝I1(λ)×η-1(λ) (14)
将描述评估负的一阶光与一阶光的出现率的方法的示例。当诸如卤素灯光的宽带光被引入一个狭缝时，色散的一阶光的光谱出现在从成像元件32获取的数据中。此时，同时产生负一阶光。由此，可以评估负的一阶光与一阶光的出现率。针对每个狭缝对此进行评估。
作为该方法的代替方案，还存在使用从高亮度白色光源连续提取单色波长的方法来导出各波长的负的一阶光的出现率的方法。
接下来，图21是用于描述本实施方式中的数据校正的具体示例的图表。此处，将描述图12的情况下的数据校正。ID是区域D的光强度并且是实际测量数据。I1是狭缝#1的一阶光的强度。I2是狭缝#2的一阶光的强度。β-1是狭缝#2的负的一阶光的出现率并且是预先评估的校正系数。
而且，IE是区域E的光强度并且是实际测量数据。α3是狭缝#1的三阶光的出现率并且是预先评估的校正系数。然后，可通过以下提供的式子(15)和(16)计算I1和I2。
ID＝I1+I2β-1 (15)
IE＝I2+I1α3 (16)
注意，可通过应用在图18中描述的用于二阶光的评估方法或在图20中描述的用于负一阶光的评估方法来执行β-1和α3的先前评估。
这样，本实施方式的观察单元1被配置使得在成像元件32中，针对多个波长色散光，特定光的零阶光与其他光的一阶光不重叠，因此可以在成像元件32中得到准确的成像数据。
例如，在常规的线扫描型荧光成像装置中使用使用多束激励光和多个狭缝的荧光显微镜的情况下，存在来自多个狭缝的光片彼此混合，并且不能获取精确的光谱数据的问题。相反，通过使用根据本实施方式的方法，可获得抑制颜色混合的更精确的数据。
注意，传统上，可以通过一个分光器仅分散一条线(或点)的光。因此，为了同时取得多条线(或点)的光谱数据，需要配置多个分光镜。这是复杂的系统，对物理布局提出了很大的限制。在显微镜等观察系统中，很难配置多个分光镜。
相反，根据本实施方式，可以利用一个分光器(衍射光栅35、成像元件32等)高精度地对多束光线(或点)进行分光。这使得装置可以变得简单，实现紧凑布局，并且同时分散多行光。在荧光观察中，在现有技术中，在整个表面上扫描一行并重复地进行与激励波长的数量一样多的拍摄，并且需要大量的时间。然而，在多个线使用不同的激励波长的情况下，可以在用于多种颜色的激励的单个扫描中完成成像。即，能够大幅缩短观察时间。
并且，在本实施方式中，如图9的具体示例所示，通过使观察单元1配置为使穿过一个狭缝的光的零阶光位于穿过其他狭缝的光的零阶光与一阶光之间，可以实现上述效果。
另外，如图10的示例所示，通过使观察单元1被配置成使得穿过一个狭缝的光的零阶光相对于穿过其他狭缝的光的一阶光位于二阶光侧，可以得到上述效果。
另外，关于分别从多个波长色散光获得的成像数据，通过基于从某光获得的成像数据对从其他光获得的成像数据进行校正，可以进一步提高成像数据的精度。
此外，通过进一步使用仅允许获得的荧光中的预定波长范围内的光通过的光学滤波器，可以进一步提高成像数据的准确度。
另外，多个波长色散光中的至少一个波长色散光的一阶光的波长频带为400至800nm中的部分或全部的情况在观察对象是生物体的情况下是有效的。
此外，通过使用衍射光栅作为色散元件，可以容易地设计当光入射在成像元件32上时如何发生波长色散。
另外，通过使用闪耀衍射光栅作为衍射光栅35，可以得到特定等级的大量的光，即使在存在高阶光与一阶光重叠的区域的情况下，也可以将影响抑制得较小。
此外，通过将开口部31的狭缝距离设置为等于或小于成像数据的视场直径，可以精确地获取基于多束激励光的成像数据。
而且，通过包括扫描机构50，可以获取观察对象的二维数据或三维数据。
此外，荧光观察装置100和用于处理成像数据的程序构成荧光观察系统(显微镜系统)。该程序是使信息处理装置执行用于处理成像数据的校正处理的程序。
该程序以存储在磁盘、光盘、磁光盘、闪存等记录介质中的状态设置，下载至与荧光观察装置100相连接的电子计算机等来使用。
此外，该程序可以经由诸如因特网的网络下载到外部电子计算机等并且使用。
应注意，本技术还可采用以下配置。
(1)
一种显微镜装置，包括：
开口部，包括第一狭缝和第二狭缝，来自观察对象的多束光穿过该第一狭缝和第二狭缝，该多束光由具有不同波长的多束照射光发射到该观察对象而产生；
色散元件，对穿过开口部的多束光进行波长色散；以及
成像元件，接收由色散元件波长色散的多束光，
其中，成像元件执行光接收，使得针对波长色散的多束光，穿过第二狭缝的光的零阶光与穿过第一狭缝的光的一阶光彼此不重叠。
(2)
根据(1)的显微镜装置，还包括照射单元，该照射单元用具有不同波长的多束照射光照射观察对象。
(3)
根据(1)的显微镜装置，还包括校正单元，该校正单元处理从成像元件接收到的成像数据。
(4)
根据(1)的显微镜装置，其中，成像元件执行光接收，使得穿过第二狭缝的光的零阶光位于穿过第一狭缝的光的零阶光与一阶光之间。
(5)
根据(1)的显微镜装置，其中，成像元件执行光接收，使得穿过第二狭缝的光的零阶光相对于穿过第一狭缝的光的一阶光位于穿过所述第一狭缝的所述光的二阶光侧。
(6)
根据(3)的显微镜装置，其中，针对从经波长色散的多束光分别获得的光信息，校正单元基于从穿过第二狭缝的光获得的光信息来校正从穿过第一狭缝的光获得的光信息。
(7)
根据(1)的显微镜装置，还包括滤波器，该滤波器仅允许来自观察对象的多束光中的在预定波长范围内的光通过。
(8)
根据(1)的显微镜装置，其中，波长色散的多束光中的至少一束光中的一阶光的波长带包括400nm至800nm中的部分或全部。
(9)
根据(1)的显微镜装置，其中，色散元件是因光的相干性来引起波长色散的衍射光栅。
(10)
根据(9)的显微镜装置，其中，衍射光栅是槽的截面形状为锯齿状的闪耀衍射光栅。
(11)
根据(1)的显微镜装置，其中，成像元件接收通过利用用作具有不同波长的多个照射光的激励光照射观察对象而得到的多束荧光。
(12)
根据(1)的显微镜装置，其中，开口部的狭缝距离等于或小于由物镜和成像透镜限定的、由成像元件提供的成像数据的视场直径。
(13)
根据(3)的显微镜装置，还包括：
扫描机构，随着时间来改变观察对象被照射光照射的位置，
其中，通过驱动扫描机构，成像元件随着时间在扫描方向上对经波长色散的多束光连续地成像，并且校正单元处理从成像元件接收的成像数据以获取观察对象的二维数据或三维数据。
(14)
根据(2)的显微镜装置，其中，照射单元以线状发射用作具有不同波长的多束照射光的激励光。
(15)
一种显微镜装置中的分光器，包括：
开口部，包括第一狭缝和第二狭缝，来自观察对象的多束光穿过该第一狭缝和第二狭缝，该多束光由具有不同波长的多束照射光发射到该观察对象而产生；
色散元件，对穿过开口部的多束光进行波长色散；以及
成像元件，接收由色散元件波长色散的多束光，
其中，成像元件执行光接收，使得针对波长色散的多束光，穿过第二狭缝的光的零阶光与穿过第一狭缝的光的一阶光彼此不重叠。
(16)
一种显微镜系统，包括：根据(1)至(14)中任一项的显微镜装置；以及用于处理由显微镜装置成像的成像数据的程序，
其中，该程序是用于使信息处理装置执行用于处理成像数据的校正处理的程序。
虽然上面已经描述了本公开的实施方式，但是本公开的技术范围不限于上述实施方式，并且在不背离本公开的主旨的情况下可以做出各种修改。
例如，图6示出Offner类型用作光谱成像单元30的情况的示例，并且衍射光栅35的外侧上的反射表面的曲率半径是反射镜34的内侧上的反射表面的曲率半径的一半，但是本公开不限于此。根据设计，它们的曲率半径之比可以不同于2:1。
此外，本说明书中描述的各个实施方式的效果仅是说明性的并且不受限制，并且可以提供其他效果。
附图标记列表
1 观察单元
2 处理单元
3 显示单元
10 激励单元
11 准直透镜
12 激光线滤波器
13 二向色镜
14 均化器
15 聚光透镜
16 入射狭缝
20 载物台
21 存储单元
22 数据校准单元
23 图像形成单元
30 光谱成像单元
31 开口部
32 成像元件
33 棱镜
34 反射镜
35 衍射光栅
40 观察光学系统
41 聚光透镜
42 二向色镜
43 二向色镜
44 物镜
45 带通滤波器
46 聚光透镜
50 扫描机构
60 聚焦机构
70 非荧光观察单元
80 控制单元。

Claims (16)

1.一种显微镜装置，包括：
开口部，包括第一狭缝和第二狭缝，来自观察对象的多束光穿过所述第一狭缝和所述第二狭缝，所述多束光由具有不同波长的多束照射光发射到所述观察对象而产生；
色散元件，对穿过所述开口部的所述多束光进行波长色散；以及
成像元件，接收由所述色散元件波长色散的多束光，
其中，所述成像元件执行光接收，使得针对经波长色散的所述多束光，穿过所述第二狭缝的光的零阶光与穿过所述第一狭缝的光的一阶光彼此不重叠。
2.根据权利要求1所述的显微镜装置，还包括：照射单元，所述照射单元用具有不同波长的多束所述照射光照射所述观察对象。
3.根据权利要求1所述的显微镜装置，还包括：校正单元，所述校正单元对从所述成像元件接收到的成像数据进行处理。
4.根据权利要求1所述的显微镜装置，其中，所述成像元件执行光接收，使得穿过所述第二狭缝的所述光的所述零阶光位于穿过所述第一狭缝的所述光的零阶光与所述一阶光之间。
5.根据权利要求1所述的显微镜装置，其中，所述成像元件执行光接收，使得穿过所述第二狭缝的所述光的所述零阶光相对于穿过所述第一狭缝的所述光的所述一阶光位于穿过所述第一狭缝的所述光的二阶光侧。
6.根据权利要求3所述的显微镜装置，其中，针对从经波长色散的所述多束光分别获得的光信息，所述校正单元基于从穿过所述第二狭缝的所述光获得的光信息来校正从穿过所述第一狭缝的所述光获得的光信息。
7.根据权利要求1所述的显微镜装置，还包括：光学滤波器，所述光学滤波器仅允许来自所述观察对象的所述多束光中的预定波长范围内的光通过。
8.根据权利要求1所述的显微镜装置，其中，经波长色散的所述多束光中的至少一束光的一阶光的波长带包括400nm至800nm中的一部分或全部。
9.根据权利要求1所述的显微镜装置，其中，所述色散元件是因光的相干性来引起波长色散的衍射光栅。
10.根据权利要求9所述的显微镜装置，其中，所述衍射光栅是槽的截面形状为锯齿状的闪耀衍射光栅。
11.根据权利要求1所述的显微镜装置，其中，所述成像元件接收多束荧光，所述多束荧光通过利用用作具有不同波长的多束所述照射光的激励光照射所述观察对象而得到。
12.根据权利要求1所述的显微镜装置，其中，所述开口部的狭缝距离等于或小于由物镜和成像透镜限定的、由所述成像元件提供的成像数据的视场直径。
13.根据权利要求3所述的显微镜装置，还包括：
扫描机构，随着时间来改变所述观察对象被所述照射光照射的位置，
其中，通过驱动所述扫描机构，所述成像元件随着时间连续地在扫描方向上对经波长色散的所述多束光进行成像，并且所述校正单元处理从所述成像元件接收的所述成像数据以获取所述观察对象的二维数据或三维数据。
14.根据权利要求2所述的显微镜装置，其中，所述照射单元以线状发射用作具有不同波长的多束所述照射光的激励光。
15.一种显微镜装置中的分光器，所述分光器包括：
开口部，包括第一狭缝和第二狭缝，来自观察对象的多束光穿过所述第一狭缝和所述第二狭缝，所述多束光由具有不同波长的多束照射光发射到所述观察对象而产生；
色散元件，对穿过所述开口部的所述多束光进行波长色散；以及
成像元件，接收由所述色散元件波长色散的多束光，
其中，所述成像元件执行光接收，使得针对经波长色散的所述多束光，穿过所述第二狭缝的光的零阶光与穿过所述第一狭缝的光的一阶光彼此不重叠。
16.一种显微镜系统，包括：根据权利要求1至14中任一项所述的显微镜装置；以及程序，用于处理由所述显微镜装置成像的成像数据，
其中，所述程序是用于使信息处理装置执行用于处理所述成像数据的校正处理的程序。
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