JP2007097582A - 微生物計数装置 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、微生物を含有するか含有する可能性のある検体に対し蛍光色素を用いて生菌および死菌を計数する微生物計数装置であり、従来から知られている手法と比較して正確性を向上させた微生物計数装置を提供すること。
【解決手段】異なる波長情報をもつ複数の画像上の発光点および／または発光点以外の座標の輝度値から、発光点がもつ蛍光発光の色彩的特性を算出して評価する蛍光評価部を備え、生菌および死菌計測における非特異的吸着や自家発光物の混入による測定誤差を低減し、正確性、信頼性を向上させたプログラムによる小型で低コストな微生物計数装置（１）を提供することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、環境試料、食品検体などの微生物の迅速検出に使用される生菌および死菌の計数装置における夾雑物との識別方法に関する。

従来、蛍光色素を用いて微生物の生菌および死菌を検出し、判別する手法の一例として蛍光性酵素基質であるフルオレセイン系蛍光色素による方法が知られている。フルオレセイン系蛍光色素は、細胞や微生物の細胞膜を透過して取り込まれると、細胞質内のエステラーゼ酵素群により加水分解され、フルオレセイン骨格を有する蛍光物質（フルオレセインなど）に変換されて発光機能が発現する。そこで励起光を照射することで生じる光点を生きている細胞や微生物として判定することができる（例えば、特許文献１参照）。

下記、特許文献１において、微生物の生死を判定するための蛍光色素として、エステラーゼ活性指標指示薬であるカルセイン誘導体及びヨウ化プロピジウムを用いた方法が提案されている。これは、微生物を上記２種類の色素で染色し、緑色および赤色の蛍光強度を測定し、その強度の比較を求めることで、生菌であるか死菌であるかをフローサイトメトリーにより判断するというものである。

また、更に別の手法として、土壌や水環境などの夾雑物が多く存在する試料から、発光物の蛍光スペクトルをもとに、細胞を判別することのできる手法が知られている（例えば、特許文献２参照）。

これは、干渉デジタル画像を取得できる顕微蛍光スペクトル測定装置を使用し、ＣＣＤ画像上のピクセルごとに得られた分光スペクトルを元に、あらかじめ指定したスペクトル波形と同一な波形をもつピクセルのみを抽出し、画像として生成することができるというものである。これを利用すると複雑なバックグラウンド自家蛍光をもつ夾雑物が混在するような試料であっても、目的の蛍光発光物を判別、計測できるというものである。
特開平１１−１４６７９８号公報 特開２００２−２９１４９９号公報

しかしながら、上記特許文献１のような従来の方法では、２つの試薬の蛍光強度から生菌および死菌を検出することはできるが、必ずしも全ての細胞を検出できているとはいえない。これはエステラーゼ分解性の色素に共通の課題であるが、微生物の種類によっては酵素の発現量が異なり、全く染色されないものが存在し、またそれ以外にも微生物の置かれている環境や活性状態によって染色性に大きな差があり、一時的な測定結果だけでは正確な生菌の検出ができているとはいえないためである。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、高い染色性、標識力を持つ核酸結合性の蛍光性化合物を使用することで、微生物のもつ酵素活性などの不安定要因に影響を受けることなく、安定して高感度な微生物の検出方法を提供することを目的としている。

また、一般的なフローサイトメータにおいて、当業者に良く知られている事実であるが、微生物を特定するために蛍光強度ならびに前方散乱光を測定して蛍光強度と粒子の大きさから判断している。そのため、装置には蛍光を検出するための検出器の他に、散乱光を検出するための別の検出器を設ける必要が生じ、装置構成が複雑化するという課題がある。

また、複数の染色試薬を用いる場合、フローセルを流れる細胞一つ一つに対して、複数の励起光源を使用するには、照射位置の距離をおいて高い精度で粒子を流す機構を設け、時間差で出現する発光シグナルを一致させる手段と、流速を頻繁にキャリブレーションする工程が必要となる。そのため、このようなフローサイトメータは高価であり、管理方法も複雑多岐になる。そのため、頻繁に使用される手法としては同一の励起光源で励起することが可能な染色試薬を使用し、同時に異なる蛍光を測定するというものである。しかし、このような手法では使用できる染色試薬に制限があるばかりか、染色試薬を最適な励起波長で使用できないため、感度が低下するという課題がある。

また、フローサイトメータの別形態として、同一の照射位置に複数の励起光源を同時に照射し、得られた複雑な合成蛍光スペクトル波形と、蛍光色素の標準スペクトル波形を比較して、蛍光色素ごとのスペクトルを分離し、強度を比較することができるというものがあり、当業者に良く知られた事実である。しかし、このような手法では、装置が高価になるうえ、既知の試料のみの評価しか行うことができず、未知試料において自家蛍光の多い場合や、蛍光波長のシフトが見られるような場合には、スペクトル波形の分離が行えず、解析が困難になるという課題がある。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、蛍光強度と粒子の大きさを同時に取得できる受像素子を使用して装置構成を簡略化することができ、微生物を固定して測定を行うことにより、異なる励起光源を切り替えることで簡便かつ容易に異なる染色試薬の画像を取得することができ、また最適波長で使用することができるため、小型でコンパクトかつ高精度である微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、特許文献２のような手法の場合、干渉デジタル画像を取得する顕微蛍光スペクトル測定装置が非常に高価であり、また１画面ごとに測定波長範囲を走査しなければならず、例えメンブレンフィルタのようなろ過濃縮手段を利用しても、測定時間が非常に長くなってしまう為、現実的ではない。更に測定を行う間、常に強い励起光を照射し続ける必要があるため、蛍光色素が褪色しやすく、安定した計測を常に行うことが求められる微生物検査用途においては使用が困難である。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、夾雑物を判別するのに必要な色彩的特性を最小限に取得することで、安価な装置を実現でき、更に測定時間も極めて短くて済むため迅速検査に使用することが可能であり、かつ蛍光色素の褪色も抑えることが可能であるために高精度である微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、蛍光染色を用いた微生物の検出方法において、蛍光発光が微生物由来なのか、もしくは微生物以外の夾雑物に非特異的に吸着したものに由来するのか、さらには自家蛍光に由来するものなのか、特性を高い精度で検出することができる手法が求められている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、複数の画像から輝度情報を取得して発光物の蛍光発光が微生物に由来するものであるかどうかを評価して、夾雑物を排除し、高い精度で微生物の数を求める微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、蛍光染色を用いた微生物の検出方法において、より簡便に精度の高い蛍光発光を評価する特徴量を求める手法が求められている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、励起波長や蛍光波長のクロストークが少ない蛍光染色試薬を使用して、それぞれの蛍光発光に対して、複数の波長の画像を取得し、輝度値を求めることで、限られた励起光源や分光フィルタ、受像素子などの限られた構成要素を大きく変えることなく、簡便に微生物の識別精度の高い特徴量を取得できる微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、微生物の生菌、死菌を検出する方法において、顕微鏡観察によって蛍光色素の強度を観察する手法では作業者ごとの熟練性の違いによる微生物認識精度の誤差が大きく、微生物の発光状態を客観的に数値化することで夾雑物を微生物と誤認識することを防止し、精度良く検出する手法が求められている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、微生物の発光状態を測定し、色度や色相角などの色彩的特性を示す値にすることで、生菌、死菌の色の違いだけでなく、混入した自家蛍光物質や、色素が非特異的吸着した粒子などの夾雑物の微妙な色の違いを客観的に判定し、精度良く生菌、死菌、微生物以外の夾雑物であること判別することができる微生物の検出方法を提供することを目的としている。

また、微生物の発光物の色彩情報を得るために、２次元空間での顕微蛍光スペクトルを取得すると装置構成が複雑化するため、より簡便に取得できる情報から色彩情報を得ることが求められている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、各波長で取得した画像から各波長の輝度値を読み取ることで、データを取得する装置構成は適当な受光フィルタと受像素子のみで実施することができるため、シンプルかつ小型な装置で、精度を向上させることができる微生物計数装置を実現することができる。

また、発光物の色彩的特性をもって、より簡便かつ客観的に評価できる手法が求められている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、色彩的特性の数値に対してしきい値を設けることで、より客観的に判定、計数を行うことができる微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、さまざまな複数の蛍光染色試薬を使用して、微生物の様々な状態を評価するとき、色彩的特性がさまざまであるため、目的の細胞集団ごとに色彩的特性の値を設定して計数することが求められている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、細胞集団が複数あった場合に、それぞれに色彩的特性の値を設定して、判断し、分類することができる微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、画像から色彩的特性を求める場合、画像データの量が膨大になってしまい、データの演算時間が長くかかってしまうばかりか、干渉フィルタの数、撮像枚数が増えることで、更に膨大な時間を要してしまい、迅速性を低下させてしまうことから、より少ないデータで精度の高い計数方法が求められている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、色彩的特性を得るのに必要なＲＧＢの三原色に対し、青色（Ｂ）にあらかじめ発光強度をもたない蛍光染色試薬を使用することや、また青色の波長域に透過性をもたない干渉フィルタによる測定条件下において測定すること、さらに青色の輝度値を取得せず、あらかじめ指定した値を代入して使用することで、赤色（Ｒ）および緑色（Ｇ）のみのデータから画像中の発光点のもつ色彩的特性を表現することが可能になる。これにより計測中のメモリ使用量を減らすことができ、迅速に計数が行える微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、微生物を蛍光染色試薬で染色し、計数する場合、蛍光顕微鏡で同じ試料を観察し、計数が正確に行えているか、確認、評価することが必要であるが、試料中のどの発光物を微生物として判定しているのか容易に確認できる方法が求められている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、微生物と判定した発光物の色彩的特性と同じ色を表示させる表示部を備えることで、蛍光顕微鏡で観察した場合に、どの発光物を微生物として判定しているかを確認することができ、また、熟練者でなくとも色彩から微生物であるかどうかを容易に確認することができる利便性の高い微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、微生物の計数に使用するためのＰＣ上で動作するプログラムのグラフィックユーザーインターフェースにおいて、微生物と判定した発光点の色彩を表示させる場合、実験者が顕微鏡で観察した像と異なる印象をもち、間違った判断がされないよう表示される方法が必要とされている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、微生物を表すオブジェクトと表示させる枠内の背景色を暗黒色とすることで、発光点の周辺部や輪郭、中心部などの背景色とのコントラストが蛍光顕微鏡における像と同様に観察することができるため、実験者が顕微鏡観察像のうち微生物として判定された発光物の確認を行うとき、色彩による認識性が向上した微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、微生物の計数を行う検査の場合、一連の処理が全て終了してから結果が出力されるのでは、結果が得られるのに時間がかかってしまい、次の工程に移ることが遅れてしまうなどの課題がある。

本発明では、このような従来の課題を解決するものであり、計数の過程において各撮像位置ごとに、検出オブジェクト数、発光画像を表示することで、計数の途中であっても、各位置ごとの菌数の存在状態と妥当性を判断することができ、さらに計数する全面積から計算すれば、最終結果を予測し、結果が出される前からあらかじめ次の行動へと移ることができるため、迅速検査を構築することができる微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、微生物の計数を行う工程において、取得した発光画像をプログラム上で表示する場合、目的の発光物が実際の蛍光色と異なる発光で表示された場合、顕微鏡による像と同じ部分を探すことが非常に難しくなるという課題がある。

本発明では、このような従来の課題を解決するものであり、取得した発光画像を個々の発光物の色彩情報を反映させてカラー画像として表示させることで、顕微鏡で確認する作業を容易に行うことができる微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、微生物の発光画像を表示した場合、目的以外の発光点が多いと、判定された微生物が目的以外の発光点にまぎれてしまい見づらくなってしまうという課題がある。

本発明では、このような従来の課題を解決するものであり、目的とする微生物などの発光点以外を暗色などの異なる色で表示することにより、発光点が非常に多い画像であっても、その中から微生物として判定したものを顕微鏡の像の発色と同様な画像で表示することができ、さらに発光画像を目視確認した際に、目的外の発光点との判断が容易に行うことができる微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、微生物の発光画像において、発光点を色分けする場合、カラー画像の色彩情報は、もとの白黒画像の輝度によって変化してしまうが、この輝度が露光時間によって変化するため、カラー画像を合成したときも表示する色彩が変化してしまうという課題がある。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、あらかじめ個々の波長の画素輝度と露光時間、色彩情報について特性を求め、露光時間の関数を係数として白黒画像の画素の輝度に乗算し、その結果をカラー合成に使用することで、露光時間が変化した場合でも、顕微鏡の像にみられる色彩特性と変わらずに画像を表示することが可能となり、画像の目視確認による判定の簡便性を向上させた微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、微生物の生菌、死菌、異物を判定する方法において、微生物の種類や環境の違いにより、生菌のような発光色を示す異物と、死菌のような発光色を示す異物が存在し、これらの異物は一つの判断基準で処理することは難しく、処理方法のフローによっては精度が低下し、余計な処理が追加されるなど効率性を欠くという課題がある。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、生菌か死菌であるかを判断する生死判断部を設けることで、微生物判断部との処理を分割し、生菌、死菌からそれぞれに近い異物を判別して除外することで精度を向上させ、また生死判断を上段にもつフローとすることでその処理工程を効率的に実行することができる微生物の計数装置を提供することを目的としている。

また、色彩情報を取得する方法において、発光点が非常に小さいものであった場合、ＲＧＢなど波長が異なる画像の輝度情報を取得するためにカラーＣＣＤのようなカラー情報が取得できる受像素子を使用すると、受像素子上の色感度をもつ素子が並んで配列されており、同一画素での色情報とはならないため、１画素のズレが影響してしまうような微小な発光体では、正確に色彩的特性を取得することが困難であるという課題がある。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、色彩的特性を算出するために必要な波長の異なる画像の輝度値を、それぞれの色ごとに取得した画像から座標の値に基づいて抽出することで、正確に同じ位置の色彩情報を取得することができ、微生物のような微小な発光点であっても、精度良く色彩的特性を取得でき、生菌、死菌、または微生物以外の夾雑物であることを判別することができる微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、微生物の生菌、死菌を判別する手法において、微生物の生菌、死菌、微生物以外の夾雑物であることを簡便かつ漏れがないように効果的に使用することができる手法が求められている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、生死判断部で生菌群と死菌群に分類した後、微生物判断部によってそれぞれに色彩的特性を算出し、微生物であるかを判断することによって、効果的かつ漏れがないように生菌、死菌の判別が行える微生物の計数装置を提供することを目的としている。

また、染色された微生物を画像として取得する場合、微生物が媒体中に拡散していると、ピントが合いにくく、精度良く輝度を取得することが難しい。

また、異なる波長のデータを取得しようとする際にも、微生物が媒体中に拡散していると、カラーＣＣＤでは、それぞれの波長に色感度をもつ電荷結合素子の配列の問題から、微生物の発光点における同じ位置の情報を取得することが難しく、極端には、菌と菌周辺の位置の測定となるため、正確な色彩情報を取得できないという課題がある。

また、複数の画像を取得して、各波長の輝度値を抽出しようとする場合、微生物が媒体中に拡散していると、同じ微生物が異なる位置に写ってしまうため、各画像での微生物の一致が難しく、色情報を抽出できなくなるという課題がある。

また、微生物を染色する場合、検体スケールが大きい場合や、検体中の微生物濃度が低い場合には、濃縮するための前処理を行う必要がある。例えば、水道水であれば１００ｍＬあたりの菌数検査が必要であり、さらにはボトリングされた飲料であれば、ボトル１本の容量（例えば５００ｍＬや１．８ｍＬ）での検査が必要になる。さらにはこのような検体に対しても染色試薬は同濃度で染色処理をするために大量の蛍光染色試薬が必要となるため環境負荷影響が大きく、また検体に含まれる成分の影響によって染色力が異なるため、安定して染色できるように検体成分を分離して観察することが要求されている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、検体中の微生物を表面に固定することで、発光点ごとに色彩情報を精度良く求めることが容易になり、簡便かつ精度の高い微生物計数装置を提供することができる。

さらには、検体をろ過して捕集するする手段を用いた場合、メンブレンフィルタなどの表面に微生物を濃縮し、検体中に溶解している染色阻害成分を除去することができ、安定して細胞内での経時的な発光を観察することができる。また最小限の蛍光染色試薬を使うことで環境負荷影響を最小限に低下させた微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、検体中の微生物をメンブレンフィルタなどで捕集する場合、フィルタが薄く小さいために、移動させようとした場合にフィルタ上部に触れてしまう恐れがあり、無菌的に取り扱うのが困難で、検査結果に支障をきたす場合がある。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、メンブレンフィルタなどの微生物の固定部に枠を設けることで、メンブレンフィルタの取り扱い性を向上させ、効率が上がり、安定した結果を得る事ができる微生物計数装置を提供することができる。

また、メンブレンフィルタ表面の微生物を計測し、同じものを顕微鏡で確認しようとした場合、メンブレンフィルタの向きを定められなければ同じ画像を得る事ができず、微生物計数装置で取得した画像中の発光点が、微生物であるかどうかの判定が困難となる。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、メンブレンフィルタなどの固定部の枠に、向きを定められる目印を設けることで、微生物検査装置で観察した方向と同じ方向になるように、メンブレンフィルタを顕微鏡のステージに固定する事ができるため、同じ位置を同じ角度で観察する事が容易になり、発光点が微生物であるかどうかを顕微鏡で確認し、精度の高い結果を得る事ができる微生物計数装置を提供する事を目的としている。

また、メンブレンフィルタを目印を参考に向きを合わせてステージに置く場合、目印が１つであった場合には、目印の向きがあっていても回転や平行移動するなどにより、顕微鏡で同じ位置を特定することが困難である場合がある。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、メンブレンフィルタなどの固定部の枠に、水平方向に３箇所以上の凸部を、固定部の中心から同心円上に対して非対称に設けたことで、回転や平行移動などを防止し、簡単に向きを合わせられるようになるため、効率よく顕微鏡で確認する事ができる微生物計数装置を提供する事ができる。

また、メンブレンフィルタ表面を顕微鏡で観察しようとする場合に、枠付近まで微生物の固定に使用すると、顕微鏡の対物レンズのうち、倍率の高い焦点深度の浅いレンズでは、枠がレンズにあたってしまい、ピントを合わせる事ができず、低倍率でしか観察ができなくなり、精度が低下するという課題がある。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、メンブレンフィルタなどの固定部の上方および／または下方に、固定部開放部分の面積よりも小さい開口面積をもつ薄膜を設けることで、メンブレンフィルタの中心部分にのみ微生物を固定できるため、メンブレンフィルタのうち枠に近い部分、すなわち高倍率のレンズで観察できない領域を使用せず、中心部分のみを利用できるようになるため、全ての発光物を高倍率で観察でき、精度の高い微生物計数装置を提供する事ができる。

また、メンブレンフィルタ表面を顕微鏡で観察しようとする場合に、対物レンズが枠に触れないようにし、かつ部品点数を減らしたい場合がある。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、メンブレンフィルタなどの固定部の上方開口面積が、下方開口面積よりも大きいものとすることで、メンブレンフィルタの中心部分のみに微生物を補修することができ、更に部品点数を増やさずに寸法のみで実施する事ができるため、精度が高く、コストを抑えた微生物計数装置を実現する事ができる。

本発明の微生物検出方法は上記目的を達成するために、請求項１記載のとおり、複数の発光画像を取得して微生物を検出する方法において、微生物の発光点および／または発光点以外の輝度を取得し、蛍光発光の特性を示す値を求め、種類を評価する蛍光評価部を備えることを特徴としたものであり、蛍光染色試薬の蛍光発光が、微生物由来であるか、微生物以外の夾雑物由来であるかを評価し、発光点の中から微生物だけを高い精度で検出し、計数することができる微生物計数装置が得られる。

また、請求項２記載の微生物計数装置は、請求項１記載の微生物計数装置において、蛍光評価部において、蛍光発光の色彩的特性を示す値を算出し、発光点の種類が微生物の生菌、死菌、もしくは微生物以外の夾雑物のいずれかであることを判断することを特徴としたものであり、異なる波長の画像から色度、色相角、彩度、明度などの色彩的特性を使用することで、複数の画像の輝度から蛍光発光の特徴量を示す値を簡便に求めることができ、さらに微生物と夾雑物を判別する精度が高い手法を実現できる。

また、請求項３記載の微生物計数装置は、請求項１または２記載の微生物計数装置において、蛍光評価部において、色彩的特性を示す値に対してしきい値を設けたことを特徴としたものであり、色彩的特性の特徴量から、生菌、死菌、または夾雑物であることを客観的に判断することができ、判断部により自動化された微生物計数装置を実現できる。

また、請求項４記載の微生物計数装置は、請求項１から３のいずれかに記載の微生物計数装置において、前記色彩的特性として、ＸＹＺ表色系のｘとｙの値を使用することを特徴としたものであり、色彩的特性をｘとｙの２軸で表現し、しきい値を設定することで、より正確な色情報を表現し、分類することが可能であり、精度を高めた微生物計数装置を実現することができる。

また、請求項５記載の微生物計数装置は、請求項１から４のいずれかに記載の微生物計数装置において、蛍光評価部にて青色の輝度値を取得せずに、色彩情報を算出することを特徴としたものであり、色彩的特性を求めるのに必要な、赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）、青色（Ｂ）のデータのうち、二つのデータのみで実行するため、メモリ使用量が少なく、またプログラムの構成も簡便化して処理の迅速性を高めることができ、光源や受光フィルタなどの装置構成も省略することができるため、小型かつコンパクトで迅速な微生物計数装置を実現することができる。

また、請求項６記載の微生物計数装置は、請求項５に記載の微生物計数装置において、前記蛍光染色試薬が、青色の波長域に強度を持たないものとすることを特徴としたものであり、青色の波長域の計測を省略することができるため、迅速性を高めた微生物計数装置を実現することができる。

また、請求項７記載の微生物計数装置は、請求項５から６のいずれかに記載の微生物計数装置において、青色の波長域に透過性を持たない干渉フィルタを使用して発光画像を取得することを特徴としたものであり、青色の波長域の強度がない画像であるため、色彩的特性を求める際にも青色の強度がないものとして、青色の画像に関する一連のデータ処理を省略することができるため、プログラムの迅速性を向上させた微生物計数装置を提供することができる。

また、請求項８記載の微生物計数装置は、請求項５から７のいずれかに記載の微生物計数装置において、前記蛍光評価部において、青色の輝度値をあらかじめ指定した値とすることを特徴としたものであり、青色の輝度を取得せずに、あらかじめ標準的な試料を使用して求められた値をパラメータとして使用することで、計測に使用する画像の種類を減らし、データ量を軽減しても、元の３原色によるデータの判定精度を落とすことなく計測できるため、迅速かつ精度の高い微生物計数装置を提供することができる。

また、請求項９記載の微生物計数装置は、請求項１から８のいずれかに記載の微生物計数装置において、検出対象の発光点の色彩と、検出対象以外の発光点の色彩を表示する表示部を備えることを特徴としたものであり、微生物と判定した発光点を顕微鏡で確認するときに、どの発光物が微生物であるのかを、表示部の表示色を比較しながら容易に判断することができるため、検査結果の確認作業を迅速に行うことができる微生物計数装置を提供することができる。

また、請求項１０記載の微生物計数装置は、請求項９に記載の微生物計数装置において、前記表示部の背景色が暗黒色であることを特徴としたものであり、表示部の表示色を、顕微鏡による観察と同じ暗黒色とすることで、発光物の周辺部や輪郭、中心部などのコントラストを同等にすることができるため、検査結果の確認作業の正確性を向上させた微生物検査システムのための微生物計数装置を構築することができる。

また、請求項１１記載の微生物計数装置は、請求項１から１０のいずれかに記載の微生物計数装置において、撮像エリアごとの微生物の発光画像とオブジェクトの個数を表示することを特徴としたものであり、計測中であっても、１画像中の微生物数と、その画像の妥当性を判断することができ、最終結果が出る前に、結果を予測することができるため、迅速な体制をとることが可能な微生物検査システム、微生物計数装置を提供することができる。

また、請求項１２記載の微生物計数装置は、請求項１から１１のいずれかに記載の微生物計数装置において、前記発光画像が、色彩情報にもとづいたカラー画像であることを特徴としたものであり、取得した発光画像を色彩情報に基づいてカラー表示することにより、顕微鏡による確認作業において、発光画像と顕微鏡の像を比較することが容易になるため、発光物の確認作業の正確性を向上させることができる。また熟練者でなくとも発光物の中から微生物を探し出すことが容易になり、検査時間を短縮するとともに測定精度管理の正確性を向上させた微生物検査システムのための微生物計数装置を提供することができる。

また、請求項１３記載の微生物計数装置は、請求項１２に記載の微生物計数装置において、前記発光画像が、複数の白黒画像を１枚に合成した画像であることを特徴としたものであり、判定データに基づいてカラー画像の色分けをしなくとも、もとの固有の波長を持つ白黒画像を重ねあわせることで、発光物の色彩を正確に表現することができ、表示用画像を作成するためのデータの演算処理を軽減し、迅速に測定が行える微生物計数装置を提供することを目的としている。

また、請求項１４記載の微生物計数装置は、請求項１３に記載の微生物計数装置において、前記発光画像が、白黒画像の画素のもつ輝度に対してそれぞれの露光時間をパラメータとした関数を乗算した画像から合成されたものであることを特徴としたものであり、非常に輝度が低い微生物と、輝度が高い微生物が存在した場合に、露光時間を変えて画像を取得する必要があり、このとき白黒画像の露光時間を関数とした係数を白黒画像の画素の輝度値に乗算し、画像を演算した後に合成することで、色彩的特性を損ねることなく撮像条件を変更し、精度良く計数を行うことができる微生物計数装置を提供することができる。

また、請求項１５記載の微生物計数装置は、請求項１から１４のいずれかに記載の微生物計数装置において、蛍光評価部において、生菌または死菌であることを判断する生死判断部と、それ以降に微生物または微生物以外の夾雑物であることを判断する微生物判断部を備えたことを特徴としたものであり、生死判断と、それによって分類された発光物に対して微生物か夾雑物であるかを判断することで、色彩的特性を効果的に扱うことができ、判別工程を効率化し、判別精度を高めた微生物計数装置を実現することができる。

また、請求項１６記載の微生物計数装置は、請求項１５記載の微生物計数装置において、生死判断部において生菌群もしくは死菌群であることを判断し、微生物判断部においてそれぞれに設定された色彩的特性に対するしきい値と比較し、発光点が微生物の生菌、死菌もしくは微生物以外の夾雑物のいずれかであることを判断することを特徴としたものであり、複数の異なる波長特性をもつ蛍光染色試薬で、さまざまな状態や、種類、また環境状態が異なる微生物集団に対して、一つのしきい値をもって判断するのではなく、生死それぞれの微生物集団に対して最適なしきい値を設定することによって、複雑なミクロフローラを形成した検体であっても、精度良く生菌、死菌および夾雑物であることを判別することができる微生物計数装置を実現できる。

また、請求項１７記載の微生物計数装置は、請求項１から１６のいずれかに記載の微生物計数装置において、撮像エリアごとに波長の異なる画像を連続的に取得し、蛍光評価部において各画像の輝度から色彩的特性を示す値を算出することを特徴としたものであり、色彩的特性を示す画像を各撮像位置で連続して取得することで、サンプルの変化の影響を受けず、精度の高い画像を取得することができる微生物計数装置を実現できる。

また、請求項１８記載の微生物計数装置は、請求項１から１７のいずれかに記載の微生物計数装置において、微生物を固定する固定部を設けたことを特徴としたものであり、例えばメンブレンフィルタなどのろ過膜や、スライドグラス表面、培養ディッシュ底面などの表面に固定する固定部により、微生物の画像を取得する際の露光時間を上げて感度を向上させ、またピントの調節が容易になるため簡便な操作性を実現でき、さらに色彩的特性を求めるために複数の画像にて複数の発光点をまとめて取得することができるため、精度の良い判別装置でかつまとめて処理するため計測を迅速化することを両立させた微生物計数装置を実現することができる。

また、請求項１９記載の微生物計数装置は、請求項１８に記載の微生物検査装置において、固定部に一体型の枠を設けたことを特徴としたものであり、検体中の微生物をメンブレンフィルタなどで捕集する場合、枠を設けることで、メンブレンフィルタの取り扱い性を向上させ、効率が上がり、安定した結果を得る事ができる微生物計数装置を提供することができる。

また、請求項２０記載の微生物計数装置は、請求項１９記載の微生物計数装置において、固定部の枠に、平面上の向きを定められる目印を設けたことを特徴としたものであり、メンブレンフィルタなどの固定部の枠に、向きを定められる目印を設けることで、微生物検査装置で観察した方向と同じ方向になるように、メンブレンフィルタを顕微鏡のステージに固定する事ができ、同じ位置を同じ角度で観察する事が容易になって、発光物が微生物であるかどうかを顕微鏡で確認して精度精度を高めた微生物計数装置を実現する事ができる。

また、請求項２１記載の微生物計数装置は、請求項１９記載の微生物計数装置において、固定部の枠に、３箇所以上の凸部を固定部の中心に対し非対称に設けたことを特徴としたものであり、メンブレンフィルタなどの固定部の枠に、水平方向に３箇所以上の凸部を、固定部の中心から同心円上に対して非対称に設けたことで、回転や平行移動などを防止し、簡単に向きを合わせられるようになるため、効率よく顕微鏡で確認する事ができる微生物計数装置を実現する事ができる。

また、請求項２２記載の微生物計数装置は、請求項１９記載の微生物計数装置において、 固定部の上方および／または下方に、固定部開放部分の面積よりも小さい開口面積をもつ薄膜を設けたことを特徴としたものであり、メンブレンフィルタなどの固定部の上方および／または下方に、固定部開放部分の面積よりも小さい開口面積をもつ薄膜を設けることで、メンブレンフィルタの中心部分にのみ微生物を固定できるため、メンブレンフィルタのうち枠に近い部分、すなわち高倍率のレンズで観察できない領域を使用せず、中心部分のみを利用できるようになるため、全ての発光物を高倍率で観察でき、精度の高い微生物計数装置を実現する事ができる。

また請求項２３記載の微生物計数装置は、請求項１９記載の微生物検査装置において、固定部の上方開口面積が、下方開口面積よりも大きいことを特徴としたものであり、メンブレンフィルタなどの固定部の上方開口面積が、下方開口面積よりも大きいものとすることで、メンブレンフィルタの中心部分のみに微生物を補修することができ、更に部品点数を増やさずに寸法のみで実施する事ができるため、精度が高く、コストを抑えた微生物計数装置を実現する事ができる。

本発明の微生物計数装置によれば、蛍光発光を評価する蛍光評価部をによって、蛍光染色試薬の蛍光発光が、微生物由来であるか、微生物以外の夾雑物由来であるかを判別することができる。

また、微生物を迅速に検査できる検査システムを構築し、食品や化成品、水などの製造、物流システムを効率化することができる。

また、蛍光染色試薬の蛍光発光を精度良く評価することにより、より確実に微生物だけを検出することができる。

また、微生物の検査の熟練者でなくとも、発光画像から微生物有無の判定を容易に行うことができる。

また、発光画像の確認を容易に行うことができるため、迅速な微生物検査システムの精度を向上し、検査時間を短縮することで、効率化を図ることができる。

また、視覚的に微生物の存在を示すことで、微生物衛生管理に対する作業者の意識を向上させることにつながり、衛生管理システムの品質を向上させることができる。

また、微生物だけを検出することにより、検査結果の確実性が向上し、微生物汚染の少ない食品や化成品、水などの製品を提供することができる。

また、微生物だけを検出することにより、より確実に微生物の発酵工程を管理することができ、品質の安定した製品を提供することができる。

また、微生物だけを検出することにより、廃水や土壌などの汚染処理の工程管理が迅速に行えるようになり、効率化された処理技術が実現できる。

また、色度、色相角、彩度、明度などの色彩的特性を使用することで、複数の画像の輝度から判別精度の高い蛍光発光の特徴量を示す値を簡便に求めることができる。

また、色彩的特性を示す値に対してしきい値を設けることで、判断の客観性を高めることができる。

また、色彩的特性を示す値に対してしきい値を設けることで、判別工程を判断部により自動化することができる。

また、さまざまな状態や、種類、また環境状態が異なる微生物集団に対して、それぞれ最適なしきい値を設定することによって、複雑なミクロフローラを形成した試料から生菌、死菌をそれぞれ集団ごとに求めることができる。

また、生菌または死菌であることを判断する工程を行う生死判断部と、微生物と微生物以外の夾雑物であることを判断する微生物判断部をそれぞれ別に設けることで、判別工程を効率化することができる。

また、生菌、死菌それぞれの蛍光発光に対して、最適な色彩特性値を設定することで、夾雑物の除去精度を高め、より確実に微生物だけを検出することができる。

本発明の請求項１記載の発明は、複数の発光画像を取得して微生物を検出する方法において、微生物の発光点および／または発光点以外の輝度を取得し、蛍光発光の特性を示す値を求め、種類を評価する蛍光評価部を備えることを特徴としたものであり、蛍光染色試薬の蛍光発光が、微生物由来であるか、微生物以外の夾雑物由来であるかを評価し、発光点の中から微生物だけを高い精度で検出することができるという作用を有する。

また、請求項２記載の発明は、蛍光評価部において、蛍光発光の色彩的特性を示す値を算出し、発光点の種類が微生物の生菌、死菌、もしくは微生物以外の夾雑物のいずれかであることを判断することを特徴としたものであり、異なる波長の画像から色度、色相角、彩度、明度などの色彩的特性を使用することで、複数の画像の輝度から蛍光発光の特徴量を示す値を簡便に求めることができるという作用を有する。

また、請求項３記載の発明は、蛍光評価部において、色彩的特性を示す値に対してしきい値を設けたことを特徴としたものであり、色彩的特性の特徴量から、生菌、死菌、または夾雑物であることを客観的に判断し、自動化することができるという作用を有する。

また、請求項４記載の発明は、前記色彩的特性として、ＸＹＺ表色系のｘとｙの値を使用することを特徴としたものであり、色彩的特性をｘとｙの２軸で表現し、しきい値を設定することで、より正確な色彩情報を表現し、分類できるという作用を有する。

また、請求項５記載の発明は、蛍光評価部にて青色の輝度値を取得せずに、色彩情報を算出することを特徴としたものであり、色彩的特性を求めるのに必要な、赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）、青色（Ｂ）のデータのうち、二つのデータのみで実行するため、光源や受光フィルタなどの装置構成も簡略化することができるため、計数装置を小型化できるという作用を有する。

また、請求項６記載の発明は、前記蛍光染色試薬が、青色の波長域に強度を持たないものとすることを特徴としたものであり、青色の波長域の計測を省略することができるため、メモリ使用量を軽減できるため、迅速性を高めることができるという作用を有する。

また、請求項７記載の発明は、青色の波長域に透過性を持たない干渉フィルタを使用して発光画像を取得することを特徴としたものであり、青色の波長域の強度を持たない画像を作ることができ、青色のデータを使用しない手法において色彩情報の正確性を高めることができる作用を有する。

また、請求項８記載の発明は、前記蛍光評価部において、青色の輝度値をあらかじめ指定した値とすることを特徴としたものであり、色彩特性を算出する演算処理を単純化することができ、処理速度を向上させることができるという作用を有する。

また、請求項９記載の発明は、検出対象の発光点の色彩と、検出対象以外の発光点の色彩を表示する表示部を備えることを特徴としたものであり、微生物と判定した発光点を顕微鏡で確認するときに、どの発光物が微生物であるのかを、表示部の表示色を比較しながら容易に判断することができるため、検査結果の確認作業を迅速化できるという作用を有する。

また、請求項１０記載の発明は、前記表示部の背景色が暗黒色であることを特徴としたものであり、表示部の表示色を、蛍光顕微鏡と同じ暗黒色とすることで、表示部の色が見やすくなり、顕微鏡像の中から微生物の有無を判定する確認作業の正確性を向上させることができるという作用を有する。

また、請求項１１記載の発明は、撮像エリアごとの微生物の発光画像とオブジェクトの個数を表示することを特徴としたものであり、計測中であっても、１画像中の微生物数と、その画像の妥当性を判断することができ、最終結果が出る前に結果を予測することができるため、微生物検査システムの迅速化、効率化を図ることができるという作用を有する。

また、請求項１２記載の発明は、前記発光画像が、色彩情報にもとづいたカラー画像であることを特徴としたものであり、顕微鏡による確認作業において、カラー画像と顕微鏡の像を比較することが容易になるため、熟練者でなくとも発光物の中から微生物を探し出すことが容易になり、簡便性を向上させることができるという作用を有する。

また、請求項１３記載の発明は、前記発光画像が、複数の白黒画像を１枚に合成した画像であることを特徴としたものであり、判定データに基づいてカラー画像の色分けをしなくとも、もとの固有の波長を持つ白黒画像に最適な表示色を持たせて合成することで、発光物の色彩を正確に表現することができ、表示用画像を作成するためのデータの演算処理を軽減し、プログラムの処理工程を迅速化することができるという作用を有する。

また、請求項１４記載の発明において、前記発光画像が、白黒画像の画素のもつ輝度に対してそれぞれの露光時間をパラメータとした関数を乗算した画像から合成されたものであることを特徴としたものであり、発光強度が異なる微生物種が混在した場合に露光時間を変えた場合も、白黒画像の露光時間を関数とした係数を白黒画像の画素の輝度値に乗算したものをカラー合成に使用することで、色彩的特性を損ねることなく画像を得ることができ、精度を向上させることができるという作用を有する。

また、請求項１５記載の発明は、蛍光評価部において、生菌または死菌であることを判断する生死判断部と、それ以降に微生物または微生物以外の夾雑物であることを判断する微生物判断部を備えたことを特徴としたものであり、生死判断と、それによって分類された発光物に対して微生物か夾雑物であるかを判断することで、色彩的特性を効果的に扱うことができるという作用を有する。

また、請求項１６記載の発明は、生死判断部において生菌群もしくは死菌群であることを判断し、微生物判断部においてそれぞれに設定された色彩的特性に対するしきい値と比較し、発光点が微生物の生菌、死菌もしくは微生物以外の夾雑物のいずれかであることを判断することを特徴としたものであり、複数の異なる波長特性をもつ蛍光染色試薬で、さまざまな状態や、種類、また環境状態が異なる微生物集団に対して、一つのしきい値をもって判断するのではなく、生死それぞれの微生物集団に対して、個別に最適なしきい値を設定することによって、複雑なミクロフローラを形成した検体であっても、分類精度を発揮できるという作用を有する。

また、請求項１７記載の発明は、撮像エリアごとに波長の異なる画像を連続的に取得し、蛍光評価部において各画像の輝度から色彩的特性を示す値を算出することを特徴としたものであり、色彩的特性を示す画像を各撮像位置で連続して取得することで、サンプルの変化の影響を受けずに、安定性を高めることができるという作用を有する。

また、請求項１８記載の発明は、微生物を固定する固定部を設けたことを特徴としたものであり、例えばメンブレンフィルタなどのろ過膜や、スライドグラス表面、培養ディッシュ底面などの表面に固定する固定部により、微生物の画像を取得する際の露光時間を上げて感度を向上させる作用を有する。またピントの調節が容易になるため簡便な操作性を実現できるという作用を有する。さらに色彩的特性を求めるために複数の画像にて複数の発光点をまとめて取得することができるため、迅速化することができるという作用を有する。

また、請求項１９記載の発明は、固定部に一体型の枠を設けたことを特徴としたものであり、検体中の微生物をメンブレンフィルタなどで捕集する場合、枠を設けることで、メンブレンフィルタの取り扱い性を向上させることで、効率が上がり、安定した計測結果を迅速に得られるという作用を有する。

また、請求項２０記載の発明は、固定部の枠に、平面上の向きを定められる目印を設けたことを特徴としたものであり、メンブレンフィルタなどの固定部の枠に、向きを定められる目印を設けることで、微生物検査装置で観察した方向と同じ方向になるように、メンブレンフィルタを顕微鏡のステージに固定する事ができ、熟練者でなくとも同じ位置を観察することが容易になり、迅速に結果が得られるという作用を有する。

また、請求項２１記載の発明は、固定部の枠に、３箇所以上の凸部を固定部の中心に対し非対称に設けたことを特徴としたものであり、メンブレンフィルタなどの固定部の枠に、水平方向に３箇所以上の凸部を、固定部の中心から同心円上に対して非対称に設けたことで、回転や平行移動せずに、簡単に向きを合わせられるようになるため、計測から顕微鏡までの一連の動きを止めずに行う事ができるようになり、同時に複数の検体があった場合にも全ての検体を１つずつ実施する事ができ、検査工程管理を１つずつ確実に行うことで製品品質を高められるという作用を有する。

また、請求項２２記載の発明は、固定部の上方および／または下方に、固定部開放部分の面積よりも小さい開口面積をもつ薄膜を設けたことを特徴としたものであり、メンブレンフィルタなどの固定部の上方および／または下方に、固定部開放部分の面積よりも小さい開口面積をもつ薄膜を設けることで、メンブレンフィルタの中心部分にのみ微生物を固定できるため、メンブレンフィルタのうち枠に近い部分、すなわち高倍率のレンズで観察できない領域を使用せず、中心部分のみを利用できるため、計数精度を高めることができるという作用を有する。

また請求項２３記載の発明は、固定部の上方開口面積が、下方開口面積よりも大きいことを特徴としたものであり、メンブレンフィルタなどの固定部の上方開口面積が、下方開口面積よりも大きいものとすることで、メンブレンフィルタの中心部分のみに微生物を補修することができ、更に部品点数を増やさずに寸法のみで実施できるため、低コスト化できるばかりでなく、枠に微生物が付着する事により、微生物数を過小評価してしまうことを防止し、枠に付着していた異物粒子が試料中に混入して、測定感度が低下することを防ぐことができ、精度を高めることができるという作用を有する。

（実施の形態１）
まず、微生物を含む試料を測定するために、固定部となるスライドグラスや、培養ディッシュ、マルチウェルプレート、またはろ過膜や、測定に適した形状を持つセルの観察面表面の表側、もしくは裏側の一方に微生物を固定する。固定は、ポリ‐Ｌ‐リジンのような試薬や、ゼラチンなどの粘着性、付着性をもった高分子材料を表面に薄く塗布し、微生物を含んだ試料を滴下し、表面に吸着させる。またメンブレンフィルタのようなろ過膜の場合、上方から液体試料を吸引してろ過し、メンブレンフィルタ表面に微生物を平面状に捕捉し、固定する。本発明において、最も好適に実施するものとしては、このようなろ過膜を使用することで、以下の染色や洗浄などの操作が簡便かつ微生物を流失することなく扱うことができるのでよい。また、メンブレンフィルタは、薄く、小さいため、そのままでは取り扱いが容易でない。そのため、専用の支持台、吸引口付きのホルダーを使用したり、もしくは膜に保持部を結合するか、一体化させたデバイスとすることで容易に膜を取り扱うことができる。

また本発明において微生物を含有するか含有する可能性のある検体は液状検体であるが、検査対象が飲料水などの液状サンプルの場合は、それ自体が液状検体となる。検査対象が野菜や肉をはじめとする食材などの固体サンプルの場合は、それをホモジナイズして液状検体としたり、その表面から綿棒などを用いて細胞および微生物を採取し、これを生理食塩水や燐酸緩衝液などに遊離させて液状検体としたりする。また、まな板などの調理器具などが検査対象となる場合、その表面から綿棒などを用いて微生物を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液状検体とする。こうした液状検体をメンブレンフィルタで吸引および加圧濾過、また場合によっては超音波を利用して加振ろ過することでメンブレンフィルタ上に細胞および微生物を捕捉することができる。

また、固定部としては、メンブレンフィルタ以外にも、プレパラート表面や、可視光の透過性が高く、平面性の高いプレートの表面や、プレート間の間隙に固定し、もしくは粘着性を持ったシート状、ディスク状のチップデバイス表面、平板培地表面、もしくはシャーレやディッシュ、マルチウェルプレートなどの表面、電極材料や吸着材料の表面などに行う。このとき、固定は、遠心力や、静電気力、誘電泳動力、疎水力などの物理吸着力以外にも、ゼラチンなどの接着成分によるものや、抗原・抗体反応、リガンド・レセプターの反応などの生物的な結合力を用いることができる。

また、蛍光染色試薬の浸透を調整するために、必要に応じて、適当な濃度の２価金属錯体や、１価カチオン、カチオン性界面活性剤を混合した水溶液などを液体試料に混合させるか、もしくは細胞および微生物が固定部の上方から接触、またはろ過するか、または下方から接触させるなどの手法により、細胞および微生物の細胞膜透過性を一定に保たせることができる。

また、蛍光染色試薬を混合する液体試料に粘性をもたせることで、微生物試料に試薬を接触させた後も、微生物細胞の表面を覆うように試薬が付着させることができ、顕微画像上でのサイズが大きくなり、蛍光強度を増加させることができる。これにより、低倍率で広い範囲を高速に走査する場合にも、十分に強い輝度で、かつ大きな面積で微生物の発光像を取得することができる。

なお、２価金属錯体としては、エチレンジアミン四酢酸などを０．５から１００ｍＭ程度の濃度範囲にて使用する。

なお、１価カチオンとしては、カリウム塩、ナトリウム塩などを０．０５から５％の濃度範囲にて使用することができる。

なお、カチオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０やＴｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの細胞に対して侵襲性が低いものが使用でき、これらを０．０１から１％程度の濃度範囲にて使用する。

なお、粘性を持たせる成分として、（Ｄ）−ソルビトールや、グリセリンなどの多価アルコール類を１０から７０％の濃度範囲で使用し、あるいはシリコンオイルなどを使用することができる。

次に蛍光染色手段として、乾燥防止成分を混合し、生死菌染色試薬または死菌染色試薬のいずれか、または両方を一定濃度含む染色試薬を固定表面に一定量滴下する。

蛍光色素は、核酸結合性の構造をもつが好ましく、生死菌染色試薬として使用するものは、紫外励起で青色蛍光を発するものであれば、１，４−ジアミジノ―２−フェニルインドール、青色励起で緑色蛍光または黄緑色、黄色蛍光を発するもので、例えばアクリジンオレンジ、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジや、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ２１、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄなどのポリメチン架橋非対称シアニン色素系化合物が使用できる。また、用途によってはグラム陽性菌を染色し、グラム陰性菌は染色されないヨウ化ヘキシジウムなどの生死菌染色試薬を使用することも有効である。

また、死菌染色試薬としては、緑色蛍光を発するもので、例えばアクリジン２量体、チアゾールオレンジ２量体、オキサゾールイエロー２量体などのモノメチン架橋非対称シアニン色素２量体や、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ、ＴＯ−ＰＲＯ−１などのモノメチン架橋非対称シアニン色素系化合物、赤色蛍光を発するものであれば、ヨウ化プロピジウム、臭化ヘキシジウム、臭化エチジウム、ＬＤＳ−７５１、ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅなどのポリメチン架橋非対称シアニン色素などが使用できる。

これらの蛍光色素は、緑色蛍光や黄緑色蛍光、黄色蛍光、オレンジ色蛍光、赤色蛍光などをもつものであれば、青色の領域に蛍光強度を持たないため、色彩的特性を取得する場合にも青色の受光を省略して行うことができる。

なお、これらの蛍光色素は、細胞および微生物を含む試料に対して、あらかじめ０．１から１００μＭとなるようを混合しておき、同時に作用させるか、もしくは別々に、時間を置かず、もしくは適当な時間間隔を開けて所定の濃度で作用させることとする。

なお、メンブレンフィルタ上に捕捉した細胞および微生物を含む物質表面が、測定中に乾燥し、発光強度が変化することを防ぐための手段として、染色試薬には１０から６０％ｗ／ｖのグリセロールや、１０から９０％ｖ／ｖのＤ（−）−マンニトールやＤ（−）−ソルビトールなどの多価アルコール類のいずれかを１種類以上混合させておく。

なお、乾燥固化して保存する目的として、ポリビニルアルコールを１０から８０％程度の適当な濃度にて混合、もしくは後から表面を覆うことで、蛍光発光を比較的安定に保存することができる。

なお、固定部として適しているメンブレンフィルタとしては、例えば、孔径が０．２μｍ〜１μｍのポリカーボネート製など公知のものを用いることができる。

また、画像検出には、蛍光色素に対して特定の波長を照射するための励起光源、分光フィルタ、励起光を直径３ｍｍ程度に集光する為の集光レンズ、励起光の成分を除去する為のハイパスフィルタ、試料から発せられる蛍光から特定の波長成分を取り出すための受光フィルタ、拡大する為のレンズユニット、蛍光像を画像の電気信号に変換するためのＣＣＤやＣＭＯＳなどの受像素子により構成される。

蛍光染色試薬として使用する蛍光色素の主な発光波長であるが、例えば、青色励起の場合には波長が４７０ｎｍから５１０ｎｍ付近の波長成分を含む励起光を照射した場合、波長が５１０ｎｍから５４０ｎｍ付近の蛍光を発する。緑色励起の場合には、５１０ｎｍから５５０ｎｍ付近の波長成分を含む励起光を照射し、波長が５６０から６２０ｎｍ付近の蛍光を発する。オレンジ色励起の場合には、波長が５４０ｎｍから６１０ｎｍ付近の波長成分を含む励起光を照射した場合、波長が５６０ｎｍから６３０ｎｍ付近の蛍光を発する。

そのため、検出手段である励起光源として、発光ダイオードを使用する場合、青色のものでは、好ましくは４８０ｎｍ付近の波長を発することができるもの、緑色のものでは、好ましくは５３５ｎｍ付近の波長を発することができるもの、黄色からオレンジ色のものでは、好ましくは５６０ｎｍ付近の波長を発することができるものを使用する。

なお、発光ダイオードを使用する場合、励起光の成分が広帯域に渡る場合が多く、蛍光画像のバックグラウンドの増加の要因となりうるため、適切な干渉フィルタを使用して、特定の波長成分を切り出して使用する。

また、励起光源としてレーザーを用いる場合には、青色のものでは、好ましくは４７５ｎｍ付近の波長を発することができるもの、緑色のものでは、好ましくは５３５ｎｍ付近の波長を発することができるものを使用する。

また、励起光源としてハロゲンランプや水銀ランプを使用する場合には、適当な分光フィルタとして、染色試薬の励起波長に合わせて最適な干渉フィルタを使用することができる。また、０．１から１０ｎｍの波長分解能を有する反射型や透過型の回折格子により、最適な角度を与え、任意の波長を含む励起光を取り出すことができる。

集光レンズは、蛍光染色された細胞および微生物が展開されているメンブレンフィルタに対し、照射範囲が、例えば直径が３ｍｍ程度の一定面積となるよう励起光を照射することができる。さらに光を散乱させるための拡散板などを一次側に組み合わせることでより均一な励起光を照射することもできる。

サンプルに照射された励起光により発生した蛍光は、ハイパスフィルタを通過することで、色彩的特性は損なわれず、効果的に励起光由来の光成分がカットされる。

当該蛍光はレンズユニットを通し、受光部として単板カラーＣＣＤや、赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）、青色（Ｂ）の３原色を取得できるＲＧＢ３種類の蛍光フィルタを含む３ＣＣＤなどの電荷結合素子ユニットを用いて露光時間０．１秒から１０秒程度の露光時間でＲＧＢ３色からなる画像撮影することにより取得される。

取得する色の輝度情報は、蛍光染色試薬である蛍光色素の蛍光波長範囲であれば、使用可能である。例えばシアニン色素であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの場合、極大蛍光波長は５２１ｎｍであるが、蛍光スペクトルは６２０ｎｍ付近まで広がっており、生死菌染色試薬として使用した場合、５３０ｎｍ付近の緑色（Ｇ）を画像（ａ）、６１０ｎｍ付近の赤色（Ｒ）を画像（ｂ）として取得することができ、（ａ）、（ｂ）を使用して微生物と夾雑物との判別が行える。

また、単板モノクロＣＣＤやＣＭＯＳを使用した場合、適切な受光フィルタを切り替えて使用することで、必要な波長の輝度情報を含む画像を取得することができる。このとき、別の利点として、同一のＣＣＤを使用することで、異なるＣＣＤによる感度特性の差の影響は全く受けずに測定を行うことが可能となり、感度補正を行う工程を省略することができる。

これらの操作により取得された複数の蛍光画像は、演算部であるマイコンや外部端末上のプログラムによって処理される。

演算部には、画像からドット欠けなどの輝点を除去するための輝点除去部と、画像から発光点を抽出するための発光点抽出部、複数の画像の発光点を照合し、一致させる発光点照合部、照合されて数値が結合されたデータを出力する出力部、蛍光発光を評価する蛍光評価部、染色試薬の輝度より微生物の生死を判別する生死判断部、そして色彩的特性を表す変数によって発光点が微生物もしくは夾雑物であることを判別する微生物判断部、そして測定した画像の有効面積を算出する有効エリア算出部により構成される。

まず、輝点除去部であるが、これはＣＣＤなどの受像素子に見られる画素ピクセルの感度ムラや、感度消失した部分によるドット欠けと呼ばれる現象があるが、このドット欠けの輝点が画像上に現れると、微生物の発光点と間違える恐れがあるか、または微生物の発光点を取得できない原因となり、誤差の要因となりうる。そのためこのような輝点は除去する必要があるが、輝点除去用の画像として、光源を照射しない暗視野画像を、露光時間をサンプル測定と同程度かもしくは長めに設定して取得し、輝点のみが写っている画像を得る。そして発光点を写した各画像から輝点画像を減算したり、目印として周辺画素と比較して埋めてしまうことにより、輝点のみを削除することが可能となる。そのようにして輝点を除去した画像を以下において使用する。

発光点抽出部について、画像中に含まれる発光点のうち、設定された面積、輝度の範囲に該当するものを抽出する。例えば、面積を２から１５、輝度を１５から２５５とすると、面積が１６以上であるような大きい夾雑物はあらかじめカウントから除外することができ、また輝度が１４以下のバックグラウンドノイズ（暗ノイズ）を除去することができる。このしきい値は、レンズの倍率や、励起光源の強度、露光時間などにより最適な値が変化するため、微生物を最適に抽出できる値は、あらかじめ検証して確認することが必用である。

なお、最大輝度を示した座標の（ｘ、ｙ）の値、ＲＧＢの値を含む場合、それぞれの輝度も数値として同時に抽出される。この処理は、汎用的な画像処理ソフトウェアであるＩｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓなどを使用して実行できる。また、同様の処理を組み込んだプログラムとすることもできる。

次に発光点照合部によって、抽出された発光点の数値データと、異なる輝度情報を含む同位置の発光点の数値データとを、座標をもとに比較、照合され、結合される。

このとき、異なる輝度情報を含む画像とは、異なる受光フィルタで取得された画像のことを指すが、画像間では受光フィルタの特性や、機械的誤差に起因する座標ズレがわずかに生じる為、そのまま画像のピクセル座標を照合した場合、一致しないことがある。そこで、一方の座標に画像ズレを補正する座標補正値を補って照合させるのだが、特に機械的誤差については温湿度などの使用環境の影響により、使用するごとに座標ズレの値が変化してしまう場合がある。そのため、座標補正値を測定毎に更新して使用することで、測定ごとに最適な値を使用することが有効である。

座標を補正するための補正値は、あらかじめ取得した位置補正用画像から補正値を読み取ることにより取得する。位置補正用画像は、取得する全ての波長域において写りこむ蛍光体を使用して撮像する。取得する波長が緑色と赤色であれば、長波長側の赤色の蛍光粒子が使用でき、同程度の発光強度が得られるように励起光源の強度と露光時間を調節して行う。また、蛍光体により補正値を自動で算出させるような処理の場合には、個数が多くなると演算する数も多くなり、時間がかかってしまうため、画面あたり５から５０個の範囲内であれば、１から数分程度と比較的短時間で求めることができる。このような濃度になるように調整し、確認された蛍光粒子の懸濁液を一定量メンブレンフィルタにろ過したり、固定部と反応させることにより、位置補正用画像を取得するための位置補正用サンプルを作成する。また、これを校正用チップとして長期的に繰返し使用したい場合には、ビーズを高分子などで固定するか、金属蒸着で金属薄膜を覆ってしまうことにより固定しておくことで繰返し使用しても外れずに位置が一定になる。また、校正用サンプルとしては、その他にも、蛍光性の樹脂をマスキングして微小パターンやスポットを形成させるなどにより作成することも有効である。

このようにして作成された校正用チップは、装置に設置されて実際の計測と同じ動きを与えて画像を撮像する。これにより、モーターの位置制御誤差やバックラッシュなどの機械的誤差、フィルタやレンズの製造誤差、装置を組み上げる際の製造誤差に由来する光軸のズレなどで発生する画像の座標ズレを再現した画像を取得し、その補正値を求めて実際の計測で使用することで、位置精度が高められる。

画像中に見られる微生物の発光点を示すオブジェクトは、拡大レンズ系の合計が２００から３００倍程度のときは、オブジェクトの面積は受像素子上で１から２０ピクセル程度になる。これは微生物の細胞１個の直径が０．６から５μｍ程度であるときに撮像された値である。一方、微生物細胞が２から複数個繋がっていた場合、発光点のオブジェクトの面積は大きくなり、２０ピクセルを越えるものも見られる。このような大きな発光点のオブジェクトは、共焦点光学系などの特殊な光学系を使用しない限りは、殆どの場合一つのオブジェクトとして検出され、二つのオブジェクトを分離して検出することが難しい。このとき問題となるのは、二つのオブジェクトが異なる発光特性をもつ場合に、各画像を比較して発光点を照合して輝度を結合したときに、同一のオブジェクトとして検出される、隣り合った微生物の発光輝度を誤って結合してしまうと、本来の微生物の発光特性とは全く異なる不正確なデータが形成されてしまうという恐れがある。そのような事例を防止するためには、発光点の座標をオブジェクトの最大輝度値を示す座標とし、画像間の発光点を照合するときは、その座標から非常に近傍に限定された誤差範囲エリア内にあるもう一方の画像の座標をもつ発光点とのみ結合されるようにすることが必要である。

そのため、同一の発光点のオブジェクトとして抽出されているものであっても、照合した場合に一致しないことがありうる。そのとき結合する輝度データが存在しなくなってしまうことを防止するために、照合するもう一方の画像に一致する発光点が検出されなかった場合に、もう一方の画像中の同じ座標のピクセルの輝度値を抽出し、この値を結合させることが有効である。これにより、発光点が一方の画像でしか抽出されなかった場合でも、輝度情報を欠如させることなく、精度よく照合データを作成することができることになる。

また、最終菌数の検出精度にも関連するが、生菌と死菌が繋がって存在している場合、上記のような工程を持たせなければ、オブジェクトを死菌として検出してしまう可能性があるが、これにより生菌と死菌が繋がったものとして検出することができるようになり、培養法などとの相関性が向上することに繋がる。

照合されて結合されたデータは、出力部によりデータファイルとして出力される。この時点でデータファイルとして保存することで、この後の工程を一度にまとめて処理することも可能となるため、作業が効率化される。この工程は、各ポジションごとに実施され、全ての撮像エリアを走査したのちに、出力ファイルを読み込んで、全領域の統合データの作成に使用される。

発光点の輝度情報をもつデータファイルに対して、生死判断部によって発光点が生菌群であるか、もしくは死菌群であるかいずれかに分類される。このとき、生菌群、もしくは死菌群であることを示すパラメータを与えることで、以降の処理が行いやすくなり、処理を効率化することができる。尚、パラメータとは生菌群であれば１、死菌群であれば２であるというように、発光点のデータの変数を与えることにより行うこととする。

生菌群または死菌群であるかを判断する為には、以下のようにグラフを使用することが望ましい。まず、発光点のデータのうち、生死菌染色試薬の輝度値と、死菌染色試薬の輝度値を用いて、この二つの値よりドットプロットを作成し、表示させる。これは、横軸に生死菌染色試薬の輝度値、縦軸に死菌染色試薬の輝度値をとり、検出された発光点毎にプロットしていく。尚、ドットプロットの表示は、画像処理を行うプログラムのインターフェース上に行うことが良く、発光点のデータファイルを読み出した場合に表示させるようにするとよい。輝度値として使用する値は、オブジェクトの最大輝度値や、平均輝度値、合計輝度値を使用することができ、グラフは常数、対数いずれも使用できる。

次に、表示されたドットプロットに対して、カーソルを使用して境界線を作成する。境界線は、１本ないし複数本の直線や曲線、多角線などで自由に作成することができるものとし、プロットを見ながら、プロットの集団を分類しやすいように、作成する。なお、境界線の作成工程は、簡単に行えるようにグリッドなどを使用したり、輪郭やプロットにトラップさせるような機能を持たせると、作成が容易であり、かつ正確に行うことができる。

また、多角線の場合には、線が交差しないように、一方の方向のみに作成可能とすると確実である。

作成した境界線は、取り消すことや、保存することができるようにし、繰り返し使用することができるようにする。

次に、作成した境界線をもとに、境界線に相当するしきい値を算出する。算出されたしきい値に対して、グラフの上・左側にあるものが死菌群、反対が生菌群として分類し、パラメータを与えて処理する。

生菌群、死菌群が判断された後、微生物判断部によって夾雑物を分離除外する場合は、以下の処理を行う。微生物と夾雑物の判別は、色彩的特性の値を算出することによってなされる。

色彩的特性とは、ＲＧＢの輝度値より演算されて与えられた色度、色相角などの色彩的特長を示す値のことである。色彩的特長を示す表色系は、Ｌａｂ表色系や、ＬＣｈ表色系、ＸＹＺ表色系などの表色系が使用される。ここではＸＹＺ表色系に基づいた色度を用いる。取得される輝度はＲＧＢの色空間のものであるため、このＲＧＢそれぞれの輝度値から、ＸＹＺ表色系への変換が行われる。

（数式１）
Ｘ＝０．３９３３×Ｒ／２５５＋０．３６５１×Ｇ／２５５＋０．１９０３×Ｂ／２５５
Ｙ＝０．２１２３×Ｒ／２５５＋０．７０１０×Ｇ／２５５＋０．０８５８×Ｂ／２５５
Ｚ＝０．０１８２×Ｒ／２５５＋０．１１１７×Ｇ／２５５＋０．９５７０×Ｂ／２５５
さらに、
ｘ＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ＋Ｚ）
ｙ＝Ｙ／（Ｘ＋Ｙ＋Ｚ）
式中のＲ、Ｇ、ＢはそれぞれＲ輝度値、Ｇ輝度値、Ｂ輝度値であることを示す。これにより細胞および微生物または夾雑物かの判断に必要な値として、最終的にｘ、ｙの値が算出される。

発光点毎に算出された色度の値であるが、発光点はそれぞれ生菌群、死菌群であるかを判別するためのパラメータが与えられており、生菌群であった場合には、生菌群に対して設定された色度しきい値と比較し、死菌群であった場合には、死菌群に対して設定された色度しきい値と比較して、それぞれに夾雑物が除外される。夾雑物が除外され、生菌、死菌として判断されたものは、積算され、カウントされる。

各ポジションごとのカウント値は、その都度表示させることが良く、これにより計測途中であっても最終結果の目安を得ることになり、カウント値が多い場合など、直ちに衛生管理工程の改善や、迅速な出荷停止判断に移れるため、作業の効率化につなげられる。

また、取得した画像、演算して合成したカラー画像もカウント結果の表示に合わせて表示させることが良く、これにより、カウント値が正しく求められる画像であるか、妥当な計測値が得られているかの判断に使用できる。

カラー画像の発光点は、取得した白黒画像の強度をもとに色彩情報に近い色で表示されることで、画像確認を容易に行えるようになる。また、カラー画像に加え、それぞれの波長を示す白黒画像も選択して表示できるよう、プログラム上のボタンなどを配しておくことがよい。

次に、このカウント値に対して、実際に使用した検体に含まれる単位量あたり（たとえば１ｍＬや１グラムなど）の菌数の総数を算出する。そのためには、測定した画像のうち、画像処理して使用した有効エリア面積を有効エリア算出部にて求める。測定に使用した有効エリアは、画像の補正値を変数とした関数で求められる。尚、有効エリア算出部の位置は、補正値が決まっていれば先に求める事もできる。

画像の縦の長さをＰ、横の長さをＱ、縦方向の座標補正値をα、横方向の座標補正値をβとすると、１画面あたりの有効エリア画素数Ｍは数式２のように表される。

（数式２）
Ｍ ＝（Ｐ−α）×（Ｑ−β）
また、有効エリア面積は、レンズ系の倍率などから、画素あたりの面積を求め、画素あたりの面積をｓとするとし、測定視野数をＮとして、１画面あたりの有効エリア面積Ｓと全有効面積は、
（数式３）
Ｓ ＝ Ｍｓ
全有効面積：Ｓ×Ｎ
となる。

得られた面積に対して、微生物の固定部の固定部分の表面積（例えば、メンブレンフィルタの全面積）の値を割り返す。これにより得られた数値を、カウント菌数に掛け合わせることで、最終的な、微生物の生菌または死菌の総数を算出し、菌数を求めることができる。

結果が得られた後、迅速検査の場合には、検出された発光物が微生物であるかどうか顕微鏡などを用いて判定し、結果の妥当性を評価することが必要である。そのため、測定に使用したメンブレンフィルタなどを蛍光顕微鏡で観察する。

顕微鏡を使用して、メンブレンフィルタ表面から発光画像の発光物と同じものを観察するためには、まずメンブレンフィルタの向きと、微生物計数装置で測定した画像の向きとが同じ方向になるように揃えることが重要である。向きが異なると、顕微鏡像に見られる発光物の集団と、取得した発光画像との配置が異なって見えてしまうため、同一の視野や同一の発光物を特定するのが困難になる。そこで、メンブレンフィルタに樹脂などの枠を設け、その枠に目印をつけ、同様に顕微鏡のステージにも目印をつけてそれらを合わせることで、顕微鏡の像と、微生物計数装置の像を揃えることができるようになる。

尚、この目印は３箇所以上、中心から非対称に設けると、一致する向きは一つしかなく必ず同じ位置に合わせられるようになり、僅かな誤差も防止できる。

さらに、この目印を凸部とし、ステージ側の同位置に凹部を設けることで、精密な調整が必要であった揃える操作を、凸部と凹部がかみ合うようにはめるだけで済むため、簡便に、効率的に実施できる。

また、メンブレンフィルタ表面のうち計測領域の全領域を、１００倍程度の高倍率の対物レンズで観察する場合、メンブレンフィルタの枠がメンブレンフィルタ表面よりも高いと、高倍率の対物レンズは焦点深度が浅いため、レンズと枠が接触してしまい、枠付近のメンブレンフィルタ表面は、焦点があわないために観察することが困難になる。また、メンブレンフィルタの面積が直径１ｃｍ程度と小さければ、ほぼ中心部分でしか焦点が合わなくなってしまい、発光物の判定が困難である。そこで、メンブレンフィルタの面積をやや大きくし、メンブレンフィルタの枠と接触しない程度の距離にろ過できるよう、また枠から一定範囲をろ過できないように、メンブレンフィルタの上方もしくは下方から中心部に穴を設けたフィルムを重ね合わせることで、メンブレンフィルタの中心部分にろ過できるようになり、全ての発光物が高倍率の対物レンズで観察でき、判定することができるようになる。

また、同様の目的で、メンブレンフィルタを固定する枠と台座の寸法をあらかじめ調整し、メンブレンフィルタ下方の台座の孔径を、メンブレンフィルタ上方の枠のフィルタ押さえ部分よりも小さくすることで、ろ過部分をメンブレンフィルタの中心部分に限定させることができるようになる。

顕微鏡の像の複数の発光物から、微生物として判定した点を容易に確認できるように、微生物として検出している点の色を表示する表示部を設ける。表示部は、プログラム上で小さなウィンドウ枠内に背景を暗黒色で、その中に微生物細胞とするオブジェクトを微生物の色彩特性で表示する。この表示色は、微生物として判定する時の色彩的特性の閾値の値をリンクさせておくことで、パラメータを変更した場合でも、表示色を自動で変更することができる。

以上の手法を用いて、試料中や細胞培養液に含まれていた微生物の生死を判別し夾雑物と分離して、数を計量することができるのである。

図１は、本発明を好適に実施するための微生物計数装置の一態様を示す概念図である。この微生物計数装置１は、検出手段として励起光源２、干渉フィルタ３、集光レンズ４、ハイパスフィルタ５、受光フィルタ６、レンズユニット７、受光素子８を含む。励起光源２から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために干渉フィルタ３で分光する。分光された励起光は集光レンズ４を経て検査台９にセットされたメンブレンフィルタ１０（別途の操作によりメンブレンフィルタ上に核酸結合性の蛍光色素で染色された微生物を捕捉してあるもの）上に集光される。励起光源から発せられた励起光は、集光レンズ４によって集光されるが、その際、集光レンズ４によって励起光を照射する範囲は直径３ｍｍ程度の微小な一定面積に集光される。励起光により発する蛍光は、励起光成分を除去するためにハイパスフィルタ５を経て、受光フィルタ６、レンズユニット７により拡大され、受像素子であるＣＣＤユニット１１に到達し、電気信号化される。これにより得られた信号は画像化され、演算部１２によって画像処理される。

図２は、演算部１２における演算工程フローを示した図である。輝点除去部１３、発光点抽出部１４、発光点照合部１５、出力部１６、蛍光評価部１７、そして有効エリア算出部１８から構成されている。

まず座標補正用画像を読み込んで座標補正値を算出する。次にしきい値などの変数を入力し、輝点除去部によって輝点を除去した画像を作成する。続いて、発光点抽出部により画像中の発光点を特定し、数値データを抽出する。画像によっては座標補正値により座標を補正する。異なる輝度情報を含む発光点のデータは、発光点照合部によって照合し、結合される。これにより集合された数値データは、出力部によってデータファイルに出力され、保存される。データファイルに対して、生死判断部１９によって生菌群または死菌群であるかを判別し、発光点毎に生菌もしくは死菌のフラグを立てる。微生物判断部２０により、フラグを検出して生菌群か死菌群かを判断し、各群ごとに設定した微生物もしくは夾雑物であるかをしきい値と照合して判別し、最終の菌数を算出、出力する。これらは画像処理をプログラミングされたマイコン等であり、外部接続した端末などによって操作されるソフトウェアと通信して使用されるものも該当する。

図３（ａ）は、微生物判断部の詳細を示す。Ｅ．ｃｏｌｉを含む水検体をメンブレンフィルタにろ過し、生死細胞用蛍光色素であるＳＹＴＯ９と、死細胞用蛍光色素であるヨウ化プロピジウムを用いて染色したものを、単板モノクロＣＣＤと、青色励起光照射におけるＧ輝度画像とＲ輝度画像を取得したデータの一例を示す表である。このとき、Ｂ輝度画像は、励起光の波長と重なるために取得できず、数値を代入して使用している。この変数は、最適な値に調整することができる。

図３（ｂ）に示される工程は、ＲＧＢの輝度から、ＸＹＺ表色系の（ｘ、ｙ）の値への変換を示す。この工程はまず、ＲＧＢの輝度を測定する手段によって取得されたＲＧＢそれぞれの輝度値から、リニアＲＧＢへの変換、ガンマ補正がなされる。これにさらに視覚的特性を重み付けし、微生物または夾雑物かの判断に必要な値として、最終的にｘ、ｙの値が求められる。このとき、例えば光学フィルタによって青色（Ｂ）をカットし、緑色（Ｇ）および赤色（Ｒ）のみが取得されるような条件の場合には、青色の感度は得られないものとして、あらかじめ実験によって最適化された固定値を代入して使用することや、またはＲまたはＧの輝度値による関数を設定して使用することもできる。これにより得られた色度の値に対してしきい値と比較することで、微生物か夾雑物であるかを判別する。なお、このときのしきい値は実験により決定する。

図３（ｃ）は、表示部を示す。微生物の色彩的特性は、あらかじめプログラム上で閾値を設定しておいて判定に使用するが、このとき微生物と判定される色彩が表示される。プログラムのＧＵＩとなるメインウィンドウ２１に含まれるか、もしくは別ウィンドウにて表示ウィンドウ２２、色彩表示オブジェクト２３、背景２４が配置される。ここでは含まれる場合を示す。色彩表示ウィンドウは、楕円形、円形などの閉曲線や矩形などであり、微生物と判定する色彩特性のパラメータとリンクして表示色が変更される。背景色は、顕微鏡画像と比較しやすいよう、暗黒色になっている。

図４（ａ）は、固定部の詳細を示す。メンブレンフィルタ１０の上方よりメンブレンフィルタのろ過面積を中心に限定するための穴を設けたフィルム２５を、上方のメンブレンフィルタ押さえ部２６と、メンブレンフィルタ台座２７の間に重ねたものである。これにより、ろ過部分を、対物レンズで観察可能な中心領域にろ過することができるようになる。

図４（ｂ）は、固定部の別様態の詳細を示す。メンブレンフィルタ押さえ部２６の孔径よりも、メンブレンフィルタ台座２７の孔径を小さくとることで、同様にメンブレンフィルタの中心部分にのみろ過を限定させることができるようになる。

（実施例１）
Ｅ．ｃｏｌｉを含む菌液と、水道水（塩素除去済み）の中の菌数を測定する。これらの液体試料を、孔径が０．４５μｍ、直径９ｍｍの黒色メンブレンフィルタに表面を金属蒸着したものの上方からピペットにて滴下し、吸引ろ過した。メンブレンフィルタは、そのままでは表面に触れてしまう恐れがあり、扱いにくいため、周囲を樹脂枠で覆い、一体化させたものを使用した。吸引ろ過圧は、あまり高すぎるとろ過できず、低すぎると微生物へのダメージとなってしまうばかりか、メンブレンフィルタが破損することがあるため、１００から４００Ｔｏｒｒ付近のポンプ圧に設定して行った。メンブレンフィルタ上にろ過するとき、計数しやすさや、逆算する精度の問題から、微生物などの発光物はできるだけ均一に分散させる必要がある。そのため、メンブレンフィルタのろ過性能を均一にするために、メンブレンフィルタ下方の吸引口にはろ紙などを挟み、吸引圧を拡散して、メンブラン全体に均一にかかるようにして行った。また、それとは別に、メンブレンフィルタのポアの通過抵抗を減少させるため、液体試料をろ過する前に、少量の界面活性剤希釈液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％）をろ過した。液体試料は、Ｅ．ｃｏｌｉ菌液の場合は０．１ｍＬ、水道水の場合は２０ｍＬろ過した。

続いてメンブレンフィルタ上に捕集された微生物に対して、蛍光染色を行った。染色試薬は、生死菌染色試薬であるＳＹＴＯ２４と、死菌染色試薬であるＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ（いずれも商品名）を使用した。これらの染色試薬は、空気中で光を吸収して分解しやすいため、ジメチルスルホキシドにて５００μＭに調整し、少量ずつマイクロチューブに分注してストック液とし、保管した。保管は、マイクロチューブ内に窒素を封入し、マイナス２０度のフリーザーにて暗所保管した。必要本数を解凍し、それぞれの試薬１０μＬに対して希釈液を全量が１ｍＬになるように加え、混合した。この希釈液は、試薬の溶解性と、保存性、細胞への浸透性、乾燥防止性、低自家蛍光性である必要があるが、このような条件を満たすものとして、Ｄ−ソルビトールを蒸留水で５０％程度に希釈しＴｒｉｓ−ＨＣｌと少量の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を混合したものを使用した。

終濃度５μＭに調整した試薬は、１種類ずつ微生物が捕集されたメンブレンフィルタ上方から滴下し、常温にて数分間染色し、余剰の試薬は吸引ろ過にて除去した。染色順序は限定されず、生死菌染色試薬、死菌染色試薬いずれから行っても同様に染色することができる。

染色したのち、余剰試薬を吸引によってできる限り除去した後、メンブレンフィルタを微生物計数装置に設置し、計測を行った。

微生物計数装置は、図１に記載されたものであるが、今回、青色ＬＥＤ（約４７０ｎｍ）と、黄色ＬＥＤ（約５６０ｎｍ）を使用し、受光フィルタとして緑色は５３０から５５０ｎｍに透過性をもつものと、赤色は５９０から６１０ｎｍに透過性を持つものを使用した。なお、光源には、光束を撮像範囲に照射しやすいよう集光レンズを設けている。

また、メンブレンフィルタの設置ステージには着脱可能な機構を設け、さらにステージ部材がメンブレンフィルタを裏側から平面かつピントが合う高さに固定できるようにし、ピント調節を不要とした。メンブレンフィルタを固定したステージは、モーター駆動のＸＹステージにより移動可能であり、プログラムによってあらかじめ指定した位置への移動を連続的に行うことができるものとした。

メンブレンフィルタ表面の蛍光画像の取得は、メンブレンフィルタの上方に設置された赤外カットフィルタを施した単板モノクロＣＣＤカメラと、拡大レンズ系にて行った。画像を取得する際には、励起光となるＬＥＤが点灯して照射され、受光フィルタを切り替えて目的の波長の画像を取得できるものとし、これらのカメラ、光源、フィルタ、およびステージは、動作をプログラムされたマイコンを使用して制御されるものとした。

画像の取得は、同一の位置で（ａ）青色励起，緑色蛍光、（ｂ）青色励起、赤色蛍光、（ｃ）黄色励起、赤色蛍光、の３種類の画像を、露光時間が０．１から３秒程度で連続的に取得し、ステージによって次の撮像領域に移動し、同様に画像を取得するものとした。また、測定の最初には、ＬＥＤを点灯させずに画像を取得し、ドット欠けのみを含む画像を取得しておいた。

画像を全て取得した後、演算部によりドット欠けの除去、発光点の抽出、照合が行われ、発光点ごとに輝度値を求めたデータを作成した。

図５の（ａ）はＥ．ｃｏｌｉと水道水中にみられる発光点のプロットを生死菌染色試薬であるＳＹＴＯ２４の蛍光波長である青励起、緑蛍光での輝度と、死菌染色試薬であるＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅの蛍光波長である黄色励起、赤蛍光での輝度を２軸におき、ドットプロットを作成したものである。

このとき、任意に設定できる境界線として、ｃがｙ＝１００、ｄがｘ＝ｙのような直線を設定し、ｃより小さく、かつｄより小さい領域を生菌群、それ以外の領域を死菌群として指定し、該当する領域の発光点に対してフラグを立て、発光点の分類を行った。

次に、生菌群として分類された発光点データの集団を、ＸＹＺ表色系における色度データのうち、ｘとｙの値をグラフ上にプロットした（図４の（ｂ））。このとき、Ｅ．ｃｏｌｉ生菌がｘ＜０．３７、ｙ＞０．５４の領域に分布していたのに対し、水道水中の発光物はｘが０．３から０．６、ｙが０．３から０．６と幅広い領域に分布していることが確認された。このとき、しきい値は、Ｅ．ｃｏｌｉの値を参考に設定し、ｘはｅ＝０．３７、ｙはｆ＝０．５４として、ｘ＜ｅ、ｙ＞ｆの領域に分類された集団を微生物として判別し、水道水中に含まれる発光物のような夾雑物を判別した。その結果、検出された発光点のうち夾雑物の大半を分離することができ、水道水では図５の（ａ）のとおり生死判断部によって１００個の点から３２個の点が抽出されたが、さらに図５の（ｂ）によってそのうちの８個が微生物の生菌であると判別することができた。

このしきい値は一例であるが、染色に使用する蛍光色素の種類や、濃度、希釈する溶液の極性などによっても変化することから、使用が想定される環境に最も適した値をあらかじめ設定しておくことが好ましい。

なお、最終菌数の妥当性については、培養困難である菌も存在する為、適切な培養方法、培地の種類を複数組み合わせて使用し、評価することが望ましい。

（実施例２）
実施例１に示された微生物計数装置において、Ｅ．ｃｏｌｉを含む菌液と、水道水（塩素除去済み）をそれぞれ一定量メンブレンフィルタにろ過し、値を測定した。

図６はＥ．ｃｏｌｉにおいて、生死判断部における生菌と死菌を判別するしきい値の設定結果である。照合されて結合された発光点の輝度情報のうち、第１と第２の染色試薬の輝度をｘ軸とｙ軸にとり、データを対応させたドットプロット２８をプログラムのウィンドウ上に表示し、さらにこのドットプロット上において、カーソル２９を操作してプロットを分離するしきい値となる多角線の始点３０、頂点ａは３１、頂点ｂは３２、終点３３を設定した。設定した多角線３４は、プログラム上で演算され、しきい値が求められた。判別を行い、計数した結果、生菌群１２０個、死菌群８０個として簡便に検出することができた。

（実施例３）
実施例１に示された微生物計数装置において、Ｅ．ｃｏｌｉを含む菌液と、水道水（塩素除去済み）をそれぞれ一定量メンブレンフィルタにろ過し、値を測定した。

図７は、生死判断部における生菌と死菌を判別するしきい値の設定方法の設定結果である。表示したドットプロット２８に対して、カーソル２９を操作して、選択したい領域の多角形の始点３５と頂点３６から３９を連続的に設定し、頂点の最後は、始点上で選択することで一致させるように多角形を設定した。設定された多角形４０に対して、しきい値が自動的に算出され、領域をチェックボックスで死菌として指定したところ、死菌数は７８個として検出できた。

（実施例４）
実施例１に示された微生物計数装置において、Ｅ．ｃｏｌｉを含む菌液と、水道水（塩素除去済み）をそれぞれ一定量メンブレンフィルタにろ過し、値を測定した。

図８は、生死判断部における生菌と死菌を判別するしきい値の設定結果である。表示したドットプロット２８に対して、カーソル２９を操作して、選択したい領域の楕円形の中心４１と長軸４２または短軸４３と、長軸の長さ４４、長軸の角度４５を設定した。楕円形４６、４７はそれぞれ死菌、損傷菌として設定したところ、死菌数が７２個、損傷菌が９個であると検出された。

この集団ごとに楕円の中心座標と長軸の角度、長さの数値を抽出し、微生物の集団の特性を示す特徴パラメータとして集団を定義できる。それぞれの値は、様々な菌種や、活性状態のものを示すものであり、比較することによって、例えば同じ死菌であっても、損傷度合いや、損傷しやすさを比較することが可能となる。図８の場合、楕円の長軸の傾きが大きく、死菌染色試薬で強く染色された４６の領域の方が損傷度が高いものであると推定することができた。

（実施例５）
実施例１に示された微生物計数装置において、Ｅ．ｃｏｌｉを含む菌液と、水道水（塩素除去済み）をそれぞれ一定量メンブレンフィルタにろ過し、値を測定した。

図９は、生死判断部における生菌と死菌を判別するしきい値の設定結果である。表示したドットプロット２８に対して、あらかじめ縦横をＮ＝５、Ｍ＝５、合計２５領域として輝度が５１ずつになるようあらかじめ各領域に番地を設け、それぞれに番号（Ａ〜Ｙ）を定めた。次に、プロット結果から、死菌領域をＡ、Ｆ、Ｋ、Ｐとして設定して、領域内の菌数を算出した。その菌数は９７個として検出された。

（実施例６）
染色試薬に粘性の高いソルビトールを６０％になるように混合し、使用した。メンブレンフィルタ上に捕集された微生物に染色試薬を滴下して反応させ、余剰試薬を下方から吸引ろ過して除去した。メンブレンフィルタ表面を顕微鏡のノーカバータイプの対物レンズを使用して観察すると図１０（ａ）のように発光物４９の周囲に球状に付着した試薬５０が確認された。また、同一の露光時間で取得した画像の一部を拡大したものを示す。図１０（ｂ）のように付着していない発光点５１と比べて付着しているものは面積が大きく、輝度も増加した。一方、同一の輝度となるように露光時間を調整した結果、付着しているものは２００ミリ秒であったのに対して、付着していないものは８００ミリ秒であり、輝度値が約４倍異なった。

本発明は、細胞および微生物を含んだ検体から蛍光染色を用いて微生物の生菌および死菌を検出する方法であって、従来から知られている方法と比較してより正確性を持たせた検出を行うことができる判別方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

本発明の実施の形態１の微生物検出装置を示す概念図 同演算部による演算工程フローを示す図 （ａ）同Ｅ．ｃｏｌｉの輝度と色度の演算結果を示す図、（ｂ）同色度の演算工程フローを示す図、（ｃ）同色度の表示部を示す図 （ａ）同固定部の断面図および上面図、（ｂ）同固定部の断面図および上面図 （ａ）本発明の実施例１のＥ．ｃｏｌｉと水道水中の発光物の輝度のドットプロット及び生死判断部による分類方法を示す図、（ｂ）同生菌群の色度図と微生物判断部による判断方法を示す図 本発明の実施例２の微生物判断部におけるドットプロットの多角線による境界線作成を示す図 本発明の実施例３の微生物判断部におけるドットプロットの多角形による境界線作成を示す図 本発明の実施例４の微生物判断部におけるドットプロットの楕円による境界線作成を示す図 本発明の実施例５の微生物判断部におけるドットプロットの領域指定による分類方法を示す図 （ａ）本発明の実施例６の発光物への試薬の付着を示す拡大図、（ｂ）同発光物へ試薬が付着したものと付着していないものの発光点を示す図

符号の説明

１ 微生物計数装置
２ 励起光源
３ 干渉フィルタ
４ 集光レンズ
５ ハイパスフィルタ
６ 受光フィルタ
７ レンズユニット
８ 受光素子
９ 検査台
１０ メンブレンフィルタ
１１ ＣＣＤユニット
１２ 演算部
１３ 輝点除去部
１４ 発光点抽出部
１５ 発光点照合部
１６ 出力部
１７ 蛍光評価部
１８ 有効エリア算出部
１９ 生死判断部
２０ 微生物判断部
２１ メインウィンドウ
２２ 表示ウィンドウ
２３ 色彩表示オブジェクト
２４ 背景
２５ フィルム
２６ メンブレンフィルタ押さえ部
２７ メンブレンフィルタ台座
２８ ドットプロット
２９ カーソル
３０ 始点
３１ａ 頂点
３２ｂ 頂点
３３ 終点
３４ 多角線
３５ 始点
３６ 頂点
３７ 頂点
３８ 頂点
３９ 頂点
４０ 多角形
４１ 中心
４２ 長軸
４３ 短軸
４４ 長軸の長さ
４５ 長軸の角度
４６ 楕円形
４７ 楕円形
４９ 発光物
５０ 付着した試薬
５１ 発光点

Claims (23)

1. 波長の異なる複数の蛍光染色試薬を使用し、複数の発光画像を取得して微生物を検出する方法において、微生物の発光点および／または発光点以外の輝度を取得し、蛍光発光の特性を示す値を求めて種類を評価する蛍光評価部を備えることを特徴とする微生物計数装置。
2. 蛍光評価部において、蛍光発光の色彩的特性を示す値を算出し、発光点の種類が微生物の生菌、死菌、もしくは微生物以外の夾雑物のいずれかであることを判断することを特徴とする請求項１記載の微生物計数装置。
3. 蛍光評価部において、色彩的特性を示す値に対してしきい値を設けたことを特徴とする請求項１または２記載の微生物計数装置。
4. 色彩的特性として、ＸＹＺ表色系のｘとｙの値を使用することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の微生物計数装置。
5. 前記蛍光染色試薬が、青色の波長域に強度を持たないものとすることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の微生物計数装置。
6. 青色の波長域に透過性を持たない干渉フィルタを使用して発光画像を取得することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の微生物計数装置。
7. 蛍光評価部において、青色の輝度値を取得せず、色彩情報を取得することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の微生物計数装置。
8. 前記蛍光評価部において、青色の輝度値をあらかじめ指定した値とすることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の微生物計数装置。
9. 検出対象の発光物の色彩と、検出対象以外の発光点の色彩を表示する表示部を備えることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の微生物計数装置。
10. 前記表示部の背景色が暗黒色であることを特徴とする請求項９に記載の微生物計数装置。
11. 撮像エリアごとの微生物の発光画像と発光点の個数を表示することを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載の微生物計数装置。
12. 前記発光画像が、色彩情報にもとづいたカラー画像であることを特徴とする請求項１１に記載の微生物計数装置。
13. 前記発光画像が、複数の白黒画像を１枚に合成した画像であることを特徴とする請求項１２に記載の微生物計数装置。
14. 前記発光画像が、白黒画像の画素のもつ輝度に対してそれぞれの露光時間をパラメータとした関数を乗算した画像から合成されたものであることを特徴とする請求項１３に記載の微生物計数装置。
15. 蛍光評価部において、生菌または死菌であることを判断する生死判断部と、それ以降に微生物または微生物以外の夾雑物であることを判断する微生物判断部を備えたことを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の微生物計数装置。
16. 生死判断部において生菌群もしくは死菌群であることを判断し、微生物判断部においてそれぞれに設定された色彩的特性に対するしきい値と比較し、発光点が微生物の生菌、死菌もしくは微生物以外の夾雑物のいずれかであることを判断することを特徴とする請求項１５記載の微生物計数装置。
17. 撮像エリアごとに波長の異なる画像を連続的に取得し、蛍光評価部において各画像の輝度から色彩的特性を示す値を算出することを特徴とする請求項１から１６のいずれかに記載の微生物計数装置。
18. 微生物を固定する固定部を設けたことを特徴とする請求項１から１７のいずれかに記載の微生物計数装置。
19. 固定部に一体型の枠を設けたことを特徴とする請求項１８記載の微生物計数装置。
20. 固定部の枠に、平面上の向きを定められる目印を設けたことを特徴とする請求項１９記載の微生物計数装置。
21. 固定部の枠に、３箇所以上の凸部を固定部の中心に対し非対称に設けたことを特徴とする請求項１９記載の微生物計数装置。
22. 固定部の上方および／または下方に、固定部開放部分の面積よりも小さい開口面積をもつ薄膜を設けたことを特徴とする請求項１９記載の微生物計数装置。
23. 固定部の上方開口面積が、下方開口面積よりも大きいことを特徴とする請求項１９記載の微生物計数装置。

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