JP4449982B2 - 生菌数の計測方法及び計測装置 - Google Patents
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Description
本発明は、試料中の生菌数を計測する方法及びその計測装置に関し、詳細には、試料中の菌等を２種類の蛍光染料を用いて染色することにより、生菌と死菌やゴミ等の夾雑物との判別が容易に可能で、正確に生菌数を計測できる方法及びその計測装置に関する。
医薬、農薬、食品衛生管理等の分野や医学、薬学、生物学等の研究分野においては、品質管理、安全性や薬効の評価等のために試料に含まれる生菌数を測定することが多い。
生菌数の測定方法としては、試料を希釈し、これを適当なプレート培地に播種して培養し、出現したコロニー数を数えることにより行われることも多いが、培養に時間がかかったり、培地を調製する必要があるため、その実用性には問題があった。
そのため、より迅速かつ簡便に生菌数を測定する方法として、染色試薬を用いて菌を染色して検出する様々な方法が提案されており、例えば、下記特許文献１には、菌類を染色する蛍光染料としてフルオレセインジアセテートとヨウ化プロピジウムを用い、菌類をこれらの蛍光染料で二重染色し、染色した菌類に対して励起光を照射することにより、フルオレセインジアセテートで染色された生菌細胞が発する特定波長の蛍光発光と、ヨウ化プロピジウムで染色された死菌細胞が発する特定波長の蛍光発光とを検出して、蛍光発光の数から生菌細胞と死菌細胞の数を計測する方法が記載されている。
また、下記特許文献２には、死菌細胞のみを蛍光発光させる蛍光試薬で検体となる菌類全体を染色して、蛍光発光した死菌細胞数を計測する第１のステップと、前記検体となる菌類全体に殺菌処理を施した上で、当該殺菌処理した菌類全体を前記蛍光試薬で再度染色して、蛍光発光した死菌細胞数を計測する第２ステップで計測した数とを比較することにより、生菌細胞数及び死菌細胞数を計測することを特徴とする微生物計測方法が開示されている。
更に、下記特許文献３には、死細胞のみを染色する核酸蛍光染色剤を作用させた測定試料が発する蛍光の強度と、該核酸蛍光染色剤を作用させる処理および細胞膜を損傷させる処理を施した測定試料が発する蛍光の強度とを各々測定し、両強度を対比することを特徴とする生存細胞数および／または細胞生存率の測定方法が開示されている。
特許２９７９３８３号公報
特開２００３−１６９６９５号公報
特開平１０−９９０９６号公報
しかしながら、上記特許文献１に記載された方法は、フルオレセインジアセテートが分解されやすく、生菌以外の夾雑物も染色されてしまうため、試料に生菌と死菌と菌以外の夾雑物とが一緒に含まれる場合は、正確な生菌数を測定できないという欠点があった。
また、上記特許文献２に記載された方法は、殺菌処理が必要なため煩雑であるだけでなく、殺菌条件が測定に影響を与えやすく、殺菌条件を十分に検討する必要がある等の欠点があった。
また、上記特許文献３に記載された方法も同様に、細胞膜を損傷させる処理が必要なため煩雑であるだけでなく、その処理条件を検討する必要があった。更に、細胞壁を有する細胞は測定できない等、測定対象が限定されてしまうという欠点もあった。
したがって、本発明の目的は、試料に含まれる生菌と、死菌やゴミ等の夾雑物とを容易に判別することができ、迅速、簡便かつ正確に生菌数を計測することができる生菌数の計測方法及び計測装置を提供することにある。
上記目的を達成するため、本発明の生菌数の計測方法は、試料をカルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）とトリパンブルー（Trypan blue）とを用いて染色し、カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）の励起光を照射して前記試料が発する蛍光を捕集し、前記捕集した蛍光を画像として取り込んで電気信号に変換して生菌数を計測することを特徴とする。
本発明の生菌数の計測方法によれば、蛍光染料としてカルボキシフルオレセインジアセテートとトリパンブルーとを用いて試料を二重染色することにより、生菌はカルボキシフルオレセインジアセテートのみで染色され、死菌やゴミ等の夾雑物はカルボキシフルオレセインジアセテートとトリパンブルーで染色される。そして、これにカルボキシフルオレセインジアセテートの励起光を照射することにより、生菌はカルボキシフルオレセインジアセテートに由来する緑色の蛍光を発し、死菌やゴミ等の夾雑物はトリパンブルーがカルボキシフルオレセインジアセテートの発する緑色の蛍光を吸収して励起されて赤色の蛍光を発するので、生菌とそれ以外の夾雑物を蛍光の色によって容易に判別することができる。したがって、これらの蛍光を捕集して画像として取り込んで電気信号に変換することにより、試料中の生菌数を迅速、簡便かつ正確に計測することができる。
本発明の生菌数の計測方法においては、試料をフィルタで濾過して前記フィルタの濾過面に菌を捕集し、前記濾過面全体に粘着シートを貼り付けて、該粘着シートの粘着層に前記フィルタ上にトラップされた菌を転写した後、該菌をカルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）とトリパンブルー（Trypan blue）とを用いて染色することが好ましい。
この態様によれば、フィルタにより試料中に浮遊している菌を効率よく捕集することができ、更に捕集した菌を粘着シートに固定することができるので、染色作業を容易に行うことができ、更に生菌数の計測も正確に行うことができる。
また、カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）で染色された生菌から発せられるカルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）の蛍光のみを捕集し、捕集した蛍光を画像として取り込むことが好ましい。
この態様によれば、トリパンブルーに染色されにくく、カルボキシフルオレセインジアセテートに染色される生菌の発する蛍光のみを撮影できるので、取り込んだ画像中の輝点をカウントすることにより、生菌数を容易に計測することができる。
また、カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）による蛍光とトリパンブルー（Trypan blue）による蛍光とを捕集し、捕集した蛍光をカラー画像として取り込み、カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）による蛍光とトリパンブルー（Trypan blue）による蛍光とを区別することが好ましい。
この態様によれば、トリパンブルーに染色されにくく、カルボキシフルオレセインジアセテートに染色される生菌の蛍光は緑色に撮影され、夾雑物はカルボキシフルオレセインジアセテートとトリパンブルーの両方に染色されるが、カルボキシフルオレセインジアセテートの発する蛍光を吸収してトリパンブルーが赤色の蛍光を発するため赤色に撮影される。したがって、取り込んだ画像中の輝点の色により生菌と夾雑物との区別を容易に行うことができ、画像処理等によって、取り込んだ画像中の緑色の輝点のみをカウントすることにより、生菌数を正確に計測できる。なお、夾雑物については、トリパンブルーに吸収されなかった微量のカルボキシフルオレセインジアセテートによる蛍光が見られることがあるが、撮影レンズの絞りを調整したり、減光フィルタをかけたり、あるいはトリパンブルー濃度を上げることにより、夾雑物のトリパンブルーに吸収されなかった微量のカルボキシフルオレセインジアセテートによる蛍光を減少させることができ、生菌の緑色の輝点のみを捉えられるようにすることができる。
更に、前記捕集した蛍光を画像として取り込む際に、計測する細菌のサイズが撮像素子の画素と同じサイズ若しくは撮像素子の画素よりも大きなサイズとなるように拡大して画像を取り込み、その画像からカルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）による蛍光で発光する菌数を計測することが好ましい。
この態様によれば、取り込んだ蛍光画像中の輝点（生菌）を認識しやすくなるので生菌数をより正確に計測することができる。
また、本発明の生菌数の計測装置の第１は、試料を保持する手段と、カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）とトリパンブルー（Trypan blue）で染色した前記試料に、カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）の励起光を照射する光学的手段と、前記試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、前記試料が発する蛍光を、波長５１０〜５５０ｎｍの光は透過し、５５０ｎｍより波長の大きい光は透過しないバンドパスフィルタを介して捕集する光学的手段と、前記バンドパスフィルタを透過した光を白黒画像として取り込む画像取り込み手段と、前記画像から輝点の数をカウントする手段とを備えていることを特徴とする。
また、本発明の生菌数の計測装置の第２は、試料を保持する手段と、カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）とトリパンブルー（Trypan blue）で染色した前記試料に、カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）の励起光を照射する光学的手段と、前記試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、前記試料が発する蛍光をカラー画像として取り込むカラーカメラからなる画像取り込み手段と、前記カラーカメラにより取り込まれたカラー画像から、緑色の輝点の数をカウントする手段とを備えていることを特徴とする。
本発明の生菌数の測定装置の第１及び第２において、前記蛍光を捕集する光学的手段は、計測する細菌のサイズが、前記画像取り込み手段の撮像素子の画素と同じサイズ若しくは該撮像素子の画素よりも大きなサイズとなるように拡大することができる光学素子を有しており、前記画像取り込み手段は、前記光学素子を介して画像を取り込むように配置されており、前記カウントする手段は、前記取り込んだ画像から前記生菌の蛍光の発光を捕らえて画像処理する手段を有していることが好ましい。
本発明によれば、生菌と、死菌やゴミ等の夾雑物とをそれぞれ異なる色の蛍光としてとらえることができるので、それらを容易に判別することができ、試料中の生菌数を正確に計測することができる。
１ 試料
２ 固定台
３ 鏡筒
４ レンズ
５、８ バンドパスフィルタ
６ 画像取り込み手段
７ 励起光源
９ ダイクロイックミラー
１０ 生菌数の計測装置
１１ 菌
１２ １つの画素
２ 固定台
３ 鏡筒
４ レンズ
５、８ バンドパスフィルタ
６ 画像取り込み手段
７ 励起光源
９ ダイクロイックミラー
１０ 生菌数の計測装置
１１ 菌
１２ １つの画素
本発明の生菌数の計測方法においては、蛍光染料としてカルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate、以下ＣＦＤＡと略記する。）とトリパンブルー（Trypan blue）の２種類が用いられる。
ＣＦＤＡは、加水分解される前は無蛍光であるが、菌の中に存在するエステラーゼで加水分解されると蛍光を発するため、基本的には生菌のみが染色されて蛍光を発し、死菌やゴミ等の夾雑物は染色されない。また、ＣＦＤＡは、フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）等に比べて、生菌内で分解された際に、その分解物（カルボキシフルオレセイン）が菌から漏出しにくいため、生菌の染色性に優れているという利点がある。
しかしながら、ＣＦＤＡは分解されやすく、染色液を調製した段階で既に一部のＣＦＤＡが分解されて蛍光を発するため、ＣＦＤＡのみを用いた場合は、実際には生菌だけでなく死菌やゴミ等の夾雑物も染色されて蛍光を発してしまい、生菌数を正確に計測することが難しかった。
一方、トリパンブルーは、死菌等の夾雑物を染色することができるが、生菌は染色されにくい。そこで、本発明においては、試料をＣＦＤＡとトリパンブルーとを用いて二重染色することにより、生菌はＣＦＤＡのみで染色され、死菌やゴミ等の夾雑物はＣＦＤＡ（一部分解したもの）とトリパンブルーによって染色される。
そして、ＣＦＤＡの励起光を照射すると、ＣＦＤＡのみで染色された生菌はＣＦＤＡに由来する緑色の蛍光（波長４８０〜６５０ｎｍ）を発する。一方、ＣＦＤＡとトリパンブルーによって染色された死菌やゴミ等の夾雑物は、図１に示すように、ＣＦＤＡの蛍光波長とトリパンブルーの励起波長がオーバーラップするため、トリパンブルーがＣＦＤＡの発する緑色の蛍光を吸収して励起し、赤色の蛍光（波長５５０〜８００ｎｍ）を発する。したがって、蛍光の色により、生菌と死菌やゴミ等の夾雑物とを容易に判別することができる。
以下、本発明の生菌数の計測方法について詳細に説明する。
（１）菌の採取
まず、試料中の菌を採取するために、適量の液体状の試料をフィルタで濾過する。これにより、フィルタの濾過面上に、試料中の生菌、死菌、ゴミ等の夾雑物がトラップされる。上記フィルタとしては、ポリカーボネイト、ポリエステル等の材質からなる孔径０．２〜０．６μｍの黒色若しくは透明のメンブレンフィルタを用いることができる。このようなメンブレンフィルタとしては、例えば、商品名「Nuclepore Track-Etch Membrane」（Whatman製）、商品名「Isopore Membrane Filters」（MILLIPORE製）、商品名「MEMBRANE FILTERS POLYCARBONATE」（東洋濾紙株式会社製）等の市販のものを用いることができる。
まず、試料中の菌を採取するために、適量の液体状の試料をフィルタで濾過する。これにより、フィルタの濾過面上に、試料中の生菌、死菌、ゴミ等の夾雑物がトラップされる。上記フィルタとしては、ポリカーボネイト、ポリエステル等の材質からなる孔径０．２〜０．６μｍの黒色若しくは透明のメンブレンフィルタを用いることができる。このようなメンブレンフィルタとしては、例えば、商品名「Nuclepore Track-Etch Membrane」（Whatman製）、商品名「Isopore Membrane Filters」（MILLIPORE製）、商品名「MEMBRANE FILTERS POLYCARBONATE」（東洋濾紙株式会社製）等の市販のものを用いることができる。
なお、試料の種類によっては、脱脂、除タンパク、濾過、遠心分離等の前処理を行ってから用いることが好ましく、液体状でない試料を用いる場合は、ミキサーやストマッカー等の破砕分散装置により菌を液体に抽出してから用いればよい。
（２）採取した菌の転写
次に、上記フィルタの濾過面全体に粘着シートを貼り付け、粘着シートの粘着層にフィルタ上にトラップされた菌等を転写する。
次に、上記フィルタの濾過面全体に粘着シートを貼り付け、粘着シートの粘着層にフィルタ上にトラップされた菌等を転写する。
粘着シートとしては、上記フィルタ上にトラップされた菌等を捕捉するのに十分な粘着性を有すると共に平滑な表面構造を有する粘着層が基材上に積層された構造からなるものを用いることができる。
また、粘着層としては、上記フィルタ上にトラップされた菌等を捕捉するのに十分な粘着性を有していれば特に限定されないが、菌の染色に用いる蛍光染料が粘着層に含浸しにくいこと及び粘着層が溶けて捕捉した菌等が移動しにくいことなどから、例えば、アクリル系粘着剤やゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の非水溶性粘着材を用いることが好ましい。
アクリル系粘着剤としては、具体的には、モノマーとして（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸ノニル、（メタ）アクリル酸デシル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステルを主成分として少なくとも１種類以上用い、これに共重合性モノマーとして（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル（メタ）アクリル酸メトキシエチル、（メタ）アクリル酸エトキシエチル、（メタ）アクリル酸ブトキシエチル、（メタ）アクリル酸エチレングリコール等の親水性モノマーを１種若しくは２種以上共重合させたものを用いることができる。なお、上記のような粘着剤からなる粘着層は、その粘着特性をより良好にするためにイソシアネート化合物、有機過酸化物、エポキシ基含有化合物、金属キレート化合物等の熱架橋剤による処理を行ったり、保形性を良好にするために紫外線、γ線、電子線等の放射線照射による処理を行って架橋を施すことが好ましい。
ゴム系粘着剤としては、天然ゴム、ポリイソブチレン、ポリイソプレン、ポリブテン、スチレン−イソプレン系ブロック共重合体、スチレン−ブタジエン系ブロック共重合体等の主ポリマーに、粘着性付与樹脂としてロジン系樹脂やテルペン系樹脂、クロマン−インデン系樹脂、テルペン−フェノール系樹脂、石油系樹脂を配合したものを用いることができる。
シリコーン系粘着剤としては、ジメチルポリシロキサンを主成分とする粘着剤が例示できる。
本発明においては、蛍光画像取得に際して光学特性に影響が少ないという点から、透明性の高いアクリル系粘着剤やシリコーン系粘着剤がより好ましく用いられる。
粘着層の厚みは、フィルタへの接着性や追従性、菌等の捕捉性の点から５〜１００μｍとすることが好ましい。また、捕捉した菌等の蛍光画像の取得に際して蛍光画像取得手段の焦点の合致範囲が広くなり、より正確な画像処理を可能とするために、粘着層表面の平滑度（凹凸差）は２０μｍ以下であることが好ましい。平滑度は、表面粗さ針や電子顕微鏡等で粘着シートの断面を観察し、粘着剤表面の凸部の頂点から凹部の最低点までの平均高さを測定して求めることができる。
また、粘着シートの基材は、粘着層表面に大きな凹凸を形成させず、また、曲面や狭所表面にも自在に圧着し得る柔軟な材質であれば特に限定されず、例えば、ポリエステル、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、織布、不織布、紙、ポリエチレンラミネート紙等を用いることができ、中でも平滑性の高いポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタンが好ましく用いられる。
また、基材の厚さは、支持体として十分な強度があればよく、５〜２００μｍ程度が好ましい。
粘着シートは、上記粘着剤からなる粘着層を公知の方法によって上記基材上に形成することにより製造することができ、その使用に際しては任意の形状に裁断して用いることができる。
（３）ＣＦＤＡ染色
上記粘着シートに転写された菌等をＣＦＤＡ溶液で染色する。ＣＦＤＡ溶液は、ＣＦＤＡを好ましくは３００〜３，０００μｇ／ｍＬとなるように、ＣＦＤＡの発色に適したｐＨの緩衝液に溶解することにより調製できる。ＣＦＤＡ濃度が薄すぎると生菌を十分に染色することができず、ＣＦＤＡ濃度が濃すぎると死菌やゴミ等の夾雑物が強く染色されてしまい、トリパンブルーに由来する蛍光を判別できなくなるため好ましくない。
上記粘着シートに転写された菌等をＣＦＤＡ溶液で染色する。ＣＦＤＡ溶液は、ＣＦＤＡを好ましくは３００〜３，０００μｇ／ｍＬとなるように、ＣＦＤＡの発色に適したｐＨの緩衝液に溶解することにより調製できる。ＣＦＤＡ濃度が薄すぎると生菌を十分に染色することができず、ＣＦＤＡ濃度が濃すぎると死菌やゴミ等の夾雑物が強く染色されてしまい、トリパンブルーに由来する蛍光を判別できなくなるため好ましくない。
上記緩衝液は、ＣＦＤＡに染色された生菌の蛍光強度の減少を防止するために、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ７．６〜８．２のリン酸緩衝液を用いることが好ましい。
なお、ＣＦＤＡ溶液は、雑菌の混入を防ぐために０．２μｍのフィルタで濾過しておくことが好ましい。また、長期保存する際には、必要に応じてアジ化ナトリウム等の防腐剤を添加でき、例えば、アジ化ナトリウムの最終濃度が０．１〜５ｍｇ／ｍＬ程度になるよう添加すればよい。
ＣＦＤＡによる染色は、粘着シートの粘着層（集菌面）上に、適量のＣＦＤＡ溶液を滴下して広げ、２〜４０℃で３０秒〜３分間放置した後、余分なＣＦＤＡ溶液を洗浄液で洗い流せばよい。
上記洗浄液としては、ＣＦＤＡの発色に適したｐＨの緩衝液が好ましく、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ７．６〜８．２のリン酸緩衝液を０．２μｍのフィルタで濾過してから用いることが好ましい。
（４）トリパンブルー染色
上記（３）においてＣＦＤＡで染色した後、トリパンブルー溶液で染色する。トリパンブルー溶液は、上記と同様に好ましくはリン酸緩衝液（好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ７．６〜８．２）に、トリパンブルーを好ましくは６０〜３０,０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは３００〜３,０００μｇ／ｍＬとなるように溶解した後、０．２μｍのフィルタで濾過することにより調製できるが、その際に、上記ＣＦＤＡ濃度の１０分の１以上となるように調製することが好ましく、１０分の１〜１倍となるように調製することが好ましい。トリパンブルーの濃度が薄すぎると死菌やゴミ等の夾雑物を十分に染色できず、トリパンブルーの濃度が濃すぎると生菌も染色されてしまい、死菌やゴミ等の夾雑物と判別できなくなるため好ましくない。なお、長期保存する際には、必要に応じてアジ化ナトリウム等の防腐剤を添加できる。
上記（３）においてＣＦＤＡで染色した後、トリパンブルー溶液で染色する。トリパンブルー溶液は、上記と同様に好ましくはリン酸緩衝液（好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ７．６〜８．２）に、トリパンブルーを好ましくは６０〜３０,０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは３００〜３,０００μｇ／ｍＬとなるように溶解した後、０．２μｍのフィルタで濾過することにより調製できるが、その際に、上記ＣＦＤＡ濃度の１０分の１以上となるように調製することが好ましく、１０分の１〜１倍となるように調製することが好ましい。トリパンブルーの濃度が薄すぎると死菌やゴミ等の夾雑物を十分に染色できず、トリパンブルーの濃度が濃すぎると生菌も染色されてしまい、死菌やゴミ等の夾雑物と判別できなくなるため好ましくない。なお、長期保存する際には、必要に応じてアジ化ナトリウム等の防腐剤を添加できる。
トリパンブルーによる染色は、粘着シートの粘着層（集菌面）上に、適量のトリパンブルー溶液を滴下して広げ、２〜４０℃で１〜１０秒間放置した後、余分なトリパンブルー溶液を洗浄液で洗い流せばよい。
なお、ＣＦＤＡ染色とトリパンブルー染色の順序に決まりはなく、トリパンブルー染色を行った後にＣＦＤＡ染色を行ってもよい。
（５）蛍光画像の取り込み及び生菌数の計測
上記のようにしてＣＦＤＡとトリパンブルーで染色した粘着シートの粘着層表面に残った液をブロワで吹き飛ばした後、これにＣＦＤＡの励起光（波長４００〜４９５ｎｍ）を照射し、粘着シートの粘着層表面上の蛍光の画像をＣＣＤカメラ、カラーカメラ、白黒カメラ等によって取り込む。
上記のようにしてＣＦＤＡとトリパンブルーで染色した粘着シートの粘着層表面に残った液をブロワで吹き飛ばした後、これにＣＦＤＡの励起光（波長４００〜４９５ｎｍ）を照射し、粘着シートの粘着層表面上の蛍光の画像をＣＣＤカメラ、カラーカメラ、白黒カメラ等によって取り込む。
本発明においては、粘着シートの粘着層表面上の蛍光を白黒画像として取り込む際に、ＣＦＤＡの蛍光波長の光のみを透過させる光学フィルタ等を介して生菌の発するＣＦＤＡの蛍光のみを画像として取り込むことが好ましい。上記光学フィルタとしては、波長５１０〜５５０ｎｍの光を透過し、波長５５０ｎｍより大きい光は透過しないフィルタが好ましく用いられる。
上記のようにして取り込まれた白黒画像では、ＣＦＤＡに由来する蛍光を発する生菌が輝点として識別できるので、この輝点（生菌）をカウントする。輝点のカウントは、目視で行ってもよく、例えば、商品名「Optimas」（MEDIA CYBERNETICS社製）等の市販の画像解析ソフトを用いて行うこともできる。
なお、本発明においては、検数のノイズとなりうる微弱な発光に対しては、減光光学フィルタを介して蛍光画像を取り込んでノイズを削除する、あるいは画像処理で閾値を設定して電気的に処理してから輝点をカウントすることが好ましい。このような画像処理は、例えば以下の（ａ）〜（ｅ）のようにして行うことができる。
（ａ）バックグラウンドノイズを除くために所定値（スレッショルド値）以下の画素は黒色にする。なお、スレッショルド値は使用者が設定する。
（ｂ）背景除去処理（ＣＣＤカメラの不良による輝点、ステージの傾きによる輝度の違いを補正）
（ｃ）エッジの検出（ソーベル、プレヴィッツ等の画像処理フィルタで処理）
（ｄ）２値化処理
（ｅ）各輝点のナンバリングと面積計算
を行った後、使用者が設定した所定のサイズに合致する輝点をカウントする。
（ｂ）背景除去処理（ＣＣＤカメラの不良による輝点、ステージの傾きによる輝度の違いを補正）
（ｃ）エッジの検出（ソーベル、プレヴィッツ等の画像処理フィルタで処理）
（ｄ）２値化処理
（ｅ）各輝点のナンバリングと面積計算
を行った後、使用者が設定した所定のサイズに合致する輝点をカウントする。
また、本発明においては、ＣＦＤＡに由来する蛍光とトリパンブルーに由来する蛍光をカラー画像として取り込むこともできる。
カラー画像では、生菌はＣＦＤＡに由来する緑色の蛍光を発する輝点として、死菌やゴミ等の夾雑物はトリパンブルーに由来する赤色の蛍光を発する輝点として識別できるので、ＣＦＤＡに由来する緑色の蛍光を発する輝点（生菌）を、目視、あるいは上記のような市販の画像解析ソフトを用いてカウントする。なお、上記の場合と同様に、検数のノイズとなりうる微弱な発光に対しては、減光光学フィルタを介して蛍光画像を取り込んでノイズを削除してもよく、画像処理で閾値を設定して電気的に処理してもよい。
本発明においては、蛍光画像を取り込む際に、図２に示すように、計測する細菌のサイズが撮像素子の画素と同じサイズ若しくは撮像素子の画素よりも大きなサイズとなるように拡大して画像を取り込むことが好ましい。すなわち、図２（ａ）に示すような菌１１の蛍光画像を、図２（ｂ）に示すように菌１１のサイズが一つの画素１２よりも大きなサイズとなるように、レンズ等の光学素子を用いて拡大してから取り込むことが好ましい。拡大倍率は、計測する細菌のサイズに応じて適宜選択すればよいが、通常、１０〜１０００倍で十分である。
上記のようにしてカウントされた輝点（生菌）の数から、試料中に含まれる生菌数を以下のようにして算出する。例えば、「食品衛生管理指針（微生物版）」（厚生省生活衛生局監修、社団法人日本食品衛生協会）の総菌数測定方法に記載されているように、顕微鏡観察の場合、１００倍の対物レンズを油浸して使用して１６視野以上観察し、観察した視野の輝点（生菌）数の合計（Ａ）を求める。そして、測定に供した液体試料の体積（Ｖ）と、メンブレンフィルタの濾過面積（Ｓｍ）と、観察視野総面積（Ｓｐ）とから下記式（１）に基づいて試料の生菌数（Ｃ）を算出すればよい。
（数１） Ｃ＝Ａ×Ｓｍ／（Ｓｐ×Ｖ）・・・（１）
次に、本発明の生菌数の計測装置について図面に基づいて説明する。図３には、本発明の生菌数の計測装置の一実施形態が示されている。
（数１） Ｃ＝Ａ×Ｓｍ／（Ｓｐ×Ｖ）・・・（１）
次に、本発明の生菌数の計測装置について図面に基づいて説明する。図３には、本発明の生菌数の計測装置の一実施形態が示されている。
この計測装置１０は、固定台２、鏡筒３、レンズ４、バンドパスフィルタ５、画像取り込み手段６、励起光源７、バンドパスフィルタ８、ダイクロイックミラー９とから構成されており、固定台２上に固定された試料１（粘着テープ上に転写され、ＣＦＤＡ及びトリパンブルーで染色された試料）に、励起光源７、バンドパスフィルタ８、鏡筒３、ダイクロックミラー９、レンズ４から構成されるＣＦＤＡの励起光を照射する光学的手段によってＣＦＤＡの励起光が照射されるようになっている。すなわち、励起光源７から照射された光は、波長４００〜４９５ｎｍの光を透過するバンドパスフィルタ８を通った後、波長５００ｎｍ以下の光を反射し、波長５００ｎｍを超える光は透過するダイクロイックミラー９で反射されて、波長４００〜４９５ｎｍの励起光が試料１に照射されるようになっている。
そして、前記試料１が発する蛍光の画像は、レンズ４、ダイクロックミラー９、鏡筒３、バンドパスフィルタ５から構成される蛍光を捕集する光学的手段を介して、画像取り込み手段６に取り込まれるようになっている。すなわち、前記試料１が発する蛍光の画像は、計測する細菌のサイズが撮像素子の画素と同じサイズ若しくは撮像素子の画素よりも大きなサイズとなるようにレンズ４で拡大されると共に、波長５１０〜５５０ｎｍの光は透過し、５５０ｎｍより波長の大きい光は透過しないバンドパスフィルタ５を介することにより、生菌から発せられるＣＦＤＡの蛍光のみが画像取り込み手段６に取り込まれるようになっている。
前記画像取り込み手段としては、例えば、ＣＣＤカメラ、カラーカメラ、白黒カメラ等を用いることができる。なお、前記バンドパスフィルタ５を使用しない場合は、前記画像取り込み手段６としてカラーカメラを用いて、ＣＦＤＡに由来する蛍光とトリパンブルーに由来する蛍光をカラー画像として取り込めばよい。
本発明の計測装置は、更に、前記画像取り込み手段６に取り込まれた蛍光画像をＣＦＤＡによる蛍光の発光を捕らえて画像処理する手段と、前記処理した画像から輝点の数をカウントする手段を備えていることが好ましい。
前記画像処理する手段及び前記輝点の数をカウントする手段としては、コンピュータを用いることができ、例えば、上記（５）で説明したような画像処理プログラム及び画像解析プログラムを有するコンピュータを用いることができる。
以下の試薬を調製して用いた。
・界面活性剤溶液：１０％トリトンＸ−１００水溶液を無菌濾過したもの
・タンパク質分解酵素溶液：２％トリプシン溶液（溶媒は生理食塩水）を無菌濾過したもの
・ＣＦＤＡ溶液：ＣＦＤＡを１５０〜３０,０００μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ８．１）に溶解した後、０．２μｍのフィルタで濾過したもの
・トリパンブルー溶液：トリパンブルーを３０〜３０,０００μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ８．１）に溶解した後、０．２μｍのフィルタで濾過したもの
・洗浄液：リン酸緩衝液（ｐＨ８．１）
試料である生乳１ｍＬと、上記界面活性剤溶液２０μＬと、上記タンパク質分解酵素溶液２５０μＬとを、マイクロチューブ（トレフ社製１．５ｍＬ微量遠心チューブ、型番No.96.7246.9.01をオートクレーブ滅菌して使用）に入れて、試験管ミキサーで１０秒混合した。そして、４２℃の恒温水槽に上記マイクロチューブを浮かべ、１０分間保温した後、室温（約２５℃）で３分間遠心分離（７３００×ｇ）した。
・タンパク質分解酵素溶液：２％トリプシン溶液（溶媒は生理食塩水）を無菌濾過したもの
・ＣＦＤＡ溶液：ＣＦＤＡを１５０〜３０,０００μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ８．１）に溶解した後、０．２μｍのフィルタで濾過したもの
・トリパンブルー溶液：トリパンブルーを３０〜３０,０００μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ８．１）に溶解した後、０．２μｍのフィルタで濾過したもの
・洗浄液：リン酸緩衝液（ｐＨ８．１）
試料である生乳１ｍＬと、上記界面活性剤溶液２０μＬと、上記タンパク質分解酵素溶液２５０μＬとを、マイクロチューブ（トレフ社製１．５ｍＬ微量遠心チューブ、型番No.96.7246.9.01をオートクレーブ滅菌して使用）に入れて、試験管ミキサーで１０秒混合した。そして、４２℃の恒温水槽に上記マイクロチューブを浮かべ、１０分間保温した後、室温（約２５℃）で３分間遠心分離（７３００×ｇ）した。
マイクロチューブを逆さまにして上澄みを捨て、乳脂肪を滅菌済み綿棒で拭いて除いた後、マイクロチューブにＰＢＳを１００μＬ入れ、ピペットで吸引と吐出を繰返して沈殿を懸濁した後、更にＰＢＳを１ｍＬ入れて菌を分散させた。
孔径０．４μｍのメンブレンフィルタ（商品名「Nuclepore Track-Etch Membrane」、Whatman製、直径２５ｍｍ）をセットした濾過器に、生理食塩水１０ｍＬを入れた後、上記試料を加えて濾過した（ファンネルの内径８ｍｍ、濾過面積２０１ｍｍ２）。
濾過器のファンネル部分を外してメンブレンフィルタを取り出し、該メンブレンフィルタの濾過面にセロファンテープ状の無蛍光な粘着シート（日東電工株式会社製）を貼り付けて、メンブレンフィルタ上の菌等を粘着シートの粘着面に転写した（転写面積１ｃｍ２）。
そして、菌等を転写した粘着シートの粘着面に、ＣＦＤＡ溶液を３００μＬ滴下して広げ、２５℃で１分間静置した後、洗浄液３００μＬで３回洗浄し、余分なＣＦＤＡを洗い流した。
次いで、粘着シートの粘着面にトリパンブルー溶液を３００μＬ滴下して広げ、２５℃で１０秒間静置した後、洗浄液３００μＬで１回洗浄した。
粘着シートの粘着面に残った水分をブロワで吹き飛ばした後、図３に示す装置で輝点（生菌数）の測定（撮影視野総面積は１９．６ｍｍ２）を行い、ＣＦＤＡ濃度とトリパンブルー濃度が、測定した輝点の数に与える影響を調べた。その結果を図４に示す。
図４においては、蛍光顕微鏡により目視でカウントした生菌数を真値とし、Ｙ軸は本装置で測定した輝点の数を、蛍光顕微鏡により目視でカウントした生菌数で除して求めた相対的な輝点数で表し、測定誤差を調べた。本発明においては、許容測定誤差を、一般な菌数の許容測定誤差である１／２〜２倍とした。ここで、測定誤差とは、平均値を真値とみなし、それに対する最小値から最大値の範囲を意味する。
図４から、濃度３００〜３,０００μｇ／ｍＬのＣＦＤＡ溶液を用い、トリパンブルー濃度を６０〜３０,０００μｇ／ｍＬとすると共にＣＦＤＡ濃度の１０分の１以上の濃度のトリパンブルー溶液を用いて染色することにより、許容測定誤差の範囲内で生菌数を計測できることが分かる。
一方、ＣＦＤＡ濃度が１５０μｇ／ｍＬでは、ＣＦＤＡ溶液のみで染色した際の輝点の数が少なく、ＣＦＤＡ濃度１５０μｇ／ｍＬ以下では測定に適さないことが分かる。また、ＣＦＤＡ濃度が３０,０００μｇ／ｍＬでは、ＣＦＤＡで染色される夾雑物の蛍光が強すぎて生菌の検出ができなかった。
本発明の生菌数の計測方法及び計測装置は、医薬、農薬、食品衛生管理等の分野や医学、薬学、生物学等の研究分野において、生菌数の測定に利用できる。
Claims (8)
- 試料をカルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）とトリパンブルー（Trypan blue）とを用いて染色し、カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）の励起光を照射して前記試料が発する蛍光を捕集し、前記捕集した蛍光を画像として取り込んで電気信号に変換して生菌数を計測することを特徴とする生菌数の計測方法。
- 試料をフィルタで濾過して前記フィルタの濾過面に菌を捕集し、前記濾過面全体に粘着シートを貼り付けて、該粘着シートの粘着層に前記フィルタ上にトラップされた菌を転写した後、該菌をカルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）とトリパンブルー（Trypan blue）とを用いて染色する請求項１に記載の生菌数の計測方法。
- カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）で染色された生菌から発せられるカルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）の蛍光のみを捕集し、捕集した蛍光を画像として取り込む請求項１又は２に記載の生菌数の計測方法。
- カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）による蛍光とトリパンブルー（Trypan blue）による蛍光とを捕集し、捕集した蛍光をカラー画像として取り込み、カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）による蛍光とトリパンブルー（Trypan blue）による蛍光とを区別する請求項１又は２に記載の生菌数の計測方法。
- 前記捕集した蛍光を画像として取り込む際に、計測する細菌のサイズが撮像素子の画素と同じサイズ若しくは撮像素子の画素よりも大きなサイズとなるように拡大して画像を取り込み、その画像からカルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）による蛍光で発光する菌数を計測する請求項１〜４のいずれか一つに記載の生菌数の計測方法。
- 試料を保持する手段と、
カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）とトリパンブルー（Trypan blue）で染色した前記試料に、カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）の励起光を照射する光学的手段と、
前記試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、
前記試料が発する蛍光を、波長５１０〜５５０ｎｍの光は透過し、５５０ｎｍより波長の大きい光は透過しないバンドパスフィルタを介して捕集する光学的手段と、
前記バンドパスフィルタを透過した光を白黒画像として取り込む画像取り込み手段と、
前記画像から輝点の数をカウントする手段とを備えていることを特徴とする生菌数の計測装置。 - 試料を保持する手段と、
カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）とトリパンブルー（Trypan blue）で染色した前記試料に、カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxy fluorescein diacetate）の励起光を照射する光学的手段と、
前記試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、
前記試料が発する蛍光をカラー画像として取り込むカラーカメラからなる画像取り込み手段と、
前記カラーカメラにより取り込まれたカラー画像から、緑色の輝点の数をカウントする手段とを備えていることを特徴とする生菌数の計測装置。 - 前記蛍光を捕集する光学的手段は、計測する細菌のサイズが、前記画像取り込み手段の撮像素子の画素と同じサイズ若しくは該撮像素子の画素よりも大きなサイズとなるように拡大することができる光学素子を有しており、前記画像取り込み手段は、前記光学素子を介して画像を取り込むように配置されており、前記カウントする手段は、前記取り込んだ画像から前記生菌の蛍光の発光を捕らえて画像処理する手段を有している請求項６又は７に記載の生菌数の計測装置。
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