FR2955121A1 - Milieu de culture fluorescent pour la detection de microorganismes comprenant un colorant masquant la fluorescence residuelle - Google Patents

Abstract

L'invention se rapporte à un milieu de culture utile pour la détection par fluorescence de microorganismes et à sa mise en œuvre, ledit milieu comprenant un support nutritif dans lequel sont solubilisés de manière homogène au moins un substrat fluorogène activé par les microorganismes, notamment le CFDA, et un composé masquant la fluorescence résiduelle liée à l'activation non-spécifique dudit substrat dans ledit milieu, en particulier le bleu brillant CFC.

Description

La présente demande de brevet concerne le domaine du contrôle bactériologique des fluides aqueux ou gazeux, et plus particulièrement celui de l'eau.

Elle se rapporte plus particulièrement à un milieu de culture utile pour la détection par fluorescence des microorganismes, ledit milieu comprenant un support nutritif dans lequel sont solubilisés de manière homogène un substrat fluorogène activé par les microorganismes, notamment des substrats fluorogènes comprenant de la fluorescéine, et un composé masquant la fluorescence résiduelle liée à l'activation non-spécifique dudit substrat fluorogène dans ledit milieu de culture, en particulier le bleu brillant CFC.

PREAMBULE Les traitements de l'eau et de l'air obéissent à des normes strictes tendant à limiter le nombre de microorganismes présents dans l'eau ou dans l'air à des niveaux, qui ne présentent pas de risque pour la santé humaine. Un suivi constant des eaux traitées est donc nécessaire pour pouvoir s'assurer qu'elles ne sont pas contaminées au-delà des normes prescrites. Il en va de même de la qualité de l'air dans les salles dites blanches, les hôpitaux ou les laboratoires dans lesquels il est requis d'opérer en conditions stériles ou d'hygiène stricte. Dans les deux cas, le contrôle des fluides liquides ou gazeux doit 25 être réalisé dans un temps suffisamment court pour pouvoir intervenir en temps utile et traiter la cause des éventuelles contaminations. Ainsi, l'une des principales contraintes des procédés de détection et d'identification des microorganismes réside dans la durée de leur mise en oeuvre. 30 En effet, même avec le développement de tests de détection basés sur des méthodes d'amplification spécifique des acides nucléiques, telle que la PCR quantitative, la culture des germes reste souvent nécessaire pour pouvoir opérer une détection fiable. En effet, les contaminants sont souvent disséminés dans l'air ou l'eau à des concentrations trop faibles pour être directement mis en évidence. Par ailleurs, il n'est pas rare que des acides nucléiques soient présents de manière résiduelle dans les échantillons, ce qui, en l'absence de microorganismes vivants, résulte en de faux positifs. De ce fait, seule la culture des microorganismes offre une garantie réelle de l'absence ou de la présence de germes vivants dans les échantillons. De plus, les microbiologistes privilégient les tests comprenant la culture des germes, dans la mesure où cette culture permet de pouvoir disposer, le cas échéant, de matériel biologique pour procéder à une caractérisation complémentaire desdits germes. A cet égard, la Pharmacopée se réfère encore largement à l'emploi de milieux de culture, dont la composition est fonction des espèces de microorganismes recherchées, pour établir les seuils de contamination à respecter. Le milieu R2A, par exemple, est un milieu à base d'extrait de levure et d'hydrolysat de caséine, prescrit par la Pharmacopée pour activer la croissance de bactéries hétérotrophes stressées présentes dans des eaux épurées, en particulier, les bactéries tolérantes aux traitements par le chlore. Dans le cas de produits fluides comme l'air ou l'eau, il est souvent nécessaire de filtrer les échantillons à tester sur une membrane de filtration, de sorte à concentrer les microorganismes avant de procéder à leur détection, ce qui allonge d'autant le temps de mise en oeuvre de cette détection. Lorsqu'on utilise un milieu de culture tel que le milieu R2A pour une énumération classique sur boîte gélosée, il convient d'incuber les microorganismes pendant 5 à 7 jours à 32,5°C+/-2,5°C pour que les différentes espèces de microorganismes constituent des colonies visibles à l'oeil nu. Le demandeur a développé depuis plusieurs années, notamment sur la base de l'enseignement de la demande WO 01/59157, une gamme de dispositif appelée « Milliflex Rapid» visant à réduire le temps nécessaire au contrôle microbiologique des échantillons fluides. Ces dispositifs permettent d'opérer la filtration d'échantillons liquides ou gazeux au travers d'une membrane de nylon ou de PVDF en conditions stériles, puis la culture des germes filtrés directement sur la membrane par mise en contact de celle-ci avec une cassette de milieu de culture gélosé, et ensuite la détection in-situ des micro-colonies sur cette même membrane. La membrane est fixée sur un support en plastique conçu pour s'emboîter successivement sur une pompe à vide pour la filtration, sur une cassette de milieu de culture gélosé pour la culture des microorganismes, puis sur différents appareils permettant de sécher et traiter la membrane pour y détecter les microorganismes. Pour réduire le temps de culture, les micro-colonies sont 15 détectées avant même qu'elles ne soient visibles à l'oeil nu par un procédé de marquage des cellules à l'aide d'un réactif luminescent. Ce procédé de marquage consiste à lyser les cellules formant les micro-colonies directement sur la membrane, afin de libérer le contenu des cellules en adénosine triphosphate (ATP), puis à faire réagir cet ATP avec un 20 réactif bioluminescent, la luciférine. La réaction de l'ATP avec le réactif bioluminescent produit une émission de lumière, dont l'intensité est mesurée au moyen d'une caméra CCD. Le signal lumineux est alors transmis à une interface informatique qui traite ce signal et qui le restitue sous la forme d'une image de synthèse de la 25 membrane montrant la localisation des micro-colonies. L'ATP étant un marqueur métabolique présent dans toutes les cellules vivantes, la détection réalisée est « universelle », c'est-à-dire qu'elle permet l'énumération de tous les microorganismes présents sur la membrane sans distinction d'espèces. 30 Ce système permet un gain de temps appréciable par rapport aux tests traditionnels sur boites de Pétri. En outre, il permet de stocker les images obtenues sur support numérique, ce qui est avantageux en termes de traçabilité des produits analysés. Cependant, il présente certains inconvénients. En particulier, la réaction avec l'ATP nécessite de lyser les cellules. La méthode de détection est donc destructive et rend difficile la récupération de matériel biologique en vue d'analyses complémentaires pour déterminer le type de microorganisme détecté. Elle ne permet donc pas de distinguer plusieurs types de microorganismes. D'autre part, l'ATP peut parfois migrer sur la membrane et créer un bruit de fond réduisant la sensibilité de la détection.

Afin de remédier à ces inconvénients, les inventeurs ont eu l'idée de marquer les microorganismes à l'aide de marqueurs fluorescents, en utilisant notamment des dérivés de la fluorescéine, tels que la fluorescéine diacétate (FDA) ou le carboxyfluorescéine diacétate (CFDA). Ces composés se présentent sous la forme de substrats fluorogènes, c'est-à-dire des molécules complexes comprenant un groupement fluorophore capable d'absorber de l'énergie lumineuse et de la restituer sous forme d'un spectre d'émission en fluorescence et un groupement « quencher » masquant la fluorescence de ce fluorophore. Au contact d'enzymes spécifiques, le substrat fluorogène adopte une forme différente permettant au fluorophore d'émettre en fluorescence. Cette activation se traduit soit par un changement de conformation de la molécule formant le substrat, soit par clivage de celle-ci pour former des résidus fluorescents. Le FDA et le CFDA sont des substrats fluorogènes ayant la particularité d'être activés par des enzymes ayant une activité estérasique non spécifique. De telles enzymes sont présentes chez la plupart des microorganismes, ce qui fait de ces substrats de bons candidats pour effectuer une détection universelle des microorganismes. Dans le principe, les substrats fluorogènes peuvent être incorporés au milieu de culture, puis adsorbés ou absorbés par les microorganismes. Les microorganismes activent alors localement le substrat qui émet un signal fluorescent en réponse à une illumination par une longueur d'onde donnée spécifique du substrat utilisé. Cependant, le FDA et le CFDA ont tous deux tendance à être partiellement hydrolysés dans les milieux de culture, notamment les milieux de culture comprenant des extraits de levure (yeast extract), tryptone, peptone, ainsi que certains tampons tels que le Tris-HCI ou comprenant du phosphate de sodium, ce qui est le cas de la plupart des milieux d'usage courant, notamment le milieu R2A [Clarke J.M. et al. (2001) Journal of Microbiological Methods 46 :261-267]. Cette instabilité pourrait s'expliquer par une activité estérasique non spécifique résiduelle provenant des extraits protéiques contenus dans ces milieux. Il résulte de cette activité estérasique résiduelle une fluorescence parasite formant un bruit de fond important, qui ne permet pas toujours de distinguer les micro-colonies de cellules vivantes des possibles hétérogénéités du milieu de culture dans lequel le substrat est solubilisé. Dans ces conditions, l'utilisation de milieux de culture comprenant des substrats fluorogènes, notamment du FDA ou du CFDA, n'a pu être développée efficacement dans le cadre des méthodes de détection rapide.

Les inventeurs ont tenté alors d'utiliser des membranes de filtration ayant des propriétés d'absorption de la fluorescence résiduelle provenant du milieu de culture (membranes teintées). Cependant, cette solution ne leur a pas donné satisfaction. De manière surprenante, c'est en incorporant dans le milieu de culture différents colorants, et plus particulièrement du Dye Concentrate Blue® (Cole Parmer Instruments Company) une composition comprenant du bleu brillant CFC, que les inventeurs sont parvenus à maitriser la fluorescence résiduelle du milieu de culture, de sorte à pouvoir détecter les micro-colonies en fluorescence avec un contraste satisfaisant.

Il est ainsi apparu que l'adjonction de composés masquant la fluorescence résiduelle liée à l'activation non-spécifique dudit substrat fluorogène, rendait ce milieu apte à la mise en oeuvre d'une détection par fluorescence des microorganismes, et ce de manière stable dans le temps. Avantageusement, le contraste reste satisfaisant lorsque la mesure de fluorescence est effectuée directement sur la membrane de filtration, après séparation de celle-ci du milieu de culture, et séchage. Ceci laisse penser que les microorganismes, dans une certaine mesure, adsorbent ou absorbent le composé, un composé masquant la fluorescence résiduelle, de telle sorte qu'on obtient une détection fine des micro-colonies, in situ, sur la membrane.

Enfin, de façon surprenante, même une fois séchés, les microorganismes peuvent être remis en culture en replaçant la membrane sur une cassette de milieu de culture, en vue d'une éventuelle caractérisation complémentaire. L'invention consiste donc en des milieux de cultures stables comprenant un ou plusieurs agents fluorogènes, ainsi qu'un ou plusieurs composés masquant la fluorescence résiduelle liée à l'activation non-spécifique dudit substrat, pour la détection précoce des micro-colonies, notamment lorsqu'elles sont cultivées sur des boites gélosées ou sur des membranes de filtration.

Cette invention permet la mise en oeuvre de tests de détection de microorganismes plus rapides, permettant, le cas échéant, de maintenir la viabilité des microorganismes en vue de leur éventuelle caractérisation. Elle permet également, dans une certaine mesure, de simplifier les protocoles actuels de détection des microorganismes sur membrane, dans la mesure où la détection s'effectue directement par une mesure de fluorescence simple, sans avoir recours à une étape intermédiaire impliquant une réaction enzymatique luminescente, comme l'ATP-bioluminescence. L'invention présente d'autres avantages, qui ressortent de ce qui suit.

Figure 1 : Principe général du procédé de détection des microorganismes selon l'invention. 1 - La filtration de l'échantillon à analyser est effectuée au travers d'une membrane maintenue dans un support de filtration de type Milliflex (Millipore). 2 - La membrane est ensuite placée sur une cassette dans laquelle a été préalablement coulé un milieu gélosé fluorescent de type R2A + CFDA comprenant un contre-colorant de type bleu brillant CFC. 3 - Les microorganismes retenus sur la membrane se développent sous forme de micro-colonies par diffusion du milieu de culture à travers la membrane. 4 - Après une incubation d'au moins 7 heures à environ 35°C, les micro-colonies deviennent fluorescentes par hydrolyse du CFDA. 5 - Il est alors possible de les visualiser sous un illuminateur en lumière bleue et de mesurer la fluorescence au moyen d'une caméra. Le contre-colorant qui a imprégné la membrane permet d'absorber la fluorescence «parasite» provenant de la dégradation partielle du CFDA dans le milieu de culture.

Figure 2 : Graphique représentant les résultats de recouvrement (%) en ce qui concerne la viabilité des micro-colonies (^) et la détection de la fluorescence des micro-colonies (•).Les tests sont réalisés sur des cassettes gélosées selon l'invention conservées à 4°C, pendant plusieurs mois (1,5 à 10 mois en abscisse). Ces résultats attestent, à la fois, d'une bonne stabilité du milieu gélosé et d'une performance conservée du milieu gélosée au cours du temps.

La présente invention a donc pour objet un procédé de détection de microorganismes mettant en oeuvre un milieu de culture particulier permettant de procéder à une meilleure détection des microorganismes par fluorescence. Par microorganisme, on entend ici toute cellule vivante (eucaryote ou procaryote) comprenant un patrimoine génétique contenu dans une enveloppe formée d'une paroi simple ou multiple, capable de se multiplier de manière autonome dans un milieu de culture adapté.

Les microorganismes visés par le procédé de l'invention sont plus particulièrement choisis parmi les bactéries pathogènes à gram positif ou négatif des genres Pseudomonas, Escherichia, Legionella, Salmonella, Listeria, Bacillus, Streptococcus, Vibrio, Yersinia, Staphylococcus, Mycobacterium, Shigella, Clostridium, Campylobacter, ou Aeromonas ; les protozoaires du genre Giardia, Entamoeba, Cryptosporidium, Cyclospora ; les mycoplasmes du genre Mycoplasma et Uréaplasma, les champignons du genre Aspergillus, Candida ou Penicillium, lesquels sont des microorganismes à caractère pathogène rencontrés fréquemment dans l'environnement.

Dans son principe, la détection des microorganismes selon l'invention s'opère par la mise en contact d'un échantillon dont on cherche à déterminer s'il est contaminé par un microorganisme vivant, avec ce milieu de culture, lequel peut être sous forme liquide ou gélosée. Ce milieu de culture comprend un support nutritif dans lequel sont solubilisés, de manière homogène, au moins un substrat fluorogène et un composé masquant la fluorescence résiduelle liée à l'activation non-spécifique dudit substrat. Par « substrat fluorogène », on désigne une molécule complexe, qui, au contact d'enzymes synthétisées par les microorganismes, deviennent fluorescentes. Ce type de molécule comprend généralement, à la fois, un groupement fluorophore capable d'absorber de l'énergie lumineuse et de la restituer sous forme d'un spectre d'émission en fluorescence et un groupement dit « quencher » masquant la fluorescence dudit groupement fluorophore. Au contact d'enzymes spécifiques des microorganismes, le substrat fluorogène adopte une forme différente permettant au fluorophore d'émettre en fluorescence. Cette activation se traduit soit par un changement de conformation de la molécule formant le substrat, soit par clivage de celle-ci pour former des résidus fluorescents. Différents substrats fluorogènes peuvent être envisagés selon l'invention. Les substrats sensibles à une activité estérasique sont préférés selon l'invention car, du fait que la plupart des microorganismes synthétisent 30 des enzymes ayant une activité estérasique, de tels substrats permettent une détection plus universelle de ceux-ci. Les substrats fluorogènes résultant, après activation enzymatique, en des composés comprenant de la fluorescéine sont préférés selon l'invention. L'émission en fluorescence de la fluorescéine se situe autour de 514 nm pour une longueur d'onde d'excitation d'environ 490 nm (Tris, pH=8). Les substrats fluorogènes particulièrement préférés selon l'invention, sont notamment la fluorescéine diacétate (FDA) (CAS n°596-09-8), le 5(6)-carboxy-2,7'-dicholorofluorescéine diacétate (CFDA) (CAS n°127770-45-0) ou le 6-carboxyfluorescéine diacétate (CAS n° 3348-03-6). D'autres substrats fluorogènes comprenant de la fluorescéine peuvent être également utilisés tels que le 5-carboxyfluoresceindiacetate-N- succinimidylester (5-CFDASE), le 6-carboxyfluoresceindiacetate-N- succinimidylester (6-CFDASE), 5(6)-carboxyfluoresceindiacetate-N- succinimidylester (5(6)-CFDASE) ou le 5(6)-carboxy-di-O-acetylfluorescein-N- succinimidyl ester (5(6)-CDOAFSE). Les substrats fluorogènes comprenant de la fluorescéine, préférés selon l'invention, peuvent se montrer sensibles à l'activité estérasique résiduelle que présente la plupart des milieux de culture prescrits par la Pharmacopée, notamment ceux comprenant des extraits de levures. Cette dégradation progressive du substrat s'observe en particulier dans le milieu R2A recommandé pour l'énumération des microorganismes dans les eaux pures. Il résulte de cette dégradation une fluorescence résiduelle générant un bruit de fond important lorsque le milieu de culture est analysé en fluorescence. C'est pourquoi, afin de limiter la fluorescence résiduelle résultant de l'hydrolyse partielle du substrat fluorogène, le milieu de culture selon l'invention, comprend une concentration adéquate d'un composé ayant pour effet de masquer la fluorescence résiduelle, liée à l'activation non spécifique du substrat fluorogène. Ce composé doit obéir à un certain nombre d'exigences, notamment celles de ne pas présenter de toxicité vis-à-vis des microorganismes, d'être soluble dans l'eau de sorte à se répartir 30 10 15 uniformément dans le milieu de culture, ne pas se concentrer à l'intérieur ou à la surface des cellules, ni être dégradé par les microorganismes (stabilité dans le temps). Enfin, la concentration de ce composé doit être ajustée de telle sorte que la fluorescence résiduelle non spécifique soit masquée, c'est-à-dire diminuée dans son intensité, sans empêcher la détection de la fluorescence spécifique résultant de l'activation du substrat par les microorganismes, laquelle fluorescence spécifique recouvre généralement le spectre d'émission de la fluorescence résiduelle. Ce composé a donc pour but d'accentuer les contrastes. Les inventeurs ont déterminé que plusieurs colorants connus dans d'autres applications pouvaient être utilisés comme composés permettant de masquer la fluorescence résiduelle, notamment la fluorescence résiduelle des composés comprenant de la fluorescéine, notamment, le bleu Trypan, le bleu Evans, le noir acide et le bleu brillant CFC. Le bleu Trypan (CAS 72-57-1) est essentiellement constitué de sel tétrasodique de l'acide ((diméthyl-3,3'biphenylène-4,4')-3,3'bis(azo))-3,3'bis(acide amino-5 hydroxy-4 naphtalènesulfonique-2,7) représenté par la formule suivante : 20 HO 3S/i1 ,p+ SO3H N N N N SO3H HO3S (CAS 314-13-6) est essentiellement constitué de 25 l'acide (dimethyl-3,3'biphenylène-4,4'bisazo)-2,2'bis-(amino-8 hydroxy-1 naphtalènesulfonique-5,7) représenté par la formule suivante : 11 o- o=s=o N N o=s=o le noir acide (CAS No.:1328-24-1) est essentiellement constitué du 4-amino-1-[(4-amino-9,10-dioxo-anthracène-1-yl)amino]anthracène-9,10-dione représenté par la formule suivante : 0 NH z [SO3Na]x NH 0 NHz Le bleu brillant CFC (CAS 2650-18-2) est essentiellement constitué de sel disodique de l'acide a-[(N-éthyl-sulfo-3-benzylamino)-4- phényl]-a-(N-éthyl-sulfo-3-benzylamino-4)-cyclohexadiène-2,5-ylidène) toluènesulfonique-2 ou de son isomère, représenté par la formule suivante : Un milieu de culture selon l'invention comprend ainsi préférentiellement un substrat fluorogène comprenant la fluorescéine ou un de ses dérivés, tel que le FDA ou le CFDA. De préférence, un tel milieu comprend un composé masquant la fluorescence résiduelle liée à l'activation non-spécifique dudit substrat fluorogène, sélectionné parmi le bleu Trypan, le bleu Evans, le noir acide et le bleu brillant CFC. Le milieu de culture selon l'invention comprend, de préférence, du bleu brillant CFC. Plus préférentiellement, ledit milieu comprend du CFDA et du bleu brillant CFC.

Le milieu selon l'invention comprend généralement entre 0,001% et 0,1 % et de préférence entre 0,005% et 0,05 % en poids de FDA ou de CFDA. Il comprend, en outre généralement entre 0,01 et 1%, de préférence entre 0,05 et 0,5 % en poids dudit composé masquant la fluorescence résiduelle liée à l'activation non-spécifique dudit substrat fluorogène.

Selon un aspect préféré de l'invention, le milieu de culture comprend un support nutritif à base d'extrait de levure, comme, par exemple, le milieu R2A, dont la composition est généralement la suivante (pour 1 litre) : - Extrait de levure, entre 1 et 2 g ; - Hydrolysat de caséine, entre 3 et 7 g ; - Protéose peptone, entre 1 et 2 g ; - Dextrose ou sucrose, entre 1 et 2 g ; - Amidon soluble, entre 1 et 2 g ; - Pyruvate de sodium, entre environ 0,1 et 1 g ; - Hydrogéno-phosphate di-potassium, entre environ 0,1 et 0,5 g 25 (K2HPO4) ; - Sulfate de magnésium, entre environ 0,01 et 0,1 g ; Auxquels s'ajoutent, selon l'invention : - Substrat fluorogène, de préférence sous forme de CFDA entre environ 50mg et 400mg ; 30 - Composé ayant pour effet de masquer la fluorescence résiduelle, de préférence celle de la fluorescéine, telle que le bleu brillant CFC entre environ 0.2 et 1 g.

Lorsque le milieu est gélosé, ledit milieu comprend, en outre, entre environ 10 et 20 g d'Agar. Le milieu de culture peut ainsi être éventuellement conservé « prêt à l'emploi » sous la forme d'une cassette dans laquelle le milieu a été coulé et refroidi sous forme gélosée.

Pour la préparation rapide du milieu de culture selon l'invention, il est avantageux que celui-ci soit formulé ou conservé sous une forme déshydratée, c'est-à-dire une composition dans laquelle chacun des ingrédients est présent sous forme de poudre. Le milieu est alors reconstitué en ajoutant un certain volume d'eau pour obtenir les proportions visées plus haut. Le substrat fluorogène et le composé masquant la fluorescence résiduelle liée à l'activation non-spécifique dudit substrat, sont solubilisés dans le support nutritif de manière homogène, c'est-à-dire de sorte à être régulièrement répartis dans le volume de milieu de culture.

Bien que la mise en oeuvre du procédé selon l'invention puisse s'opérer pour des échantillons de formes très diverses, il s'applique préférentiellement aux échantillons filtrables liquides ou gazeux. Pour de tels échantillons, une filtration est généralement préalablement pratiquée pour concentrer les microorganismes à la surface d'une membrane généralement placée à l'intérieur d'une unité de filtration stérile. Par « membrane », on désigne un support synthétique présentant deux faces, dont les pores ont un diamètre moyen connu. La membrane utilisée dans le cadre de la présente invention présente, en général, un rapport surface/volume élevé et une épaisseur constante comprise, de préférence, entre 90 et 200 pm. Une telle membrane peut être mono ou multicouche. Elle est en général constituée d'un ou plusieurs matériaux choisis parmi le polytétrafluoroéthylène, le fluorure de poly(vinylidène) (PVDF), le polycarbonate, le polyamide, le polyester, le polyéthersulfone, l'acétylcellulose et la nitrocellulose. De préférence, cette membrane sert à filtrer préalablement l'échantillon dont on cherche à tester la stérilité ou déterminer la présence de microorganismes. Cette membrane est généralement en nylon, en ester de cellulose ou en polycarbonate (ex : HAWG Milliflex, Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 USA) et présente une taille moyenne du diamètre des pores comprise entre environ 0,1 et 0,5 pm, de préférence, entre 0,15 et 0,3 pm de diamètre. Après l'étape de filtration, la membrane est généralement mise en contact avec le milieu de culture selon l'invention défini précédemment. Le substrat fluorogène et le composé masquant la fluorescence résiduelle, ainsi que les éléments nutritifs permettant aux cellules de se développer diffusent alors dans la membrane jusqu'aux microorganismes s'y trouvant piégés. Après un temps d'incubation, au cours duquel les microorganismes se multiplient dans la membrane en absorbant ou adsorbant les composés fluorescents, la détection par fluorescence des microorganismes s'effectue ensuite directement sur la membrane, qui s'est intimement imprégnée, à la fois, des molécules fluorescentes, et du composé coloré visant à masquer la fluorescence résiduelle. La membrane est alors généralement séparée du milieu de culture, puis séchée sous une hotte stérile. Cette étape de séchage, qui n'affecte pas la viabilité des cellules, permet d'éliminer une partie de la fluorescence résiduelle de la surface de la membrane.

La fluorescence est révélée par illumination de la membrane à l'aide d'une longueur d'onde permettant l'excitation des fluorophores, par exemple à l'aide d'une lampe bleue. Pour des mesures plus précises, on utilisera un cytomètre à balayage ce qui permettra, notamment, de conserver, le cas échéant une image numérisée de la membrane.

L'incorporation dans le milieu de culture du composé masquant la fluorescence résiduelle permet d'obtenir un meilleur contraste de l'image obtenue et ainsi de déterminer la position des micro-colonies à un stade précoce de la culture des microorganismes. Avantageusement, la membrane peut être repositionnée sur le milieu de culture gélosé pour une durée de temps plus longue ou pour stockage en chambre froide, en vue de conserver les microorganismes vivant pour toute analyse biologique complémentaire ultérieure.

Les exemples qui suivent montrent que 10 mois après la préparation du milieu de culture, les caractéristiques, restent identiques et que la viabilité reste supérieure à 70% et la fluorescence toujours détectable dans ces cellules (cf. Figure 2). Ceci indique donc que le milieu de culture ainsi formulé est stable dans le temps. Plus généralement, l'invention vise un kit de détection des microorganismes, comprenant différents articles permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, notamment: - un milieu de culture tel que défini précédemment, et - une membrane destinée à être mise en contact avec ledit milieu de culture. Un tel kit selon l'invention peut notamment comprendre une cassette dans laquelle le milieu tel que défini précédemment a été déposé sous forme gélosée. Il peut comprendre, en outre, un module de filtration, de préférence transparent, dans lequel une filtration préalable d'un échantillon liquide peut être pratiquée. Le kit peut fournir différentes composants du milieu de culture selon l'invention dans des conditionnements différents, prêts à être mélangés. En particulier, le support nutritif, le substrat fluorogène et le composé masquant la fluorescence résiduelle liée à l'activation non-spécifique dudit substrat, peuvent être conditionnés séparément. Le kit selon l'invention peut également fournir le milieu de culture sous forme liquide, conditionné de manière stérile, en vue de pratiquer le procédé en culture liquide, par exemple selon le protocole Steritest® EZ (Millipore, ref. TZHA LA 210) Les exemples qui suivent ont pour but de compléter la description de l'invention sans y apporter de limitation.

EXEMPLES

1. Préparation d'un milieu R2A + CFDA + selon l'invention Selon la pharmacopée, un milieu R2A est un milieu minimum gélosé utilisé pour la croissance de bactéries hétérotrophes stressées présentes dans différents types d'échantillons d'eau, en particulier des d'échantillons d'eau de haute pureté. Les faibles concentrations en extrait de levures, hydrolysat de caséine, peptone et dextrose permettent à un large éventail de bactéries de pousser sans que les bactéries à croissance rapide inhibent la pousse des bactéries à croissance lente (comme c'est le cas pour des milieux plus riches au niveau nutritif, comme par exemple le milieu PCA). La présence d'amidon et de sels de pyruvate permet d'améliorer la récupération des cellules stressées. Comparé à des milieux plus riches nutritionnellement, le milieu R2A est décrit comme permettant plus particulièrement de favoriser les bactéries tolérantes au chlore contenues dans l'eau potable. Le composé fluorogène est incorporé au milieu sous la forme de 5(6)-CFDA dans du DMSO (10 mg/ml) (Sigma D2438). Le 5(6)-CFDA est mis en solution dans le milieu de culture R2A (Oxoid CM0906) autoclavé et partiellement refroidi (environ 50°C) à raison d'une concentration finale de 100 mg/I. Le composé masquant la fluorescence résiduelle liée à l'activation non-spécifique dudit substrat est incorporé sous la forme d'un liquide à raison d'une concentration finale de 0,08 % lors de la préparation du milieu précédant son autoclavage. Le milieu de culture ainsi obtenu présente la formule suivante : - extrait de levure 0,5 g - hydrolysat de caséine 5,5 g - protéose peptone 0,5 g - dextrose 0,5 g - amidon soluble 0,5 g 16 - pyruvate de sodium 0,3 g - hydrogéno-phosphate di-potassium 0,3 g (K2HPO4) - sulfate de magnésium 0,05 g - agar 15 g - 5(6)-CFDA 0,1 g - bleu brillant CFC 0.8 g Le milieu est coulé en conditions stériles dans des cassettes, lesquelles, une fois refermées, sont conservées à 4°C enveloppées dans du Parafilm pour éviter la déshydratation.

La stabilité au cours du temps du milieu de culture ainsi conservé dans les cassettes à 4°C, est testée par dénombrement des bactéries, ainsi que la viabilité de celles-ci sur les membranes maintenues au contact du milieu de culture gélosé, ceci afin de tester l'effet du milieu de culture comprenant la CFDA et le bleu brillant CFC sur la viabilité des microorganismes.

2. Protocole de dénombrement Un échantillon d'eau comprenant une concentration prédéterminée de différents microorganismes (cf. tableau 1) a été formé dans de l'eau physiologique préalablement stérilisée, puis cet échantillon a été filtré dans un dispositif Milliflex au travers d'une membrane d'ester de cellulose blanche (Millipore, HAWG Milliflex).

Tableau 1 : bactéries testées Bactéries ATCC Temps de détection milieu R2A (35°C) Escherichia coli 8739 8 heures Bad/lus subtilis 6633 7 heures Pseudomonas aeruginosa 9027 11 heures Staphylococcus aureus 6538 9 heures Salmonella enterica 13314 11 heures La membrane a été placée à la surface du milieu gélosé défini au point précédent sur les cassettes réalisées précédemment. Les microorganismes retenus sur la membrane ont été ainsi incubés à 35°C pendant 7 heures, puis la membrane a été séparée de la cassette et séchée 15 à 30 minutes sous une hotte en conditions stériles avant d'être placée sous un illuminateur en lumière bleue en vue de détecter les premières micro-colonies. Les mesures de fluorescence ont effectuées à l'aide d'une caméra et sauvegardées sous forme d'images au format jpg. Les membranes ont été ensuite replacées sur la même cassette de milieu R2A, puis ré-incubées pour déterminer la viabilité des microorganismes à 24 heures. Les cassettes préparées ont été placées à 4°C, enveloppées dans du Parafilm pour éviter la déshydratation. Elles ont été ensuite contrôlées régulièrement pour effectuer des mesures de fluorescence et de viabilité, jusqu'à 12 mois. A chaque pointage de temps, les cassettes sont sorties puis testées avec filtration d'un échantillon contaminé. Une mesure de la fluorescence est effectuée, ainsi qu'une ré-incubation de 24 heures pour mesure de la viabilité ; Les recouvrements des bactéries sur la membrane sont calculés en fonction des formules suivantes : lTJii` nele.:ti pots . lnufé pp 1~ E r n ,J (: f` C eTrkrf}t7Èr o {fY ri"2:363 l:r`F @'if'.`i Moyenne rF( ap ~> ' r ir eu aion Moyenne d UF' m3cr hk log ?'it.32: ità. m}, eti . Les résultats des mesures de fluorescence et de viabilité sont reportés dans le graphique de la figure 2, lesquels montrent un recouvrement de la fluorescence et de la viabilité, tous deux supérieurs à 70% même après 10 mois de conservation des cassettes gélosées à 4°C. Après 10 mois de conservation, le recouvrement de la fluorescence devient plus élevé que le recouvrement de la viabilité, ce qui laisse paraître, à ce stade, un début de toxicité du milieu gélosé ou un début de déshydratation de celui-ci, dont l'effet se ressent sur la viabilité des microorganismes. Les derniers pointages à 12,5 mois, non représentés sur la figure 2, montrent un recouvrement fluorescent qui reste satisfaisant, de l'ordre de 112 %, mais une viabilité qui n'est plus que de 9%.

Il reste que pendant les 10 premiers mois, le milieu reste très stable. Ainsi la filtration d'un échantillon contaminé sur la membrane et la mise en contact de cette membrane sur le milieu de culture fluorescent selon l'invention permet une détection fiable et rapide des microorganismes.

Outre la viabilité des bactéries, qui est préservée, le gain en contraste entre des membranes contaminées incubées sur milieu de culture avec et sans bleu brillant CFC a été calculé. Le contraste est calculé en effectuant le rapport de la fluorescence totale (membrane + micro-colonies) sur la seule fluorescence spécifique des micro-colonies (spots de fluorescence seuls). 64e coure mei'Y. RT F h.u. (%) --- -7--Re E 7 T ct. reemCnf Viab tie( Le gain mesuré entre les membranes incubées en milieu de culture comprenant du bleu brillant CFC et celles incubées dans un milieu dépourvu de bleu brillant CFC est d'au minimum 20 %. L'ajout de bleu brillant CFC permet donc de masquer une 5 partie significative du bruit de fond provenant de la fluorescence non spécifique du 5(6)-CFDA dans le milieu R2A.

Claims (14)

1. REVENDICATIONS1. Milieu de culture pour microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend un support nutritif dans lequel sont solubilisés de manière homogène au moins un substrat fluorogène et un composé masquant la fluorescence résiduelle liée à l'activation non-spécifique dudit substrat.
2. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat fluorogène comprend de la fluorescéine, tel que le FDA ou le CFDA.
3. 3. Milieu de culture selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé masquant la fluorescence résiduelle est sélectionné parmi le bleu Trypan, le bleu Evans, le noir acide et le bleu brillant CFC.
4. 4. Milieu de culture de type R2A, caractérisé en ce qu'il comprend un support nutritif à base d'extrait de levure, un substrat fluorogène comprenant de la fluorescéine et un composé masquant la fluorescence résiduelle liée à l'activation non-spécifique dudit substrat fluorogène.
5. 5. Milieu selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend entre 0,001 % et 0,1 %, de préférence entre 0.005% et 0,05 % en poids de FDA ou de CFDA.
6. 6. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend entre 0,01 et 1%, de préférence entre 0,05 et 0,5 % en poids du composé masquant la fluorescence résiduelle liée à l'activation non-spécifique dudit substrat fluorogène.
7. 7. Milieu selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit composé masquant la fluorescence résiduelle est le bleu brillant CFC.
8. 8. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit milieu est gélosé.
9. 9. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il se présente sous une forme déshydratée.
10. 10. Cassette de milieu gélosé comprenant un milieu de culture tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes.
11. 11. Procédé de détection de microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'un échantillon dont on cherche à déterminer s'il est contaminé par un microorganisme vivant, avec un milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
12. 12. Procédé de détection de microorganismes selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la filtration d'un échantillon gazeux ou liquide à travers une membrane préalablement stérile ; - la mise en contact des microorganismes retenus par la membrane avec un milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 9; - la détection par fluorescence des microorganismes mis en contact sur ladite membrane.
13. 13. Kit de détection des microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend : - un milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 9 ; - une membrane destinée à être mise en contact avec ledit milieu de culture.
14. 14. Kit de détection des microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend : - une cassette de milieu gélosé selon la revendication 10; - une membrane destinée à être mise en contact avec ledit milieu de culture.