JPH07135996A - 生細胞の検出方法 - Google Patents
生細胞の検出方法Info
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- JPH07135996A JPH07135996A JP31425393A JP31425393A JPH07135996A JP H07135996 A JPH07135996 A JP H07135996A JP 31425393 A JP31425393 A JP 31425393A JP 31425393 A JP31425393 A JP 31425393A JP H07135996 A JPH07135996 A JP H07135996A
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- medium
- cells
- soil
- sfda
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ５−スルホフルオレセインジアセテート及び
／又は６−スルホフルオレセインジアセテートを媒体に
添加し、媒体中に存在する細胞内からの蛍光を測定する
ことを特徴とする生細胞の検出方法。 【効果】 本発明の方法によれば、任意の媒体中におけ
る生細胞の数を、感度良く、簡便に検出することができ
る。
／又は６−スルホフルオレセインジアセテートを媒体に
添加し、媒体中に存在する細胞内からの蛍光を測定する
ことを特徴とする生細胞の検出方法。 【効果】 本発明の方法によれば、任意の媒体中におけ
る生細胞の数を、感度良く、簡便に検出することができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生細胞の検出方法に関す
るものである。詳しくは、特定の物質を添加することに
より発せられる細胞内からの蛍光を測定することによる
生細胞の検出方法に関するものである。
るものである。詳しくは、特定の物質を添加することに
より発せられる細胞内からの蛍光を測定することによる
生細胞の検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】媒体中における生細胞の検出は、滅菌状
態の確認や、細胞の生存状態の異常を検出する上で重要
な技術である。例えば工業用水、飲料水、嗜好飲料、ア
ルコール飲料などに存在する生菌を検出することは、工
業製品の歩留りや飲料の安全性、衛生性、品質保証の面
で重要な業務であり、ＬＳＩを生産する電子工業におい
ては、その中間製品である半導体ウエハーの洗浄にあた
り、その歩留りを向上させるために、洗浄水の水質管理
は極めて重要な業務となっている。また近年のバイオテ
クノロジーの急速な進展に伴い、医薬品等の有用な物質
が微生物、昆虫細胞、哺乳動物由来の細胞等の宿主細胞
を培養して生産されているが、生産性を管理する上でこ
れら宿主細胞の生存を確認することは必要不可欠であ
る。 従来、このような生細胞を検出するための手段と
して、生体染色といわれる方法や、フルオレセインジア
セテートを媒体に添加し、細胞内からの蛍光を測定する
ことによる検出方法が知られている。
態の確認や、細胞の生存状態の異常を検出する上で重要
な技術である。例えば工業用水、飲料水、嗜好飲料、ア
ルコール飲料などに存在する生菌を検出することは、工
業製品の歩留りや飲料の安全性、衛生性、品質保証の面
で重要な業務であり、ＬＳＩを生産する電子工業におい
ては、その中間製品である半導体ウエハーの洗浄にあた
り、その歩留りを向上させるために、洗浄水の水質管理
は極めて重要な業務となっている。また近年のバイオテ
クノロジーの急速な進展に伴い、医薬品等の有用な物質
が微生物、昆虫細胞、哺乳動物由来の細胞等の宿主細胞
を培養して生産されているが、生産性を管理する上でこ
れら宿主細胞の生存を確認することは必要不可欠であ
る。 従来、このような生細胞を検出するための手段と
して、生体染色といわれる方法や、フルオレセインジア
セテートを媒体に添加し、細胞内からの蛍光を測定する
ことによる検出方法が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来のフル
オレセインジアセテートや６−カルボキシフルオレセイ
ンジアセテートを媒体に添加する方法における欠点、例
えば蛍光の強度が弱いこと、細胞内部と細胞外部の蛍光
強度の差（コントラスト）が弱いこと、染色されない細
胞の種類が多いこと等が解決された生細胞の検出方法を
提供しようとするものである。
オレセインジアセテートや６−カルボキシフルオレセイ
ンジアセテートを媒体に添加する方法における欠点、例
えば蛍光の強度が弱いこと、細胞内部と細胞外部の蛍光
強度の差（コントラスト）が弱いこと、染色されない細
胞の種類が多いこと等が解決された生細胞の検出方法を
提供しようとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記の課題
を解決するため、フルオレセインジアセテートや６−カ
ルボキシフルオレセインジアセテートに代わる物質を種
々検討した結果、５−スルホフルオレセインジアセテー
ト及び／又は６−スルホフルオレセインジアセテートが
その目的に最適であることを見いだし本発明を完成し
た。
を解決するため、フルオレセインジアセテートや６−カ
ルボキシフルオレセインジアセテートに代わる物質を種
々検討した結果、５−スルホフルオレセインジアセテー
ト及び／又は６−スルホフルオレセインジアセテートが
その目的に最適であることを見いだし本発明を完成し
た。
【０００５】即ち本発明の要旨は、５−スルホフルオレ
セインジアセテート及び／又は６−スルホフルオレセイ
ンジアセテートを媒体に添加し、媒体中に存在する細胞
内からの蛍光を測定することによる生細胞の検出方法に
存する。以下、本発明を詳細に説明する。本発明で使用
する５−スルホフルオレセインジアセテート及び６−ス
ルホフルオレセインジアセテートは何れも既知の化合物
であり、既に市販されている。
セインジアセテート及び／又は６−スルホフルオレセイ
ンジアセテートを媒体に添加し、媒体中に存在する細胞
内からの蛍光を測定することによる生細胞の検出方法に
存する。以下、本発明を詳細に説明する。本発明で使用
する５−スルホフルオレセインジアセテート及び６−ス
ルホフルオレセインジアセテートは何れも既知の化合物
であり、既に市販されている。
【０００６】本発明の方法で検出しようとする生細胞と
しては、バクテリア、酵母、放線菌、カビ類等の微生
物、カイコのＳｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ
ＯＳ細胞等の哺乳動物由来の細胞等が挙げられるが、こ
れらに限定されるものではなく、いずれの細胞でもよ
い。本発明においては、生きた状態の細胞を死んだ細胞
と区別して検出することが出来る。
しては、バクテリア、酵母、放線菌、カビ類等の微生
物、カイコのＳｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ
ＯＳ細胞等の哺乳動物由来の細胞等が挙げられるが、こ
れらに限定されるものではなく、いずれの細胞でもよ
い。本発明においては、生きた状態の細胞を死んだ細胞
と区別して検出することが出来る。
【０００７】生細胞を検出しようとする媒体としては、
水、酒等の液体の媒体、土、砂等の固体の媒体、寒天、
ゲル等の半固体やそれらの混合物等が挙げられる。本発
明で使用する５−スルホフルオレセインジアセテート及
び／又は６−スルホフルオレセインジアセテート（以
下、両者を合わせて「ＳＦＤＡ」と総称する）を媒体に
添加する方法は、媒体に応じて適宜行えばよい。ＳＦＤ
Ａはそれぞれを単独で使用することもできるが、両者を
併用して用いてもよい。ＳＦＤＡは何れも水に難溶性で
あるので、水性媒体の場合には、ＳＦＤＡを溶解する溶
媒、例えばメタノール、エタノール等のアルコール類、
アセトン等のケトン類等にＳＦＤＡを溶解し、媒体に加
えることにより行えばよい。ＳＦＤＡを溶解する溶媒と
しては、水に溶解しやすいこと、検出しようとする生細
胞中の酵素を失活させにくい点で、低分子アルコール類
が好ましい。固体の媒体の場合にも，前述のような溶媒
にＳＦＤＡを溶解し、媒体に加えることにより行えばよ
い。この溶媒としても、検出しようとする生細胞中の酵
素を失活させにくい点で、低分子アルコール類が好まし
い。例えば、１００％エタノールに最終濃度１ｍＭとな
るようにＳＦＤＡを溶解させれば、この溶液は−２０℃
以下の温度で、数カ月以上安定に保存できる。
水、酒等の液体の媒体、土、砂等の固体の媒体、寒天、
ゲル等の半固体やそれらの混合物等が挙げられる。本発
明で使用する５−スルホフルオレセインジアセテート及
び／又は６−スルホフルオレセインジアセテート（以
下、両者を合わせて「ＳＦＤＡ」と総称する）を媒体に
添加する方法は、媒体に応じて適宜行えばよい。ＳＦＤ
Ａはそれぞれを単独で使用することもできるが、両者を
併用して用いてもよい。ＳＦＤＡは何れも水に難溶性で
あるので、水性媒体の場合には、ＳＦＤＡを溶解する溶
媒、例えばメタノール、エタノール等のアルコール類、
アセトン等のケトン類等にＳＦＤＡを溶解し、媒体に加
えることにより行えばよい。ＳＦＤＡを溶解する溶媒と
しては、水に溶解しやすいこと、検出しようとする生細
胞中の酵素を失活させにくい点で、低分子アルコール類
が好ましい。固体の媒体の場合にも，前述のような溶媒
にＳＦＤＡを溶解し、媒体に加えることにより行えばよ
い。この溶媒としても、検出しようとする生細胞中の酵
素を失活させにくい点で、低分子アルコール類が好まし
い。例えば、１００％エタノールに最終濃度１ｍＭとな
るようにＳＦＤＡを溶解させれば、この溶液は−２０℃
以下の温度で、数カ月以上安定に保存できる。
【０００８】土壌中の生細胞を検出しようとする場合に
は、土壌中の水分含量を調節するほうが好ましい結果を
与える。好ましい水分含量は、２〜１５％程度である。
この時、エタノールをＳＦＤＡの溶媒とした場合には、
エタノール含量として、４０〜６０％程度となるように
調節することが好ましい。土壌中の水分が多い場合に
は、０〜４℃程度で、ゆっくり乾燥させれば、好ましい
結果を与える。水分含有量が多いと、背景蛍光輻射が増
加し、顕微鏡での観察が困難となることがある。
は、土壌中の水分含量を調節するほうが好ましい結果を
与える。好ましい水分含量は、２〜１５％程度である。
この時、エタノールをＳＦＤＡの溶媒とした場合には、
エタノール含量として、４０〜６０％程度となるように
調節することが好ましい。土壌中の水分が多い場合に
は、０〜４℃程度で、ゆっくり乾燥させれば、好ましい
結果を与える。水分含有量が多いと、背景蛍光輻射が増
加し、顕微鏡での観察が困難となることがある。
【０００９】液体媒体中の生細胞を検出しようとする場
合には、ＳＦＤＡを添加した後、寒天、ゼラチン等で非
流動体化して蛍光を測定するのが好ましい。ＳＦＤＡは
いずれも単独では蛍光を発しない化合物であるが、エス
テラーゼ等の生体内酵素の作用によりエステル結合が切
断されて、フルオレセイン ５−スルホン酸及び／又は
フルオレセイン ６−スルホン酸（以下、両者を合わせ
て「ＦＳＡ」と総称する）を生じ、このＦＳＡは蛍光を
発する化合物であるので、蛍光を観察することにより生
きた細胞を検出することが出来る。
合には、ＳＦＤＡを添加した後、寒天、ゼラチン等で非
流動体化して蛍光を測定するのが好ましい。ＳＦＤＡは
いずれも単独では蛍光を発しない化合物であるが、エス
テラーゼ等の生体内酵素の作用によりエステル結合が切
断されて、フルオレセイン ５−スルホン酸及び／又は
フルオレセイン ６−スルホン酸（以下、両者を合わせ
て「ＦＳＡ」と総称する）を生じ、このＦＳＡは蛍光を
発する化合物であるので、蛍光を観察することにより生
きた細胞を検出することが出来る。
【００１０】エステラーゼ等の生体内酵素は、細胞が死
滅すると急速に失活してしまうので、死んだ細胞は本発
明の方法では検出の感度が低く、従って生細胞と、死細
胞との区別をすることができる。ＳＦＤＡの添加量は、
特に制限はされないが、媒体中における最終濃度が１×
１０-4〜１×１０-3Ｍとなるように調節することが好ま
しい。また２５〜３７℃の温度条件下にて測定を行う
と、上記の反応が促進されるので好ましい。このときの
反応時間としては、５分〜１５分程度が最適である。
滅すると急速に失活してしまうので、死んだ細胞は本発
明の方法では検出の感度が低く、従って生細胞と、死細
胞との区別をすることができる。ＳＦＤＡの添加量は、
特に制限はされないが、媒体中における最終濃度が１×
１０-4〜１×１０-3Ｍとなるように調節することが好ま
しい。また２５〜３７℃の温度条件下にて測定を行う
と、上記の反応が促進されるので好ましい。このときの
反応時間としては、５分〜１５分程度が最適である。
【００１１】検出しようとする細胞が、メラニン色素等
で着色している場合には、そのままＳＦＤＡと反応させ
ても、蛍光が色素で妨害されて観察しにくいので、ＳＦ
ＤＡと反応させる前に、予め過酸化水素等で細胞を脱色
しておくことが望ましい。検出する手段としては特に制
限はされないが、例えばＳＦＤＡを添加した媒体をスラ
イドガラス上にのせて蛍光顕微鏡で観察する方法や、Ｃ
ＣＤカメラとパソコンとを組み合わせた画像解析装置を
用いて観察する方法などが挙げられる。
で着色している場合には、そのままＳＦＤＡと反応させ
ても、蛍光が色素で妨害されて観察しにくいので、ＳＦ
ＤＡと反応させる前に、予め過酸化水素等で細胞を脱色
しておくことが望ましい。検出する手段としては特に制
限はされないが、例えばＳＦＤＡを添加した媒体をスラ
イドガラス上にのせて蛍光顕微鏡で観察する方法や、Ｃ
ＣＤカメラとパソコンとを組み合わせた画像解析装置を
用いて観察する方法などが挙げられる。
【００１２】また細胞数を定量する場合には、顕微鏡下
のサンプルを写真撮影し、焦点深度法（focal depth me
thod）により算出することができる。
のサンプルを写真撮影し、焦点深度法（focal depth me
thod）により算出することができる。
【００１３】
【発明の効果】本発明の方法によれば、任意の媒体中に
おける生細胞の数を、感度良く、簡便に検出することが
できる。
おける生細胞の数を、感度良く、簡便に検出することが
できる。
【００１４】
【実施例】次に本発明を実施例について更に詳細に説明
するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例
に限定されるものではない。なお以下の実施例におい
て、枯草菌(Bacillus subtilis) 及び大腸菌(Escherich
ia coli)は、ＬＢブロス培地（バクトトリプトン１％、
イーストエキストラクト０．０５％、塩化ナトリウム
０．０５％）で、３７℃、８時間培養し、栄養細胞を得
た。さらに３０時間培養し、胞子を得た。酵母(Sacchar
omyces cerevisiae)は、ＹＰＤ培地（バクトぺプトン２
％、デキストロース２％、イーストエキストラクト１
％、寒天２％）で成長させ、胞子化の培地（酢酸カリウ
ム１．２％、デキストロース０．０６％、イーストエキ
ストラクト０．１５％、寒天２％）に移して栄養細胞と
胞子を得た。細胞性粘菌(Dictyostelium discoideum)の
培養は、河崎らの方法（Plant Physiology，９３巻，１
５６８−１５７２，１９９０年参照）に従って行った。
その他の好気性菌、カビ類、放線菌の培養はポテトデキ
ストロース寒天培地のスラント（ポテトエキストラクト
０．４％、グルコース２％、寒天１．５％）で行った。
嫌気性菌(Desulfovibrio latus ,D.vulgaris等)は、嫌
気的ロールチューブ法（J.Gen.Appl.Microbiol.,２６
巻，２５−３５，１９８０年参照）に従って培養した。
するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例
に限定されるものではない。なお以下の実施例におい
て、枯草菌(Bacillus subtilis) 及び大腸菌(Escherich
ia coli)は、ＬＢブロス培地（バクトトリプトン１％、
イーストエキストラクト０．０５％、塩化ナトリウム
０．０５％）で、３７℃、８時間培養し、栄養細胞を得
た。さらに３０時間培養し、胞子を得た。酵母(Sacchar
omyces cerevisiae)は、ＹＰＤ培地（バクトぺプトン２
％、デキストロース２％、イーストエキストラクト１
％、寒天２％）で成長させ、胞子化の培地（酢酸カリウ
ム１．２％、デキストロース０．０６％、イーストエキ
ストラクト０．１５％、寒天２％）に移して栄養細胞と
胞子を得た。細胞性粘菌(Dictyostelium discoideum)の
培養は、河崎らの方法（Plant Physiology，９３巻，１
５６８−１５７２，１９９０年参照）に従って行った。
その他の好気性菌、カビ類、放線菌の培養はポテトデキ
ストロース寒天培地のスラント（ポテトエキストラクト
０．４％、グルコース２％、寒天１．５％）で行った。
嫌気性菌(Desulfovibrio latus ,D.vulgaris等)は、嫌
気的ロールチューブ法（J.Gen.Appl.Microbiol.,２６
巻，２５−３５，１９８０年参照）に従って培養した。
【００１５】実施例 １ 長野県志賀山標高１９７０ｍ地点から、brown forest s
oil （ＢD ）及びwetpodzolic soil （ＰW ）を採取し
た。サンプルは、Ｆ層とＣ層との間にある６つの層それ
ぞれから、１９９０年から１９９２年にかけて３回、同
一地点から２サンプルずつ採取した。図１に、当該土壌
中におけるバクテリア数の分布を示す。
oil （ＢD ）及びwetpodzolic soil （ＰW ）を採取し
た。サンプルは、Ｆ層とＣ層との間にある６つの層それ
ぞれから、１９９０年から１９９２年にかけて３回、同
一地点から２サンプルずつ採取した。図１に、当該土壌
中におけるバクテリア数の分布を示す。
【００１６】埼玉県狭山市の野菜畑からは、火山灰土を
採取した。東京都町田市の玉川大学構内のシロカシ(Que
rcus myrsinaefolia Blume) 林及びヤマボウシ(Quercus
acutissima Carr) 林からは、明色の火山灰土を採取し
た。いずれのサンプルも、４℃にて使用時まで保存し
た。
採取した。東京都町田市の玉川大学構内のシロカシ(Que
rcus myrsinaefolia Blume) 林及びヤマボウシ(Quercus
acutissima Carr) 林からは、明色の火山灰土を採取し
た。いずれのサンプルも、４℃にて使用時まで保存し
た。
【００１７】一方、ＳＦＤＡを最終濃度が１ｍＭとなる
ように１００％エタノールに溶解した。この溶液は、−
２０℃以下の温度にて数カ月間安定である。また志賀山
のＢD 土壌のＡ1 層（深さ約１３ｃｍ）を土壌サンプル
とし、低温（０〜４℃）でゆっくりと乾燥させて水分含
量を２〜１５％に調整した。１００ｍｇの乾燥土壌を、
滅菌したピンセットを用いてスライドガラス上にのせ
た。１ｍＭのＳＦＤＡ溶液 １５μｌを、マイクロピペ
ットを用いて土壌サンプルの上に滴下して、カバースラ
イドガラスを土壌サンプルの上に静かにのせた。カバー
スライドの縁をセロテープでシールし、エタノールや水
の蒸発を防いだ。１５分後に、このサンプルを落射型蛍
光顕微鏡(Zeiss社，Axiophoto)下、Ｂ−励起で蛍光を観
察した。無蛍光のＳＦＤＡは、細胞中に含まれるエステ
ラーゼの活性により蛍光性のＦＳＡ（励起波長：４９２
ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）に変化し、観察が可能と
なる。同サンプルを写真撮影した結果を、図２のＢに示
す。
ように１００％エタノールに溶解した。この溶液は、−
２０℃以下の温度にて数カ月間安定である。また志賀山
のＢD 土壌のＡ1 層（深さ約１３ｃｍ）を土壌サンプル
とし、低温（０〜４℃）でゆっくりと乾燥させて水分含
量を２〜１５％に調整した。１００ｍｇの乾燥土壌を、
滅菌したピンセットを用いてスライドガラス上にのせ
た。１ｍＭのＳＦＤＡ溶液 １５μｌを、マイクロピペ
ットを用いて土壌サンプルの上に滴下して、カバースラ
イドガラスを土壌サンプルの上に静かにのせた。カバー
スライドの縁をセロテープでシールし、エタノールや水
の蒸発を防いだ。１５分後に、このサンプルを落射型蛍
光顕微鏡(Zeiss社，Axiophoto)下、Ｂ−励起で蛍光を観
察した。無蛍光のＳＦＤＡは、細胞中に含まれるエステ
ラーゼの活性により蛍光性のＦＳＡ（励起波長：４９２
ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）に変化し、観察が可能と
なる。同サンプルを写真撮影した結果を、図２のＢに示
す。
【００１８】比較として、同じ土壌サンプルに蛍光色素
を加えずにＢ−励起したところ、土壌及び岩屑中の自家
蛍光（バックグラウンド）は観察されたが、細胞由来の
蛍光は観測されなかった（図２のＡ）。同サンプルを２
５分間オートクレーブ滅菌してＳＦＤＡを加えたもの
は、細胞由来の蛍光が観測されなかった（図２のＣ）。
またこの滅菌したサンプルに枯草菌（B.subtilis）をＢ
ｏｎｎｅｒ緩衝液（塩化ナトリウム０．６ｇ、塩化カリ
ウム０．７５ｇ、塩化カルシウム０．３ｇ、純水１Ｌ、
ｐＨ７．０）で懸濁したもの０．２ｍｌ（１０9 ｃｅｌ
ｌ／ｍｌ）を加えて更にＳＦＤＡを加えたところ、枯草
菌由来の蛍光が土壌の自家蛍光とともに観測された（図
２のＤ）。
を加えずにＢ−励起したところ、土壌及び岩屑中の自家
蛍光（バックグラウンド）は観察されたが、細胞由来の
蛍光は観測されなかった（図２のＡ）。同サンプルを２
５分間オートクレーブ滅菌してＳＦＤＡを加えたもの
は、細胞由来の蛍光が観測されなかった（図２のＣ）。
またこの滅菌したサンプルに枯草菌（B.subtilis）をＢ
ｏｎｎｅｒ緩衝液（塩化ナトリウム０．６ｇ、塩化カリ
ウム０．７５ｇ、塩化カルシウム０．３ｇ、純水１Ｌ、
ｐＨ７．０）で懸濁したもの０．２ｍｌ（１０9 ｃｅｌ
ｌ／ｍｌ）を加えて更にＳＦＤＡを加えたところ、枯草
菌由来の蛍光が土壌の自家蛍光とともに観測された（図
２のＤ）。
【００１９】以上の結果から、1)土壌中の微生物はＳＦ
ＤＡを加えた後にのみ観察できる、2)ＳＦＤＡは土壌中
の生細胞を染色する、3)ＳＦＤＡは、死細胞や土壌鉱
物、岩屑等の土壌成分を染色しない、4)バックグラウン
ドの自家蛍光は細胞の測定を妨げない、ことがわかる。 実施例 ２ 土壌中の微生物は、種々の濃度のニュートリエントブロ
ス培地（ニュートリエントブロス（Difco 社）０．２
％、塩化ナトリウム０．５％）を用いた寒天−プレート
法により培養した。
ＤＡを加えた後にのみ観察できる、2)ＳＦＤＡは土壌中
の生細胞を染色する、3)ＳＦＤＡは、死細胞や土壌鉱
物、岩屑等の土壌成分を染色しない、4)バックグラウン
ドの自家蛍光は細胞の測定を妨げない、ことがわかる。 実施例 ２ 土壌中の微生物は、種々の濃度のニュートリエントブロ
ス培地（ニュートリエントブロス（Difco 社）０．２
％、塩化ナトリウム０．５％）を用いた寒天−プレート
法により培養した。
【００２０】２ｍｍの篩いでふるい分けした土壌１．４
ｍｌに、水０．７ｍｌを加えた。サンプルは振とう機
（Retsch MM2, Germany ）で２分間振とう粉砕した後、
蒸留水で１６，０００倍に希釈した。土壌懸濁液約０．
３ｍｌを、１００％エタノールまたはＢｏｎｎｅｒ緩衝
液で全量を４ｍｌに調整した後、ＳＦＤＡを最終濃度が
１０μＭとなるように加えた。一方で、１／１倍、１／
１０倍及び１／１００倍に希釈したニュートリエントブ
ロス培地に、最終濃度が１．８％となるように寒天（Di
fco 社）を混合した。ＳＦＤＡを含む土壌懸濁液０．１
〜０．３ｍｌを寒天プレート上にまき、２５℃で２週間
培養した後、蛍光を測定した。
ｍｌに、水０．７ｍｌを加えた。サンプルは振とう機
（Retsch MM2, Germany ）で２分間振とう粉砕した後、
蒸留水で１６，０００倍に希釈した。土壌懸濁液約０．
３ｍｌを、１００％エタノールまたはＢｏｎｎｅｒ緩衝
液で全量を４ｍｌに調整した後、ＳＦＤＡを最終濃度が
１０μＭとなるように加えた。一方で、１／１倍、１／
１０倍及び１／１００倍に希釈したニュートリエントブ
ロス培地に、最終濃度が１．８％となるように寒天（Di
fco 社）を混合した。ＳＦＤＡを含む土壌懸濁液０．１
〜０．３ｍｌを寒天プレート上にまき、２５℃で２週間
培養した後、蛍光を測定した。
【００２１】表１に、染色された微生物のコロニーの比
を示す。分母は試験した細胞の数を表し、分子は染色さ
れた数を表す。１５１コロニー（９８．１％）が染色さ
れた。
を示す。分母は試験した細胞の数を表し、分子は染色さ
れた数を表す。１５１コロニー（９８．１％）が染色さ
れた。
【００２２】
【表１】 表１ ─────────────────────────────────── 寒天プレート上の栄養物の濃度 a ────────────────── 土壌 １／１ １／１０ １／１００ Ｔｏｔａｌ ─────────────────────────────────── ＢD *1 25／26 15／15 8／8 48／49 ＰW *1 18／18 9／10 5／6 32／34 火山灰土 *2 30／30 22／22 19／19 71／71 Ｔｏｔａｌ 73／74 46／47 32／33 151／154 ─────────────────────────────────── ａ ：ニュートリエントブロス培地中における栄養物濃
度の比 ＊１：志賀山から採取したサンプル ＊２：玉川大学構内から採取したサンプル
度の比 ＊１：志賀山から採取したサンプル ＊２：玉川大学構内から採取したサンプル
【００２３】実施例 ３ Ｂｏｎｎｅｒ緩衝液で懸濁した大腸菌（E.coli）を試験
管中に入れ、熱水（９９．２℃）に１／８〜１６分間浸
した。熱処理後、大腸菌はLB Nutrient Broth培地の寒
天プレートで３０℃、２日間培養した。死滅時間は、寒
天プレート上にコロニーの形成が全く見られなくなるの
に要した最短の熱処理時間で定義した。熱処理したサン
プルは、ＳＦＤＡ、ＡＯ（アクリジンオレンジ）、ＦＤ
Ａ（フルオレセインジアセテート）、Ｍｇ−ＡＮＳ（１
−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸のマグネシウム
塩）により染色した。それぞれの最終濃度は、３００μ
Ｍ（６０％エタノール中）、１００μＭ（水に溶解）、
１２μＭ（ＤＭＳＯに溶解）、１０ｍＭ（ＤＭＳＯに溶
解）となるように調整した。大腸菌が充分に染色された
後、個々の細胞についての平均蛍光強度を測定した。
管中に入れ、熱水（９９．２℃）に１／８〜１６分間浸
した。熱処理後、大腸菌はLB Nutrient Broth培地の寒
天プレートで３０℃、２日間培養した。死滅時間は、寒
天プレート上にコロニーの形成が全く見られなくなるの
に要した最短の熱処理時間で定義した。熱処理したサン
プルは、ＳＦＤＡ、ＡＯ（アクリジンオレンジ）、ＦＤ
Ａ（フルオレセインジアセテート）、Ｍｇ−ＡＮＳ（１
−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸のマグネシウム
塩）により染色した。それぞれの最終濃度は、３００μ
Ｍ（６０％エタノール中）、１００μＭ（水に溶解）、
１２μＭ（ＤＭＳＯに溶解）、１０ｍＭ（ＤＭＳＯに溶
解）となるように調整した。大腸菌が充分に染色された
後、個々の細胞についての平均蛍光強度を測定した。
【００２４】平均蛍光強度は、落射型蛍光顕微鏡(Zeiss
社，Axiophoto)、冷却ＣＣＤ（Photometrics LTD，Type
CH250）及びマイクロコンピューター（Macintosh IIf
x）からなる画像処理システムを用いて、ＩＰＬａｂ（S
ignal Analytics，version 2.1 ）の画像解析のソフト
ウェアにより求めた。また分光光度計は、島津製作所製
のＲＦ−５０２を使用した。まず顕微鏡による画像を冷
却ＣＣＤで観察し、デジタル画像データはＩＰＬａｂを
有するマイクロコンピューターに送られた。個々の細胞
の蛍光強度から、バックグラウンドの強度を差し引い
て、２０〜４０細胞の平均蛍光強度を計算した。測定は
いずれも細胞を染色して１５分後に行った。
社，Axiophoto)、冷却ＣＣＤ（Photometrics LTD，Type
CH250）及びマイクロコンピューター（Macintosh IIf
x）からなる画像処理システムを用いて、ＩＰＬａｂ（S
ignal Analytics，version 2.1 ）の画像解析のソフト
ウェアにより求めた。また分光光度計は、島津製作所製
のＲＦ−５０２を使用した。まず顕微鏡による画像を冷
却ＣＣＤで観察し、デジタル画像データはＩＰＬａｂを
有するマイクロコンピューターに送られた。個々の細胞
の蛍光強度から、バックグラウンドの強度を差し引い
て、２０〜４０細胞の平均蛍光強度を計算した。測定は
いずれも細胞を染色して１５分後に行った。
【００２５】結果を図３に示す。０〜１／４分熱処理し
た大腸菌は寒天プレート上にコロニーを形成したが、１
／２〜１６分間熱処理したものは形成しなかった。即
ち、９９．２℃で熱処理した場合の大腸菌の死滅時間
は、１／４〜１／２分の間にあることがわかる。ＳＦＤ
Ａによる蛍光強度は、初めの１／２分間の間に初期値の
２〜４％にまで減少し、その後はほとんど変化しない。
これは、細胞の生死の判別が容易であることを意味す
る。ＦＤＡで染色された細胞の蛍光強度は、ＳＦＤＡで
染色した細胞のそれよりも素早く減少する。ＡＯによる
蛍光強度は初期値の１／３にまで減少するが、その後は
ほとんど変化しない。これは生細胞と死細胞との識別が
困難であることを意味する。Ｍｇ−ＡＮＳで染色した細
胞は、生細胞よりも死細胞の蛍光強度の方が大きくな
る。その変化の幅も小さく、ゆるやかな変化をたどるこ
とから、生細胞と死細胞との識別はまず困難であること
がわかる。
た大腸菌は寒天プレート上にコロニーを形成したが、１
／２〜１６分間熱処理したものは形成しなかった。即
ち、９９．２℃で熱処理した場合の大腸菌の死滅時間
は、１／４〜１／２分の間にあることがわかる。ＳＦＤ
Ａによる蛍光強度は、初めの１／２分間の間に初期値の
２〜４％にまで減少し、その後はほとんど変化しない。
これは、細胞の生死の判別が容易であることを意味す
る。ＦＤＡで染色された細胞の蛍光強度は、ＳＦＤＡで
染色した細胞のそれよりも素早く減少する。ＡＯによる
蛍光強度は初期値の１／３にまで減少するが、その後は
ほとんど変化しない。これは生細胞と死細胞との識別が
困難であることを意味する。Ｍｇ−ＡＮＳで染色した細
胞は、生細胞よりも死細胞の蛍光強度の方が大きくな
る。その変化の幅も小さく、ゆるやかな変化をたどるこ
とから、生細胞と死細胞との識別はまず困難であること
がわかる。
【００２６】実施例 ４ 表２に示す種々の微生物の培養物を白金耳でかき取り、
マイクロスライドガラス上に拡げた。カバースライドガ
ラスをのせ、１ｍＭのＳＦＤＡ液（１００％エタノール
中）をカバースライドの縁に滴下した。落射型蛍光顕微
鏡で観察したところ、染色されたものと染色されていな
いものとが明瞭に区別された。
マイクロスライドガラス上に拡げた。カバースライドガ
ラスをのせ、１ｍＭのＳＦＤＡ液（１００％エタノール
中）をカバースライドの縁に滴下した。落射型蛍光顕微
鏡で観察したところ、染色されたものと染色されていな
いものとが明瞭に区別された。
【００２７】
【表２】 表２ ─────────────────────────────────── バクテリア Alcaligenes feacalis, Bacillus subtilis 168 trpC2 * Desulfovibrio latus, Desulfovibrio vulgaris, Enterobacter cloacae, Enterococcus feacalis, Escherichia coli W3110, Methanothrix sp., Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus 209P 放線菌 Nocardia aliena * , Rhodococcus equi * 細胞性粘菌 Dictyostelium discoideum NC-4 * 酵母 Saccharomyces cerevisiae MK040 * 藻類 Synechococcus sp. ─────────────────────────────────── ＊印は、胞子形成能があることを表す。
【００２８】カビ類についても同様に染色を行ったとこ
ろ、目視による染色の度合いから３段階に分類すること
ができた（表３）。
ろ、目視による染色の度合いから３段階に分類すること
ができた（表３）。
【００２９】
【表３】 表３ ────────────────────────────────── Ascobolus denudatus 菌糸（＋） Aspergillus niger 菌糸（＋），分生子（＋） Aureobasidium pullulans 菌糸（＋），分生子（＋） Chaetomium globosum 菌糸（＋*，Ｃ），菌糸（＋*，Ｂ） 被子器の菌糸（＋*） 子嚢胞子（＋*，Ｂ） Conidiobolus coronatus 菌糸（＋），分生子（＋） Coprinus comatus 菌糸（＋） Mortierella ambigua 菌糸（＋），分生子（−） Mortierella elongata 菌糸（＋），厚膜胞子（＋） 胞子嚢柄（±） Mortierella humilis 菌糸（＋），子嚢胞子（＋） Mucor racemosus 菌糸（＋），胞子嚢柄（＋） 厚膜胞子（＋） Phaeosphaeria sp. 菌糸（＋） Rhizopus arrhizus 菌糸（＋），胞子嚢柄（＋） ────────────────────────────────── ＋：染色される， ±：わずかに染色される， −：染
色されない Ｂ：メラニンで褐色に着色 Ｃ：無色（メラニン含有量が極めて少ない） ＊：Ｎａ2Ｏ3 １０％、１時間、室温処理後）
色されない Ｂ：メラニンで褐色に着色 Ｃ：無色（メラニン含有量が極めて少ない） ＊：Ｎａ2Ｏ3 １０％、１時間、室温処理後）
【００３０】実施例 ５ 土壌中の微生物を蛍光色素により観察する場合、土壌中
の自家蛍光が測定の妨げになることがある。そこで使用
する蛍光色素には、高い明るさを有することが要求され
る。表４に、種々の色素で染色した後、実施例３と同様
の画像解析により測定した２０〜４０個の大腸菌細胞の
平均蛍光強度を示す。
の自家蛍光が測定の妨げになることがある。そこで使用
する蛍光色素には、高い明るさを有することが要求され
る。表４に、種々の色素で染色した後、実施例３と同様
の画像解析により測定した２０〜４０個の大腸菌細胞の
平均蛍光強度を示す。
【００３１】
【表４】 表４ ─────────────────────────────────── 色 素 濃 度 励 起 強 度 a,b Ｓ．Ｄ．b （ｍＭ） （ＳＦＤＡ＝１００） ─────────────────────────────────── ＳＦＤＡ ０．３ Ｂ １００ ５３ ＣＦＤＡ ０．０１ Ｂ ４７ ３２ ＦＤＡ ０．０１ Ｂ １５ ９ ＡＯ ０．１ Ｂ ５２７ １７９ Ｍｇ−ＡＮＳ １０ Ｕ １６２ ８６ ─────────────────────────────────── ａ：色素を添加して１４〜１５分間後 ｂ：２０細胞の蛍光強度から計算 ＣＦＤＡ：６−カルボキシフルオレセインジアセテート 明るさではＡＯが最高であったが、バックグラウンドの
蛍光もまた非常に高いので細胞の観察が妨げられる。Ｓ
ＦＤＡの明るさはおよそＣＦＤＡの２倍で、ＦＤＡの約
７倍であった。従って、ＳＦＤＡは細胞内エステラーゼ
で加水分解される色素の中で、最もコントラストが鮮や
かであった。
蛍光もまた非常に高いので細胞の観察が妨げられる。Ｓ
ＦＤＡの明るさはおよそＣＦＤＡの２倍で、ＦＤＡの約
７倍であった。従って、ＳＦＤＡは細胞内エステラーゼ
で加水分解される色素の中で、最もコントラストが鮮や
かであった。
【図１】志賀山の土壌サンプルＢD （Ａ）及びＰ
W （Ｂ）中に生息する微生物数の分布を表す図面であ
る。Ａにおいては上から順にＦ層、Ｈ層、Ａ1 層、Ｂ1
層、Ｂ2層、Ｃ層を表し、Ｂにおいては上から順にＦ
層、Ｈ層、Ａ2 層、Ｂ1 層、Ｂ2 層、Ｃ層を表す。
W （Ｂ）中に生息する微生物数の分布を表す図面であ
る。Ａにおいては上から順にＦ層、Ｈ層、Ａ1 層、Ｂ1
層、Ｂ2層、Ｃ層を表し、Ｂにおいては上から順にＦ
層、Ｈ層、Ａ2 層、Ｂ1 層、Ｂ2 層、Ｃ層を表す。
【図２】種々の条件下における志賀山の土壌サンプル
（ＢD のＡ1 層）中の細胞の形態を蛍光顕微鏡で調べ
た、図面に変わる写真である。Ａは蛍光色素を加えてい
ない天然土壌を、ＢはＳＦＤＡで染色した土壌（細胞数
は、８．０１×１０8 ／ｇ−ｄｒｙ ｓｏｉｌ）を、Ｃ
はオートクレーブ滅菌した土壌をＳＦＤＡで染色したも
のを、ＤはＣの土壌に枯草菌の懸濁液を添加して再度Ｓ
ＦＤＡで染色したものを表す。図中の右下に示す線は、
４０μｍの長さを表す。写真の倍率は、Ａ、Ｃ及びＤが
１００倍で、Ｂが１２５倍である。
（ＢD のＡ1 層）中の細胞の形態を蛍光顕微鏡で調べ
た、図面に変わる写真である。Ａは蛍光色素を加えてい
ない天然土壌を、ＢはＳＦＤＡで染色した土壌（細胞数
は、８．０１×１０8 ／ｇ−ｄｒｙ ｓｏｉｌ）を、Ｃ
はオートクレーブ滅菌した土壌をＳＦＤＡで染色したも
のを、ＤはＣの土壌に枯草菌の懸濁液を添加して再度Ｓ
ＦＤＡで染色したものを表す。図中の右下に示す線は、
４０μｍの長さを表す。写真の倍率は、Ａ、Ｃ及びＤが
１００倍で、Ｂが１２５倍である。
【図３】大腸菌の熱処理時間と相対蛍光強度との関係を
表す図面である。図中、黒丸はＳＦＤＡを、白三角はＦ
ＤＡを、白四角はＡＯを、白丸はＭｇ−ＡＮＳをそれぞ
れ表す。Ｍｇ−ＡＮＳのみ、縦軸は右側のスケールで表
す。
表す図面である。図中、黒丸はＳＦＤＡを、白三角はＦ
ＤＡを、白四角はＡＯを、白丸はＭｇ−ＡＮＳをそれぞ
れ表す。Ｍｇ−ＡＮＳのみ、縦軸は右側のスケールで表
す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年６月１６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】種々の条件下における志賀山の土壌サンプル
（ＢＤのＡ１層）中の細胞の形態を表す、図面に変わる
蛍光顕微鏡写真である。Ａは蛍光色素を加えていない天
然土壌を、ＢはＳＦＤＡで染色した土壌（細胞数は、
８．０１×１０８／ｇ−ｄｒｙ ｓｏｉｌ）を、Ｃはオ
ートクレーブ滅菌した土壌をＳＦＤＡで染色したもの
を、ＤはＣの土壌に枯草菌の懸濁液を添加して再度ＳＦ
ＤＡで染色したものを表す。図中の右下に示す線は、４
０μｍの長さを表す。
（ＢＤのＡ１層）中の細胞の形態を表す、図面に変わる
蛍光顕微鏡写真である。Ａは蛍光色素を加えていない天
然土壌を、ＢはＳＦＤＡで染色した土壌（細胞数は、
８．０１×１０８／ｇ−ｄｒｙ ｓｏｉｌ）を、Ｃはオ
ートクレーブ滅菌した土壌をＳＦＤＡで染色したもの
を、ＤはＣの土壌に枯草菌の懸濁液を添加して再度ＳＦ
ＤＡで染色したものを表す。図中の右下に示す線は、４
０μｍの長さを表す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三川 隆 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 ５−スルホフルオレセインジアセテート
及び／又は６−スルホフルオレセインジアセテートを媒
体に添加し、媒体中に存在する細胞内からの蛍光を測定
することを特徴とする生細胞の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31425393A JPH07135996A (ja) | 1993-11-19 | 1993-11-19 | 生細胞の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31425393A JPH07135996A (ja) | 1993-11-19 | 1993-11-19 | 生細胞の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07135996A true JPH07135996A (ja) | 1995-05-30 |
Family
ID=18051130
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31425393A Pending JPH07135996A (ja) | 1993-11-19 | 1993-11-19 | 生細胞の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07135996A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002034595A (ja) * | 2000-07-24 | 2002-02-05 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 生細胞の検出方法 |
| JP2005103371A (ja) * | 2003-09-29 | 2005-04-21 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | メタン発酵処理方法 |
| EP3650838A4 (en) * | 2017-07-05 | 2021-03-17 | Reyes Fuchs, Carmen Gabriela | PROCESS FOR FORMING AN IMAGE WITH THE COLORS OF INCINERATED MATERIALS BY MEANS OF MICROSCOPY TECHNIQUES |
| WO2024024648A1 (ja) * | 2022-07-29 | 2024-02-01 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 有機色素組成物及びそれを含むスプレー剤 |
-
1993
- 1993-11-19 JP JP31425393A patent/JPH07135996A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002034595A (ja) * | 2000-07-24 | 2002-02-05 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 生細胞の検出方法 |
| JP2005103371A (ja) * | 2003-09-29 | 2005-04-21 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | メタン発酵処理方法 |
| JP4506137B2 (ja) * | 2003-09-29 | 2010-07-21 | 富士電機ホールディングス株式会社 | メタン発酵処理方法 |
| EP3650838A4 (en) * | 2017-07-05 | 2021-03-17 | Reyes Fuchs, Carmen Gabriela | PROCESS FOR FORMING AN IMAGE WITH THE COLORS OF INCINERATED MATERIALS BY MEANS OF MICROSCOPY TECHNIQUES |
| WO2024024648A1 (ja) * | 2022-07-29 | 2024-02-01 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 有機色素組成物及びそれを含むスプレー剤 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040518 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20041005 |