JPS58502082A

JPS58502082A - 細菌及び菌類の検出のための方法及び試薬

Info

Publication number: JPS58502082A
Application number: JP83500092A
Authority: JP
Inventors: ゼ−ダ−ヘ−ル・トルド・ケネス
Original assignee: ゼ−ダ−ヘ−ル、トルド、ケネス
Priority date: 1981-12-17
Filing date: 1982-12-17
Publication date: 1983-12-08
Also published as: WO1983002123A1; EP0096689A1; SE431228B; SE8107599L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】細菌及び菌類の検出のための方法及び試薬本発明は、高感度で細菌性及び真菌性感染を検出するための方法及び試薬に関するものである。

比較的高感度でグラム陰性細菌を通しての細菌性感染を早急に検出するための各種方法は、変形細胞（ｃＬｍｇｂｏｃｙ−ｔｇｚ　）の細胞分解産物またはカブトガニ（んｏｒｚｇｚｈｏｇｃｒａｂｓ　）からの１血球”の反応に基づいている。細胞分解産物はリポ多糖類である細菌内毒素と反応し、ゲルを形成する。カブトガニの防禦反応であるこのゲル化現象は、セリン・プロテアーゼを活性化するリポ多糖類により誘導され、頴番にコアグロゲン（ｃｏｃＬｇｔｔＬｏｇｇｎ　）をコアグリン（ｃｏｃＬｌｔＬｌｉｎ　）に変換する。以前の決定方法は、一方では、ゲル形成速度、混濁度変化等の測定などのようなゲル反応それ自体に基づいており、他方では、活性化されたセリン・プロテアーゼに基づいている。

最後に述べた方法は、限定的には最も鋭敏な方法であり、また１０−６〜ｔｏ− ”！／−程も低濃度の検出も可能であって、成る合成されたポリペプチドを酵素的に加水分解するためにセリン・プロテアーゼの能力を利用す−るものであり、このようにして、特定の末端基が裂開され、これにより色度測定的（比色的）にまたは螢光測定的に検出しうる化合物を形成する。この方法は、例えば西ドイツ公開公報２．７４０，３２３号に記載さｔている。スウェーデン国、メルンダール、カビ・ペプチド・リサーチ社（ｇａｂｉＰｇｐｔｉｄ、ｇ　Ｒｇｚｅｒｔｒｃｈ　Ｌｔｄ、、　）製の重版の試薬は、末端ｐ−ニトロアニリド基を有する合成ペプチド、及びアメリカ・かブトガニまたはリムラス・ポリフエマス（ＬｉｍｔｂＬμＳｐｏＬｙｐｈｅｍｕ、ｓ　）からの細胞分解産物を含有している。細菌性リポ多糖類の付加により細胞分解産物のセリン・プロテアーゼが活性化され、これにより遊離されたｐ−ニトロアニリンの黄色が比色的に読み取られる。

上記反応は全ゆるカブトガニ種からの血球細胞分解産物に適用されるけれども、この早期の殆んど化石の海洋動物にはわずかの数の生存様があるのみである。これらの中でも、上記カブトガニ、アメリカ大陸沿岸に生存するリムラス・ポリフエマス、日本カブトガニ、及びタチプリュス・トリデンティタス（Ｔａｃｈｙｐｌｔｕｓ　ｔｒｔｄｅｒＬｔａｔｗｚ）が挙げられる。このように海洋中にも比較的まれであるこれらの動物もまた減少しており、このことは特に、上述した試験方法にこれまで商業的に最も利用されてきたものの一つであるリムラス・ポリフェマスの場合にそうである。カブトガニは水性養殖できないので、このような細胞分解産物の貯蔵が将来においては期待される。

しかしながら、これまでは、カブトガニの血球細胞分解産物のための代替物はなかったし、カブトガニは、他の節足動物のそれとは幾つかの観点において実質的に異なるユニークな血液システムを胃する、古い原始の奇数分枝の有節類または節足動物とみなされていた。上述した内毒素反応は、従って、この特定の動物種に限定されるべきものと信じられていたつ従って、例えばカブトガニのみが一つのタイプの血球を有し、一方、他の節足動物は綱及び種に依存して３乃至９の別個の血球タイプを有する。しかしながら、この関係においてさらに重要な相違は、カブトガニのコアグロゲンは血球中にあり、一方、他の節足動物においては血漿中に含まれここで主たる凝集反応が同様に起るということが示されたことである。後者の場合には従って血漿及び血球の両方に凝結活性化が要求されるだろうし、これは従ってカブトガニからのそれと同様な全く安定な活性な調剤の調製を不可能とするだろう。

しかしながら、不発明によれば、コアグロゲンと少なくとも１つのセリン・プロテアーゼが節足動物甲殻類及び昆虫類の血球中に含有され、カブトガニにおけるのと同様にして凝結様反応の活性化に関わるということ、及び、従って細菌性及び真菌性感染がこれらの動物からの血球または血球細胞分解産物を用いて質的にもまた量的にも決定できるということが見い出された。これらの節足動２物からの細胞分解産物は、リポ多糖類またはＬＰＳ。

すなわち縄菌内毒素により、並びに他のタイプの炭水化物、すなわち本質的に全ての菌類の細胞壁の部分である特表昭５８−５０２０８２（３） β−１，３−グルカン類（β−ｌ　＋　３−　ｇｌｗｃｘｒＬ、９）により定量的に活性化される。生化学的機構は完全には知られて〜・ないけれども、β−１，３−グルガン類は非常に特異的にセリン・プロテアーゼを活性化し、これがコアグロゲンをコアグリンに変換する他に、プロフェノールｆそシダーゼを活性な酵素フェノールオキシダーゼに変換する。

不発明によれば、真菌性または細菌ｉ！感染は、このように、それ自体公知の方法において、試験されるべきサンプルを、一方では甲殻類またしま昆虫類からの血球細胞分解産物またはそれらから単離された活性化可能なセリン・プロテアーゼもしくはプロテアーゼ類と、他方では細菌性もしくは真菌性抽出物により活性化されたこのような血球細胞分解産物による酵素作用を通して、物理的にあるいは化学的に検出可能な化合物を形成しうる検出物質と接触させ、上記化合物を決定することにより、素速（ばた容易に検出しうる。従って、真菌性または細菌性、感染を検出しまたは決定するための相当する試薬または試薬キットは、一方では甲殻類または昆虫類からの血球細胞分解産物及び他方ではこのよう；な検出物質からなる。

一般に全ゆる甲殻類及び昆虫類からの血球細胞分解産物が本発明に従って使用できるけれども、甲殻類（ｃｒｕ、−１ｔｃＬｃｇα）の中でも中脚甲殻類もしくはいわゆる中脚類が好ましいう淡水十卯類並び文海産士脚類が使用できる。

淡水ザリガニの例としては、アスタカス・アスタカス、４ｚｔｔｘｃＬＬ、？α ｓｔαｃｕ、ｓ　（河ザリガニ）、パシファスタカスーｖ＝ウスキュラスｐａｃｉｆｔｔｚｔａｃｔｂｓ　１ｇｎｉｕｚｃｕ１ｗｚ　（信号ザリガニ）、アスタカス・パリラス　Ａｉｔａｃｕ、ｚ　ｐａｌハｐｕ。

オルコネクテス・リモサス　Ｏｒｃｏｎｇｃｔｅｚハフ７ＬＯ，？ｔＬＪ？、アスタカスｅレプトダクテイラス　Ａｚｔｃｔｃｗｚ　１ｇｐｔｏｄａｃｔｙｌｕｚ。

キャンバラス・アフイニス　ＣａｍｂαｒμＳαｆｆｉ、ｉＳ＜北米ザリガニ）、プロキャンバラス・クラ−キイー（ｐｒｏ　−ｃｃＬｍｂａｒｕｚ　ｃｌατ ｋｉｉ　が挙げられる。好適な海産土製類の中では、キャンサーロパグラスＣａｎｃｇｒ　ｐｃＬｇｗｒｔｂｓ　（普通のまたは食用のカニ）、カーシナス・メーナス　Ｃａｒ−ｃｉｒＬｕｊＩｒｎａｇｒｂαＳ　（岸辺カニ）、ホマラス・ブルガリスＨｏｍａｒｕ、ｚ　ｖｗｌｇａｒｉｚ　（ｏプスター）、バリヌラス・ブルガリス　ｐａ、１ｉｎｕ、ｒｗｓ　ｖｗｆｃｔｒｉｚ　（とげロブスタ− ）、ネフロッグス・ノルヴエギカス　Ｎｇｐｈｒｏｐ、？ｎｏｒｖｇｇｉｃｕｓ（ノルウェー・ロブスタ−）、キャリネクテス・サピダス　Ｃａｌｌｒｉｎｇｃｔｇｓ　ｚａｐｉｔｉｕｚ　が挙げられる。これらの甲殻類の中でも、幾つかは水性養殖における養殖に直接に適しており、例えば河ザリガニや信号ザリガニであるが同様にロブスタ−やカニもそうであり、従ってこれらは本発明の目的に適している。− 昆虫類の中では、特に直翅類及び鱗翅類（チョウ類）のものが挙げられる。最初に述べた目（も（）の例は、スキストセル力・グレガリア（砂漠バッタ）　及ヒ啓Ｆｆ　バッタ　ＬｏｃｌＬｓｔａ　ｍｉｇｒａｔｏｒｉｃ　（普通のバッタ）であるっチョウ類の中では、ガレリア・メロネラ　Ｇαｌｌｅｒｉｗｍｇｌｏｎｇｌｌａ　（ロウ蛾）、ヒヤルフｆう・セクロピアＨｙａｌｐｈｏｒａ　ｃｇｃｒｏｐｉａ　及びボムビツクス・モリ　Ｅｏｒｎｂｙｘｒｒｉｏｒｉ　（絹蛾）が挙げられる。昆虫の場合は細胞分解産物のための利益が多分甲殻類と同じではないだろう力＼この目的のためには例えば絹蛾の養殖は非常によく予期されるであろう。

例えば上述した甲殻類からの血球細胞分解産物が使用できるという事により、例えばザリガニからの血液リンパは年間殆んどの時期に収集できるので、非常に均一な品質を有する血球細胞分解産物源が簡単にまた持続的に確保される。他方、カブトガニの血液リンパは非常に限られた期間だけ収集できるのみである。

前述したように、甲殻類及び昆虫類からの血液リンパのための凝結プロセスは、少なくとも一つのセリン・プロテアーゼの活性化を含む。このような活性なセリン・プロテアーゼの存在により、以前に公知のリムラス細胞分解産物プロセスに使用されまたは提１案されてきたものと本質的に同じタイプのペプチド化合物が使用できる。

従って、本発明は、検出物質、すなわち活性化された細胞分解産物により冒されるべき物質が、下記式のペプチド化合物及び／又はそれらの鉱酸塩である方法及び試薬からなる。

ここで、Ｒ１はＮ−末端で保護され、少な（とも二つのアミノ酸単位を有するペプチド部分であり、ＸはＧ　ｌ　ｙまたは７（ニ、好ましくはＧｌｙであり、またＲ２は酸アミド及び／又はエステル結合を通して、４ｒｇで表わされるアルギニン残基のＣ−末端に結合した残基であって、細菌または菌類により活性化された血球細胞分解産物の存在下でＲ２Ｈに酵素的に加水分解されうるものである。

残基Ｒ２はさらに、形成された化合物Ｒ２Ｈが物理的にまたは化学的に、例えば比色的にまたは分光光度測定的に測定されうるようなものであり、好ましくは螢光性化合物または発色性化合物である。好ましくは、基Ｒ２はｐ−二トロアニリド、５−ニトロ−α−ナフチルアミド、β−ナフチルアミド、α−ナフチルエステル、β−ナフチルエステル、インドキシルエステル、Ｎ−メチルインドキシルエステル、（４−メチル）アンベリフエリルエステル及び／又はレゾルフィンエステルから誘導され、相当する化合物Ｒ，Ｈはｐ−ニトロアニリン、５−ニトロ −α−ナフチルアミン、β−ナフチルアミン、α−ナフトール、β−ナフトール、インドキシル、Ｎ−メチル−インドキシル、４−メチルーアンヘリフエロン及ヒレゾルフィンである。これらのうち最初の二つの化合物は発色性であり、一方、他のものは螢光化合物である。

Ｒ２のための好適な保護基は、例えばベンゾイル、アセチル、カルボベンゾキシ、ｔａｒｔ−ブトキシカルボニル及ヒｐ　−トルエンスルフォニルでアル。

本発明のこの観点における使用のための特に好適なペプチド誘導体は、Ｂｚ　−ｆｉｇ　−Ｇｌ’ｕ、　−Ｇｌｙ　−１ｒｇ　−ＰＮＡ、　ＨＣｉＢｚ　−Ｉｔｓ　−Ｇｌｗ　（７”−ピペリジル）−Ｇｌｙ　−１ｒｇ　−ＰＮＡ、ＨＣｔＢｚ−１１ｓ−Ｇｌｕ、（０−Ｅｔ　）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＨ７（、ＨＣＩＢｚ　−１）ｇ−Ｇｌｔｂ（０−ｉ−Ｐｒ　）−Ｇｌｙ−，４ｒｇ−ＰＮＡ、ＢＣｉＢｚ　−１１ｅ　−Ｓｅｒ　−ＧＡ　ｙ−Δｒｇ　−ＰＨＡ　、　ＨＣＩＥｚ−ｆｉｇ−Ｇｌｕ、（０−Ｍｅ　）−Ｇｌｙ−，４ｒｇ−ＰＮＡ、ＨＣｌ１ｔｃ　−ｒｔシーＧｌｔｂ　−Ａｌα−Ａｒｇ　−ＰＮＡ、　ＥＣ１である。

ここで、　Ｂｚ−ベンゾイル、Ａｃ−アセチル、Ｍｅ−メチル、Ｅｔ−エチル１，１−ｐｒ−イングロビル、及びＰＮＡ−ｐ−ニトロアニリドであり、アミノ酸はＩＵｐＡＣ略号により与えられている。

ペプチド化合物の幾つかは市場で入手でき、一方、他のものは公知の方法で調製できる。

他の点においては、プロセスは、前述した西ドイツ公開公報２，７４０．３２３においてリムラス細胞分解産物法について記載されているようにして行なうことができる。

本発明による甲殻類及び昆虫類からの血球細胞分解産物は、本質的にはカブトガニからの周知のリムラス細胞分解産物と同様にして調製できる。この方法は、これまでにも文獄に充分に記載されて２つ、従ってここに詳細に説明する必要はないであろう。このように、例えば甲殻類からの部分的に精製された血球細胞分解産物が、血液の汚染を避けるように注意しながら、まず動物から血液を収集することにより調製される。ザリガニ、信号ザリガニなどのような水性養殖で養殖できる甲殻類を、血液を収集するときに殺す必要はないが、ヒト供血者の場合のように一定の間隔で同じ動物から幾度か収集できるということは注目されるべきである。このことはもちろん大きな利点である。なぜならば、本発明による血球細胞分解産物製造用の血液の回収は、そこで食用目的のザリガニ養殖と組み合わせ５るからである。血球は、ついで常法に従って遠心分離及び洗浄を通じて単離される。。

これらは高カルシウムイオン濃度の緩衝液中で均質化された後、７０，０００　ｆで遠心分離され、上澄液が回収される。得られた細胞分解産物は、カブトガニからの現在市販の細胞分解産物よりも安定であり、少なくとも２４時間安定に維持される。しかしながら、好ましくは、得られた上澄液は使用の際に水または適当な緩衝液（ｐＨ〜ｇ）で希釈されるように凍結乾燥される。溶液は任意に０．５〜ｌ　、５　Ａｆ　ＮｔｔＣ７で安定化でき、これにより幾日かの安定性が達成できる。同様に凍結乾・燥した細胞分解産物の溶液も少なくとも５時間安定である。凍爾乾燥安定性を増大させるために、例えば牛血清アルブミン及び／又ン家グリシンを卯えることかできる。

真菌性及び細菌性感染を検出するための不発明に係る試薬または試薬キットは、以上のように調製された血球細胞分解産物及び先に定義したような検出物質から構成できる。好ましくは、細胞分解産物及び検出物質は粉享形態にある。・これを例えば疑いのある真菌性または細菌性感染を有する抽出物をテストするために用いるときには、テスト試薬は適当な緩衝液（ｐＨ〜８）に洛かされ、ついでテストされるべき抽出物が側えられる。試薬溶液は、ついで、使用された検出物質に依存して、例えば分光光度測定的にあるいは比色的に検査される。

本発明の方法及び試薬はまた、内毒素決定用に公知のカブトガニ細胞分解産物と比べて、真菌性感染を検出するのに著しく鋭敏である。それらの細胞壁中にβ− １，３−グルカンを゛含有する全ての菌類が検出でき、これは殆んど例外なく現存する全ての菌類に適用される。本発明に従って素速く真菌性感染を検出できるということは大きな価値がある。現在、ヒト及び動物における真菌性皮膚感染は培養され、これは約２週間刀）かつている、同様に、食物における徽惑染、いわゆるマ仁コトキレン類は急速に大きな問題となっている。

不発明による甲殻類からのａ胞分解産物を用いてこれ１で漫しれた感度は、内毒素（細菌性、悠染）に対して約１０−”〜ｌ　Ｏ−”　？／７ｎｌ、β−ｌ　＋　３−！　”　７７　ン（真菌性感染）に対して約Ｉ　Ｑ−”０ｆ／ｍｌである。同毒素に対する感度は、例えば市販のカブトガニ細胞分解産物で現在行なわれているものに類似して、細胞分＄Ｎ物に含有されるということが示された内毒素活性化の抑制物質を除去することにより、おそらくさらに増大されうる。

血球細胞分解産物は、過剰のβ−１，３−グルカン類を加えることにより、内毒素特異性が付与される。相応するやり方において、β−１，３−グルカン％　異性、４、ザリガニ細胞分解産物から純粋な形態で製造された抗−内毒素因子を加えることにより達成され、これはそこでザリガニ細胞分解産物の内毒素活性を妨げるであろう。

選択的に、高含量の内毒素（ＬＰＳ）が加えられる。

本発明の方法によって内毒素及びβ−１，３−グルカン類の定量的決定は、それ自体公知のやり方で、例えば標準あるいは検量曲線を準備することによって行なうことができる。

幾つかの特定の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明をいかなる意味においても限定するものでない。

ザリガニ、アスタカス・アスタカス　Ａｓｔαｃｔｂ、？ｏＬｇｔα−Ｃｕ、９からの血球を、０．１Ｍクエン酸ナトリウムを除いた以外はＳ６ｄ、ｔｒｈＪＬｌｌ　、　、ｆ、　、　Ｈａｌｌ　、　Ｌ、、Ｕｎｇｓｔａｍ　、　Ｔ、及びＮｙｈｌｈｂ　、Ｌ、（１９１９）　Ｊ、ＩｒＬｕｅｒｔｅｂｒ、ｐａｔんｏｌ、３４゜２８５−２’？４に記載のようにして収集した。血球をｌｏｏｍ、ＶＣｏＬＣｌ　２を含有するｐＨ７，０のｌｏｎ、Ｍ　カコジール酸ナトリウム中で均質化し、ホモゲネートを次いで７０，０００　？で２０分間遠心分離した。およそ２■タンパク／ｍｌを含有する得られた上澄液は、直ちに使用するかまたは３ｄアリコートに凍結乾燥して使用できる。使用に先だって、これは２Ｈｉ／−の最終タンパク濃度まで蒸留水３−中に溶解される。

血球細胞分解産物の特異的β−１，３−グルカン活性化に関して本発明の方法をテストするために、実施例１で得られた血球細胞分解産物の２容量部を１容量部のβる濃度の他の炭水化物と２０−２２℃で１３０分間混合した。この反応混合物の１００μｌを、ｐＨ８：、、ｏのＯ，１，＆トリダールのカビ・ペプチド・リサーチ社から得た）合成ペプチドＢｚ　−１１ｔ　−Ｇｌｕ（１−ピペリジ＃　）　−Ｇｌｙ　−Ａｒｇ　−ＰＮＡ。

ＨＣＩ　２　ｒｎＭ溶液１００μｌに加えた。３７℃で帆５時間インキュベートした後、５０％酢酸１００μノを反応を終了させるためシて１え、遊里されたｐ −ニトロアニリン（入ｖ、ｇを４０５藺　で分光光度法により測定した。

用いたβ−１，３−グルカン類シ家１．？’ｓ（酵母細胞贋の１％慧濁液の上澄液、ツィモサン　Ｚｙｍｏｓｔｘｎ、　、シグマ５１ｇｍα）、ラミナラン、Ｍ、ラミナランＧ及びβ−１，３−り一結合グルコシル残基からなる直鎖五糖類であった。

ラミナランＭ及びＧは、５ｔｒｔｒｋ　Ｓ、　、　Ｊ、　Ｒ，（１９７６）ＣｏＬｒｔｏｙんｙｄ、ｒ、　Ｒｇｓ、±ユ、　＋７６−１７８に従って、ＤＥＩＥ −モリブデン酸塩−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｇｘ　、登鏝商標。

クロマトグラフィーを使用してラミナラン（シグマ）から精製した。直鎖五糖類は、Ｓｄｃｔｔｒｈｇｌｌ　、　Ｋ、　、及びＵｒＬｅｚｔｃｍ　、　Ｔ、（ｌ　９７９　）　Ｃｘｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２５　。

４０６−４１４に記載のようにして調製し、精製した。

特異的β−１，３−グルカン活性化を示す酵素活性決定（セリン・グロテアーゼ）の結果を、下記第１表に示すＯ実　施　列　３実施例１の凍結友燥した血球、細胞分解産物を、　ｐｌｉ　８．０のαＩ　Ｍ　）　ＩＪスス−Ｃｌ−緩衝液３−中に浴かした。この溶液をついで実施列２に従ってソイモサン上澄液１．５−と混合し、２０℃で３０分間インキュベートシタ。この反応混合物から１００μｔを取り、０．１．Ｖ）リス−ＨＣ１（ｐＨｇ、　Ｏ）６００μノに加えた。（スウェーデン国、メルンダールのカビ・ペプチド・リサーチ社から４た）発色性末端基を有する容積合成ペプチド２　ｍ　ｔＫ溶液１００μｌをこの混合物に加え、３７℃でＩ［９間インキュベートした後、５０チ酢酸１００μｔを加えて反応を終了させた。ついで、遊離したγ−ニトロアニリンを４０５ｎｍで分光光度法により測定した。各種発色性物質に対する結果を、下記第２表に示す。

以下余白第　２　表Ｂｚ−１１ｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−，４ｒｇ−ＰＮｌ、ＨＣｌ　Ｏ，６２Ｂｚ　− ｌｉｔ　−Ｇｔｕ−Ｃｒ−ピペリジル）−Ｇｔｙ−ｉ４ｒｇ−ＰＮＡ、ＥＣ１０８４Ｂｚ　−１１ｅ　−ＧｌｔｔＣＯ−Ｅｔ’）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＮｌ、ＨＣｔ　０−８４Ｂｚ　−１１ｔ　−ＧｔｕＣＯ−ｉ−Ｐｒ）−Ｇｔｙ−Ａｒｇ− ＰＮ、４．ＨＣｌ　Ｏ，９２Ｂｚ　−Ｉｔｓ　−Ｓｇｒ７Ｇ７３／　−Ａｒ５− ＰＮＡ、ＢＣｌ、　０．９０Ｂｚ　−Ｉｔｓ　−ＧｌｕＣＯ−Ｍｅ）−Ｇｔｙ− Ａｒｇ−ＰＮＡ、ＨＣｌ　Ｏ，７００，０ｚｌｒカコジール酸塩緩衝液（ＰＨ７，０）中の実漬例１のザリガニ血球細胞分解産物及び同量（ｆＪ１００μｔ）のＢｚ−１，１ｇ　−ＧｌｔＬ　（ｒ−ピペリジル）　−Ｇｌｙ　−Ａｒｇ　−ＰＮＡ、ＥＣ１からなる本発明の試薬を、以下の１＠の予め加熱（５分。

１００℃）シタ抽出物と混合した：アファノビセス・アスタシ　ｒ４ｐｈａｎｏｍｙｃｅｓαｓｔαＣ乙、アファノばセス・レヴイスＡｐｈαｒＬｏｍｙｃｅ、？ｌαｅυｉｓ、アフ了ノミセス・ニーティケスＡｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ　ｅｕｔｚｉｃｈｇ、５１．サン力ロミセス・セレヴイゼＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｇｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、アスペ／Ｌ−ギルスーフレヴスΔ、１１ｐｅｒｇｉｌｌｔｔｓ　ｆｌａｖｕｓ、ペニシリウム・ヴイリジ力タムＰｅｎｉｃｉｌｌｉｔｔｍ　ｖｉｒｉｄｉｃａｔｗｍ　、カンジダ・アルビカンスＣａｎｔｔｉｄａ　ａｌＡｉｃａｎｓ、ポリポラス・アンノサｘ　ｐｏｌｙｐｏｒｔｂｓαｎｎＯ，９１ＬＪ？　、ボレタス・ヴアリエガタス　ＢｏｌｅｔｕＪｌｖａｒｉ　ｇダα ｔｕｒ、ついで、浴液を４０５ｙｉｍで比色法により観察した。全ての菌類に対して、黄色が得られ、Ｐ−二）ロアニリト基のＰ−ニトロアニリンへの酵素加水分解と関連して血球細胞分解産物の活性化を指示した。

実施例５実施例１の血球細胞分解産物＋００μｔ、各種濃度のＥ、ｃｏｌｉ円毒素（米国、プリンク０フトー社ｐ　、　Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄ、ｔ　Ｉｎｃ、）１００　ｐｌ、　ｐＨｇ、　ＯＩ）　Ｏ，Ｉ　＆　）　リｘ−ＨＣｔＩ００ａｌ、及び（スウェーデン国、メルンダールのカビ・ペプチド・リサーチ社製）　Ｂｚ−１１ｇ−ＧｌｔｔＣｒ−ピペリジル）　−Ｇｌｙ−７ｔ４ｒｇ　−ＰＮＡ、ｌ１ＣＩ　Ｉ）　２　ｍＭ溶ｐ　Ｉ　０Ｏｔｉｌの混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ついで１反応を終了させるために５０チ酢ｅ１００１１１を加え、ついで遊離きれたｐ〜ニトロアニリンを４０５ｎｍで分光光度法により測定した。得らｆた吸光度変化を第３表に示す。

以下余白第　３　表 −実施例１と同様にして、以下の甲殻類から血球細胞分解産物ケ調製した：パシフテスタカス・レニウスキュラス　Ｐαｃｉｆａｓｔａｃｕ、ｓ　１ｅｎｉｕｓｃｕ、１ｔｔｓアスタカス・パリプｘ　Ａｓｔａｃｕ、？ｐａ、１ｌｉｐｅｒアスダカス・レズトダクテイラス　１．？ｔａｃｔｔｓ　１ｇｐｔｏｄａｃｔｉｌｔｔｚオルコネクテス・リモサス　Ｏｒｃｏｎｇｃｔｅｓ　ｌｉｍｏｓｕ、？キャンサー・バグ７スＣａｎｃｅｒ　ｐａｇｔｔｒｕｓカーシナス・メーナスＣａｒｃｉｎｕ、５１ｍａ’ｅｎａｓ不７０ソブス・ノルヴエギカス　Ｎｅｐｈｒｏｐｓ　ｎｏｒυ６３　Ｌ　Ｃｕ　４得られた細胞分解産物を実施例２及び５に記載の方法と同様にしてβ−１，３−グルカン類及び内毎素による活性化について試、發し、活狂化（Ｐ−ニトロアニリンの遊離）が全ての細胞分所産物について指示で１１．た。

昆虫類スキストセル力・グレガリ了　５ｃｈｉ　ｓ′ｔｏｃａｒｃａｇｒｅｇａｒｉａ、ガレリ了−メロネラ　（ンａｌｌｅｒｉａ　ｍｅｌｏｎｅｌｌａ、ヒヤルフオラ・セクロビ了　Ｈｙａｌｐｈｏｒａ　ｃｔｃｒｏｐｉα及ヒボムビツクス・モリＢｏｍｈｙｘ　ｍｏｒｉからの血球細胞分解産物は、ここ１ではフェノールオそ／ダーゼの活性化についてのみ試験ざｎ、上述した甲殻撃細胞分解産物に関しては肯定的な落果が得られた。甲殻類と昆虫類との血液システム間の大きな類似性のために、ぼた本発明に関連してフェノールオキシダーゼがセリン・プロテアーゼにより項番に活性化さ１．るということが見い出きｎたことから、これらの昆虫細胞分解産物も同様に、上記試験に２いて活性化されることが予期されねばならない。

■節調杏報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．　試験されるべきサンプルを、（４節足動物綱甲殻類（Ｃｒｕｚｔａｃｇａ　）及び昆虫類（Ｉｎｓｇｃｔａ　）の一つに属する動物からの血球細胞分解産物またはそれらから単離された活性化可能なセリン・グロテアーゼもしくはプロテアーゼ類、及び（Ｅ）下記式ここで、Ｒ１はそのＮ−末端で保護され、少なくとも二つのアミノ酸単位を有するペプチド部分であり、ＸはＧｌｙまたは、４１αであり、−！たＲ２は酸アミド及び／又はエステル結合を通して、４ｒｌで表わされるアルギニン残基のＣ− 末端に結合した残基であって、内毒素またはβ−１，３−グルカンにより活性化さｎた血球細胞分解産物の存在下でＲ，Ｈに酵素的に加水分解されうるものである、−のペプチド化合物の形態にある検出物質及び／又はそれらの鉱酸塩と接触させ、物理的にまたは化学的に検出されうる化合物好ましくは螢光性もしくは発色性化合物である形成された＾Ｈを決定することを特徴とする。内置決定することにより菌類及び／又は細菌全検出する方法。２　血球細胞分解産物が、中脚類の目に属する動物からの血球細胞分解産物であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。１　血球細胞分解産物が淡水ザリガニ、特にアスクカス・アスクカス　、４ｓｔａｃｔｔｓα５ｔαｃｕｓ’またはノ（シフアスクカス。レニウスキュラｘ　ｐａｃｉｆａｔｔａｃｔｔｚ　１ｅｎｉｔｔｓｃｕ、ｔｔｔｓ　から誘導されることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。瓜　上記中脚類がアスクカス・アスクカス　Ａｓｔａｃｕ、？α５ｔαＣＵＳ　、バシファスタカス・レニウスキュラスＰａｃｉｆαｙｔαｃｔｔｘ　１ｔｎｉｕｓｃｒｔｌｕｓ、アスクカス・レズトダクテイラス　Ａｓｔａｃｕ、＋１１ｅｐｔｏｄａｃｔｙｌｕｓ　、アスクカス・バグラス　１４ｓｔａｃｕｚ　ｐａｌｌｉｐｇｒ、オルコネクテス・リモサスＯｒｃｏｎｅｃｔｇｚ　ｌｉｍｏｓｕｓ、キャンバラスーアフイニスＣａｍｈａｒｔｔｓａｆｆｉｎｇｓ　、グロキャンバラス・クラ−キイー　ｐｒｏｃａｍｈａｒｔｔｓｃｌａｒｋｉｉ　、キャンサー・バグラス　Ｃａｎｃｅｒ　ｐａｌｔｔｒｕｚ、カーシナス・メーナス　Ｃａｒｃｉｎｕｚ　ｍａｔルαＳ、ホマラス・ヴルガリス　ＨｏｍαγＵＳυｕ１ｇ αγＬＳ、バリヌラス争ヴルガリスｐａｌｉｎｕｒｕｓ　ｖＬＬｌｇａｒｉｓ、ネフロンブス・ノルヴエギカスＮｇｐｈｒｏｐｓ　ｎｏｒｖｅｌｉｃｔｔｓ及びキャリネクテス、サピダスＣａ１ｌｉｎｅｃｔｅｓ　５ａｐｉｄｕｚから選択されることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。５、Ｒ２がＰ−ニトロアニリド、５−ニトロ−α−ナフチルアｉド、β−ナフチルアｉド、！を一ナフチルエステル。 β−ナフチルエステル、インドキシルエステル、Ｎ−メチルインドキシルエステル、（４−メチル）アンベリフエリルエステルｔｙｃｔａレゾルフィンエステル基であることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の方法。６　検出物質が。Ｂｚ　−１１ｅ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ−１ｒｇ　−ＰＮＡ、ＥＣ１Ｂｚ　−Ｉｔｓ　−ＧｌｔｔＣｒ−ｐｉｐｔｒｉｒｌｙｌ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＮＡ、ＨＣｔＢｚ　−１１ｅ　−Ｇｔｕ、（０＝Ｅｔ’）−Ｇｌｙ−，４ｒｙ−ＰＮＡ、ＨＣＩＢｚ　−Ｉｔｓ　−Ｇｌｕ、（０−ｉ−ｐｒ）−Ｇｔｙ−Ａｒｌ−ＰＮＩ、ＢＣｌＢｚ　−１１ｅ　−５ｅｒ−Ｇｔｙ−Ａｒ’ｇ−ＰＨ４，ＢＣｔＢｚ　− １１ｅ　−Ｇｔｔｂ（０−Ａｆｅ　）−Ｇｌｙ−Ａｒｙ）−ＰＮＡ、ＨＣｌＡｃ　−１ｔｅ　−Ｇｔｔｂ−ｔ４１ａ−Ｉ４ｒｙ−ＰＮＩ４．ＨＣｌ（ここで、　Ｂｚはベンゾイル、　ｒ４ｃはアセチル、−ｐＮイはｐ−ニトロアニリドである）から選択されることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の方法。７　（４節足動物綱甲殻類（Ｃｒｕｓｔａｃｇα）及び昆虫類（Ｉｎ５ｅｒｔα ）の一つに属する動物からの血球細胞分解産物、及び（劫請求の範囲第１項、５項又は６項に規定した検出物質からなることを特徴とする内毒素及びβ−１，３ −グルカン類をそれぞれ検出もしくは決定することにより菌類及び／又は細菌を検出するための試薬。８、　少なくとも一つの抗−内毒素因子＝！りに過剰の内裕累を含有することを特徴とする真因性感染を検出するための請求の範囲第７項に記載の試薬。ｑ　過剰のβ−１，３−グルカンを含有することを特徴とする細酌性感染を検出するための請求の範囲第７項に記載の試薬。１０　請求の範囲第２項乃至第４項のいずれかに規定するような血球細胞分解産物を含有することを特徴とする請求の範囲第７項乃至第９項のいずれかに記載の試薬。