FI85988B - Screeningsfoerfarande foer gram-negativa bakterier och foer bakteruri orsakad av dessa, i screeningsfoerfarandet anvaendbar enhetlig screeningsanordning och foerfarande foer framstaellning av den. - Google Patents

Description

1 85988

Seulontamenetelmä gram-negatiivisille bakteereille ja niiden aiheuttamalle bakteriurialle, seulontamenetelmässä käyttökelpoinen yksikkömuodossa oleva seulontaväline ja menetelmä sen valmistamiseksi 5

Keksintö koskee diagnostisia testimenetelmiä virtsanäytteiden seulomiseksi gram-negatiivisten bakteerien suhteen sekä yksikkömuodossa olevaa kiinteä faasi-testi-välinettä samaan tarkoitukseen käytettäväksi.

10 Ilmausta "gram-negatiivisten bakteerien aiheuttama bakteriuria (bakteerivirtsaisuus)" käytetään virtsatietulehduksista, joiden aiheuttajina ovat gram-negatiiviset bakteerit. Virtsatietulehdukset on luokiteltu neljään ryhmään taudin oireiden, uusiutumisen ja lisätautien pe-15 rusteella. Äkillinen, selvä gram-negatiivisten bakteerien aiheuttama bakteriuria voi hävitä itsestään, mutta tavallisesti sitä seuraa sitkeä tai uusiutuva bakteriuria, joka saattaa vaatia pitkän lääkehoidon. Kolme muuta bakte-riurialuokkaa saattaa hoitamattomina johtaa munuaistu-20 lehdukseen tai kuolemaan. Lisäksi, koska gram-negatiivisten bakteerien aiheuttama bakteriuria on yleinen ja heikentävä, siihen liittyvien oireiden havaitseminen saattaa olla vaikeaa, jolloin muodostuu ns. oireettomien potilaiden ryhmä.

25 Virtsanäytteen viljelyllä voidaan todeta baktee- 4 ripitoisuudet 10 bakteeria ml:ssa näytettä, jota pitoi-. : suutta joskus pidetään gram-negatiivisten bakteerien nor maalin pitoisuuden yläraja-arvona, mutta viljelytulokset ovat käytettävissä vasta 18-24 tunnin kuluttua, niiden 30 saaminen edellyttää koulutettua henkilökuntaa ja on kallista. Mikroskooppinen tutkimus on nopeampi, siihen ku- 5 luu noin 45 minuuttia, mutta herkkyys on vain 10 bakteeria mlsssa ja tutkimuksen suorittaminen edellyttää myöskin koulutetun henkilökunnan käyttöä. Kumpaakaan menetel-35 mää ei voida pitää seulontamenetelmänä. Nopea, helposti suoritettava ja halpa seulontamenetelmä olisi erityisen käyttökelpoinen sellaisten väestönosien, kuten koululaisten tai sotilashenkilökunnan laajamittaisissa tutkimuksissa.

2 85988

Limulus Amebocyte Lysate (LAL, molukkiravun hajotetut amebamaiset solut) -määritysmenetelmä perustuu tietyistä taskurapulajeista uutetusta, luonnollisesta materiaalista peräisin olevan lysaatin (hajotetut solut) 5 käyttöön. Äskettäin on havaittu, että tämä lysaatti sisältää proentsyymejä sekä luonnollisen substraatin, koagu-logeenin. Endotoksiini, joka on gram-negatiivisten bakteerien soluseinän komponentti, aktivoi lysaattikaskadin. Kaskadin aktivoituminen johtaa luonnollisesti geelimäisen 10 lopputuotteen muodostumiseen.

Väline, joka muodostuu LAL-määritysmenetelmässä tarvittavat reagenssit sisältävästä läpinäkyvästä putkesta ja joka on tarkoitettu endotoksiinin määrittämiseen, on julkaistu EP-patenttijulkaisussa 0 121 868. Mikä ta-15 hansa näyteneste voidaan analysoida.

Endotoksiinin esiintyminen virtsassa on yhdistetty bakteriuriaan myös käyttäen laitteita, joilla voidaan havaita endotoksiinin aiheuttamasta LAL-entsyymikaskadin aktivoitumisesta johtuva sameneminen. Laitteilla mita-20 taan endotoksiinin aiheuttaman kaskadin aktivoitumisen jälkeisen sameuden aste, joka on saatettu verrannolliseksi bakteriurian esiintymiseen. Toteamisrajaksi on ilmoitettu 105 bakteeria ml:ssa näytettä. Korkeista laitekus-. . tannuksista johtuen tätä menetelmää ei kuitenkaan voida 25 pitää seulontamenetelmänä.

Äskettäin on tullut kaupallisesti saataviksi kro-mogeenisiä tai fluorogeenisiä ryhmiä sisältäviä synteettisiä peptidisubstraatteja, jotka endotoksiinin aktivoi-man LAL-kaskadin tuottama hyytymän muodostava entsyymi . : : 30 voi pilkkoa. Lukuisia synteettisiä substraatteja on jul kaistu. Katso esimerkiksi GB-patenttijulkaisu 1 547 747 ja US-patenttijulkaisu 4 188 264. Yleisesti, kahden aminohapon sekvenssin, glysiini-arginiini-sekvenssin, on / _ havaittu olevan oleellinen hyytymän muodostavan entsyy- ’· 35 min suorittamalle kromogeenisen tai fluorogeenisen läh- tevän ryhmän pilkkomiselle. Pilkkoutuvia lähteviä • * 3 85988 ryhmiä, kuten nitrofenyyli, metyylikumariinijohdannaiset, p-(Ν,Ν-dietyyliamino)aniliini ja indoksyyli, on julkaistu. JP-patenttijulkaisu nro 56 42597 tuo julki en-dotoksiinin mittauksen mistä tahansa ruumiinnesteestä, 5 virtsa mukaan lukien, käyttäen substraattia, jonka pilk-koutumistuote voi reagoida l-naftoli-2-sulfonihapon kanssa, jolloin saadaan sininen väri.

Kromogeenisiä tai fluorogeenisiä substraatteja on pääasiassa käytetty endotoksiinin määritysmenetelmissä 10 suonensisäisistä liuoksista ja verestä. Mittaukset verestä on saatettu verrannollisiksi bakteremiaan (veren bakteeritulehdus) . Endotoksiinimäärityksiä verestä vaikeuttaa LAL-kaskadin inhibiittoreiden läsnäolo. Useimmat patenttijulkaisut ja kirjallisuuslähteet koskevat joko 15 näiden häiritsevien tekijöiden eliminoimista tai uusia synteettisiä substraatteja. Katso esimerkiksi EP-patent-tihakemusjulkaisu nro 0 80 649, joka koskee endotoksiinin mittaamisen edellyttämää häiritsevien aineiden poistamista. Patenttihakemuksessa mainitaan julkaistun mene-20 telmän sovellutus bakteriurian määrittämistä häiritsevien aineiden poistamiseksi.

JP-patenttihakemusjulkaisu 56 35994 tuo julki välineen endotoksiinin mittaamiseksi, joka väline sisältää osan, jossa on lysaatista eristettyä entsyymin esiastet-I" 25 ta ja osan, jossa on optisesti mitattavaa peptidisub-straattia erillisessä astiassa.

Kromogeeninen LAL-liuosmääritysmenetelmä, jolla 5 voidaan määrittää 10 negatiivista bakteeria ml:ssa gram-negatiivisten bakteerien aiheuttaman bakteriurian diag-30 nostisoimiseksi käyttäen testipakkausta Whittaker, M.A., Bioproducts, Walkeville, MD (QCL-1000), on julkaistu (Nachum ja Berzofsky, J. Clin. Microbiology (1985) 759-.*:·. 763) .

/ _ Tämä keksintö antaa käyttöön tarkoituksenmukaisen • 35 seulontamenetelmän, jolla voidaan määrittää 104 gram- ···' negatiivista bakteeria mlrssa laimentamatonta virtsa- 4 85988 näytettä sekä kiinteä faasi -testivälineen, joka on 5 herkkä 10 bakteerille ml:ssa virtsanäytettä.

Kuvio 1 on graafinen estiys tuloksista, jotka saatiin tämän keksinnön mukaista koeputki/testiväline-mene-5 telmää käyttäen. Testiväline valmistettiin käyttäen kro-mogeenistä LAL-substraattia, joka sisältää 3-aminoindo-lin lähtevänä ryhmänä ja väriä stabiloivan polymeerin. Graafinen esitys on tietokoneella saatu käyrä, jossa ref-lektanssi-%, %R, on esitetty aallonpituutta, vastaan. 10 Värin kehittymistä testivälineessä seurattiin 45 sekunnin välein sen jälkeen kun testiväline oli saatettu kosketukseen komponenttiseoksen kanssa, joka oli valmistettu käyttäen negatiivista virtsanäytettä, johon oli lisät- 4 ty 10 Escherichia coli -solua ml kohti.

15 Pisteviiva esittää testivälineen reflektanssia välittömästi kosketukseen asettamisen jälkeen (aika = 0). Katkoviivat esittävät reflektanssia 45 ja 90 minuutin kuluttua. Yhtenäiset viivat, jotka menevät päällekkäin, esittävät reflektanssia 135 ja 225 sekunnin vä-20 Iillä. Välineen reflektanssiprosentti pienenee, kun värin määrä kasvaa. Kuvio 1 osoittaa, että pysyvä väri muodostuu 135 sekunnissa (noin 2 min). Graafinen esitys kuvaa esimerkin 3 tuloksia.

.· Kuvio 2 on graafinen esitys reflektanssimittauk- 25 sen tuloksista, jotka saatiin yksikkömuodossa olevaa kiinteä faasi -välinettä käyttäen. Reflektanssi-% aallonpituudella 405 nm on ilmaistu suhteena K/S, jossa K on absorptiokerroin ja S on sirontakerroin. K/S laskettiin %R:stä Kubelka-Munk-yhtälöä käyttäen. K/S:n arvo 30 kasvaa, kun välineessä kehittyneen värin määrä kasvaa.

K/S on esitetty graafisesti sekuntteina annettua aikaa ·"·.! (t) vastaan. Kun koeputkiseoksen kanssa kosketukseen saatettua testivälinettä oli inkuboitu seitsemän minuu-. tin ajan 37°C:ssa, reflektanssia 405 nm:ssä seurattiin ’ 35 kuuden minuutin ajan. Yksikkömuodossa oleva testiväli-

R

ne valmistettiin esikäsittelemällä paperia Gantrez 5 85988 AN 119 -reagenssilla, GAF Corp., New York, N.Y. ja kyllästämällä esikäsitelty paperi lysaatilla, joka oli saatu Associates of Cape Cod -yhtiöstä, puskurilla ja kaupallisesti saatavissa olevalla p-nitroanilidi-sub-5 straatilla. Liuskat kastettiin bakteereja sisältäviin fysiologisiin suolaliuoksiin. Kuvion 2 yhtenäiset viivat kuvaavat tilannetta, jossa bakteeripitoisuus oli 0; kat- 5 koviivat osoittavat 10 E. coli -bakteeria ml:ssa ja pisteviiva osoittaa 10^ E. coli -bakteeria ml:ssa. Liuskois-10 sa, jotka kastettiin viimeksi mainittuihin näytteisiin, tapahtuu voimakas K/S-arvon tai värin lisäys. Kuvio 2 osoittaa, että yksikkömuodossa olevalla testivälineellä voidaan erottaa negatiiviset näytteet näytteistä, jotka sisältävät 105 gram-negatiivista bakteeria. Graafinen 15 esitys kuvaa esimerkin 4 tuloksia.

Keksintö antaa käyttöön seulontamenetelmän, jolla 4 voidaan määrittää vähintään 10 gram-negatiivista bakteeria ml:ssa virtsanäytettä, yksikkömuodossa olevan 5 testivälineen, jolla voidaan määrittää vähintään 10 20 gram-negatiivista bakteeria mltssa virtsanäytettä, menetelmän välineen valmistamiseksi sekä menetelmän sen käyttämiseksi.

Seulontamenetelmä, jolla voidaan määrittää vä- 4 - hintään 10 gram-negatiivista bakteeria ml:ssa virtsa- , 25 näytettä, muodostuu seuraavista vaiheista (a) lisätään laimentamaton virtsanäyte koeputkeen, joka sisältää mo-lukkiravun amebamaisten solujen lysaattia ja ensimmäisen puskurin, joka pystyy vastustamaan pH-muutosta pH-alueella noin 6,3 - 7,5, jolloin syntyy koeputkiseos, 30 jonka lysaattipitoisuus on vähintään 3,5 mg ml:ssa syntynyttä koeputkiseosta; (b) inkuboidaan koeputkiseosta sellainen aika, joka riittää aktivoimaan lysaatin; (c) : : : saatetaan testiväline kosketukseen aktivoituneen koeput- kiseoksen kanssa testivälineen muodostuessa kantajamat-35 riisistä, johon on kiinnitetty toinen puskuri, joka pystyy vastustamaan pH:n muutosta pH-alueella noin 6 85988 8,0 - 8,9 ja synteettisen peptidisubstraatin, joka sisältää kromogeenisen tai fluorogeenisen lähtevän ryhmän, jonka lysaatti pystyy pilkkomaan; (d) poistetaan testivä-line koeputkesta; ja (e) määritetään pilkotun lähtevän 5 ryhmän pitoisuus. Seulontamenetelmä on suoritukseltaan helppo, halpa ja herkkyydeltään riittävä toteamaan pitoi- 4 suuksia 10 gram-negatiivista bakteeria ml:ssa virtsanäytettä, jota pitoisuutta pidetään kliinisesti merkittävänä, mutta joka usein löydetään oireettomista poti-10 laista.

Keksintö antaa käyttöön myös yksikkömuodossa ole- 5 van kiinteä faasi -testivälineen vähintään 10 gram-ne-gatiivisen bakteerin osoittamiseksi virtsanäytteessä. Yksikkömuodossa oleva kiinteä gram-negatiivisten bak-15 teereiden aiheuttaman bakteriurian kiinteä faasi -seu-lontaväline muodostuu kantajamatriisista ja siihen kiinnitetystä testikoostumuksesta, joka sisältää molukkira-vun amebosyyttisten solujen lysaattia, kaksiarvoisen kationin, synteettisen peptidisubstraatin mukaan lukien 20 kromogeeninen tai fluorogeeninen lähtevä ryhmä, jonka lysaatti pystyy pilkkomaan, puskurikomponentin, joka pystyy vastustamaan pH-muutosta pH-alueella noin 7,5 - 8,5 ja stabiloivan komponentin, joka pystyy stabiloi-··. maan lysaatin. Yksikkömuodossa oleva kiinteä faasi -tes- 25 tiväline on erityisen tarkoituksenmukainen testimuoto ; . suurten väestöryhmien seulomiseen ja sen herkkyys on yh tä suuri kuin tällä hetkellä markkinoilla olevien kal-• liimpien ja hitaampien testimuotojen herkkyys.

Koska bakteriuria on hyvin yleinen väestössä, mo-v 30 nia menetelmiä on kehitetty sen esiintymisen toteamiseksi ja diagnostisoimiseksi. Tällä hetkellä ei ole saa- : tavilla yhtään sellaista bakteriurian seulontamenetel- mää, jonka herkkyys olisi 10 bakteeria ml:ssa laimenta-. matonta virtsanäytettä ja jossa käytettäisiin LAL-kas- 35 kadia ja synteettistä substraattia. Saatavilla ei myös-'··' kään ole sellaista yksikkömuodossa olevaa kiinteä faasi 5 7 85988 -testivälinettä, jolla voitaisiin todeta vähintään 10 gram-negatiivista bakteeria mlrssa laimentamatonta virtsanäytettä ja jossa käytettäisiin hyväksi LAL-kaskadia ja synteettistä substraattia.

5 Määritysmenetelmä bakteriurian toteamiseksi perus tuu molukkiravun amebamaisten solujen lysaatin luonnolliseen entsyymikaskadiin. Molukkiravun amebamaisten solujen lysaatti voidaan saada Limulus- tai Tachypleus-tasku-rapulajeista. Limulus-lajit ovat molukkiravun läntisiä 10 lajeja ja Limulus-lysaatti on helposti saatavissa Associates of Cape Cod -yhtiöstä, Woods Hole, MA. Limulus-lysaatti on edullinen lysaattilähde, koska sen on havaittu olevan tasalaatuista ja se on saatavissa konsentroidussa muodossa, jota voidaan käyttää keksinnössä. Vaik-15 ka lysaattikaskadin on uskottu olevan liian herkkä endo-toksiinille, jotta sitä voitaisiin käyttää bakteriuria-testissä, tämä keksintö antaa käyttöön kaksi testimuotoa, jotka on huolellisesti suunniteltu antamaan positiivinen osoitusreaktio silloin kun virtsanäytteessä 20 esiintyy gram-negatiivisten bakteerien kynnyspitoisuus, jota pidetään osoituksena gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamasta virtsatietulehduksesta.

A. Endotoksiinin normaalit pitoisuudet virtsassa Jotta seulontamenetelmä olisi käyttökelpoinen, sen 25 täytyy tulla positiiviseksi käytettäessä analyytin kyn-; . nyspitoisuutta, joka viittaa mahdolliseen lääketieteel liseen vaivaan, antamatta ei-hyväksyttävän korkeaa määrää vääriä positiivisia koetuloksia. Tavallisesti seulontamenetelmällä saadun positiivisen tuloksen jälkeen 30 tarvitaan seurantatoimenpiteitä. Niinpä seulontamenetelmän hyödyllisyys riippuu sen kyvystä antaa käyttöön nopea, suoritukseltaan helppo ja hinnaltaan edullinen menetelmä ratkaistaessa, milloin kalliimpia testejä tu-.·, lisi suorittaa. Bakteriurian ollessa kyseessä seulonta- *· ; 35 menetelmän täytyy tulla positiiviseksi halutulla pitoi- • suudella gram-negatiivisia bakteereja ml:ssa virtsa- 8 85988 näytettä antamatta väärää positiivista osoitusreaktio-ta silloin, kun näytteessä esiintyy vain normaali pitoisuus näitä bakteereja.

Vaikka sekä instrumentaalisten sameusmittausten 5 5 että gram-värjäysten herkkyys on 10 solua ml:ssa, jotkut 4 lääketieteen asiantuntijat uskovat, että pitoisuus 10 solua ml:ssa osoittaisi jotkut oireettomat potilaat tai potilaat, joiden oireet on vaikea nimetä bakteriuriasta johtuviksi. Näitä potilaita voitaisiin auttaa bakteeri-10 tulehduksen varhaisissa vaiheissa, mutta heidän löytämi-sensä saattaa epäonnistua käytettäessä tällä hetkellä saatavissa olevia seulontamenetelmiä, kuten nitraattia pelkistävien bakteerien (eräs gram-negatiivisten bakteerien luokka) läsnäolon osoittavia nitriittireagenssi-15 liuskoja tai tulehduksen johdosta kehon tuottamia valkosoluja tunnistavia valkosolureagenssiliuskoja.

Nachum ja Berzofsky, J. Clin. Microbiology (1985) 759-763, havaitsivat, että normaali virtsa saattaa sisältää jopa 20 nanogrammaa vapaata endotoksiinia ml:ssa, 3 20 joka pitoisuus viittaisi 10 gram-negatiivisen bakteerin esiintymiseen ml kohti. Geelinmuodostusmääritysmenetel-mällä saadut tulokset tukevat näitä havaintoja. Tämä tausta ei vaikuta tämän keksinnön mukaiseen koeputki/ testiväline-menetelmään eikä yksikkömuodossa olevaan 25 testiväline-testimuotoon. Koeputki/testiväline-testimuo-to suoritetaan olosuhteissa, joissa se ei ole herkkä näille endotoksiinitasoille. Yksikkömuodossa oleva tes-tiväline ei osoita vapaata endotoksiinia.

B. Koeputki/testivälinemenetelmä 30 Tämä keksintö antaa käyttöön bakteeriurian seu- 4 lontamenetelman, joka on herkkä 10 bakteerille ml:ssa laimentamatonta virtsanäytettä. Menetelmässä laimenta-maton virtsanäyte lisätään koeputkeen, joka sisältää ly-. saatin ja ensimmäisen puskurin, putki sekoitetaan ja 35 seosta inkuboidaan sellainen aika, joka tarvitaan akti- ' ’ 4 voimaan lysaatti bakteeripitoisuudelle 10 gram- 9 85988 negatiivista bakteerisolua ml:ssa näytettä. LAL-kaska-din tuottaman hyytymän muodostavan entsyymin muodostumiseen sen jälkeen, kun se on saatettu kosketukseen endo-toksiinin kanssa, viitataan tästä lähtien aktivoitumise-5 na. Testiväline, joka muodostuu kantajamatriisista, johon on kiinnitetty toinen puskuri ja synteettinen peptidi-substraatti, saatetaan kosketukseen aktivoidun koeputki-seoksen kanssa. Sitten testiväline poistetaan ja välineen havaitsema vaste määritetään. Synteettisiä substraat-10 teja, jotka sisältävät fluorogeenisiä tai kromogeenisiä lähteviä ryhmiä, voidaan käyttää. Edullinen havaittava vaste on kuitenkin väri, koskapa kokeen tulos voidaan sitten määrittää joko visuaalisesti tai instrumentaalises-ti reflektanssiin perustuen.

15 Kontrolloimalla lysaatin pitoisuutta, inkuboin- tiaikaa ja inkubointilämpötilaa, määrityksen herkkyys 4 voidaan asettaa 10 bakteeriin ml:ssa virtsanäytettä, ilman että todetaan normaalin taustan bakteeripitoisuus-taso eli 10^ bakteeria. Mielekkäiden tulosten saamisek- 4 20 si 10 solulle tulisi käyttää puhtaastilaskettua, keski- suihkusta otettua virtsanäytettä.

1. Koeputki a) Lysaatti ···. Lysaatti voidaan hankkia kylmäkuivattuna Associ- 25 ates of Cape Cod -yhtiöstä. Lysaatin määrän koeputkessa tulisi olla tarpeeksi korkea, jotta saadaan pitoisuus noin 3,5 - 7 mg lysaattia ml:ssa näytteen koeputkeen lisäyksen jälkeen saatua koeputkiseosta.

b) Kaksiarvoinen kationi 30 Lysaattikaskadin aktivoitumiseen tarvitaan kaksi arvoinen kationi. Kaupallisesti saatavissa olevat ly-- ·; saattivalmisteet sisältävät stabiloivana aineena kalsium- ioneja sellaisen määrän, joka riittää aktivoimaan lysaatin. Valinnaisesti saattaa olla toivottavaa lisätä vie-35 lä toinen kationi. Kaksiarvoinen kationi voi olla kalsium, magnesium, strontium tai mangaani; edullinen 10 85988 kationi on kalsium. Jos käytetään lysaattivalmistetta, joka ei sisällä kationia, siihen tulisi lisätä kaksiarvoinen kationi.

c) Ensimmäinen puskuri 5 Ensimmäisen puskurin tulisi kyetä vastustamaan pH- muutosta pH-alueella noin 6,3 - 7,5. Natrium- tai kalium-fosfaattia voidaan käyttää valmistettaessa aktivointi-vaiheen edullista ensimmäistä puskuria. Tällaisen sopivan ensimmäisen puskurin valinta kuuluu tässä julkaisussa an-10 netun alan asiantuntemuksen piiriin.

2. Testiväline koeputki/testivälinemenetelmälle Testiväline muodostuu kantajamatriisiin kiinnitetystä synteettisestä peptidisubstraatista, joka sisältää kromogeenisen tai fluorogeenisen lähtevän ryhmän, jonka 15 aktivoitunut lysaatti pystyy pilkkomaan irti ja toisesta puskurista, joka pystyy vastustamaan pH-muutosta pH-alueella noin 8,0 - 8,9, kun se joutuu kosketukseen koe-putkiseoksen kanssa. Valinnaisesti matriisiin voidaan kiinnittää myös hapan polymeeri, joka pystyy stabiloi-20 maan pilkotun ryhmän ja/tai kaksiarvoinen kationiryhmä. a) Kantajamatriisi

Kantajamatriisi voi olla mikä tahansa aine, johon voidaan kiinnittää tarvittavat komponentit, kunhan se on oleellisesti inertti näihin komponentteihin nähden 25 sekä huokoinen ja/tai absorboiva virtsanäytteen suhteen. Ilmaisu "kantajamatriisi" viittaa joko imukykyi-siin tai ei-imeviin matriiseihin, jotka ovat liukenemattomia ja jotka säilyttävät rakenteellisen kokonaisuutensa, kun ne altistetaan vedelle tai muulle fysiologisel-30 le nesteelle. Edullinen kantajamatriisi on paperi, tavallisesti korkealaatuinen suodatinpaperi, kuten Whatman-yhtiöstä, Clifton, N.J., saatavissa olevat suodatinpaperit.

/ . Kiinnittäminen voidaan suorittaa millä tahansa 35 menetelmällä, kuten kastamalla, levittämällä tai suihkuttamalla, joka sallii kantajamatriisin yhdistämisen 11 85988 substraattiin tai toiseen puskuriin. Tämä voidaan suorittaa kyllästämällä paperinen kantajamatriisi vesipitoisella liuoksella, joka sisältää substraatin ja toisen puskurin ja kuivaamalla. Kuivaus voidaan suorittaa millä 5 tahansa keinolla, joka ei vaikuta haitallisesti yhdistettyyn koostumukseen, tavallisesti käyttämällä ilmauunia. Sitten kuivattu paperi voidaan leikata ja asettaa tuki-osaan, esimerkiksi jäykän tai puolittain jäykän polysty-reenikalvoliuskan toiseen päähän. Paperin asettaminen 10 polystyreeniin voidaan tehdä käyttämällä kaksipuolista teippiä, kuten 3M Co. -yhtiöstä St. Paul, Minnesota, saatavissa olevat teipit. Tukiosa on tarkoituksenmukainen kahva, joka helpottaa testin käyttöä, b) Synteettinen substraatti 15 Vaikka luonnollisen kaskadin päätepisteen, hyyty misen, muodostumista onkin käytetty bakteriurian toteamisessa, kvantitatiivisia tuloksia saadaan tällöin- vain käytettäessä kallista laitetta, joka mittaa valon sirontaa. Tämän laitteen kalleudesta johtuen tällä hetkellä 20 saatavissa olevat testimenetelmät eivät sovi rutiiniseulontaan. Lisäksi valonsirontamenetelmän herkkyyden on 5 raportoitu olevan 10 solua ml:ssa.

On toivottavampaa käyttää synteettistä substraattia, jonka avulla saadaan helposti erottuva kolorimetri-25 nen tai fluorometrinen päätepiste. Lukuisia kromogeeni-siä tai fluorogeenisiä LAL-substraatteja on kaupan en-dotoksiini-LAL-määritysmenetelmissä käytettäväksi ja niitä voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa seulontamenetelmässä.

‘ 30 LAL-määritysmenetelmiin sopivia fluorogeenisiä substraatteja, jotka sisältävät N-metyylikumariinin läh-tevänä ryhmänä, on saatavissa Peninsula Labs -yhtiöstä, '· Belmont, Kalifornia. Näitä voidaan käyttää virtsanäyt- .· . teille, sillä virtsan luonnollinen fluoresenssitausta / 35 on liian matala häiritäkseen merkittävästi vaaditulla kokeen herkkyydellä.

i2 85988

Kromogeeniset synteettiset substraatit ovat erityisen edullisia,sillä väri voidaan määrittää joko suhteellisen yksinkertaisella, halvalla laitteella tai vielä mukavammin visuaalisesti vertaamalla tulosta käyttä-5 jälle annettuihin sopiviin värikarttoihin. Ainoat kaupallisesti saatavissa olevat kromogeeniset substraatit sisältävät lähtevänä ryhmänä/»-nitroanaliinin, joka tuottaa keltaisen värin, kun aktivoitu lysaatti pilkkoo sen irti. Yllättäen huolimatta saadusta keltaisesta päätepis- 10 teestä näitä /O-nitroanaliinia sisältäviä substraatteja on onnistuneesti käytetty toivotun herkkyyden saavuttamiseksi virtsanäytteille koeputki/testiväline-testimuo-dossa. Koska kliiniset virtsat, esim. virtsat, joiden ominaispaino on suuri, voivat kuitenkin olla hyvin vä- 15 rillisiä, on edullista käyttää synteettisiä substraatteja, joilla saadaan muu kuin keltainen väri.

Käyttökelpoisilla kromogeenisilla substraateilla on yleinen kaava:

20 B-(A1)n-A2-Gly-Arg-I

jossa a) n on luku 0 tai 1; ·· b) A^ on väliini tai leusiini; 25 c) A2 on leusiini tai seriini; d) Gly on glysiini; e) Arg on arginiini? f) B on terminaalisen aminohapon estävä ryhmä; ja g) I on kromogeeninen indikaattoriryhmä.

30 Estävät ryhmät t-butyylioksikarbonyyli, asetyyli, bentsoyyli tai tosyyli ovat edullisia,t-butyylioksikar-bonyylin (tBOC) ollessa erityisen edullinen. Muita vas-;'· taavia aminohapposekvenssejä voidaan käyttää, mutta yleensä sellaiset aminohapposekvenssit, joissa on gly-" 35 siini-arginiinisekvenssi pilkkoutuvan lähtevän ryhmän ' ·· vieressä, ovat edullisia.

“ 85988

Edullisia kromogeenisiä indikaattoriryhmiä ovat ne, joissa I on 1^ tai I2, joilla on kaavat: R1 (I1) /3> ^ (I2’ 10 joissa a) Y on hydroksyyli- tai amidoryhmä; b) X on rikki, typpi tai happi; c) R^ on alempi alkyyli-, aryyli-, amido- tai syaaniryhmä; ja 15 d) R2 voi olla yksi tai useampi substituentti, joko sama tai eri, kuten vety, alempi alkyyli, aryyli tai edullisesti elektroneja puoleensa vetävä ryhmä, kuten kloori, nitro ja vastaava.

Indikaattoriryhmä liitetään arginiiniin Y:n kautta, 20 jolloin muodostuu amidi- tai esterisidos, joka voidaan katkaista lysaatin aktivoitumisessa syntyvän hyytymän muodostavan entsyymin avulla.

Alemmat alkyyliryhmät ovat alkyyliryhmiä, jotka ... sisältävät 1-4 hiiliatomia. Alempiin alkyyleihin kuuluvat 25 metyyli-, etyyli-, n-propyyli-, isopropyyli-, n-butyyli-, ; / sek-butyyli- ja tert-butyyliryhmät. Ryhmät voivat olla substituoituja tai substituoimattomia edellyttäen, etteivät substituutiot häiritse amidi- tai esterisidoksen ent-" symaattista katkaisua.

30 Termillä "aryyli" on synteettisten orgaanisten ke mistien hyvin tuntema normaali merkityksensä, tämä tar-koittaa, että se on orgaaninen radikaali, joka saadaan . aromaattisesta hiilivedystä poistamalla yksi atomi, • esimerkiksi bentseenistä saatu fenyyli. Tällainen subs- 35 tituentti voi myös olla substituoitu tai substituoima-.··' ton edellyttäen, etteivät mitkään substituentit häiritse 14 85988 hyytymän muodostavan entsyymin suorittamaa esteri- tai amidisidoksen katkaisua. Nämä substraatit ovat yleensä arginiinispesifisten proteaasien substraatteja. Tällaisten proteaasien pitoisuus virtsassa on kuitenkin niin ma-5 tala, ettei se häiritse bakteriuriatestin herkkyyttä.

Erityisen edullinen kromatogeeninen substraatti on t-BOC-Leu-Gly-Arg-NH-r-ji^^l

10 I

H

jossa indikaattoriryhmä I ja liittävä ryhmä Y muodostavat 3-aminoindolin.

15 Kun 3-aminoindoli-substraattia käytetään, testivä- lineeseen tulee yhdistää kytkevä komponentti, jotta saadaan kolorimetrinen vaste. Sopivia kytkeviä komponentteja ovat diatsoniumyhdisteet, kuten 2-metoksi-4-morfolii-nobentseenidiatsoniumkloridi, 2,4-diklooribentseenidiat- 20 sonium, 2,6-diklooribentseenidiatsonium, 5-kloori-2-me-toksibentseenidiatsonium (Fast Red RC) ja 2,3'-dimetyyli-atsobentseenidiatsonium (Fast Garnet GBC). Diatsosuola 2-metoksi-4-morfoliinobentseenidiatsoniumkloridi on edullinen. Näin valmistettu testiväline tämän keksinnön mu- 25 kaisesti käytettynä muuttui vaaleanpunaiseksi, kun 4 virtsanäyte sisälsi 10 bakteerisolua ml:ssa. Kun bak-teeripitoisuus oli 10° solua ml:ssa, väri tuli viininpunaiseksi.

d) Toinen puskuri 30 Toisen puskurin tulee kyetä vastustamaan pH-muu- ; ] tosta pH-alueella noin 8,0 - 8,9. Edullinen puskuri on tris(hydroksimetyyli)aminoraetaani (joka yleisesti tunnetaan TRIS:nä).

e) Hapan polymeeri ".· 35 Jotta saataisiin pysyvän värin omaava testi käy- : tettäessä koeputki/testivälinemenetelmää, voidaan is 85988 pilkotun lähtevän ryhmän stabiloiva hapan polymeeri kiinnittää kantajamatriisiin. Sopivia yhdisteitä ovat esimerkiksi metyylivinyylieetteri ja maleiinihappo, jotka ovat

O

saatavissa kauppanimellä GANTREZ GAF-yhtiöstä, New York, 5 N.Y. Kun käytetään edullista 3-aminoindolisubstraattia p diatsoniumsuolan kanssa GANTREZ :llä esikäsitellyssä pa-perikantajassa, saadaan purppuranpunainen päätepiste, joka säilyy päiviä.

f) Kaksiarvoinen kationi 10 Valinnaisesti voidaan kantajaan kiinnittää vielä toinen kaksiarvoinen kationi. Myös tässä vaiheessa voidaan käyttää samanlaisia kationeja kuin lysaatin akti-vointivaiheessa käytetyt kationit. Kalsiumioni on edullinen.

15 3. Käyttö

Pieni määrä puhtaastilaskettua, keskisuihkusta otettua virtsanäytettä lisätään koeputkeen, joka sisältää ensimmäisen puskurin ja riittävästi lysaattia, jotta lysaatin loppupitoisuudeksi saadaan noin 3,5 - 7 mg 20 ml:ssa muodostuvaa koeputkiseosta. Koeputkiseosta in-kuboidaan sellainen aika, joka tarvitaan lysaatin aktivoitumiseen ja aikaisemmin kuvatulla tavalla kiinnitetty testiväline saatetaan kosketukseen inkuboidun seoksen kanssa. Kosketukseen saatettu testiväline poiste-25 taan ja pilkotun lähtevän ryhmän pitoisuus määritetään joko visuaalisesti tai instrumentaalisesti. Normaaleja steriilejä toimenpiteitä käytetään, mutta näytettä ei tarvitse esikäsitellä.

Tarvittava aktivointiaika riippuu toivotusta tes-30 tin herkkyydestä. Testi, jonka herkkyys on 10^ bakteeria ml:ssa näytettä, vaatii pidemmän inkubointiajän • : 5 * · kuin vain 10 bakteerille herkkä testi. Aktivointiaika ei kuitenkaan saa olla niin pitkä, että herkkyys ulot-.1 tuu taustakontaminaatiotasolle. Aktivoituminen tapahtuu 35 nopeammin kohotetuissa lämpötiloissa kuin huoneen lämpö-.*. : tilassa. Esimerkiksi käytettäessä Associates of Cape ie 85988

Cod -yhtiöstä saatua lysaattia aktivointiin tarvitaan 15 minuutin inkubointi 37°C:ssa tai 45 minuutin inku- bointi huoneen lämpötilassa (25°C), jotta saadaan testi, 4 joka on herkkä 10 E. coli -bakteerille ml:ssa laimenta- 5 5 matonta virtsaa. Määritysmenetelmä, joka on herkkä 10 solulle ml:ssa virtsaa, saadaan käyttäen 30 minuutin in-kubointiaikaa 25°C:ssa. Herkkyydeltään halutunkaltaisen testin saamiseksi tarvittavan ajan ja lämpötilan määrittäminen kuuluu tässä julkaisussa annetun alan asiantunte-10 muksen piiriin.

Pilkotun lähtevän ryhmän pitoisuus voidaan määrittää 2-5 minuutin kuluttua siitä, kun testiväline on saatettu kosketukseen aktivoidun koeputkiseoksen kanssa.

Kun 3-aminoindolisubstraatti ja diatsoniumyhdiste kiin-15 nitetään kantajaan, jota ei esikäsitelty lähtevää 3-ami-noindoliryhmää stabiloivalla aineella, muodostunut väri voidaan stabiloida kastamalla reagoinut testiväline 25 % (tilavuus-%) etikkahappoliuokseen.

Koeputki/testiväline-testimuoto antaa käyttöön 20 virtsanäytteessä olevien gram-negatiivisten bakteerien suhteen herkemmän testin kuin markkinoilla olevat testit. Lisäksi testi voidaan suorittaa alle tunnissa silloinkin, kun inkubointi suoritetaan huoneen lämpötilassa .

25 B. Yksikkömuodossa oleva kiinteä faasi-testiväline

Voidaan valmistaa LAL-määritysmenetelmän synteettisen substraatin sisältävä, yksikkömuodossa oleva kiinteä faasi-testiväline, jolla on sama herkkyys bakteri-urialle (103 solua ml:ssa virtsaa) kuin tällä hetkellä 30 saatavissa olevilla menetelmillä, joissa käytetään LAL-geelinmuodostusmääritysmenetelmää ja jotka vaativat kalliin laitteiston. Yksikkömuodossa oleva testiväline muodostuu kantajamatriisista, johon on kiinnitetty testi-: koostumus, joka sisältää lysaatin, kaksiarvoisen katio- : : ‘ 35 nin, synteettisen substraatin, puskurikomponentin ja ly- ,·. · saattia stabiloivan komponentin. Yksikkömuodossa oleva i7 85988 testiväline-testimuoto antaa käyttöön nopean, suoritukseltaan helpon ja halvan testin, joka sopii erityisesti suurten populaatioiden seulontaan.

Kantajamatriisi voi olla mikä tahansa aikaisemmin 5 kuvatuista kantajamatriiseista, kunhan se pystyy sitomaan riittävästi reagensseja, erityisesti lysaattia, jotta saadaan herkkyydeltään halutunlainen testi. Imukykyiset matriisit, erityisesti paperi, ovat edullisia. Matriisin kiinnittäminen ja kuivaus voidaan suorittaa millä tahan-10 sa aikaisemmin kuvatulla tavalla. Kiinnitettävän liuoksen lysaattipitoisuus noin 15 mg ml:ssa (mg/ml) on edullinen. Erityisen mielenkiintoinen piirre yksikkömuodossa olevassa testivälineessä, jossa käytetään paperimat-riisia, on se, ettei sillä saada vastetta vapaalle endo- 5 15 toksiinille, mutta että se on herkkä 10 gram-negatiivi-selle bakteerille ml:ssa virtsaa. Tämä poikkeavuus tuo esiin vaikeuden muuttaa tällä hetkellä saatavissa olevat endotoksiinimääritysmenetelmä-testimuodot yksikkömuodossa olevaan kiinteään kiinteä faasi -testiväline-testi-20 muotoon.

Lysaatti, kaksiarvoinen kationi ja synteettinen substraatti on kuvattu aikaisemmin. Edullisia synteettisiä substraatteja ovat ne aikaisemmin julki tuodut kaupallisesti saatavissa olevat synteettiset substraatit, 25 joissa käytetään ^o-nitroaniliinia lähtevänä ryhmänä.

Jotta saadaan yksikkömuodossa oleva testiväline, mukana : on puskurikomponentti, joka pystyy vastustamaan pH-muu- tosta pH-alueella noin 7,5 - 8,5, edullisesti 7,5 - 8,0. Tris(hydroksimetyyli)diaminometaani on edullinen pusku-. 30 rikomponentti.

Yllä mainittujen testikomponenttien lisäksi, kun kaikki LAL-kromogeeniseen testiin tarvittavat komponentit on kiinnitetty kantajamatriisiin, kuten paperiin, • on tarpeen lisätä stabiloiva aine, joka stabiloi lysaa- '·1 ‘ 35 tin proentsyymit. Tämä stabiloiva komponentti voi olla * ·/.· neutraali tai negatiivisesti varattu polymeeri ja se · is 85988 voi olla gelatiini, metyylivinyylieetterin ja maleiini-happoanhydridin sekapolymeeri tai etyleeniglykolin ja iso-oktyylifenyylieetterin polymeeri. Sekapolymeerejä voidaan kuvata rakenteella: 5

H R

--1 =C CH —CH--

Λ A

, n O V o 10 L. _In jossa R on C^-C^g-alkyyli, eetteri, asetaatti tai bent-syyli ja n on luvun kaksi ja polymeerin toistuvien yksikköjen kokonaislukumäärän välillä oleva luku. Edullinen se-15 kapolymeeri on poly(metyylivinyylietoksimaleiinihappoan-hydridi), joka on saatavissa GAF-yhtiöstä, New York, New p

York, kauppanimellä Gantrez . Polyetyleeniglykoli-/J-iso-oktyylifenyylieetteriä voidaan kuvata rakenteella: 20 CH3 _

CH3C(CH3) 2CH2 - C —^ (CH2CH2°* XH

ch3 25 Edullinen polyetyleeniglykoli-/0-iso-oktyylifenyylieette- ... p ‘ ri on saatavissa kauppanimellä Triton X-100 Rohm % Haas -yhtiöstä, Philadelphia, PA. Stabiloiva komponentti kiin-:Y. nitetään paperimatriisiin edullisesti ennen lysaatin .t. kiinnittämistä.

. .·. 30 Käytettäessä yksikkömuodossa oleva testiväline kastetaan laimentamattomassa virtsanäytteessä. Sitten yksikkömuodossa olevaa testivälinettä inkuboidaan 37°C:ssa suljetussa astiassa 15-20 minuuttia, edulli-'· sesti yhdessä negatiivisen kontrollin kanssa. Kuten ai- ’ 35 kaisemmin on osoitettu, inkuboinnin kestoa ja lämpöti- **.; laa voidaan vaihdella. Kuitenkin 37°C:n lämpötila on • · i9 85988 edullinen verrattuna alempaan, esimerkiksi 25°C:n lämpötilaan. Mikä tahansa väriaste, joka on suurempi kuin kontrollin, ilmoittaa positiivisen näytteen. Väri voidaan stabiloida myöhempää luentaa varten kastamalla liuska 25 5 tai 50 % (tilavuus-%) etikkahapossa. Normaaleja steriilejä toimenpiteitä käytetään, mutta näytteen esikäsittelyä ei tarvita. Näytteen tulisi olla puhtaasti laskettu, kes-kisuihkusta otettu virtsanäyte. Yksikkömuodossa olevalla testivälineellä ei saada vastetta vapaalle endotoksiinil- 5 10 le vesipitoisessa liuoksessa, vaikka se erottaakin 10 bakteeria sisältävän näytteen negatiivisesta näytteestä.

Seuraavat esimerkit kuvaavat suoritettuja kokeita. Samalla kun esimerkit valaisevat keksintöä, niitä ei tule tulkita sen piiriä rajoittaviksi, jonka piirin mää-15 rittelevät vain patenttivaatimukset. Alan asiantuntija voi tehdä koostumuksen komponentteihin ja reaktiopara-metreihin sellaisia muunnoksia, substituutioita ja muutoksia, jotka tuntuvat toivotuilta.

V. Esimerkit 20 Seuraavat lyhenteet ovat käytössä: g gramma mmol millimoolia mM millimoolia litrassa ml millilitra 25 ^ul mikrolitra °C astetta Celsiusta sp. sulamispiste t-BOC tert.butyylioksikarbonyyli DMF dimetyyliformamidi 30 Arg arginiini

Leu leusiini

Gly glysiini L- vasemmalle kiertyvä MS massaspektrometriä 35 FAB pommitus nopeilla atomeilla (MS:ää varten) 20 85988 2 2 /οζ/ρ optinen kierto 22°C:ssa natriumin D-viivan aallon pituudella 589,8 nm CBz karbobentsyylioksi kPa kiloPascal (6,85 kPa:ta vastaa painetta 0,074 ki- 5 logrammaa kuutiosenttimetriä kohti) 1. Vakioiden valmistus E. coli -vinopintaviljelmät saatiin Miles Laboratories Inc. -yhtiön Ames Division -osaston laadunvarmis-tusosastosta (Quality Assurance Department). Ravintolie-10 mi (10 ml) siirrostettiin E. coli -bakteereilla ja sitä inkuboitiin 37°C:ssa 16-18 tunnin ajan. Tämä kasvuaika tuottaa tavallisesti noin 101 E. coli -bakteeria ml:ssa kantalientä. Varsinainen E. coli -pitoisuus määritettiin laimentamalla liemi 7- ja 8-kertaisesti ja sivelyvilje-15 lemällä 100 ^,ul kumpaakin laimennosta veriagarlevyillä. Koska jokainen organismi tuottaa yhden pesäkkeen, 100 ^ulissa laimennosta olevien organismien lukumäärä saadaan laskemalla agarille muodostuvat pesäkkeet yli yön 37°C:ssa inkuboinnin jälkeen.

20 Kvantitoitua kantalientä käytettiin sopivien E. coli -laimennosten valmistamiseksi LAL-määritystä varten ja se käytettiin viikon kuluessa. Tämä toimenpide varmisti sen, että kantaliemessä oleva vakiomäärä vapaata endotoksiinia on vähentynyt kasvun ja/tai solu-25 jen kuolemisen aikana.

2. Edullisen kromogeenisen substraatin valmistus

Kaikki käytetyt aminohapot olivat vasemmalle kiertyvässä konfiguraatiossa.

3-aminoindoli (I) 30 Jäähdyttäjällä, kuivausputkella ja lisäsuppilol- la varustettua 250 ml:n pyöreäpohjäistä pulloa huuhdottiin argonilla 15 minuutin ajan. Sitten pyöreään pulloon laitettiin natriumia (1,3 g, 57 mmol, äskettäin pieniksi paloiksi leikattuna) ja 10 yUl vedetöntä etano-35 lia, jonka jälkeen seokseen lisättiin tipoittain 9 ml vedetöntä etanolia. Kun vedettömän etanolin lisäys oli 2i 85988 tehty ja reaktioseoksen vähäinen refluksoituminen oli rauhoittunut, reaktioseosta kuumennettiin varovasti ref-luksoiden 15 minuutin ajan. Sitten kuumennuslähde poistettiin ja indoli (5 g, 45 mmol) lisättiin. Reaktioseos-5 ta sekoitettiin, kunnes kaikki indoli oli liuennut. Seokseen lisättiin tipoittain isoamyylinitriittiä (12 ml, 89 mmol), joka oli kuivattu vedettömän kaliumkarbonaatin päällä ennen käyttöä, 30 minuutin kuluessa. Reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla yli 10 yön.

Reaktioseos konsentroitiin alkoholin poistamiseksi ja tislattua vettä (100 ml) lisättiin. Saatu seos kuumennettiin kiehuvaksi. Argonin alla siihen lisättiin tipoittain liuosta, joka sisälsi kaliumhydroksidia 15 (30 g, 540 mmol) ja natriumditioniittia (23 g, 132 mmol) 125 mlzssa tislattua vettä. Tummanvihreä kiinteä aine alkoi saostua ja liuoksen väri muuttui vaaleammaksi ja lopulta keltaiseksi. Kun seokseen oli lisätty kalium-hydroksidi/natriumditioniitti-liuos, siihen lisättiin 20 100 ml tislattua vettä ja reaktioseosta kuumennettiin kiehauttaen 10 minuutin ajan.Tummanvihreä kiinteä aine suodatettiin kuumasta liuoksesta argonin alla. Levyn muotoisia keltaisia kiteitä saostui keltaisesta suodoksesta sen jäähtyessä argonin alla. Keltaiset kiteet otettiin 25 talteen ja uudelleenkiteytettiin kuumasta vedestä, jol-' ' loin saatiin vaaleanruskeita neulaskiteitä, I, 2,7 g (48 %:n saanto), sp. 120°C (muuttui tummaksi), MS (FAB, M+ = 132, 100 %).

t-BOC-L-Leu-Gly (II) 30 Liuos, joka sisälsi t-BOC-L-leusiinia (5 g, 20 mmol) ja N-hydroksisukkinimidiä (2,3 g, 20 mmol) 25 moolissa vedetöntä dimetyyliformamidia, jäähdytettiin jää-hauteessa argonin alla. Liuokseen lisättiin disyklohek-- syylikarbodi-imidiä (4,5 g, 22 mmol) ja reaktioseosta . ' 35 sekoitettiin jäähauteessa kolmen tunnin ajan. Liuos, jo ka sisälsi glysiiniä (1,5 g, 20 mmol) ja natriumbikarbo- 22 85988 naattia (3,4 g, 400 mmol) 48 ml:ssa tislattua vettä, li-sättiin seokseen ja saadun seoksen annettiin hitaasti lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä sekoitettiin yli yön. Valkoinen, kiinteä aine saostui, liuos suodatettiin ja 5 suodoksen pH säädettiin pH 3:ksi 6-normaalisella kloori-vetyhapolla. Sitten liuos uutettiin kahdesti etyyliasetaatilla. Etyyliasetaattiuutos kuivattiin vedettömän magnesiumsulfaatin päällä ja konsentroitiin ensin pyörö-haihduttimessa ja sitten korkeassa vakuumissa. Konsen-10 traatista saatiin 8 g:n öljyjäännös. Flash-kromatogra-fian, jossa käytettiin 170 g silikageeliä ja CH^OH/NH^OH-seosta (80:20:2 tilavuusosuuksina) eluointi-liuottimena, jälkeen saatiin 2,73 g valkoista kiinteää t-BOC-L-Leu-Gly:n ammoniumsuolaa. Noin 2,3 g ammonium-15 suolaa liuotettiin 20 ml:aan tislattua vettä ja liuoksen pH säädettiin pH 3:ksi 6-normaalisella kloorivetyha-polla. Vapaa happo uutettiin kahdesti etyyliasetaatilla (kaikkiaan 100 ml). Etyyliasetaattiliuos kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä, konsentroitiin ja tuotteeksi 20 saatiin 2,1 g valkoista, kiinteää ainetta, II, sp. 116 -117,5°C, MS (FAB, M + 1 = 289), = -28,2° (C = 1,15, CH3OH).

Analyysi yhdisteelle C13H24N2°5:

Laskettu: C 54,15 H 8,39 N 9,71 25 Saatu: C 54,26 H 8,37 N 9,62

Noc-CBz-N^,-nitro-L-Arq-3-indolyyliamidi (III)

Liuos, joka sisälsi Ncj-CBz-Nw-nitro-L-arginiinia (13,4 g, 37,8 mmol) ja trietyyliamiinia (5,3 ml, 37,8 mmol) 82 ml:ssa vedetöntä dimetyyliformamidia, jäähdy-30 tettiin -20°C:seen metanoli-kuiva jää-hauteessa argonin alla. Liuokseen lisättiin isobutyyliklooriformaattia (5 ml, 37,8 mmol) ja reaktioseosta sekoitettiin -20°C:ssa . . 45 minuutin ajan. Sitten seokseen lisättiin 3-aminoindo- lia (2,80 g, 21,2 mmol) ja saadun seoksen annettiin hi-35 taasti lämmetä huoneen lämpötilaan ja seosta sekoitet- ·. tiin yli yön. Reaktioseokseen lisättiin tislattua vettä 23 85988 ja 5 % natriumbikarbonaattia lisättiin, kunnes saavutettiin pH 9. Sitten liuos uutettiin kahdesti etyyliasetaatilla (250 ml). Etyyliasetaattiuutos kuivattiin vedettömän magnesiumsulfaatin päällä ja konsentroitiin, jolloin 5 saatiin ruskeankeltainen öljyjäännös, öljystä ajettiin flash-kromatografia käyttäen 170 g silikageeliä ja CH2CI2/ CH^OH-seosta (95:5 tilavuusosuuksina) eluutioliuottimena. Uudelleenkiteytys C^C^/CH^OH-seoksesta tuotti 5,18 g (53 %) valkoisia kiteitä. III, sp. 202-203°C, MS (FAB, 10 M + 1 = 468), ΛΧ7^2 = +13,1 (C = 1,08, DMF) .

Analyysi yhdisteelle C22H25N7°5:

Laskettu: C 56,52 H 5,39 N 20,97 Saatu: C 56,32 H 5,40 N 20,77 L-Arg-3-indolyyliamidi « 2HOAc (IV) 15 Na-CB-Nw-nitro-L-Arg-3-indolyyliamidi (0,93 g, 20 mmol) liuotettiin 25 ml:aan vedetöntä etanolia ja 25 ml:aan jääetikkaa kuumentaen seosta varovasti, jolloin saatiin vaaleankeltainen liuos. Sitten liuokseen lisättiin 10 % palladium-hiili-katalyyttiä (Pd/C, 500 mg) 20 ja seos hydrogenoitiin 345 kPa:n (3,52 kilogrammaa kuutiometriä kohti) vetykaasun paineessa 15 tunnin ajan.

Seos suodatettiin ja suodos konsentroitiin, jolloin saatiin vaaleanvihreä öljyjäännös. Flash-kromatografiän, jossa käytettiin 63 g silikageeliä ja CH2Cl2/CH,jC)H-seos-25 ta (1:1, tilavuusosuuksina) eluoivana liuottimena, jälkeen saatiin 300 mg vaaleanruskeaa kiinteää ainetta IV.

(37 %:n saanto) · MS (FAB, M + 1 = 289).

: : : Analyysi yhdisteelle C^^H2QNgO·2HOAc·3H20: : Laskettu: C 46,75 H 7,41 N 18,17 - ;·; 30 Saatu: C 46,73 H 7,12 N 17,93 t-BOC-L-Leu-Gly-L-Arq-3-indolyyliamidi (V)

Liuos, joka sisälsi t-BOC-L-Leu-glysiiniä (158 mg, . . 0,55 mmol) ja trietyyliamiinia (0,077 ml, 0,55 mmol) 1,6 ml:ssa vedetöntä dimetyyliformamidia, jäähdytettiin 35 -20°C:seen metanoli-kuiva jää-hauteessa argonin alla. t Liuokseen lisättiin isobutyyliklooriformaattia (0,070 ml, 24 85988 0,55 mmol) ja saatua reaktioseosta sekoitettiin -20°C:ssa 25 minuutin ajan. Seokseen lisättiin liuos, joka sisälsi L-Arg-3-indolyyliamidi·2HOAc (200 mg, 0,48 nunol) ja tri-etyyliamiinia (0,070 ml, 0,49 mmol) 1,1 ml:ssa vedetöntä 5 dimetyyliformamidia ja saadun reaktioseoksen annettiin hitaasti lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä sekoitettiin yli yön. Reaktioseokseen lisättiin tislattua vettä ja liuoksen pH säädettiin pH 7,2:ksi 5 %:lla natriumhydrok-sidilla. Sitten liuos konsentroitiin, jolloin saatiin 10 öljyjäännös, josta flash-kromatografiaa käyttäen CH^^/ CH3OH/NH4OH-seosta (80:20:5 tilavuusosuuksina) eluutio-liuottimena ja uudelleenkiteytyksen CH30H/H20-seoksesta jälkeen saatiin 200 mg valkoista, kiinteää ainetta V (67 %:n saanto), sp. 125°C (pehmenee), MS (FAB, M + 1 = 15 559), = 25,2 (C = 1,06, CH^OH) , korkeaerotuksinen massaspektri (high resolution mass spectrum) (positiivinen ioni -mode)

Laskettu yhdisteelle: C^H^NgOg + 1 = 559,33559 Saatu: 559,33563 20 3. Koeputki/testiväline-formaatti

Koeputki, joka sopii koeputki/testivälinemenetelinään, jossa käytetään 100^ul:n virtsanäytettä, valmistettiin lisäämällä putkeen 50 ^ul 100 mmol/1 fosfaattipuskuria ja 1,7 mg lysaattia, joka oli hankittu Associates 25 of Cape Cod -yhtiöstä. Woods Hole, MA. Whatman 31 ET -paperi kastettiin 2 % (w/w) vesipitoiseen Gantrez AN-119 -liuoksessa, joka oli hankittu GAF-yhtiöstä, New York, N.Y. ja joka oli puskuroitu välille pH 8 ja 9 tris(hydroksimetyyli)aminometaanilla. Sitten paperia kui-30 vattiin ilmauunissa 50°C:ssa 10 minuutin ajan. Kuivattu, - esikäsitelty paperi kastettiin liuoksessa, joka oli pus kuroitu pH 8,7:ään ja joka sisälsi 10 mmol/1 kalsiumio-; nia, 1 mmol/1 indolisubstraattia (V) ja 0,24 mmol/1 I..’ 2-metoksi-4-morfoliinobentseenidiatsoniumkloridia. Kah- 35 desti kiinnitetty paperi kuivattiin taas 50°C:ssa.

25 85988 100 yul:n näyte puhtaastilaskettua virtsanäytettä laitettiin koeputkeen ja muodostunutta koeputkiseosta inkuboitiin 37°C:ssa 15 minuutin ajan. Testiväline, joka oli muodostettu kiinnittämällä palanen kahdesti kuivattua 5 ja kyllästettyä paperia kahvana käytettyyn muoviseen tukijaan, kastettiin inkuboidussa koeputkiseoksessa ja poistettiin siitä. Kahden minuutin kuluttua testivälineen saattamisesta kosketukseen seoksen kanssa, reagoineen testivälineen kehittynyt väri luettiin. Tulokset on esitet- 4 10 ty graafisesti kuviossa 1. Testimuoto voi havaita 10 solua ml:ssa. Testivälineen väri oli tummemman purppuranpunainen, kun E. coli -pitoisuus kasvaa 10^ soluun ml kohti. Värin kehittyminen pysähtyi oleellisesti noin kahden minuutin kuluttua. Vastaavanlaisia tuloksia saatiin, 15 kun koeputkiseosta inkuboitiin 25°C:ssa (huoneen lämpötilassa) 45 minuutin ajan. Vastaava herkkyys saatiin käytettäessä Eaton and Dikeman 205 -paperia kantajana.

4. Yksikkömuodossa oleva kiinteä faasi -testiväline 20 Yksikkömuodossa oleva kiinteä faasi -testiväline, 5 jonka herkkyys on vähintään 10 solua ml:ssa virtsaa, valmistettiin seuraavalla tavalla. Eaton and Dikeman 205 p -paperi kastettiin 2-%:isessa GANTREZ AN 119 -liuoksessa, joka oli hankittu GAF-yhtiöstä, New York, N.Y. ja 25 jonka pH oli säädetty noin pH 7,5:ksi natriumhydroksi-dilla. Esikäsiteltyä paperia kuivattiin 50°C:ssa ainakin 10 minuutin ajan. Lysaattiliuos valmistettiin liuot-tamalla lysaatti (pyrotell, joka oli hankittu Associates ·;· of Cape Cod -yhtiöstä) 50 mmol/1 tris-puskurilla noin . 30 pH 7,8:aan puskuroituun vesipitoiseen liuokseen. Liuos • ·_ sisälsi myös noin 1,1 mmol/1 Spectrozyme LAL -substraat tia, joka oli hankittu American Diagnostica -yhtiöstä, Greenwich, CT. Spectroenzyme on tripeptidi, jossa on • · /O-nitroaniliini lähtevänä ryhmänä (asetyyli-D-heksahyd- 35 rotyrosiini-glysiini-argiini-/0-nitroaniliini) . Pyrotell-valmiste sisältää kalsiumionin ja muita stabiloivia ai-neita.

26 85988

Kuivattu, esikäsitelty paperi kastettiin lysaattiliuok-sessa ja kuivattiin uudelleen 50°C:ssa noin 10 minuutin ajan. Kahdesti kuivattu ja kiinnitetty paperi leikattiin pieniin liuskoihin ja kiinnitettiin polystyreenitu-5 keen kaksipuolisella teipillä. Väline saatettiin kosketukseen virtsanäytteen kanssa, poistettiin näytteestä, inku-boitiin 37°C:ssa noin 15 minuutin ajan ja reflektanssilu-kema otettiin. Kuviossa 2 esitetyt tulokset osoittavat, että yksikkömuodossa oleva testiväline pystyy erottamaan 10 näytteen, joka sisältää 10^solua ml kohti, negatiivisesta näytteestä. Samanlaiset tulokset saatiin käytettäessä Mallinkrodt'n substraattia Color Lysate Chemistry -testi-pakkauksesta .

Kokeet, joissa yritettiin käyttää testivälinettä 15 liuoksiin, jotka sisälsivät vain vapaata endotoksiinia, osoittivat, ettei yksikkömuodossa oleva testiväline ole herkkä vapaalle endotoksiinille.

On selvää, että julkaistuun keksintöön voidaan tehdä monia muunnoksia poikkeamatta keksinnön hengestä 20 tai piiristä.

Claims (10)

1. 27 859 88
2. 1. Seulontamenetelmä gram-negatiivisille bakteereille vähintään 104 gram-negatiivisen bakteerisolun 5 ml:ssa virtsanäytettä määrittämiseksi, tunnettu siitä, että siinä on seuraavat vaiheet: (a) lisätään testattava laimentamaton virtsanäyte koeputkeen, joka sisältää molukkiravun amebamaisten solujen lysaatin ja ensimmäisen puskurin, joka pystyy vastus- 10 tamaan pH-muutosta pH-alueella noin 6,3 - 7,5, jolloin saadaan koeputkiseos, jossa lysaattipitoisuus on vähintään 3,5 mg ml:ssa muodostunutta koeputkiseosta; (b) inkuboidaan koeputkiseosta sellainen aika, joka tarvitaan lysaatin aktivoimiseksi; 15 (c) saatetaan testiväline kosketukseen aktivoidun koeputkiseoksen kanssa mainitun testivälineen muodostuessa kantajamatriisissa, johon on kiinnitetty synteettinen peptidisubstraatti, joka sisältää kromogeenisen tai fluo-rogeenisen lähtevän ryhmän, jonka aktivoitunut lysaatti 20 pystyy pilkkomaan irti sekä toinen puskuri, joka pystyy vastustamaan pH-muutosta pH-alueella noin 8,0 - 8,9; (d) poistetaan koeputkiseoksen kanssa kosketukseen saatettu testiväline putkesta; ja (e) määritetään pilkotun lähtevän ryhmän pitoi- '·. 25 suus.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seulontamenetelmä, tunnettu siitä, että kantajamatrlisiin on lisäksi kiinnitetty kaksiarvoinen kationi.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen seulontamenetel- ; 30 mä, tunnettu siitä, että koeputkeen lisätään lisäksi kaksiarvoinen kationi ennen inkubointia.
5. 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen seulontamenetelmä, tunnettu siitä, että lähtevä ryhmä on kromogeeninen. . . 35 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen seu- 28 85988 lontamenetelmä, tunnettu siitä, että kromogee-ninen lähtevä ryhmä on 3-aminoindoli ja kantajamatrlisiin on lisäksi kiinnitetty diatsoniumsuola.
6. 6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen seu- 5 lontamenetelmä, tunnettu siitä, että kantaja- matriisi esikäsitellään happamalla polymeerillä, joka on jokin metyylivinyylieetterin ja maleiinihappoanhydridin sekapolymeeri.
7. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä 10 käyttökelpoinen yksikkömuodossa oleva gram-negatiivisten bakteerien aiheuttaman bakteriurian seulontaväline vähintään 105 gram-negatiivisen bakteerin ml:ssa virtsanäytettä määrittämiseksi, tunnettu siitä, että se muodostuu 15 (a) kantajamatrlisistä; ja (b) kantajamatriisiin kiinnitetystä testikoos-tumuksesta, joka koostumus sisältää molukkiravun ameba-maisten solujen lysaatin, kaksiarvoisen kationin, synteettisen peptidisubstraatin, jossa on kromogeeninen tai 20 fluorogeeninen lähtevä ryhmä, jonka lysaatti pystyy pilkkomaan irti, puskurikomponentin, joka pystyy vastustamaan pH-muutosta pH-alueella noin 7,5 - 8,5 ja stabiloivan komponentin, joka pystyy stabiloimaan lysaatin.
8. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen yksikkömuodossa 25 oleva seulontaväline, tunnettu siitä, että stabiloiva komponentti on gelatiini, jokin metyylivinyylieetterin ja maleiinihappoanhydridin sekapolymeeri tai poly ety leen iglyko 1 i — i so-oktyy 1 i f enyy 1 ieetter i .
9. 9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen yksikkö-30 muodossa oleva seulontaväline, tunnettu siitä, että kromogeeninen lähtevä ryhmä on p-nitroaniliini.
10. 10. Menetelmä patenttivaatimuksen 7 mukaisen yk-sikkömuodossa olevan seulontavälineen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että siinä on seuraavat vaiheet: 35 (a) kiinnitetään kantajamatriisiin stabiloiva kom- 29 85988 ponentti, joka pystyy stabiloimaan molukkiravun ameba-maisten solujen lysaatin; (b) kuivataan; ja (c) kiinnitetään kuivattuun matriisiin testikoos-5 tumus, joka sisältää molukkiravun amebamaisten solujen lysaatin, kaksiarvoisen kationin, synteettisen peptidi-substraatin, jossa on kromogeeninen tai fluorogeeninen lähtevä ryhmä, jonka lysaatti pystyy pilkkomaan irti ja puskurikomponentin, joka pystyy vastustamaan pH-muutosta 10 pH-alueella noin 7,5 - 8,5; ja (d) kuivataan. 30 85988