JP2781974B2 - 尿検査方法及びキット - Google Patents
尿検査方法及びキットInfo
- Publication number
- JP2781974B2 JP2781974B2 JP63300421A JP30042188A JP2781974B2 JP 2781974 B2 JP2781974 B2 JP 2781974B2 JP 63300421 A JP63300421 A JP 63300421A JP 30042188 A JP30042188 A JP 30042188A JP 2781974 B2 JP2781974 B2 JP 2781974B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ala
- elastase
- substrate
- pro
- urine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/20—Coumarin derivatives
- C12Q2337/22—7-Amino-4-methylcoumarin, i.e. AMC, MCA
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/966—Elastase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、尿中の白血球の存在を同定するための尿検
査方法（urine assay process）に関する。
査方法（urine assay process）に関する。
病院の微生物検査室で分析されるサンプルの最高50％
が尿サンプルである。検査されるサンプルの少なくとも
80％乃至90％は臨床的な徴候を認めないものである。尿
サンプルを徹底的に検査するためには顕微鏡検査及び／
又は培養を実施しなければならず、時間と熟練した技術
を要する。従って、培養及び顕微鏡検査により検査しな
ければならないサンプルの数を減らすために負のサンプ
ルを除外できれば望ましい。可能ならば全ての正のサン
プルを同定できるように、テストはかなり特異的でなけ
ればならない。経済的に有用であるためには、テストは
正のサンプルと負のサンプルを非常に特異的に区別で
き、高率で負のサンプルを同定できるものでなければな
らない。
が尿サンプルである。検査されるサンプルの少なくとも
80％乃至90％は臨床的な徴候を認めないものである。尿
サンプルを徹底的に検査するためには顕微鏡検査及び／
又は培養を実施しなければならず、時間と熟練した技術
を要する。従って、培養及び顕微鏡検査により検査しな
ければならないサンプルの数を減らすために負のサンプ
ルを除外できれば望ましい。可能ならば全ての正のサン
プルを同定できるように、テストはかなり特異的でなけ
ればならない。経済的に有用であるためには、テストは
正のサンプルと負のサンプルを非常に特異的に区別で
き、高率で負のサンプルを同定できるものでなければな
らない。
一般的に、尿中に多数の白血球、例えば10個/mm3以上
の白血球が検出されると臨床的に多数の細菌が存在する
ことを意味するので、尿中の白血球数は例えば無症候性
感染症の発見又は尿中の病原体と汚染物質とを区別する
際の指標として利用されている。尿中の白血球数はより
少ない数の細菌の存在をも意味するので、感染を伴なわ
ない炎症又はchlamydia trachomatis，mycoplama spp又
はneisseria gonorrheaeのような或る種の媒介物による
感染の指標となり得る。尿中の白血球を検出・定量する
幾つかの方法が提案されている。
の白血球が検出されると臨床的に多数の細菌が存在する
ことを意味するので、尿中の白血球数は例えば無症候性
感染症の発見又は尿中の病原体と汚染物質とを区別する
際の指標として利用されている。尿中の白血球数はより
少ない数の細菌の存在をも意味するので、感染を伴なわ
ない炎症又はchlamydia trachomatis，mycoplama spp又
はneisseria gonorrheaeのような或る種の媒介物による
感染の指標となり得る。尿中の白血球を検出・定量する
幾つかの方法が提案されている。
一つの方法は、グラム染色により或いは容積定量チャ
ンバ内にて遠心分離されていない尿を顕微鏡検査する方
法である。遠心分離した尿を顕微鏡検査することもでき
るが、遠心分離は余分なステップであり、使用した容
量，遠心分離速度及び時間及び操作方法による差を受け
やすい。顕微鏡検査は長時間を要し且つ比較的熟練した
技術をも要する。更に、尿中の白血球は、pHの上昇，浸
透圧濃度の低下及び温度の上昇に伴なって死滅すること
も知られている。
ンバ内にて遠心分離されていない尿を顕微鏡検査する方
法である。遠心分離した尿を顕微鏡検査することもでき
るが、遠心分離は余分なステップであり、使用した容
量，遠心分離速度及び時間及び操作方法による差を受け
やすい。顕微鏡検査は長時間を要し且つ比較的熟練した
技術をも要する。更に、尿中の白血球は、pHの上昇，浸
透圧濃度の低下及び温度の上昇に伴なって死滅すること
も知られている。
別の最近開発された方法はCoulterカウンターを用い
て粒子サイズの分布を分析する方法であるが、この方法
は高価な装置を使用する点で病院の検査室や多数のサン
プルを検査する場合には実用的でない。
て粒子サイズの分布を分析する方法であるが、この方法
は高価な装置を使用する点で病院の検査室や多数のサン
プルを検査する場合には実用的でない。
更に最近開発された検査法はAutomated Microscony S
ystemsから販売されている所謂Autotrakである。この自
動検査方法では、尿サンプルをサンプル中の微生物と白
血球の両方を染色する橙アクリジンで染色後、染色した
サンプルをエピー螢光（epi-fluorescence）顕微鏡を用
いて調べる。この分析システムは白血球から発する螢光
と微生物から発する螢光を区別することができるので、
このシステムを用いることによりサンプル中の白血球数
を調べることができる。このシステムに関する問題はこ
のシステムが尿スクリーン検査にしか利用できないこと
である。
ystemsから販売されている所謂Autotrakである。この自
動検査方法では、尿サンプルをサンプル中の微生物と白
血球の両方を染色する橙アクリジンで染色後、染色した
サンプルをエピー螢光（epi-fluorescence）顕微鏡を用
いて調べる。この分析システムは白血球から発する螢光
と微生物から発する螢光を区別することができるので、
このシステムを用いることによりサンプル中の白血球数
を調べることができる。このシステムに関する問題はこ
のシステムが尿スクリーン検査にしか利用できないこと
である。
尿中の白血球の存在を検出するための化学的方法も開
発されている。その一つは、Chemstrip LNの商品名で市
販されているディップスティックである（Kusumiら,JAM
A 245,1653〜1655参照）。プラスチックストリップはエ
ステラーゼに対する基質であるインドキシルカルボン酸
エステルを含有する紙パッドを有しており、前記エス
テルは空気中で酸化されてインドキシルに変化し、青色
のインジゴを形成する。Kusumiはこの検査法は膿尿に対
するスクリーンとして非常に高感度であり且つ特異的で
ある（10個/mm3以上）と述べているが、最近の報告によ
るとこの検査法が高感度であり特異的であるかは疑わし
い。例えば、Wilkinsら［J.Clin.Path.Ol.（1985），3
8,1342〜1345］Murrayら［J.Clin.Micro.Biol.（198
7），25,467〜470］及びWuら［J.Clin.Micro.Biol.（19
85），21,796〜799］は、エステラーゼストリップの感
度及び特異性が不十分であるためにこの検査法は有用で
ないと述べている。また、Wilkinsらは色変化が判断し
にくいときがあると報告している。Wuらは或る種の抗体
特にアミノグリコシドを使用すると白血球のエステラー
ゼ活性が阻害されると報告している。
発されている。その一つは、Chemstrip LNの商品名で市
販されているディップスティックである（Kusumiら,JAM
A 245,1653〜1655参照）。プラスチックストリップはエ
ステラーゼに対する基質であるインドキシルカルボン酸
エステルを含有する紙パッドを有しており、前記エス
テルは空気中で酸化されてインドキシルに変化し、青色
のインジゴを形成する。Kusumiはこの検査法は膿尿に対
するスクリーンとして非常に高感度であり且つ特異的で
ある（10個/mm3以上）と述べているが、最近の報告によ
るとこの検査法が高感度であり特異的であるかは疑わし
い。例えば、Wilkinsら［J.Clin.Path.Ol.（1985），3
8,1342〜1345］Murrayら［J.Clin.Micro.Biol.（198
7），25,467〜470］及びWuら［J.Clin.Micro.Biol.（19
85），21,796〜799］は、エステラーゼストリップの感
度及び特異性が不十分であるためにこの検査法は有用で
ないと述べている。また、Wilkinsらは色変化が判断し
にくいときがあると報告している。Wuらは或る種の抗体
特にアミノグリコシドを使用すると白血球のエステラー
ゼ活性が阻害されると報告している。
EP-A-0237394には、コリンエステラーゼの色素産生性
基質を尿中の白血球の存在を測定するためのアッセイに
使用する旨が開示されている。
基質を尿中の白血球の存在を測定するためのアッセイに
使用する旨が開示されている。
EP-A-0012957（及びUS-A-4278763）には、アミノ酸及
びペプチドの色素産生性インドキシルエステル誘導体が
向神経性白血球顆粒球におけるエステラーゼに対する基
質として開示されている。前記誘導体は、水溶液中及尿
以外の体液中のエラスターゼ，キモトリプシン及びトリ
プシンを含めたタンパク分解酵素を検出するために該酵
素により加水分解される。
びペプチドの色素産生性インドキシルエステル誘導体が
向神経性白血球顆粒球におけるエステラーゼに対する基
質として開示されている。前記誘導体は、水溶液中及尿
以外の体液中のエラスターゼ，キモトリプシン及びトリ
プシンを含めたタンパク分解酵素を検出するために該酵
素により加水分解される。
EP-A-0158225（及びUS 4758508）では、フェノールエ
ステルである基質が例えば尿中の白血球におけるエステ
ル分解若しくはタンパク分解酵素に対するアッセイに使
用されている。１つの基質はフェノール誘導体のアラニ
ルエステルである。
ステルである基質が例えば尿中の白血球におけるエステ
ル分解若しくはタンパク分解酵素に対するアッセイに使
用されている。１つの基質はフェノール誘導体のアラニ
ルエステルである。
他の尿スクリーンは白血球と反応させる。例えば、Ba
c-T-Screen（Marion Scientific Laboratory）システム
は尿を紙に通した後サフラニン染料を紙に加える比
色過システムである。尿中の細菌及び白血球の両方が
染料に保持され、ピンク色を呈する。しかしながら、こ
の検査法では細菌と白血球を区別することができず、尿
中の各種組織片例えば染料及び白血球及び血液がスクリ
ーンを塞いでサンプルの通過を阻止するため、この検査
法では分析できない尿の割合が高い。
c-T-Screen（Marion Scientific Laboratory）システム
は尿を紙に通した後サフラニン染料を紙に加える比
色過システムである。尿中の細菌及び白血球の両方が
染料に保持され、ピンク色を呈する。しかしながら、こ
の検査法では細菌と白血球を区別することができず、尿
中の各種組織片例えば染料及び白血球及び血液がスクリ
ーンを塞いでサンプルの通過を阻止するため、この検査
法では分析できない尿の割合が高い。
更に自動化された検査法は生物ルミネセンスを使用
し、螢ルシフエラーゼが細菌性ATPと定量的に反応して
ルミネセンスを発する作用を利用したものである。この
システムは、Ulrich and Wannlund,American Clinical
Product Review,November 1984に記載されている。この
システムによれば白血球由来の数種の哺乳類ATP及び細
菌性ATPを検出することができるが、両者を区別するこ
とはできない。また、このシステムはかなりの労力を要
し、高価な試薬を使用する。
し、螢ルシフエラーゼが細菌性ATPと定量的に反応して
ルミネセンスを発する作用を利用したものである。この
システムは、Ulrich and Wannlund,American Clinical
Product Review,November 1984に記載されている。この
システムによれば白血球由来の数種の哺乳類ATP及び細
菌性ATPを検出することができるが、両者を区別するこ
とはできない。また、このシステムはかなりの労力を要
し、高価な試薬を使用する。
白血球が、エラスターゼが存在するが故にプロテアー
ゼ活性に富んでいることは公知である。Barrett［Metho
ds in Enzymology（1981），80,581〜588］は、酵素が
白血球から精製され得るか又は化膿痰及びヒト脾臓やリ
ウマチ様滑液膜から単離され得ると述べている。
ゼ活性に富んでいることは公知である。Barrett［Metho
ds in Enzymology（1981），80,581〜588］は、酵素が
白血球から精製され得るか又は化膿痰及びヒト脾臓やリ
ウマチ様滑液膜から単離され得ると述べている。
エラスターゼは肺気腫のような疾患に関与し、多分こ
の疾患に特有な肺組織のタンパク分解を生ずるものと考
えられてきた。エラスターゼは炎症そのものの仲介物を
産生する点で他の炎症性疾患にも関与すると考えられて
きた。酵素をアッセイすることは、前記した炎症性疾患
の研究及び治療方法の開発上重要である。
の疾患に特有な肺組織のタンパク分解を生ずるものと考
えられてきた。エラスターゼは炎症そのものの仲介物を
産生する点で他の炎症性疾患にも関与すると考えられて
きた。酵素をアッセイすることは、前記した炎症性疾患
の研究及び治療方法の開発上重要である。
Castilloら［Analytical Biochemistry,99,53〜64（1
979）］は、エラスターゼをアッセイするために各種合
成ペプチド基質を調べた。各種基質は同一のペプチド基
を含み、エラスターゼ加水分解によって放出される遊離
基（leaving groups）は異なる。遊離基の１つはｐ−ニ
トロアニリンを形成した。２つの基質は螢光光度的に検
出可能な螢光化合物、１−メトキシ−３−ナフチルアミ
ン及び７−アミノ−４−メチルクマリンを生じた。別の
基質はチオベンジルエステルであり、別の試薬と反応し
てベンジルメルカプタンを生成した。即ち、5,5′−ジ
チオビス（２）−ニトロ安息香酸（Ellman試薬）と反応
して３−カルボキシ−４−ニトロチオフェノキシドアニ
オンを生成し、或いは4,4′−ジチオジピリジンと反応
して４−チオピリドンを生成した。前記生成物は夫々41
2nm及び324nmでの光の吸収を測定することにより検出さ
れ得る。別の基質はペプチドのエチルエステルであり、
エラスターゼ加水分解によりエタノールを生成する。こ
のエタノールはアッセイ混合物中にNAD−及び肝アルコ
ールデヒドロゲナーゼを含有させることにより同定され
得、340nmでの吸収を測定することにより分析され得るN
ADH+を生成する。アッセイは全て反応混合物中に存在す
る少量のエラスターゼを検出できた。精製エラスターゼ
を使用した。
979）］は、エラスターゼをアッセイするために各種合
成ペプチド基質を調べた。各種基質は同一のペプチド基
を含み、エラスターゼ加水分解によって放出される遊離
基（leaving groups）は異なる。遊離基の１つはｐ−ニ
トロアニリンを形成した。２つの基質は螢光光度的に検
出可能な螢光化合物、１−メトキシ−３−ナフチルアミ
ン及び７−アミノ−４−メチルクマリンを生じた。別の
基質はチオベンジルエステルであり、別の試薬と反応し
てベンジルメルカプタンを生成した。即ち、5,5′−ジ
チオビス（２）−ニトロ安息香酸（Ellman試薬）と反応
して３−カルボキシ−４−ニトロチオフェノキシドアニ
オンを生成し、或いは4,4′−ジチオジピリジンと反応
して４−チオピリドンを生成した。前記生成物は夫々41
2nm及び324nmでの光の吸収を測定することにより検出さ
れ得る。別の基質はペプチドのエチルエステルであり、
エラスターゼ加水分解によりエタノールを生成する。こ
のエタノールはアッセイ混合物中にNAD−及び肝アルコ
ールデヒドロゲナーゼを含有させることにより同定され
得、340nmでの吸収を測定することにより分析され得るN
ADH+を生成する。アッセイは全て反応混合物中に存在す
る少量のエラスターゼを検出できた。精製エラスターゼ
を使用した。
Tschescheら［Methods of Enzymatic Analysis″ 3rd
Ed.,Vol.5,176〜184］には、Suc-Ala-Ala-Ala-NA,MeOS
uc-Ala-Ala-Pro-Val-NA及びSuc-Ala-Ala-Val-NAを含め
た合成色素産生性若しくは螢光発生性ペプチド基質を使
用する、ヒト白血球エラスターゼのアッセイを記載して
いる。この方法は抽出酵素を使用し、具体的にはヒト血
液からの抽出方法が記載されているに過ぎない。
Ed.,Vol.5,176〜184］には、Suc-Ala-Ala-Ala-NA,MeOS
uc-Ala-Ala-Pro-Val-NA及びSuc-Ala-Ala-Val-NAを含め
た合成色素産生性若しくは螢光発生性ペプチド基質を使
用する、ヒト白血球エラスターゼのアッセイを記載して
いる。この方法は抽出酵素を使用し、具体的にはヒト血
液からの抽出方法が記載されているに過ぎない。
Wenzelら［Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem.（198
0），361,1413〜1416］は、精製ヒト白血球エラスター
ゼ及びブタ膵エラスターゼのSuc-Ala-Ala-Val-NA,MeOSu
c-Ala-Ala-Pro-Val-NA及びAc-Ala-Ala-Pro-Val-NAに対
する使用動態を比較している。
0），361,1413〜1416］は、精製ヒト白血球エラスター
ゼ及びブタ膵エラスターゼのSuc-Ala-Ala-Val-NA,MeOSu
c-Ala-Ala-Pro-Val-NA及びAc-Ala-Ala-Pro-Val-NAに対
する使用動態を比較している。
Ashe及びZimmerman［B.B.R.C.75,194〜199（1977）］
は、エラスターゼに対するアッセイ方法においてエラス
チンを基質として使用し、生成物を螢光検出により同定
している。精製エラスターゼ酵素を使用した。
は、エラスターゼに対するアッセイ方法においてエラス
チンを基質として使用し、生成物を螢光検出により同定
している。精製エラスターゼ酵素を使用した。
血漿中のエラスターゼが、α1−プロテアーゼ阻害剤
として公知のエラスターゼの酵素活性を完全に阻害する
阻害剤と複合体を形成することは公知である。血漿中の
数種のエラスターゼがα2−マクログロブリンと結合す
ることも公知である。後者の複合体において酵素は酵素
活性を保持する。実際、Twumasiら［Nature（1977），2
67,61〜63］は、ヒト白血球エラスターゼがヒトα2−マ
クログロブリンによりSuc（Ala）3NAに対して活性化さ
れる旨示唆している。しかしながら、前記複合体が比較
的少なく且つ循環により急速に消失してしまうため、そ
の同定は余り有用でない。
として公知のエラスターゼの酵素活性を完全に阻害する
阻害剤と複合体を形成することは公知である。血漿中の
数種のエラスターゼがα2−マクログロブリンと結合す
ることも公知である。後者の複合体において酵素は酵素
活性を保持する。実際、Twumasiら［Nature（1977），2
67,61〜63］は、ヒト白血球エラスターゼがヒトα2−マ
クログロブリンによりSuc（Ala）3NAに対して活性化さ
れる旨示唆している。しかしながら、前記複合体が比較
的少なく且つ循環により急速に消失してしまうため、そ
の同定は余り有用でない。
前記した問題に関する一つの方法が、J.Clin.Chem.Cl
in.Biochem.,22（1984）,693〜697に記載されている。
この文献でNeumanらは阻害剤−エラスターゼ複合体に対
する免疫アッセイを述べている。この方法は、多段階を
含む方法であるために時間と労力を要する他、高価な試
薬を使用するといった幾つかの欠点を有する。
in.Biochem.,22（1984）,693〜697に記載されている。
この文献でNeumanらは阻害剤−エラスターゼ複合体に対
する免疫アッセイを述べている。この方法は、多段階を
含む方法であるために時間と労力を要する他、高価な試
薬を使用するといった幾つかの欠点を有する。
本発明者らは、エラスターゼ活性の阻害が血漿のみな
らず、尿のような他の体液中でも生ずることを知見し
た。尿中でエラスターゼが阻害される一因は、多分尿中
に血液が存在するためであり、こうした現象は人工の一
部、特に或る種の疾患患者で認められる。
らず、尿のような他の体液中でも生ずることを知見し
た。尿中でエラスターゼが阻害される一因は、多分尿中
に血液が存在するためであり、こうした現象は人工の一
部、特に或る種の疾患患者で認められる。
他の基質がエラスターゼ活性を阻害することは公知で
あり、治療薬としての使用可能性についての研究が進め
られてきた。Ashe及びZimmerman（上掲文献参照）は、
ヒト顆粒球エラスターゼがオレイン酸のようなcis−不
飽和脂肪酸により阻害されると述べている。Veredら［A
m.Rev.Respir.Dis.（1985）,131〜133］は、温和な変性
剤例えばドデシル硫酸ナトリウムによりエラスターゼか
ら解離され得る肺炎連鎖球菌由来のペプチドによりエラ
スターゼが阻害される旨述べている。
あり、治療薬としての使用可能性についての研究が進め
られてきた。Ashe及びZimmerman（上掲文献参照）は、
ヒト顆粒球エラスターゼがオレイン酸のようなcis−不
飽和脂肪酸により阻害されると述べている。Veredら［A
m.Rev.Respir.Dis.（1985）,131〜133］は、温和な変性
剤例えばドデシル硫酸ナトリウムによりエラスターゼか
ら解離され得る肺炎連鎖球菌由来のペプチドによりエラ
スターゼが阻害される旨述べている。
Castilloら［上掲文献参照）は、DMSO（ジメチルスル
ホキシド）がエラスターゼを刺激することが判明した
が、その理由は解明されていないと述べている。Bieth
and Wermuth（上掲文献参照）はDMSO及びDMF（ジメチル
ホルムアミド）がエラスターゼに対する阻害作用を有し
ていると述べているが、Lestienne and Bieth［J.Biol.
Chem.（1980），255,89〜9294］は白血球エラスターゼ
が過剰の基質、疎水性溶媒及びイオン強度により活性化
されると述べている。Boudierら［J.Biol.Chem.（198
1），256,10256〜10258］は、別の白血球プロテアーゼ
であるカテプシンＧにより白血球エラスターゼが活性化
されると述べている。効果（effect）は合成基質を使用
した場合には見られず、多分エラスチンに対するカテプ
シンＧのタンパク分解作用によるのであろう。これらの
実験は精製エラスターゼについて実施したものである。
JP-A-57-166982には、膵エラスターゼの先駆体を例えば
Rhizopusより産生される酸性プロテアーゼを用いて10時
間処理すると該先駆体が活性化される旨が記載されてい
る。
ホキシド）がエラスターゼを刺激することが判明した
が、その理由は解明されていないと述べている。Bieth
and Wermuth（上掲文献参照）はDMSO及びDMF（ジメチル
ホルムアミド）がエラスターゼに対する阻害作用を有し
ていると述べているが、Lestienne and Bieth［J.Biol.
Chem.（1980），255,89〜9294］は白血球エラスターゼ
が過剰の基質、疎水性溶媒及びイオン強度により活性化
されると述べている。Boudierら［J.Biol.Chem.（198
1），256,10256〜10258］は、別の白血球プロテアーゼ
であるカテプシンＧにより白血球エラスターゼが活性化
されると述べている。効果（effect）は合成基質を使用
した場合には見られず、多分エラスチンに対するカテプ
シンＧのタンパク分解作用によるのであろう。これらの
実験は精製エラスターゼについて実施したものである。
JP-A-57-166982には、膵エラスターゼの先駆体を例えば
Rhizopusより産生される酸性プロテアーゼを用いて10時
間処理すると該先駆体が活性化される旨が記載されてい
る。
本発明の白血球の存在を検出するための新規な尿検査
方法は、まず尿サンプルと酵素基質とを含むアッセイ混
合物を調製する。該基質はアッセイ混合物中のエラスタ
ーゼにより加水分解されてその存在をアッセイ混合物中
で検出し得る化合物を形成する。次いで、化合物を検出
することからなる。
方法は、まず尿サンプルと酵素基質とを含むアッセイ混
合物を調製する。該基質はアッセイ混合物中のエラスタ
ーゼにより加水分解されてその存在をアッセイ混合物中
で検出し得る化合物を形成する。次いで、化合物を検出
することからなる。
アッセイにかけるサンプルは直接（direct）尿サンプ
ルでも、希釈されていても、遠心分離された尿でもよ
い。余分なステップを避けるために、直接尿サンプルを
使用することが好ましい。
ルでも、希釈されていても、遠心分離された尿でもよ
い。余分なステップを避けるために、直接尿サンプルを
使用することが好ましい。
本発明において好ましい基質は非常に高感度で且つ特
異的な白血球エラスターゼ基質であり、白血球エラスタ
ーゼ，トリプシン又はキモトリプシンにより実質的に加
水分解され得ないもの、即ちプロテアーゼによる加水分
解がエラスターゼによる加水分解速度よりも遅いか若し
くは全くプロテアーゼにより加水分解され得ないもので
ある。
異的な白血球エラスターゼ基質であり、白血球エラスタ
ーゼ，トリプシン又はキモトリプシンにより実質的に加
水分解され得ないもの、即ちプロテアーゼによる加水分
解がエラスターゼによる加水分解速度よりも遅いか若し
くは全くプロテアーゼにより加水分解され得ないもので
ある。
適当な基質は式Ｉ Ｒ1−Ａ4−Ａ3−Ａ2−Ａ1−CONH−Ｒ2 を有する化合物である。上記式中、 Ａ1は非極性側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくは
アラニル，バリル，フェニルアラニル及びメチオニルか
ら選択されたアミノ酸残基であり、 Ａ2は結合（bond）又は非極性側鎖を有するアミノ酸
残基であり、好ましくはプロピル，アラニル及びロイシ
ルから選択されたアミノ酸残基であり、 Ａ3は結合又は非極性側鎖を有するアミノ酸残基であ
り、好ましくはアラニル残基であり、 Ａ4は結合又は非極性側鎖を有するアミノ酸残基であ
り、好ましくはアラニル残基であり、 Ｒ1はグルタリル又はＮ−末端封鎖基であり、及び Ｒ2は化合物R2NH2がアッセイ媒体中で検出され得るよ
うに選択される。
アラニル，バリル，フェニルアラニル及びメチオニルか
ら選択されたアミノ酸残基であり、 Ａ2は結合（bond）又は非極性側鎖を有するアミノ酸
残基であり、好ましくはプロピル，アラニル及びロイシ
ルから選択されたアミノ酸残基であり、 Ａ3は結合又は非極性側鎖を有するアミノ酸残基であ
り、好ましくはアラニル残基であり、 Ａ4は結合又は非極性側鎖を有するアミノ酸残基であ
り、好ましくはアラニル残基であり、 Ｒ1はグルタリル又はＮ−末端封鎖基であり、及び Ｒ2は化合物R2NH2がアッセイ媒体中で検出され得るよ
うに選択される。
好ましくは、Ｒ1はアセチル（Ac），スクシニル（Su
c），メトキシスクシニル（MeOSuc）,t−ブチルオキシ
カルボニル（Boc）及びグルタリル（Glt）から選択され
る。好ましい化合物は、式中Ａ1がアラニル又はバリ
ル、より好ましくはバリルであり、Ａ2がアラニル又は
プロリルであり、Ａ3がアラニルである化合物のような
トリ−もしくはテトラペプチド誘導体である。MeOSucは
特に好ましい基Ｒ1である。
c），メトキシスクシニル（MeOSuc）,t−ブチルオキシ
カルボニル（Boc）及びグルタリル（Glt）から選択され
る。好ましい化合物は、式中Ａ1がアラニル又はバリ
ル、より好ましくはバリルであり、Ａ2がアラニル又は
プロリルであり、Ａ3がアラニルである化合物のような
トリ−もしくはテトラペプチド誘導体である。MeOSucは
特に好ましい基Ｒ1である。
本アッセイで使用されるエラスターゼ基質はエラスタ
ーゼ酵素に対して特異的なペプチド誘導体である。基質
として適当なペプチド誘導体は多数公知であり、この中
には Ac-Ala-Ala-Ala Ac-Ala-Ala-Pro-Ala Ac-Ala-Ala-Pro-Phe Ac-Ala-Pro-Ala Boc-Ala Boc-Ala-Ala Boc-Ala-Ala-Ala Boc-Ala-Ala-Pro-Ala Boc-Ala-Ala-Pro-Val Glt-Ala-Ala-Ala MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val Suc-Ala-Ala-Ala Suc-Ala-Ala-Pro-Met Suc-Ala-Ala-Val Suc-Ala-Try-Leu-Val Pyr-Pro-Val のアミド又は（余り好ましくはないが）エステル誘導体
が包含される。
ーゼ酵素に対して特異的なペプチド誘導体である。基質
として適当なペプチド誘導体は多数公知であり、この中
には Ac-Ala-Ala-Ala Ac-Ala-Ala-Pro-Ala Ac-Ala-Ala-Pro-Phe Ac-Ala-Pro-Ala Boc-Ala Boc-Ala-Ala Boc-Ala-Ala-Ala Boc-Ala-Ala-Pro-Ala Boc-Ala-Ala-Pro-Val Glt-Ala-Ala-Ala MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val Suc-Ala-Ala-Ala Suc-Ala-Ala-Pro-Met Suc-Ala-Ala-Val Suc-Ala-Try-Leu-Val Pyr-Pro-Val のアミド又は（余り好ましくはないが）エステル誘導体
が包含される。
好ましい基質は、Ala-Ala-Pro-Val及びAla-Ala-Valの
好ましくはアミド誘導体の封鎖（blocked）誘導体であ
る。
好ましくはアミド誘導体の封鎖（blocked）誘導体であ
る。
最も好ましい基質はMeOSuc-Ala-Ala-Pro-Valのアミド
誘導体であり、この誘導体についてはAnalytical Bioch
emistry（1979），99,53〜64に記載されている。
誘導体であり、この誘導体についてはAnalytical Bioch
emistry（1979），99,53〜64に記載されている。
アッセイ混合物中の化合物の検出は、光学検出方法、
例えば濁度測定法、分光光度法、又は最も好ましくは螢
光光度法により実施することが最も便利である。ペプチ
ジル基質の誘導基（derivatising group）は、基質がエ
ラスターゼにより加水分解されたときに光学手段により
直接検出されるか又は余り好ましくはないが間接的に検
出され得るような化合物を生ずるものである。例えば、
サンプル中で更に反応して光学手段により検出され得る
生成物を生ずるものである。
例えば濁度測定法、分光光度法、又は最も好ましくは螢
光光度法により実施することが最も便利である。ペプチ
ジル基質の誘導基（derivatising group）は、基質がエ
ラスターゼにより加水分解されたときに光学手段により
直接検出されるか又は余り好ましくはないが間接的に検
出され得るような化合物を生ずるものである。例えば、
サンプル中で更に反応して光学手段により検出され得る
生成物を生ずるものである。
光学検出手段は、特定波長の可視光線の反射，吸収若
しくは螢光を検出する手段又は濁度の変化を検出する手
段を含む。従って、例えば基質の加水分解により生じた
化合物は、その螢光特性が基質自体の螢光特性と異なる
もの、異なる波長で螢光を発するものであり得る。或い
は、化合物が基質とは異なる色を有していてもよく、光
の吸収又は反射を分光光度的に又は単に可視的に測定し
得る。
しくは螢光を検出する手段又は濁度の変化を検出する手
段を含む。従って、例えば基質の加水分解により生じた
化合物は、その螢光特性が基質自体の螢光特性と異なる
もの、異なる波長で螢光を発するものであり得る。或い
は、化合物が基質とは異なる色を有していてもよく、光
の吸収又は反射を分光光度的に又は単に可視的に測定し
得る。
加水分解により生ずる化合物が光学検出手段により直
接観察され得るものでなくてもよく、試薬混合物中の他
の成分と反応して観察し得る化合物を生成するものであ
ればよい。更なる反応は単なる化学反応であるか又は酵
素触媒反応であり得る。例えば、化合物をカップリング
剤と反応させてアゾ染料のような染料を生成させてもよ
い。化合物又は化合物の他の反応生成物が、例えばUS44
95293に記載されている如く成分により発せられる螢光
を吸収することによってアッセイ混合物中の他の成分の
光学的性質に影響を与えてもよい。
接観察され得るものでなくてもよく、試薬混合物中の他
の成分と反応して観察し得る化合物を生成するものであ
ればよい。更なる反応は単なる化学反応であるか又は酵
素触媒反応であり得る。例えば、化合物をカップリング
剤と反応させてアゾ染料のような染料を生成させてもよ
い。化合物又は化合物の他の反応生成物が、例えばUS44
95293に記載されている如く成分により発せられる螢光
を吸収することによってアッセイ混合物中の他の成分の
光学的性質に影響を与えてもよい。
好ましくは、誘導基は螢光発生性基である。前記した
適当な基質としては、４−メトキシ−β−ナフチルアミ
ド（4MβNA）及びβ−ナフチルアミド（βNA）の誘導体
を含むβ−ナフチルアミド類、７−アミノ−クマリン誘
導体例えば７−アミノ−４−メチルクマリン（AMC）誘
導体及び７−アミン−４−トリフルオロメチルクマリン
（AFC）誘導体のようなクマリン誘導体が例示される。
前記基質の加水分解により生成される螢光化合物は公知
の方法及び装置により検出され得る。
適当な基質としては、４−メトキシ−β−ナフチルアミ
ド（4MβNA）及びβ−ナフチルアミド（βNA）の誘導体
を含むβ−ナフチルアミド類、７−アミノ−クマリン誘
導体例えば７−アミノ−４−メチルクマリン（AMC）誘
導体及び７−アミン−４−トリフルオロメチルクマリン
（AFC）誘導体のようなクマリン誘導体が例示される。
前記基質の加水分解により生成される螢光化合物は公知
の方法及び装置により検出され得る。
別の適当な誘導基は着色化合物を生成するものであ
り、前記した着色化合物は肉眼により又は通常特定の波
長の光の吸収を測定することにより分光光度的に直接観
察され得る。基質は例えばｐ−ニトロアニリン若しくは
ｐ−ジエチルアミノアニリンのアミド誘導体、ｐ−ニト
ロフェノールのエステル及び２−ナフトールのエステル
であり得る。
り、前記した着色化合物は肉眼により又は通常特定の波
長の光の吸収を測定することにより分光光度的に直接観
察され得る。基質は例えばｐ−ニトロアニリン若しくは
ｐ−ジエチルアミノアニリンのアミド誘導体、ｐ−ニト
ロフェノールのエステル及び２−ナフトールのエステル
であり得る。
他の誘導基は直接観察され得る化合物を生成しない
が、試薬混合物中に存在する他の成分と更に反応して光
学的に検出可能な化合物を生成し得るものである。前記
した追加の成分は混合物に特に添加しても、又サンプル
中に存在させてもよい。基質は例えば、加水分解生成物
がCastillo（上掲文献参照）に記載されている如き方法
により検出され得るエチルエステル又はチオベンジルエ
ステルである。
が、試薬混合物中に存在する他の成分と更に反応して光
学的に検出可能な化合物を生成し得るものである。前記
した追加の成分は混合物に特に添加しても、又サンプル
中に存在させてもよい。基質は例えば、加水分解生成物
がCastillo（上掲文献参照）に記載されている如き方法
により検出され得るエチルエステル又はチオベンジルエ
ステルである。
使用可能な別の基質は、Quinn and Blout［BBRC（197
0）40,328〜333］に記載されている如き光学的に検出可
能なラベルを有するエラスチンである。エラスチンは水
に不溶性であるために、余り好ましくない。
0）40,328〜333］に記載されている如き光学的に検出可
能なラベルを有するエラスチンである。エラスチンは水
に不溶性であるために、余り好ましくない。
本発明に使用するのに最も好ましい基質はMeo-Suc-Al
a-Ala-Pro-Val-AMCであり、これはヒト白血球エラスタ
ーゼに対して非常に特異的であり且つその加水分解生成
物AMCは螢光検出により少量消去（delete）され得る。
a-Ala-Pro-Val-AMCであり、これはヒト白血球エラスタ
ーゼに対して非常に特異的であり且つその加水分解生成
物AMCは螢光検出により少量消去（delete）され得る。
基質の加水分解はアッセイ混合物中のの化合物の存在
を定期的に観察することによって連続的にモニターされ
得る。または、反応の終点を観察したり、全ての基質が
加水分解された後である必要はないが所定時間後アッセ
イ混合物を分析してもよい。アッセイ方法は、サンプル
中の白血球の数を測定したり、単に白血球数がカットオ
フ価以上、好ましくは８乃至10個/cm3−尿以上であるこ
とを示すために使用される。
を定期的に観察することによって連続的にモニターされ
得る。または、反応の終点を観察したり、全ての基質が
加水分解された後である必要はないが所定時間後アッセ
イ混合物を分析してもよい。アッセイ方法は、サンプル
中の白血球の数を測定したり、単に白血球数がカットオ
フ価以上、好ましくは８乃至10個/cm3−尿以上であるこ
とを示すために使用される。
本発明者らの知見によれば、尿サンプル中にエラスタ
ーゼ活性の阻害剤が存在する場合があり、従ってこの阻
害を低下若しくは消失させる試薬をアッセイ混合物中に
添加するのが有利である。本発明者らの知見によれば、
或る種のプロテアーゼ酵素は酵素そのものの活性に影響
を及ぼすことなく又は酵素基質に対してタンパク分解作
用を示すことなく阻害を減じることができる。これらの
酵素の１種をアッセイ混合物中に添加することが好まし
い。
ーゼ活性の阻害剤が存在する場合があり、従ってこの阻
害を低下若しくは消失させる試薬をアッセイ混合物中に
添加するのが有利である。本発明者らの知見によれば、
或る種のプロテアーゼ酵素は酵素そのものの活性に影響
を及ぼすことなく又は酵素基質に対してタンパク分解作
用を示すことなく阻害を減じることができる。これらの
酵素の１種をアッセイ混合物中に添加することが好まし
い。
本発明者らは、アッセイ混合物中に酵素を添加するこ
とは尿以外の体液のテストにおける阻害を低下させるの
に有用であると判明した。本発明のエラスターゼについ
て体液サンプルをアッセイするための新規な方法は、 ａ） 液体サンプル、 ｂ） エラスターゼにより開裂されてその存在が混合物
中で検出され得る化合物を生成し得るエラスターゼ基
質，及び ｃ） エラスターゼ阻害をエラスターゼ阻害剤により低
下させ得るがエラスターゼ基質を加水分解し得ないプロ
テアーゼ， を含むアッセイ混合物を調製し、 次いで混合物を分析して化合物の存在を検出すること
からなる。
とは尿以外の体液のテストにおける阻害を低下させるの
に有用であると判明した。本発明のエラスターゼについ
て体液サンプルをアッセイするための新規な方法は、 ａ） 液体サンプル、 ｂ） エラスターゼにより開裂されてその存在が混合物
中で検出され得る化合物を生成し得るエラスターゼ基
質，及び ｃ） エラスターゼ阻害をエラスターゼ阻害剤により低
下させ得るがエラスターゼ基質を加水分解し得ないプロ
テアーゼ， を含むアッセイ混合物を調製し、 次いで混合物を分析して化合物の存在を検出すること
からなる。
本発明は、或る種のプロテアーゼ酵素がエラスターゼ
酵素そのものに悪影響を及ぼすことなく且つエラスター
ゼ基質を加水分解せずに白血球エラスターゼ活性の阻害
を低下させ、存在が検出され得る化合物を遊離する（即
ち誤った正の結果を示す）か又は基質の組成を変化させ
て基質がもはやエラスターゼに対する有効な基質として
作用しなくなる（即ち誤った負の結果を示すか若しくは
維持する）という驚くべき知見に基づく。
酵素そのものに悪影響を及ぼすことなく且つエラスター
ゼ基質を加水分解せずに白血球エラスターゼ活性の阻害
を低下させ、存在が検出され得る化合物を遊離する（即
ち誤った正の結果を示す）か又は基質の組成を変化させ
て基質がもはやエラスターゼに対する有効な基質として
作用しなくなる（即ち誤った負の結果を示すか若しくは
維持する）という驚くべき知見に基づく。
本発明でテストされるサンプルは、ヒト又は他の動物
の生物学的流体例えば血液、炎症部位や他の傷からの排
泄物、痰又は尿であり得る。本アッセイで使用されるサ
ンプルは、流体そのものであっても各種精製過程を経た
ものであってもよい。例えば全白血球又は溶解白血球又
はそのタンパク抽出物の生成を含む。
の生物学的流体例えば血液、炎症部位や他の傷からの排
泄物、痰又は尿であり得る。本アッセイで使用されるサ
ンプルは、流体そのものであっても各種精製過程を経た
ものであってもよい。例えば全白血球又は溶解白血球又
はそのタンパク抽出物の生成を含む。
所望の阻害低下性を有する（且つMeOSuc-Ala-Ala-Pro
-Val-AMCを加水分解しない）プロテアーゼ酵素には、溶
解酵素、Rhizopus種由来のプロテアーゼタイプX VIII、
Streptomyces caespitosus由来のプロテアーゼタイプI
V、Bacillus polymixa由来のプロテアーゼタイプIX及び
Bacillus polymixa由来のプロテアーゼタイプIVが包含
される。本発明者らがエラスターゼ基質MeOSuc-Ala-Ala
-Pro-Val-AMCに対して加水分解作用を示す又は十分に阻
害を低下させないために、アッセイ混合物の成分として
有用でないことを知見したプロテアーゼ酵素には、Aspe
rgillus susae由来のプロテアーゼタイプI XI、Aspergi
llus saitoi由来のプロテアーゼタイプXIII、Aspergill
us caryzae由来のプロテアーゼ、Papaya由来のプロテア
ーゼタイプIII、Bovine pancreas由来のプロテアーゼタ
イプＩ、プロテアーゼタイプX X IV（細菌性）及びSubt
illisin Carlsberg由来のプロテアーゼが包含される。
これらのタンパクは全てSigmaから市販されている。
-Val-AMCを加水分解しない）プロテアーゼ酵素には、溶
解酵素、Rhizopus種由来のプロテアーゼタイプX VIII、
Streptomyces caespitosus由来のプロテアーゼタイプI
V、Bacillus polymixa由来のプロテアーゼタイプIX及び
Bacillus polymixa由来のプロテアーゼタイプIVが包含
される。本発明者らがエラスターゼ基質MeOSuc-Ala-Ala
-Pro-Val-AMCに対して加水分解作用を示す又は十分に阻
害を低下させないために、アッセイ混合物の成分として
有用でないことを知見したプロテアーゼ酵素には、Aspe
rgillus susae由来のプロテアーゼタイプI XI、Aspergi
llus saitoi由来のプロテアーゼタイプXIII、Aspergill
us caryzae由来のプロテアーゼ、Papaya由来のプロテア
ーゼタイプIII、Bovine pancreas由来のプロテアーゼタ
イプＩ、プロテアーゼタイプX X IV（細菌性）及びSubt
illisin Carlsberg由来のプロテアーゼが包含される。
これらのタンパクは全てSigmaから市販されている。
本発明に使用するのに好ましいプロテアーゼ酵素は溶
解酵素（lysing enzymes）及びRhizopus種由来のプロテ
アーゼタイプX VIIIである。
解酵素（lysing enzymes）及びRhizopus種由来のプロテ
アーゼタイプX VIIIである。
本発明者らの知見によれば、アッセイ混合物中に別の
成分を添加することは基質に対するエラスターゼ活性に
別の阻害低下（活性化）性を与える。
成分を添加することは基質に対するエラスターゼ活性に
別の阻害低下（活性化）性を与える。
活性化剤として適当な別の成分は或る程度の表面活性
特性及び／又はタンパク変性特性を有していなければな
らないが、エラスターゼ又はプロテアーゼに対して重大
な有害作用を及ぼすものであってはならない。混合物に
添加するのに適当な別の活性化成分は、サポニン、トリ
トン及びCHAPS（３−コラミドプロピル）−ジメチルア
ンモニオ）−１−プロパンスルホネート）である。アッ
セイ混合物は通常緩衝液を含み、金属イオン、安定化剤
糖を含み得る。
特性及び／又はタンパク変性特性を有していなければな
らないが、エラスターゼ又はプロテアーゼに対して重大
な有害作用を及ぼすものであってはならない。混合物に
添加するのに適当な別の活性化成分は、サポニン、トリ
トン及びCHAPS（３−コラミドプロピル）−ジメチルア
ンモニオ）−１−プロパンスルホネート）である。アッ
セイ混合物は通常緩衝液を含み、金属イオン、安定化剤
糖を含み得る。
基質は0.02〜２％w/v、好ましくは0.05〜５％例えば
約0.2％の濃度でアッセイ混合物中に存在するのが適当
である。例えば分光光度検出が使用される場合には前記
値を超えてもよい。プロテアーゼは0.05〜５％w/v、好
ましくは0.2〜２％例えば約0.5％の濃度が有効であると
判明した。別の活性化剤を混合物中に添加しなければな
らないときには、通常0.25〜10％w/v、好ましくは１〜
５％例えば約2.5％の濃度で存在させる。
約0.2％の濃度でアッセイ混合物中に存在するのが適当
である。例えば分光光度検出が使用される場合には前記
値を超えてもよい。プロテアーゼは0.05〜５％w/v、好
ましくは0.2〜２％例えば約0.5％の濃度が有効であると
判明した。別の活性化剤を混合物中に添加しなければな
らないときには、通常0.25〜10％w/v、好ましくは１〜
５％例えば約2.5％の濃度で存在させる。
アッセイ方法は、反応を実施する容器に乾燥成分とし
て又は水溶液の形態で試薬を別々に添加することにより
実施され得る。しかしながら、試薬の少なくとも一部、
好ましくは全部を、好ましくは容器内で所要により凍結
させた溶液の形態、又は好ましくは乾燥した形態、より
好ましくは容器の内表面上にフィルムとして予め調製し
た形態で作製するのが好ましい。方法を実施するための
装置は試薬を担持した吸収材例えばパッド又はペーパー
の形態であり、その空間にはアッセイ混合物が収容され
ている。
て又は水溶液の形態で試薬を別々に添加することにより
実施され得る。しかしながら、試薬の少なくとも一部、
好ましくは全部を、好ましくは容器内で所要により凍結
させた溶液の形態、又は好ましくは乾燥した形態、より
好ましくは容器の内表面上にフィルムとして予め調製し
た形態で作製するのが好ましい。方法を実施するための
装置は試薬を担持した吸収材例えばパッド又はペーパー
の形態であり、その空間にはアッセイ混合物が収容され
ている。
試薬は、被検尿サンプルを添加する前に別の再構成ス
テップ例えば試薬を十分に溶解させるステップを必要と
しない形態が好ましい。従って、好ましい方法では液体
成分を尿サンプルから完全に抽出する（derived）。尿
サンプルは通常５〜250μｌ、好ましくは10〜100μｌ使
用する。
テップ例えば試薬を十分に溶解させるステップを必要と
しない形態が好ましい。従って、好ましい方法では液体
成分を尿サンプルから完全に抽出する（derived）。尿
サンプルは通常５〜250μｌ、好ましくは10〜100μｌ使
用する。
本発明の方法を実施するのに適したキットは、アッセ
イ混合物を収容するのに適したアッセイ容器とエラスタ
ーゼ基質を含む。基質は通常乾燥形態で容器内に収容さ
れているのが好ましい。本発明の好ましい具体例では上
記したタイプのプロテアーゼを含む。基質及び／又はプ
ロテアーゼが、同一又は異なる容器の表面上に所要によ
り水溶性フィルム形成性安定化剤を含む同一又は異なる
乾燥フィルムの形態にあるのが好ましい。
イ混合物を収容するのに適したアッセイ容器とエラスタ
ーゼ基質を含む。基質は通常乾燥形態で容器内に収容さ
れているのが好ましい。本発明の好ましい具体例では上
記したタイプのプロテアーゼを含む。基質及び／又はプ
ロテアーゼが、同一又は異なる容器の表面上に所要によ
り水溶性フィルム形成性安定化剤を含む同一又は異なる
乾燥フィルムの形態にあるのが好ましい。
好ましい形態のキットは、複数のウェル（容器として
作用する）を有するプレート例えば微量測定用プレート
を含む。前記器具は生化学的アッセイを実施しその後色
の変化を肉眼で観察したり、光の吸収を測定したり、螢
光を検出する装置として公知である。別の態様のキット
は吸収材を含み、該吸収材の空間には液体アッセイ混合
物が収容されており、従って該吸収材は容器を形成し得
る。取扱いを容易にするために、例えばペーパー又はパ
ッドから作成される吸収材を非吸収性不溶性材料のスト
リップ上に載置させるのが好ましい。吸収材は必要な試
薬の一部若しくは全部を含むように作成され得る。
作用する）を有するプレート例えば微量測定用プレート
を含む。前記器具は生化学的アッセイを実施しその後色
の変化を肉眼で観察したり、光の吸収を測定したり、螢
光を検出する装置として公知である。別の態様のキット
は吸収材を含み、該吸収材の空間には液体アッセイ混合
物が収容されており、従って該吸収材は容器を形成し得
る。取扱いを容易にするために、例えばペーパー又はパ
ッドから作成される吸収材を非吸収性不溶性材料のスト
リップ上に載置させるのが好ましい。吸収材は必要な試
薬の一部若しくは全部を含むように作成され得る。
通常、キットには尿を検査するための使用説明書が添
付されている。
付されている。
試薬が１種以上存在する場合には、試薬を同一又は別
の容器に収容してもよい。通常、単一の容器に全ての試
薬を収容して、被サンプルを容器に添加することによ
り、別の操作（即ちある容器から別の容器に材料を移動
させる）を伴うことなく全体のアッセイ混合物を調製す
ることが好ましい。
の容器に収容してもよい。通常、単一の容器に全ての試
薬を収容して、被サンプルを容器に添加することによ
り、別の操作（即ちある容器から別の容器に材料を移動
させる）を伴うことなく全体のアッセイ混合物を調製す
ることが好ましい。
試薬は、試薬混合物中の濃度が上記した値となるよう
な量含まれる。微量測定用プレートの場合、使用される
サンプル量は通常５〜250μｌ、より一般的には10〜100
μｌであり、基質は約10〜500μｇ、例えば約100μｇの
量含まれ、プロテアーゼは約25〜1250μｇ例えば約250
μｇ含まれる。
な量含まれる。微量測定用プレートの場合、使用される
サンプル量は通常５〜250μｌ、より一般的には10〜100
μｌであり、基質は約10〜500μｇ、例えば約100μｇの
量含まれ、プロテアーゼは約25〜1250μｇ例えば約250
μｇ含まれる。
適当には、尿中のエラスターゼアッセイは同一の尿に
対して細菌尿の検査と一緒に実施される。別の方法は培
養を実施しない方法でなければならず、好ましくはエラ
スターゼアッセイと同一時間内に結果が得られるもので
ある。同一の検出手段を使用するのが好都合であり、エ
ラスターゼアッセイと同一の微量測定用プレートの別の
ウェルで実施するのが好ましい。
対して細菌尿の検査と一緒に実施される。別の方法は培
養を実施しない方法でなければならず、好ましくはエラ
スターゼアッセイと同一時間内に結果が得られるもので
ある。同一の検出手段を使用するのが好都合であり、エ
ラスターゼアッセイと同一の微量測定用プレートの別の
ウェルで実施するのが好ましい。
細菌尿を検出するための適当なテストは例えば硝酸テ
スト（Griessテスト）、J.Lab.and Clin Med.（1961）,
490〜494に記載されているカタラーゼテスト、グルコー
スオキシダーゼテスト、例えばEP-A-91837に記載されて
いる細菌尿により加水分解され得る螢光発生性若しくは
クロロ−非有機（chloro-unorgenic）基質を使用するテ
スト、又は好ましくはJorgensenら（1973）,Applied Mi
cro.Biol.26,38〜42に記載されている。グラム陰性細菌
により生成したエンドトキシンを好ましくはゲル化カス
ケードで生じた酵素により加水分解され得る螢光発生若
しくは色素産生性基質を用いて検出するlimulus amoebo
cyte lysateアッセイである。
スト（Griessテスト）、J.Lab.and Clin Med.（1961）,
490〜494に記載されているカタラーゼテスト、グルコー
スオキシダーゼテスト、例えばEP-A-91837に記載されて
いる細菌尿により加水分解され得る螢光発生性若しくは
クロロ−非有機（chloro-unorgenic）基質を使用するテ
スト、又は好ましくはJorgensenら（1973）,Applied Mi
cro.Biol.26,38〜42に記載されている。グラム陰性細菌
により生成したエンドトキシンを好ましくはゲル化カス
ケードで生じた酵素により加水分解され得る螢光発生若
しくは色素産生性基質を用いて検出するlimulus amoebo
cyte lysateアッセイである。
本発明者らは、エラスターゼアッセイの結果はChemst
rip LNのエステラーゼテストよりも膿尿をより高い信頼
度で発見することができ、従って誤った結果を得る可能
性が少ないので本発明のアッセイは尿スクリーンにおい
て有用であることを知見した。
rip LNのエステラーゼテストよりも膿尿をより高い信頼
度で発見することができ、従って誤った結果を得る可能
性が少ないので本発明のアッセイは尿スクリーンにおい
て有用であることを知見した。
以下、本発明の実施例を示す。
実施例１ pH7.5の５％リン酸緩衝液380ml、蒸留・脱イオン水中
で作成したPVAの15％w/v溶液20ml、（Sigma製）サポニ
ン12g、２−Me（２−メトキシエタノール,BDH Analar）
100ml中に蛍光発生性エラスターゼ基質1gを含む溶液を
含有する試薬溶液を調製した。得られた溶液50μｌを、
微量測定用プレートのウェルに導入した。溶液を、溶液
が沸騰も凍結もしない条件下で実質的に全ての溶媒が除
去されるまで高温で真空乾燥させることにより乾燥させ
た。
で作成したPVAの15％w/v溶液20ml、（Sigma製）サポニ
ン12g、２−Me（２−メトキシエタノール,BDH Analar）
100ml中に蛍光発生性エラスターゼ基質1gを含む溶液を
含有する試薬溶液を調製した。得られた溶液50μｌを、
微量測定用プレートのウェルに導入した。溶液を、溶液
が沸騰も凍結もしない条件下で実質的に全ての溶媒が除
去されるまで高温で真空乾燥させることにより乾燥させ
た。
こうして作成したプレートを使用して、尿サンプル中
の白血球の存在を調べた。同時に、ペプチダーゼ酵素の
数も調べて、エラスターゼ活性の阻害減少性を観察し
た。ペプチダーゼ酵素を使用するときには、ウェル当た
り0.25mgを使用した。新鮮な尿サンプルを、ウェル当た
り50μｌの割合で各ウェルに導入した。次いで、プレー
トを37℃で30分間インキュベートした。
の白血球の存在を調べた。同時に、ペプチダーゼ酵素の
数も調べて、エラスターゼ活性の阻害減少性を観察し
た。ペプチダーゼ酵素を使用するときには、ウェル当た
り0.25mgを使用した。新鮮な尿サンプルを、ウェル当た
り50μｌの割合で各ウェルに導入した。次いで、プレー
トを37℃で30分間インキュベートした。
読取り結果 ウェルを蛍光計で読み取った。ゼノンランプを使用し
て、ウェルに360nmの波長でピークの光を当てた。
て、ウェルに360nmの波長でピークの光を当てた。
直ぐに、ウェルからの発光を光電子増幅管を用いて45
0nmでピークの発光をカウントすることによって読み取
った。
0nmでピークの発光をカウントすることによって読み取
った。
各尿サンプルを顕微鏡検査して、尿サンプル中に存在
する白血球及び赤血球の実際の数を調べた。赤血球の数
は、赤血球がエラスターゼの阻害に関与するかどうかを
見るために調べた。顕微鏡検査の結果を表１に示す。
する白血球及び赤血球の実際の数を調べた。赤血球の数
は、赤血球がエラスターゼの阻害に関与するかどうかを
見るために調べた。顕微鏡検査の結果を表１に示す。
蛍光計の検出結果を、表２に示す。900以上のカウン
トは、このアッセイが正と判定した。
トは、このアッセイが正と判定した。
上記結果から、尿サンプルNo.27の場合エラスターゼ
活性テストで正の結果を示し、このサンプルには顕微鏡
検査の結果でも臨床的に有意な数の白血球が含まれてい
た。また、上記結果からアッセイ結果が負の尿サンプル
（尿サンプルNo.8）には白血球が全く含まれていなかっ
た。尿サンプルNo.30及び51の場合には、ペプチダーゼ
を含まないアッセイの結果から、エラスターゼが尿サン
プル中で阻害されることが判明した。適当な酵素を選択
することによって阻害を減じることができた。従って、
Rhizopusペプチダーゼは両方の尿サンプルにおける阻害
を破壊するように考えられる。Aspergillus saitoiペプ
チダーゼは尿サンプルNo.51の阻害に影響を及ぼすが、
尿サンプルNo.30に対しては影響を及ぼさなかった。Asp
ergillus oryzaeペプチダーゼは基質そのものを加水分
解し、よって誤った正の結果を示した。
活性テストで正の結果を示し、このサンプルには顕微鏡
検査の結果でも臨床的に有意な数の白血球が含まれてい
た。また、上記結果からアッセイ結果が負の尿サンプル
（尿サンプルNo.8）には白血球が全く含まれていなかっ
た。尿サンプルNo.30及び51の場合には、ペプチダーゼ
を含まないアッセイの結果から、エラスターゼが尿サン
プル中で阻害されることが判明した。適当な酵素を選択
することによって阻害を減じることができた。従って、
Rhizopusペプチダーゼは両方の尿サンプルにおける阻害
を破壊するように考えられる。Aspergillus saitoiペプ
チダーゼは尿サンプルNo.51の阻害に影響を及ぼすが、
尿サンプルNo.30に対しては影響を及ぼさなかった。Asp
ergillus oryzaeペプチダーゼは基質そのものを加水分
解し、よって誤った正の結果を示した。
実施例２ プロテアーゼを全く添加せず且つサポニンを存在させ
るか（1.2mg/ウェル）若しくは別の５つのサンプルには
サポニンを存在させずに、実施例１を繰り返した。結果
を表３及び表４に示す。蛍光計で900以上のカウント
は、このアッセイで正と判定した。
るか（1.2mg/ウェル）若しくは別の５つのサンプルには
サポニンを存在させずに、実施例１を繰り返した。結果
を表３及び表４に示す。蛍光計で900以上のカウント
は、このアッセイで正と判定した。
上記結果から、尿サンプルNo.21,29及び58はサポニン
の存在下でアッセイに対して改良された正の反応を示
す。尿サンプルNo.33は影響を受けなかった例である。
の存在下でアッセイに対して改良された正の反応を示
す。尿サンプルNo.33は影響を受けなかった例である。
尿サンプルNo.38のアッセイの結果（真に負）から、
アッセイそのものはサポニンの影響を受けないことが判
明した。
アッセイそのものはサポニンの影響を受けないことが判
明した。
実施例３ （蒸留・脱イオンした）水800ml,オルトリン酸水素二
ナトリウム（無水）36.15g、オルトリン酸二水素カリウ
ム4.0g及びCHAPS 9.0gを用いて緩衝溶液を調製した。溶
液を水を用いて900mlとした。前記実施例で使用したの
と同一の基質2gを含む溶液を、DMSO 20ml中で調製し、
緩衝液に添加した。Rhizopusペプチダーゼ5.0gを基質溶
液に溶解させた。溶液50μｌを微量測定用プレートのウ
ェルに導入し、溶液を真空乾燥により乾燥させた。実施
例１と同様にしてプレートを使用し、同調の結果を得
た。
ナトリウム（無水）36.15g、オルトリン酸二水素カリウ
ム4.0g及びCHAPS 9.0gを用いて緩衝溶液を調製した。溶
液を水を用いて900mlとした。前記実施例で使用したの
と同一の基質2gを含む溶液を、DMSO 20ml中で調製し、
緩衝液に添加した。Rhizopusペプチダーゼ5.0gを基質溶
液に溶解させた。溶液50μｌを微量測定用プレートのウ
ェルに導入し、溶液を真空乾燥により乾燥させた。実施
例１と同様にしてプレートを使用し、同調の結果を得
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 サイモン・ジユリアン・ロウランド・ヒ ル イギリス国、ウエスト・サセツクス、イ ースト・グリンステツド、サツクビル・ ガーデンズ・45 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/37
Claims (17)
- 【請求項１】白血球の存在を検出するための尿検査方法
であって、尿サンプルとアッセイ混合物中のエラスター
ゼにより加水分解されてその存在がアッセイ混合物で検
出され得る化合物を形成する酵素基質とを含むアッセイ
混合物を調製後、化合物を検出することからなることを
特徴とする方法。 - 【請求項２】尿サンプルが直接尿サンプルであることを
特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】エラスターゼ基質が実質的に白血球エステ
ラーゼ、トリプシン又はキモトリプシンにより加水分解
され得ないことを特徴とする請求項１又は２に記載の方
法。 - 【請求項４】エラスターゼ基質が式Ｉ Ｒ1−Ａ4−Ａ3−Ａ2−Ａ1−CONH−Ｒ2 （式中、 Ａ1はアラニル、バリル、フェニルアラニル及びメチオ
ニルから選択されたアミノ酸残基であり、 Ａ2は結合又はプロピル、アラニル及びロイシルから選
ばれたアミノ酸残基であり、 Ａ3は結合又はアラニル残基であり、 Ａ4は結合又はアラニル残基であり、 Ｒ1はグルタリル又はＮ−末端封鎖基であり、 及び Ｒ2は化合物R2NH2がアッセイ媒体中で検出され得るよう
に選択される） を有する化合物であることを特徴とする請求項１〜３の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項５】Ｒ1がアセチル（Ac）、スクシニル（Su
c）、メトキシスクシニル（MeOSuc）、ｔ−ブチルオキ
シカルボニル（Boc）及びグルタリル（Glt）から選択さ
れることを特徴とする請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】基質がトリ−もしくはテトラペプチド誘導
体、好ましくは式中Ａ1がアラニル又はバリル、より好
ましくはバリルであり、Ａ2がアラニル又はプロリルで
あり、Ａ3がアラニルであることを特徴とする請求項４
又は５に記載の方法。 - 【請求項７】エラスターゼ基質が、 Ac-Ala-Ala-Ala Ac-Ala-Ala-Pro-Ala Ac-Ala-Ala-Pro-Phe Ac-Ala-Pro-Ala Boc-Ala Boc-Ala-Ala Boc-Ala-Ala-Ala Boc-Ala-Ala-Pro-Ala Boc-Ala-Ala-Pro-Val Glt-Ala-Ala-Ala MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val Suc-Ala-Ala-Ala Suc-Ala-Ala-Pro-Met Suc-Ala-Ala-Val Suc-Ala-Try-Leu-Val及び Pyr-Pro-Val から選択されるペプチド誘導体、好ましくはMeOSuc-Ala
-Ala-Pro-Valの誘導体であることを特徴とする請求項１
又は２に記載の方法。 - 【請求項８】アッセイ混合物中の化合物を光学検出方
法、好ましくは濁度測定法、分光光度法、又は最も好ま
しくは螢光光度法により検出することを特徴とする請求
項１〜７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】化合物を直接光学検出手段、好ましくは基
質に対して異なる螢光特性を有する光学検出手段、より
好ましくはクマリン誘導体を用いて検出し得ることを特
徴とする請求項４に記載の方法。 - 【請求項１０】基質がMeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMCであ
ることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項１１】アッセイ混合物が、エラスターゼ阻害を
低下もしくは除去し得るが基質を加水分解しないプロテ
アーゼ酵素をも含むことを特徴とする請求項１〜10のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】アッセイ混合物が、エラスターゼ阻害低
下特性を有する活性化剤、好ましくは表面活性剤、より
好ましくはサポニン、トリトン及びCHAPSから選択され
た表面活性剤をも含むことを特徴とする請求項１〜11の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】アッセイ混合物を、好ましくは乾燥形態
のアッセイ混合物を調製するための試薬の一部もしくは
全部を既に収容したアッセイ容器に尿サンプルを添加し
て作製することを特徴とする請求項１〜12のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項１４】請求項１〜13のいずれかに記載の方法を
実施するのに用いるキットであって、アッセイ混合物を
収容するのに用いるアッセイ容器、エラスターゼ基質、
及び所要により請求項11に記載した如きプロテアーゼ酵
素及び／又は請求項12に記載した如き活性化剤を含むこ
とを特徴とするキット。 - 【請求項１５】基質が好ましくは乾燥形態で容器に収容
されていることを特徴とする請求項14に記載のキット。 - 【請求項１６】キットに尿検査に使用するための使用説
明書が添付されていることを特徴とする請求項14又は15
に記載のキット。 - 【請求項１７】前記尿の別のサンプルについて細菌尿を
検査するための試薬及びそのための容器を含み、好まし
くは複数のウェルを有するプレート、より好ましくは微
量測定用プレートを含むことを特徴とする請求項14〜16
のいずれかに記載のキット。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8727794 | 1987-11-27 | ||
| GB878727794A GB8727794D0 (en) | 1987-11-27 | 1987-11-27 | Urine assay process and kit |
| GB8727795 | 1987-11-27 | ||
| GB878727795A GB8727795D0 (en) | 1987-11-27 | 1987-11-27 | Process and kit for enzyme assay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH022397A JPH022397A (ja) | 1990-01-08 |
| JP2781974B2 true JP2781974B2 (ja) | 1998-07-30 |
Family
ID=26293106
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63300421A Expired - Lifetime JP2781974B2 (ja) | 1987-11-27 | 1988-11-28 | 尿検査方法及びキット |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0318318A1 (ja) |
| JP (1) | JP2781974B2 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69126592T2 (de) * | 1990-10-15 | 1998-01-08 | Tecnogen Scpa | Nicht-lineare Peptide, die hydropatisch komplementär zu bekannten Aminosäuresequenzen sind, Verfahren zur Herstellung und Verwendung davon |
| ZA926185B (en) * | 1991-08-22 | 1993-03-01 | Merrell Dow Pharma | Novel orally-active elastase inhibitors. |
| US5714470A (en) * | 1991-08-22 | 1998-02-03 | Merrell Pharmaceuticals, Inc. | Orally-active elastase inhibitors |
| US5478811A (en) * | 1991-08-22 | 1995-12-26 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Orally-active elastase inhibitors |
| ES2161293T3 (es) * | 1994-06-02 | 2001-12-01 | Merrell Pharma Inc | Derivados de enol acilados como profarmacos de inhibidores de la elastasa. |
| NZ284766A (en) * | 1994-06-02 | 1998-06-26 | Merrell Pharma Inc | Perfluoro amino ketones; medicaments as elastase inhibitors |
| US6172044B1 (en) | 1995-12-01 | 2001-01-09 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Acylated enol derivative of α-ketoesters and α-ketoamides |
| US5948886A (en) * | 1996-11-20 | 1999-09-07 | Hoechst Marion Roussel, Inc. | Acylated enol derivatives of α-ketoesters and α-ketoamides |
| WO2012104620A2 (en) * | 2011-01-31 | 2012-08-09 | Systagenix Wound Management Ip Co. B.V. | Wound prognosis |
| CN111044723A (zh) * | 2018-10-12 | 2020-04-21 | 谢鲍生物科技股份公司 | 含有胰弹性蛋白酶-1-特异性的抗体以及样品准备装置的新型测试试剂盒 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2594955B1 (fr) * | 1986-02-21 | 1989-05-26 | Arley Guillaubey Laboratoires | Agent de diagnostic, son procede de preparation et sa methode d'emploi |
-
1988
- 1988-11-25 EP EP88311209A patent/EP0318318A1/en not_active Withdrawn
- 1988-11-28 JP JP63300421A patent/JP2781974B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH022397A (ja) | 1990-01-08 |
| EP0318318A1 (en) | 1989-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5804395A (en) | Fluorescence polarization assays of enzymes and substrates therefore | |
| US9315851B2 (en) | Methods, peptides, and biosensors useful for detecting a broad spectrum of bacteria | |
| US4748116A (en) | Peptide substrates for determination of protease activity | |
| FI85988B (fi) | Screeningsfoerfarande foer gram-negativa bakterier och foer bakteruri orsakad av dessa, i screeningsfoerfarandet anvaendbar enhetlig screeningsanordning och foerfarande foer framstaellning av den. | |
| CA1152494A (en) | Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes | |
| JP3524120B2 (ja) | 前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定用キット及び試料の判定方法 | |
| Dolbeare et al. | Flow cytometric measurement of peptidases with use of 5-nitrosalicylaldehyde and 4-methoxy-beta-naphthylamine derivatives. | |
| EP2211167B1 (en) | Method and kit for measurement of endotoxin level | |
| US7410769B2 (en) | Peptide biosensors for anthrax protease | |
| Quigley et al. | An endopeptidase inhibitor, similar to mammalian alpha 2-macroglobulin, detected in the hemolymph of an invertebrate, Limulus polyphemus. | |
| JP2781974B2 (ja) | 尿検査方法及びキット | |
| FI96434B (fi) | Laite fluoresenssin vahvistamiseksi ja kinetiikka ja menetelmiä laitteen käyttämiseksi | |
| JP2004147650A (ja) | トリコモナスなどのヒドロラーゼのアッセイ法 | |
| EP1497452B1 (en) | Methods for measuring enzyme activity | |
| EP0320154A1 (en) | Body fluid assay and kit | |
| Freydière et al. | Rapid methods for identification of the most frequent clinical yeasts | |
| Sardesai et al. | A fluorometric method for determining the tame esterase (tryptic) activity of plasma | |
| EP1517997A2 (en) | Luminogenic protease substrates | |
| US20060014233A1 (en) | Methods for measuring ADAMTS13 activity and protein on platelets and in plasma | |
| EP0292708A2 (en) | Detection of Bacteroides gingivalis | |
| JP2004507252A (ja) | サンプル中の標的微生物検出のための組成物および方法 | |
| AU674829B2 (en) | Diagnosing periodontal disease by measuring proteolytic activity of periodontopathogenic bacteria | |
| JP2662228B2 (ja) | 歯周病原性菌検査薬 | |
| US6413734B1 (en) | Method for judging effectiveness of drug having protease inhibitory activity | |
| AU2650601A (en) | Urinary trypsin inhibitor assay containing a chelating agent |