JPH022397A - 尿検査方法及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、尿中の白血球の存在を同定するための尿検査
方法（ｕｒｉｎｅ　ａｓｓａｙ　ｐｒｏｃｅｓｓ）に関
する。

病院の微生物検査室で分析されるサンプルの最高５０％
が尿サンプルである。検査されるサンプルの少なくとも
８０％乃至９０％は臨床的な徴候を認めないものである
。尿サンプルを徹底的に検査するためには顕微鏡検査及
び／又は培養を実施しなＧノればならず、時間と熟練し
た技術を要する。従って、培養及び顕微鏡検査により検
査しなければならないサンプルの数を減らすために負の
サンプルを除外できれば望ましい。可能ならば全ての正
のサンプルを同定できるように、テストはかなり特異的
でなければならない。経済的に有用であるためには、テ
ストは正のサンプルと負のサンプルを非常に特異的に区
別でき、・高率で負のサンプルを同定できるものでなけ
ればならない。

−船釣に、尿中に多数の白血球、例えば１０個／−以上
の白血球が検出されると臨床的に多数の細菌が存在する
ことを意味するので、尿中の白血球数は例えば無症候性
感染症の発見又は尿中の病原体と汚染物質とを区別する
際の指標として利用されている。尿中の白血球数はより
少ない数の細菌の存在をも意味するので、感染を伴なわ
ない炎症又はｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｎ＋ａ
ｔｉｓ　、　ｍｙｃｏｐｌａｍａ　ｓｐｐ又はｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅのような成る秒の媒
介物による感染の指標となり得る。尿中の白血球を検出
・定量する幾つかの方法が提案されている。

一つの方法は、ダラム染色により或いは容積定量チャン
バ内にて遠心分離されていない尿を顕微鏡検査する方法
である。遠心分離した尿を顕微鏡検査することもできる
が、遠心分離は余分なステップであり、使用した容量、
遠心分離速度及び時間及び操作方法による差を受けやす
い。顕微鏡検査は長時間を要し目つ比較的熟練した技術
をも要する。更に、尿中の白血球は、ｐＨの上昇、浸透
圧濃度の低下及び温度の上昇に伴なって死滅することも
知られている。

別の最近開発された方法はＣ０ｕｌｔｅｒカウンターを
用いて粒子サイズの分布を分析する方法であるが、この
方法は高価な装置を使用する貞で病院の検査室や多数の
サンプルを検査する場合には実用的でない。

更に最近開発された検査法はＡｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｈｉ
ｃｒｏ−ｓｃｏｐｙ　ｓｙｓｔｅｍｓから販売されてい
る所謂Ａｕｔｏｔｒａｋである。この自動検査方法では
、尿サンプルをサンプル中の微生物と白血球の両方を染
色する橙アクリジンで染色侵、染色したサンプルをエビ
−螢光（ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）ｌａ微鏡
を用いて調べる。この分析システムは白血球から発する
螢光と微生物から発する螢光を区別することができるの
で、このシステムを用いることによりサンプル中の白面
球数を調べることができる。このシステムに関する問題
はこのシステムが尿スクリーン検査にしか利用できない
ことである。

尿中の白血球の存在を検出するための化学的方法も開発
されている。その一つは、Ｃｈｅｍｓｔｒｉｐ　ＬＭの
商品名で市販されているデイツプスティックである（に
ｕｓｕＩｌ＋ｉら、　ＪＡ１４八２４５．１６５３〜１
６５５参照）。

プラスチックストリップはエステラーゼに対する基質で
あるインドキシルカルボン酸エステルを含有する１紙パ
ッドを有しており、前記エステルは空気中で酸化されて
インドギシルに変化し、青色のインジゴを形成する。に
ｕｓｕｎ＋ｉはこの検査法は膿尿に対するスクリーンと
して非常に高感度であり且つ特異的である（１０個／−
以上）と述べているが、最近の報告によるとこの検査法
が高感度であり特異的であるかは疑わしい。例えば、Ｗ
ｉｌｋｉｎｓら［Ｊ、　ｃｌｉｎ、　Ｐａｔｈ、’０１
．（１９８５）、　３８．１３４２〜１３４５］Ｈｕｒ
ｒａｙら　　［Ｊ、　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｍｉｃｒｏ、　
　Ｂｉｏｌ、（１９８７）、　　２５４６７〜４７０　
］及び向ら［Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏ、　Ｂｉｏ
ｌ。

（１９８５）、　２１，７９６〜１９９］は、エステラ
ーゼストリップの感度及び特異性が不十分であるために
この検査法は有用でないと述べている。また、Ｗｉｌｋ
ｉｎｓらは色変化が判断しにくいときがあると報告して
いる。Ｍｕらは成る種の抗体特にアミノグリコシドを使
用すると白血球のエステラーゼ活性が阻害されると報告
している。

［Ｐ−Ａ−０２３７３９４には、コリンエステラーゼの
色素産生性基質を尿中の白血球の存在を測定するための
アッセイに使用する旨が開示されている。

ＩＥＰ−Ａ−００１２９５７’（及びＵＳ−Ａ−４２７
８７６３）には、アミノ酸及びペプチドの色素産生性イ
ンドキシルエステル誘導体が向神経性白血球顆粒球にお
けるエステラーゼに対する基質として開示されている。

前記誘導体は、水溶液中茂原以外の体液中のエラスター
ゼ、キモトリプシン及びトリプシンを含めたタンパク分
解酵素を検出するために該酵素により加水分解される。

ＥＰ−Ａ−０１５８２２５（及ヒＵＳ　４７５８５０８
）　ｒ　Ｌｔ、フェノールエステルである基質が例えば
尿中の白血球におけるエステル分解若しくはタンパク分
解酵素に対するアッセイに使用されている。１つの基質
はフェノール誘導体のアラニルエステルである。

他の尿スクリーンは白血球と反応させる。例えば、Ｂａ
ｃ−Ｔ−３ｃｒｅｅｎ　（Ｈａｒｉｏｎ　５ｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ）システムは尿を１
紙に通した後サフラニン染料を１紙に加える比色濾過シ
ステムである。尿中の細菌及び白血球の両方が染料に保
持され、ピンク色を？する。しかしながら、この検査法
では細菌と白血球を区別することができず、尿中の各種
組ｍハ例えば染料及び血液がスクリーンを寒いでサンプ
ルの通過を阻止するため、この検査法では分析できない
尿の割合が高い。

更に自動化された検査法は生物ルミネセンスを使用し、
螢ルシフェラーゼが細菌性＾ＴＰと定晴的に反応してル
ミネセンスを発する作用を利用したものである。このシ
ステムは、Ｕｌｒｉｃｈ　ａｎｄＷａｎｎｌｕｎｄ、　
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔ
　Ｉｔｅｖｉｅｗ。

Ｎｏｖｅｌｌｌｂｅｒ１９８４に記載されている。この
システムによれば白血球由来の数種の哺乳類ＡＴＰ及び
細菌性＾ＴＰを検出することができるが、両者を区別す
ることはできない。また、このシステムはかなりの労力
を要し、高価な試薬を使用する。

白血球が、エラスターゼが存在するが故にプロテアーゼ
活性に富んでいることは公知である。

Ｂａｒｒｅｔｔ　［Ｈｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏ１６ｑｙ　（１９８１）、　８０５８１〜５８８］は
、酵素が白血球から精製され得るか又は化ｍ痰及びヒト
肺臓やリウマヂ様滑液膜から単離され得ると述べている
。

エラスターゼは肺気腫のような疾患に関与し、多分この
疾患に特有な肺組織のタンパク分解を生ずるものと考え
られてきた。エラスターゼは炎症そのものの仲介物を産
生ずる点で他の炎症性疾患にも関与すると考えられてき
た。酵素をアッセイすることは、前記した炎症性疾患の
研究及び治療方法の開発ヒ重要である。

Ｃａ５ｔ　ｉ　Ｉ　Ｉｏら　［八ｎａｌｙｔｉｃａｌ　
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　！９コ１５３〜６４（
１９７９）　］は、エラスターぜをアッセイするために
各種合成ペプチド基質を調べた。各種基質は同一のペプ
チド基を含み、エラスターゼ加水分解によって放出され
る′Ｍ離基（Ｉｅａｖｉｎｇｏｒｏｕｐｓ）は異なる。

遊離基の１つはｐ−ニトロアニリンを形成した。２つの
基質は螢光光度的に検出可能な螢光化合物、１−メトキ
シ−３−ナフチルアミン及び７−アミノ−４−メチルク
マリンを生じた。別の基質はチオベンジルエステルであ
り、別の試薬と反応してベンジルメルカプタンを生成し
た。即ち、５．５°−ジヂオビス■−ニトロ安息香ＦＭ
　（Ｆｌ１ｍａｎ試薬）と反応して３−カルボキシ−４
−二トロチオフエノキシトアニオンを生成し、或いは４
，４°−ジチオジピリジンと反応して４−チオピリドン
を生成した。前記生成物は夫々４ｔ２ｒ＋ｍ及び３２４
ｎｍでの光の吸収を測定することにより検出され得る。

別の基質はペプチドのエチルエステルであり、エラスタ
ーゼ加水分解によりエタノールを生成する。このエタノ
ールはアラレイ混合物中にＮａり一及び肝アルコールデ
ヒドロゲナーゼを含有さけることにより同定され得、３
４０ｎｍでの吸収を測定することにより分析され得るＮ
ＡＤＨ’を生成する。アッセイは全て反応混合物中に存
在する少鎖の１ラスターゼを検出できた。

精製エラスターゼを使用した。

Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ　　ら　［Ｈｅｔｈｏｄｓ　　ｏｆ
　　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　　Ａｎａｌｙ−ｓｉｓ”　３
ｒｄ　Ｅｄ、　　Ｖｏｌ、５．１７６〜１８４　］には
、Ｓｕｃ八ｌａ　へ−Ａｌａ　　−Ａｌａ−Ｎａ、Ｈｅ
０３ｕｃ−Ａｌａ　　−Ａｌａ　　−ｐｒｏ　−Ｖａｌ
　　−ＮＡ及びＳｕｃ　　−Ａｌａ　−Ａｌａ　−Ｖａ
ｌ　　−ＮＡを含めた合成色素産生性若しくは螢光発生
性ペプチド基質を使用する、ヒト白血球エラスターゼの
アッセイを記載している。この方法は抽出酵素を使用し
、具体的にはヒト血液からの抽出方法が記載されている
に過ぎない。

Ｗｅｎｚｃ　Ｉら［Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ
、　　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

（１９８０）、　　３６１．１４１３〜１４１６］は、
精製ヒト白血球エラスターゼ及びブタ膵エラスターゼの
５ｕｃＡｌａ　−Ａｌａ　−Ｖａｌ　−ＨＡ、　Ｈｅ０
３ｕｃ−Ａｌａ　−Ａｌａ　−Ｐｒｏ　　−Ｖａｔ　　
−ＨＡ及びＡＣ−八１ａ　−Ａｌａ　　−Ｐｒｏ　　−
Ｖａ−Ｎａに対する作用動態を比較している。

Ａｓｈｅ及びＺｉｌｌｌｌｌｌｅｒｌｌｌａｎ　　［Ｂ
、Ｂ、Ｒ，Ｃ，Ｈ，１９４〜１９９（１９７７）　］は
、エラスターゼに対するアッセイ方法においてエラスチ
ンを基質として使用し、生成物を螢光検出により同定し
ている。精製エラスターゼ酵素を使用した。

血漿中のエラスターゼが、α１−プロテアーゼ阻害剤と
して公知のエラスターゼのＢ素活性を完全に阻害する阻
害剤と複合体を形成することは公知である。血漿中の数
種のエラスターゼがα２マクログロブリンと結合するこ
とも公知である。

後者の複合体において酵素は酵素活性を保持する。

実際、Ｔｗｕｍａｓｉ　ら［Ｎａｔｕｒｅ　（１９７７
）、　２６７、６１〜６３］は、ヒト白血球エラスター
ゼがヒトα２−マクログロブリンによりＳｕｃ　（八Ｉ
ａ）３Ｎ八に対して活性化される旨示唆している。しか
しながら、前記複合体が比較的少なく且つ循環により急
速に消失してしまうため、その同定は余り有用でない。

前記した問題に関する一つの方法が、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｗ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　２］１
９８４）、　　（１１）３〜（１１）７に記載されてい
る。この文献でＮｅｕＩＩｌａｎらは阻害剤−エラスタ
ーゼ複合体に対する免疫アッセイを述べている。この方
法は、多段階を含む方法であるために時間と労力を要す
る他、高価な試薬を使用するといった幾つかの欠点を有
する。

本発明者らは、エラスターゼ活性の阻害が血漿のみなら
ず、尿のような他の体液中でも生ずることを知見した。

尿中でエラスターゼが阻害される一因は、多分尿中に血
液が存在するためであり、こうした現象は人口の一部、
特に成る秒の疾患患者で認められる。

他の基質がエラスターゼ活性を阻害することは公知であ
り、治療薬としての使用可能性についての研究が進めら
れたきた。八ｓｈｅ及びＺｉｌｌｌｌｅｒｌｌｌａｎ（
１掲文献参照）は、ヒト顆粒球エラスターゼがオレイン
酸のようなｃｉｓ−不飽和脂肪酸により阻害されると述
べている。ｖｅｒｅｄら［八ｉ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐ
ｉｒＤｉｓ、　（１９８５）、　１３１〜１３３］は、
温和な変性剤例えばドデシル硫酸ナトリウムによりエラ
スターゼから解離され得る肺炎連鎖球菌由来のペプチド
によりエラスターゼが阻害される旨述べている。

Ｃａ５ｔｉｌｌｏら（１掲文献参照）は、ＤＨＳＯ（ジ
メチルスルホキシド）がエラスターゼを刺激することが
判明したが、その理由は解明されていないと述べている
。Ｂｉｅｔｈ　ａｎｄ　Ｗｅｒｍｕｔｈ　　（１掲文献
参照）はＤＨＳＯ及びＤＨＦ　　（ジメチルホルムアミ
ド）がエラスターＬに対する阻害作用を有していると述
べているが、Ｌｅｓｔｉｅｎｎｅ　ａｎｄ　Ｂｉｅｔｈ
　　［Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｃｍ。

（１９８０）、　２５５　、８９〜９２９４　］は白血
球エラスターゼが過剰の１５賀、疎水性溶媒及びイオン
強度により活性化されると述べている。Ｂｏｕｄｉｅｒ
ら［Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８１）、　２５６　、
　１０２５６〜１０２５８１は、別の白血球プロプアー
ゼであるカテプシンＧにより白血球エラスターゼが活性
化されると述べている。効果（ｅｒｒｅｃｔ）は合成基
質を使用した場合には見られず、多分エラスチンに対す
るカテブシンＧのタンパク分解作用によるのであろう。

これらの実験は精製エラスターゼについて実施したもの
である。ＪＰ−Ａ−５７−１６（１１）８２には、膵エ
ラスターゼの先駆体を例えばＲｈ１ＺＯｐＵＳより産生
される酸性プロテアーゼを用いて１０時間処理すると該
先駆体が活性化される旨が記載されている。

本発明の白血球の存在を検出するための新規な尿検査方
法は、まず尿サンプルと酵素基質とを含むアッセイ混合
物を調製する。該基質はアッセイ混合物中のエラスター
ゼにより加水分解されてその存在をアッセイ混合物中で
検出し得る化合物を形成する。次いで、化合物を検出す
ることからなる。

アッセイにかけるサンプルは直接（ｄｉｒｅｃｔ）尿サ
ンプルでも、希釈されていても、遠心分離された尿でも
よい。余分なステップを避けるために、直接尿サンプル
を使用することが好ましい。

本発明において好ましいｉ！質は非常に高感度で且つ特
異的な白血球エラスターゼ基質であり、白血球エステラ
ーゼ、トリプシン又はキモトリプシンにより実質的に加
水分解され得ないもの、即ちプロテアーゼによる加水分
解が１ラスターゼによる加水分解速度よりも遅いか若し
くは全くプロテアーゼにより加水分解され得ないもので
ある。

適当な基質は式Ｉ Ｒ１ｉ、　４−−　Ａ３　　Ａ　２−Δ１−ＣＯＮＨ−
Ｒ２を有する化合物である。上記式中、 Ａ１は非極性側鎖を有するアミノ酸残１４、好ましくは
アラニル、バリル、フェニルアラニル及びメチオニルか
ら選択されたアミノ酸残基であり、Ａ２は結合（ｂｏｎ
ｄ）又は非極性側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ま
しくはプロピル、アラニルＡ３は結合又は非極性側鎖を
有するアミノ酸残基であり、好ましくはアラニル残基で
あり、Ａ４は結合又は非極性側鎖を有するアミノ酸残基
であり、好ましくはアラニル残基であり、Ｒ１はグルタ
リル又はＮ−末端封鎖基であり、及び Ｒは化合物ＲＮＨ２がアッセイ媒体中で検出され得るよ
うに選択される。

好ましくは、Ｒ１はアセチル（Ａｃ）、スクシニル（Ｓ
ｕｃ）、メトキシスクシニル（Ｈｅ０３ｕｃ）、　ｔ−
プチルオキシ力ルポニノに（Ｂｏｃ）及びグルタリル（
Ｇｌｔ）から選択される。好ましい化合物は、式中Δ１
がアラニル又はバリル、より好ましくはバリルであり、
Ａ２がアラニル又はプロリルであり、Ａ３がアラニルで
ある化合物のようなトリーもしくはテトラペプチド誘導
体である。Ｈｅ０３ｕｃは特に好ましい基Ｒ１である。

及びロイシルから選択されたアミノ酸残基であり、本ア
ッセイで使用されるエラスターゼ基質はエラスターゼ酵
素に対して特異的なペプチド誘導体である。基質として
適当なペプチド誘導体は多数公知であり、この中には Ａｃ−Ａｌａ−Ａａ−Ａｌａ ＡＣ−八ｌａ　　−Ａｌａ　　−Ｐｒｏ　　−Ａ　　ａ
Ａｃ−八Ｉａ　　−Ａｌａ　　−Ｐｒｏ　　−Ｐｈｅ＾
Ｃ−八ｌａ　　−Ｐｒｏ　　−＾１ａＢｏＣ−Ａｌａ Ｂｏｃ　　−Ａｌａ　　−八１ａ ８ＯＣ−＾１ａ−Ａｌａ−＾１ａ Ｂｏｃ　　−Ａｌａ　　−八Ｉａ　　−Ｐｒｏ　　−Ａ
ｌａＢｏｃ−Ａｌａ　−Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−ＶａｔＧ
ｌｔ　　−Ａｌａ　　−Ａｌａ　　−八１ａＨｅＯ３ｕ
ｃ−Ａｌａ　　−八Ｉａ　　−Ｐｒｏ　　−ＶａｌＳｕ
ｃ　　−Ａｌａ　−八Ｉａ　　−ＡｌａＳｕｃ　−Ａｌ
ａ　−Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−ＮｅｔＳｕｃ　　−Ａｌａ
　−Ａｌａ　　−ＶａＳｕｃ　　−八Ｉａ　　−Ｔｒｙ
　　−Ｌｅｕ−ＶａＰｙｒ　　−Ｐｒｏ　　−Ｖａ のアミド又は（余り好ましくはないが）エステル誘導体
が包含される。

好ましいＭ質は、Ａｌａ　−Ａｌａ　−Ｐｒｏ−Ｖａｌ
及びＡｌａ　−Ａｌａ−Ｖａｌの好ましくはアミド誘導
体の封鎖（ｂｌＯｃｋｅｄ）誘導体である。

最も好ましい基質はＨｅ０３ｕｃ−Ａｌａ　−Ａｌａ　
−Ｐｒ。

−Ｖａｔのアミド誘導体であり、この誘導体については
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ＢｉｏｃｈｅｎｉｓｔｒＶ　（
１９７９）、　９９．５３〜６４に記載されている。

アッセイ混合物中の化合物の検出は、光学検出方法、例
えば濁度測定法、分光光度法、又は最も好ましくは螢光
光度法により実施することが最も便利である。ペプチジ
ル基質の誘導基（ｄａｒｉｖａｔｉ−ｓｉｎａ　ｇｒｏ
ｕｐ）は、基質がエラスターゼにより加水分解されたと
きに光学手段により直接検出されるか又は余り好ましく
はないが間接的に検出され得るような化合物を生ずるも
のである。例えば、サンプル中で更に反応して光学手段
により検出され得る生成物を生ずるものである。

光学検出手段（よ、特定波長のｉＩ視光線の反（ト）。

吸収若しくは螢光を検出する手段又は濁度の変化を検出
する手段を含む。従って、例えば基質の加水分解により
生じた化合物は、その螢光特性が基質自体の螢光特性と
異なるもの、異なる波長で螢光を発するものであり得る
。或いは、化合物が基質とは異なる色を有していてもよ
く、光の吸収又は反射を分光光度的に又は単に可視的に
測定し得る。

加水分解により生ずる化合物が光学検出手段により直接
観察され得るものでなくてもよく、試薬混合物中の伯の
成分と反応して１２察し得る化合物を生成するものであ
ればよい。更なる反応は単なる化学反応であるか又は酵
素触媒反応であり得る。

例えば、化合物をカップリング剤と反応させてアゾ染料
のような染料を生成させてもよい。化合物又は化合物の
他の反応生成物が、例えばＵＳ４４９５２９３に記載さ
れている如く成分により発せられる螢光を吸収すること
によってアッセイ混合物中の他の成分の光学的性質に影
響を与えてもよい。

好ましくは、誘導基は螢光発生性基である。前記した適
当な基質としては、４−メトキシ−β−ナフチルアミド
（４８βＮ＾）及びβ−ナフチルアミド（βＮＡ）の誘
導体を含むβ−ナフチルアミド類、７−アミノ−クマリ
ン誘導体例えば７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭ
Ｃ）　ｌ導体及び１−アミノ−４−トリフルオロメチル
クマリン（ＡトＣ）　ｌ導体のようなりマリン誘導体が
例示される。前記基質の加水分解により生成される螢光
化合物は公知の方法及び装置により検出され得る。

別の適当な誘導基は着色化合物を生成するものであり、
前記した着色化合物は肉眼により又は通常特定の波長の
光の吸収を測定することにより分光光度的に直接観察さ
れ得る。基質は例えばｐ−二トロアニリン若しくはｐ−
ジエチルアミノアニリンのアミド誘導体、叶ニトロフェ
ノールのニスデル及び２−ナフトールのエステルであり
得る。

他の誘導基は直接観察され得る化合物を生成しないが、
試薬混合物中に存在する他の成分と更に反応して光学的
に検出可能な化合物を生成し得るものである。前記した
追加の成分はＵ合物に特に添加しても、又サンプル中に
存在さＶてもよい。

基質は例えば、加水分解生成物がＣａ５ｔｉｌｌｏ（１
掲文献参照）に記載されている如き方法により検出され
得るエチルエステル又はチオベンジルエステルである。

使用可能な別の基質は、Ｑｕｉｎｎ　ａｎｄ　Ｂｌｏｕ
ｔ［ＢＢＲＣ（１９７０）　４０．３２８〜３３３］に
記載されている如き光学的に検出可能なラベルを有する
エラスチンである。エラスチンは水に不溶性であるため
に、余り好ましくない。

本発明に使用するのに最も好ましい基質はＨｅｏ−３ｕ
ｃ　−Ａｌａ　−Ａｌａ　−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−八ＨＣで
あり、これはヒト白血球エラスターゼに対して非常に特
異的であり且つその加水分解生成物ＡＭＣは螢光検出に
より少量消去（ｄｅｌｅｔｅ）され得る。

基質の加水分解はアッセイ混合物中の化合物の存在を定
期的に観察づることによって連続的にモニターされ得る
。または、反応の終点を観察したり、全ての基質が加水
分解された後である必要はないが所定時間後アッセイ混
合物を分析しても−よい。アッセイ方法は、サンプル中
の白血球の数を測定したり、巾に白血球数がカットオフ
価以上、好ましくは８乃至１０個／−−尿以ヒであるこ
とを示すために使用される。

本発明者らの知見によれば、尿サンプル中にエラスター
ゼ活性のＭ害剤が存在する場合があり、従ってこの、阻
害を低下若しくは消失させる試薬をアッセイ混合物中に
添加するのが有利である。本発明者らの知見によれば、
成る種のプロテアーゼ酵素は酵素そのものの、活性に影
響を及ぼすことなく又は酵素基質に対してタンパク分解
作用を示すことなく阻害を減じることができる。これら
の酵素の１種をアッセイ混合物中に添加することが好ま
しい。

本発明者らは、アッセイ混合物中に酵素を添加すること
は尿以外の体液のテストにＪ３ける阻害を低下させるの
に有用であると判明した。本発明のエラスターゼについ
て体液サンプルを）アッセイするための新規な方法は、 ａ）液体サンプル。

ｂ）エラスターゼにより開裂されてその存在が混合物中
で検出され得る化合物を生成し得るエラスターゼ基質、
及び Ｃ）エラスターゼ阻害をエラスターゼ阻害剤により低下
させ１ｑるがエラスターゼ基質を加水分解し得ないプロ
テアーゼ。

を含むアッセイ混合物を調製し、 次いで混合物を分析して化合物の存在を検出することか
らなる。

本発明は、成る種のプロテアーゼ酵素がエラスターゼ酵
素そのものに悪影響を及ぼすことなく且つエラスターゼ
基質を加水分解せずに白血球エラスターゼ活性の阻害を
低下させ、存在が検出され得る化合物を遊離する（即ち
誤った正の結果を示す）か又は基質の組成を変化させて
基質がもはやエラスターゼに対する有効な基質として作
用しなくなる（即ら誤った負の結果を示すか若しくは維
持する）という麿くべき知見に基づく。

本発明でテストされるサンプルは、ヒト又は他の動物の
生物学的流体例えば血液、炎症部位や他の傷からの排泄
物、痰又は尿であり得る。本アッセイで使用されるサン
プルは、流体そのものであっても各種精製過程を経たも
のであってもよい。

例えば全白血球又は溶解白血球又はそのタンパク抽出物
の生成を含む。

所望の阻害低ド性を有−づる（且つＨｅ０３ｕｃ　−Ａ
　ｌ　ａ−八ｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｖａｌ−ＡＮＣを加水
分解しない）プロテアーゼ酵素には、溶ｗｌ酵素、Ｒｈ
ｌｚｏｐｕｓ種由来のプロテアーゼタイプＸ■、ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｅ−３Ｄｉｔｏｓｕｓ由来の
プロテアーゼタイプ■、８ａｃ　ｉ　Ｉ　Ｉｕｓｐｏｌ
ｙｍｉｘａ由来のプロテアーゼタイプ■及びＢａｃｕｓ
　ｐｏｌｙｍｉｘａ由来のプ【コテアーゼタイプ■が包
含される。本発明者らがエラスターゼ基質Ｈｅ０３ｕｃ
　−Ａｌａ−Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｖａｌ−ＡＭＣに対
して加水分解作用を示す又は十分に阻害を低下させない
ために、アッセイ混合物の成分として有用でないことを
知見したプロテアーゼ酵素には、Ａｓｐｅｒｇｉ　Ｉ　
１ｕｓｓｕｓａｅ由来のプロテアーゼタイプＩ　ＸＩ　
、　Ａｓｐｅｒｇｉ−ｕｓ　５ａｉｔＯｉ由来のプロテ
アーゼタイプ■、Ａｓ−ｐｅｒｏｉｌｌｕｓ　ｃａｒｙ
ｚａｅ由来のプロテアーゼ、ｐａｐａｙａ由来のプロテ
アーゼタイプ■、ＢＯＶｌｎｅ　ｔ）ａｎＣｒｅ！ａｓ
由来のプロテアーゼタイプ■、プロテアーゼタイプＸＸ
ｒＶ（細菌性）及び５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　Ｃａｒｌｓ
ｂｅｒ。

由来のプロテアーゼが包含される。これらのタンパクは
全てＳｉｇｍａから市販されている。

本発明に使用するのに好ましいプロテアーゼ酵素は溶解
酵素（ｌｙｓｉｎｇ　ｅｎｚｙｎ＋ｅｓ）及びＲｈｌｚ
ｏｐｕｓ種由来のプロテアーゼタイプＸ■である。

本発明者らの知見によれば、アッセイ混合物中に別の成
分を添加することは基質に対するエラスターげ活性に別
のＭ害低下（活性化）性を与える。

活性化剤として適当な別の成分は成る程度の表面活性特
性及び／又はタンパク変性特性を有していな（）ればな
らないが、エラスターゼ又はプロテアーゼに対して重大
な有害作用を及ぼすものであってはならない。混合物に
添加するのに適当な別の活性化成分は、サポニン、トリ
トン及びＣＨＡＰＳ（３−コラミドプロピル）−ジメチ
ルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート）である。

アッセイ混合物ｔよ通常緩衝液を含み、金属イオン、安
定化剤糖を含み得る。

基質は０．０２〜２％Ｗ／Ｖ　、好ましくは０．０５〜
５％例えば約０．２％の濃度でアッセイ混合物中に存在
するのが適当である。例えば分光光度検出が使用される
場合には前記値を超えてもよい。プロテア−げは０．０
５〜５％ｗ／ｖ　、好ましくは０．２〜２％例えば約０
５％の濃度が有効であると判明した。別の活性化剤を混
合物中に添加しなければならないときには、通常０．２
５〜１０％ｗ／ｖ　、好ましくは１〜５％例えば約２．
５％の濃度で存在させる。

アラはイガ法は、反応を実施する容器に乾燥成分として
又は水溶液の形態で試薬を別々に添加することにより実
施され得る。しかしながら、試薬の少な（とも一部、好
ましくは全部を、好ましくは容器内で所要により凍結さ
せた溶液の形態、又は好ましくは乾燥した形態、より好
ましくは容器の内表面上にフィルムとして予め調製した
形態で作製するのが好ましい。方法を実施するための装
置は試薬を担持した吸収材例えばパッド又はペーパーの
形態であり、その空間にはアッセイ混合物が収容されて
いる。

試薬は、被検尿サンプルを添加する前に別の再構成ステ
ップ例えば試薬を十分に溶解させるステップを必要とし
ない形態が好ましい。従って、好ましい方法では液体成
分を尿ナンブルから完全に抽出する（ｄｅｒｉｖｅｄ）
。尿サンプルは通常５〜２５０成、好ましくは１０〜１
００屑使用する。

本発明の方法を実施するのに適したキットは、アッセイ
混合物を収容するのに適したアッセイ容器とエラスター
ゼ基質を含む。基質は通常乾燥形態で容器内に収容され
ているのが好ましい。本発明の好ましい具体例では上記
したタイプのプロテアーゼを含む。４’Ｈ＋　ｆ’Ｊ及
び／又はプロテアーゼが、同−又は異なる容器の表面ト
に所要により水溶性フィルム形成性安定化剤を含む同−
又は異なる乾燥フィルムの形態にあるのが好ましい。

好ましい態様のキットは、複数のウェル（容器として作
用する）を有するプレート例えば微量測定用プレートを
含む。前記器具は生化学的アッセイを実施しその復色の
変化を肉眼で観察したり、光の吸収を測定したり、螢光
を検出する装置として公知である。別の態様のキットは
吸収材を含み、該吸収材の空間には液体アッセイ混合物
が収容されており、従って該吸収材は容器を形成し得る
。

取扱いを容易にするために、例えばペーパー又はパッド
から作成される吸収材を非吸収性不溶性材料のストリッ
プ上に載置させるのが好ましい。吸収材は必要な試薬の
一部若しくは全部を含むように作成され得る。

通常、４ツトには尿を検査ザるための使用説明書が添付
されている。

試薬が１種以上存在する場合には、試薬を同一・又は別
の容器に収容してもよい。通常、単一の容器に全ての試
薬を収容して、被検サンプルを容器に添加することによ
り、別の操作（即ちある容器から別の容器に材料を移動
させる）を伴うことなく全体のアッセイ混合物を調製す
ることが好ましい。

試薬は、試薬泥合物中の濃度が上記した値となるような
ｆｔｆ含まれる。微量測定用プレートの場合、使用され
るサンプル済は通常５〜２５０ハ、より一般的には１０
〜１００　、ｍであり、基質は約１０〜５００１１ｇ、
例えば約１００埒のけ含まれ、プロテアーゼは約２５〜
１２５０１１ｇ例えば約２５０ＩＩ９含まれる。

適当には、尿中のエラスターゼアッセイは同一の尿に対
して細菌尿の検査と一緒に実施される。

別の方法は培養を実施しない方法でなければならず、好
ましくはエラスターゼアッセイと同一時間内に結果が得
られるものである。同一の検出手段を使用するのが好都
合であり、エラスターゼアッセイと同一の微量測定用プ
レートの別のウェルで実施するのが好ましい。

細菌尿を検出するための適当なテストは例えば硝酸テス
ト（ＧｒｉｅＳＳテスト）　、Ｊ、　Ｌａｂ、　ａｎｄ
　Ｃｌ１ｎＨｅｄ、　（１９６１）　、　４９０〜４９
４に記載されているカタラーゼテスト、グルコースオヤ
シダーゼテスト、例えばＥＰ−＾−９１８３７に記載さ
れている細菌尿により加水分解され得る螢光発生性若し
くはクロロ−非存＠　（ｃｈｌｏｒｏ−ｕｎｏｒｇｅｎ
ｉｃ）３４質を使用するテスト、又は好ましくはＪｏｒ
ｇｅｎｓｅｎら（１９７３）、　　へｐｐｌｉｅｄ旧ｃ
ｒｏ、　Ｂｉｏｌ、　２６．３８〜４２に記載されてい
る、ダラム陰性細菌により生成したエンドトキシンを好
ましくはゲル化カスケードで生じた酵素により加水分解
され得る螢光発生性若（）くは色素産生性基質を用イテ
検出すルｌｉｍｕｌｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙ
ｓａｔｅ　）アッセイである。

本発明者らは、エラスターゼアッセイの結果はＣｈｅｌ
ｌＳｔｒｉｐ　ＬＮのエステラーゼテストよりも轄尿を
より高い信頼度で発見することができ、従って誤った結
果を得る可能性が少ないので本発明の）アッセイは尿ス
クリーンにおいて有用であることを知見した。

以下、本発明の実施例を示す。

実施例１ ｐＨ７，５の　５％リン酸緩衝液　３８０−１然溜・脱
イオン水中で作成したＰＶＡの１５％Ｗ／Ｖ溶液２０戒
、（Ｓｉｇｍａ　Ｈ）サポニン１２９　、２−Ｈｅ　（
２−メトキシエタノール、　ＢＤｔｌ　Ａｎａｌａｒ）
　　１００ｄ中に蛍光発生性エラスターゼ基質１！Ｊを
含む溶液を含有する試薬溶液を調フｊした。（ｑられた
溶液５０μｌを、徴用測定用プレートのウェルに導入し
た。溶液を、溶液が沸騰も凍結もしない条件Ｆで実質的
に全ての溶媒が除去されるまで高温で真空乾燥させるこ
とにより乾燥させた。

こうして作成したプレートを使用して、尿サンプル中の
白血球の存在を調べた。同時に、ペプチダーゼ酵素の数
も調べて、エラスターゼ活性の阻害減少性を観察した。

ベブチダーぜ酵素を使用するときには、ウェル当たり０
．２５■を使用した。新鮮な尿サンプルを、ウェル当た
り５０ｐｉの割合で各ウェルに導入した。次いで、プレ
ートを３７℃で３０分間インキュベートした。

読取り結果 ウェルを蛍光計で読み取った。ゼノンランプを使用して
、ウェルに３６００ｍの波長でピークの光を当てた。

直ぐに、ウェルからの発光を光電子増幅管を用いて４５
０　ｎｍでピークの発光をカウントすることによって読
み取った。

各尿サンプルを顕微鏡検査して、尿サンプル中に存在す
る白１ｍ球及び赤血球の実際の数を調べた。

赤血球の数は、赤血球が１ラスターゼの阻害に関与する
かどうかを見るために調べた。顕微鏡検査の結果を表１
に示す。

表　　　　１ 表 蛍光計の検出結果を、表２に示す。９００以上のカウン
トは、この）アッセイが正と判定した。

傘Ｏ３−オフスケール Ｊ−記結果から、尿サンプルＮα２７の場合エラスター
ぜ活性テストで正の結果を示し、このサンプルには顕微
鏡検査の結果でも臨床的に有意な数の白血球が含まれて
いた。また、ト記結果からアッセイ結果が負の尿サンプ
ル（尿サンプルＮｏ、　８　）には白血球が全く含まれ
ていなかった。尿サンプルＮα３０及び５１の場合には
、ベブヂダーゼを含まないアッセイの結果から、エラス
ターゼが尿サンプル中で阻害されることが判明した。適
当なＭ索を選択することによって阻害を減じることがで
きた。

従って、Ｒｈ１ｚｏｐｕｓペプチダーゼは両方の尿サン
プルにおける阻害を破壊するように考えられる。

＾ｓｐｅｒｇｉ＋ｕｓ　５ａｉＬｏｉベブヂダーゼは尿
サンプルＮα５１の阻害に影響を及ぼすが、尿サンプル
Ｎｏ、３０に対しては影響を及ぼさなかった。ＡＳｐｅ
ｒｌＪｉ　ｌ　Ｉｕｓｏｒｙｚａｅペプチダーゼは基質
そのものを加水分解し、よって誤ったｉ［の結果を示し
た。

実施例２ プロプアーゼを全く添加せず且つサポニンを存在させる
か（１，２■／ウエル）若しくは別の５つのナンブルに
はサポニンを存在させずに、実施例１を繰り返した。結
果を表３及び表４に示す。蛍光計で９００以上のカウン
トは、このアッセイで正と判定した。

表　　　　　　３ 表　　　　　　４ Ｌ記結果から、尿サンプルＮα２１．２９及び５８はサ
ポニンの存在下でアッセイに対して改良された正の反応
を示す。尿サンプルＮＱ３３は影響を受けなかった例で
ある。

尿ナンブルＮＱ３８のアッセイの結果（真に負）から、
アッセイそのものはサポニンの影響を受けな実施例３ （蒸留・脱イオンした）水８００威、オルトリン酸水素
−１トリウム（無水）３６．１５９、オルトリン酸二水
素カリウム４．０ｇ及びＣＨ＾ＰＳ　９．Ｏｇを用いて
緩衝溶液を調製した。溶液を水を用いて９００−とした
。前記実施例で使用したのと同一の′！ｆ−質２３を含
む溶液をＤＮＳｏ　２０ｄ中で調製し、緩衝液に添加し
た。Ｒｈ１ｚｏｐｕｓベブチダ−１，４５，０４７を基
質溶液に溶解させた。溶液５０ｐｆ！を微墳測定用プレ
ートのウェルに導入し、溶液を真空乾燥により乾燥させ
た。実施例１と同様にしてプレートを使用し、同様の結
果を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）白血球の存在を検出するための尿検査方法であつ
   て、尿サンプルとアッセイ混合物中のエラスターゼによ
   り加水分解されてその存在がアツセイ混合物中で検出さ
   れ得る化合物を形成する酵素基質とを含むアッセイ混合
   物を調製後、化合物を検出することからなることを特徴
   とする方法。 （２）尿サンプルが直接尿サンプルであることを特徴と
   する請求項１に記載の方法。 （３）エラスターゼ基質が実質的に白血球エステラーゼ
   、トリプシン又はキモトリプシンにより加水分解され得
   ないことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。 （Ａ）エラスターゼ基質が式 I Ｒ＾１−Ａ＾４−Ａ＾３−Ａ＾２−Ａ＾１−ＣＯＮＨ−
   Ｒ＾２（式中、 Ａ＾１はアラニル、バリル、フエニルアラニル及びメチ
   オニルから選択されたアミノ酸残基であり、Ａ＾２は結
   合又はプロピル、アラニル及びロイシルから選択された
   アミノ酸残基であり、 Ａ＾３は結合又はアラニル残基であり、 Ａ＾４は結合又はアラニル残基であり、 Ｒ＾１はグルタリル又はＮ−末端封鎖基であり、及び Ｒ＾２は化合物Ｒ＾２ＮＨ＿２がアッセイ媒体中で検出
   され得るように選択される） を有する化合物であることを特徴とする請求項１〜３の
   いずれかに記載の方法。 （５）Ｒ＾１がアセチル（Ａｃ）、スクシニル（Ｓｕｃ
   ）、メトキシスクシニル（ＨｅＯＳｕｃ）、ｔ−ブチル
   オキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びグルタリル（Ｇｌｔ）
   から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法
   。 （６）基質がトリ−もしくはテトラペプチド誘導体、好
   ましくは式中Ａ＾１がアラニル又はバリル、より好まし
   くはバリルであり、Ａ＾２がアラニル又はプロリルであ
   り、Ａ＾３がアラニルであることを特徴とする請求項４
   又は５に記載の方法。 （７）エラスターゼ基質が、 Ａｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ Ａｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ Ａｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ Ａｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ Ｂｏｃ−Ａｌａ Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ Ｇｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＶａｌＳｕｃ
   −Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｈｅｔ Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ｔｒｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ及びＰｙｒ−
   Ｐｒｏ−Ｖａｌ から選択されるペプチド誘導体、好ましくはＨｅＯＳｕ
   ｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌの誘導体であるこ
   とを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。 （８）アッセイ混合物中の化合物を光学検出方法、好ま
   しくは濁度測定法、分光光度法、又は最も好ましくは螢
   光光度法により検出することを特徴とする請求項１〜７
   のいずれかに記載の方法。 （９）化合物を直接光学検出手段、好ましくは基質に対
   して異なる螢光特性を有する光学検出手段、より好まし
   くはクマリン誘導体を用いて検出し得ることを特徴とす
   る請求項４に記載の方法。 （１０）基質がＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
   −Ｖａｌ−ＡＭＣであることを特徴とする請求項１〜９
   のいずれかに記載の方法。 （１１）アッセイ混合物が、エラスターゼ阻害を低下も
   しくは除去し得るが基質を加水分解しないプロテアーゼ
   酵素をも含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれ
   かに記載の方法。 （１２）アッセイ混合物が、エラスターゼ阻害低下特性
   を有する活性化剤、好ましくは表面活性剤、より好まし
   くはサポニン、トリトン及びＣＨＡＰＳから選択された
   表面活性剤をも含むことを特徴とする請求項１〜１１の
   いずれかに記載の方法。 （１３）アッセイ混合物を、好ましくは乾燥形態のアッ
   セイ混合物を調製するための試薬の一部もしくは全部を
   既に収容したアツセイ容器に尿サンプルを添加して作製
   することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載
   の方法。 （１４）請求項１〜１３のいずれかに記載の方法を実施
   するのに適したキットであつて、アッセイ混合物を収容
   するのに適したアッセイ容器、エラスターゼ基質、及び
   所要により請求項１１に記載した如きプロテアーゼ酵素
   及び／又は請求項１２に記載した如き活性化剤を含むこ
   とを特徴とするキット。 （１５）基質が好ましくは乾燥形態で容器に収容されて
   いることを特徴とするキット。 （１６）キットに尿検査に使用するための使用説明書が
   添付されていることを特徴とする請求項１４又は１５に
   記載のキット。 （１７）前記尿の別のサンプルについて細菌尿を検査す
   るための試薬及びそのための容器を含み、好ましくは複
   数のウェルを有するプレート、より好ましくは微量測定
   用プレートを含むことを特徴とする請求項１４〜１６の
   いずれかに記載のキット。