JP2004147650A - トリコモナスなどのヒドロラーゼのアッセイ法 - Google Patents

Abstract

【課題】トリコモナス症の検出手段を提供する。
【解決手段】低pHで限定されたクラスの基質を加水分解するヒドロラーゼがトリコモナス原虫から放出され、しかもトリコモナス症とは無関係のヒドロラーゼからの干渉はないということが、低pHにおいて膣液によるこれら基質の加水分解を測定するというトリコモナス症選択的診断アッセイの基礎である。トリコモナス症選択的診断アッセイは、膣液サンプルから粒子状物質を除去し、選択したサイズよりも大きな粒子を含まない分画を抽出し、望むのであればその抽出した分画を特定のヒドロラーゼ・インヒビターと混合した後、その分画のヒドロラーゼ酵素活性をテストすることによっても実行できる。トリコモナス症のこうした特徴は、肉眼その他の手段で非常に正確に検出できる結果を生み出す一連の診断テストおよびテスト装置の基礎である。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ヒドロラーゼ（すなわち加水分解酵素）の分野、中でもサンプルまたは試料中のヒドロラーゼの活性を検出するための方法と装置、ならびにヒドロラーゼの活性検出に基づいて疾患を診断する方法に関する。本発明が特に対象とする領域は、膣液サンプルにトリコモナスのヒドロラーゼの酵素活性があるかどうかを調べることにより、女性患者のトリコモナス症を検出することである。

この明細書で引用したあらゆる文献（特許、技術報告、書籍を含む）は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。

トリコモナス症は、原生動物である膣トリコモナスによって起こる臨床的に重要な性感染病（STD）である。1955年、世界保健機関は、世界中の大人の間でトリコモナス症の新患が毎年約1億7千万人発生するであろうと推定した。この数字は、発展途上国と先進工業国のどちらにおいても、他のどの性感染病よりも多い。トリコモナス症は、検出されないことがしばしばある。というのも、感染しているほとんどの男性と、感染している女性の約半数が、自覚症状を持っていないからである。トリコモナス症は、女性では不快感や膣分泌物の悪臭をもたらす可能性があり、好ましくない臨床的な余病を伴うことがある。トリコモナス症は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の伝染と感染のリスクを増大させる（Laga他、AIDS、第7巻（1）、95〜102ページ、1993年；WHOプレス・リリース WHO/64、1995年）。

トリコモナス原虫は、プロテイナーゼと呼ばれていてIgG抗体、IgM抗体、IgA抗体などのタンパク質を加水分解する特殊なヒドロラーゼを産生する（ProvenzanoとAlderete、Infect. Immun.、第63巻（9）、3388〜3395ページ、1995年）。これらプロテイナーゼは、膣液中に通常は存在していてHIVウイルスがヒト単球細胞に入るのを抑制する保護因子である分泌型白血球ヒドロラーゼ・インヒビター（SLPI）にもダメージを与える（Draper他、J. Infect. Dis.、第178巻（3）、815〜819ページ、1998年）。膣トリコモナスは、子宮頸ガンを促進する役割も担っていると考えられている（Yap他、Genitourin. Med.、第71巻（6）、402〜404ページ、1995年）。妊娠中期に膣トリコモナスに感染した妊婦は、出生時の体重が少ない赤ん坊や未熟児を産む傾向が強い（Cotch他、Sex. Transm. Dis.、第24巻、353〜360ページ、1997年）。

トリコモナス症を診断する最も一般的な方法は、ウエット・マウント顕微鏡検査法である。これは、顕微鏡を用いて膣液サンプルの中に膣トリコモナスを探す検査法である。これはめんどうな方法であり、顕微鏡と熟練した技術者が必要とされるため、感染した女性の約半数が見落とされる（Baron他、「女性生殖管感染の実験室における診断、Cumitech 17A」、アメリカ微生物学会、1993年）。トリコモナス症は、膣液サンプルを培養することによって高感度で診断できるが、この方法は、顕微鏡と熟練した技術者に加え、培地と、温度制御されたインキュベータでの長期間にわたる増殖を必要とする。人件費、培地と添加物のコスト、必要な訓練、トリコモナスの増殖を検出するまでにかかる一週間という時間が必要であるため、クリニックまたは実験室で日常的に培養を行なってトリコモナス症を診断しているところはほとんどない。

LawingらによってDNAの増幅と検出に基づいた診断テストが最近開発された（J. Clin. Microbiol.、第38巻（10）、3585〜3588ページ、2000年）。このテストは感度が高いが、培養と同様、患者がクリニックを訪れている間に結果が得られるほど速くはない。DNAに基づいたテスト・キットと、このようなテストを行なうのに必要な訓練と装置にコストがかかるため、この方法は、クリニックや一般的な医療機関で広く用いられるには至っていない。特に、トリコモナス症のテストが最も必要とされる地域に広く普及してはいない。

したがって、トリコモナス症を医療現場において診断するための、迅速で、正確で、コスト・パフォーマンスがよく、簡単な方法またはテスト装置は、現在のところ存在していない。数多くの研究により、膣トリコモナスがさまざまなヒドロラーゼを産生することがわかっている。例えばGarber他、Can. J. Microbiol.、第35巻、903〜909ページ、1989年を参照のこと。トリコモナス症にかかっている女性の膣液サンプルには検出可能なレベルのヒドロラーゼが含まれているが、感染した女性が感染の治療を受けて治癒した後にはヒドロラーゼが消えることが、2つの研究によって明らかにされている（Alderete他、Genitourin. Med.、第67巻（6）、469ページ、1991年；GarberとLemchuck-Favel、Parasitol. Res.、第80巻（5）、361〜365ページ、1994年）。残念なことに、報告されたこれらの研究で用いられている実験室ベースのヒドロラーゼ検出法は、装置と技術と訓練を必要とし、めんどうであり、時間がかかる。そのため結果は数時間経たないとわからない。例えばトリコモナスのヒドロラーゼを検出するAldereteらの方法は、ゼラチン-アクリルアミド・ザイモグラムを作るのに4つのステップを含んでいる。まず最初に、ポリアクリルアミド・ゲルからなるシート内でトリコモナスのヒドロラーゼを電気泳動によって濃縮して離散したバンドにし；次に、ポリアクリルアミド・ゲルの内部にあらかじめ固定化してあるゼラチンをヒドロラーゼに消化させ；3番目に、一般的なタンパク質染色法を用いてこのゲルを染色し；4番目に、このゲルを長い洗浄プロセスを通じて脱染色する。その結果、ヒドロラーゼによって消化されたゼラチンが、暗く染色された背景ゲルの上にはっきりとしたバンドとして現われることがある（ザイモグラム）。Garberらの研究では、トリコモナスのヒドロラーゼは、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動を行なった後にイムノブロット法を実施して検出した。イムノブロット法は、特定のヒドロラーゼのバンドを可視化するためにウサギの抗体を用いるという、同様に複雑な方法である。上記の両方の方法とも高度の熟練と高価な装置を必要とし、完了までに多くの時間がかかるため、治療現場でのテストには適していない。

上記のザイモグラム法は、ゲル電気泳動によってトリコモナスのヒドロラーゼを分離した後に合成蛍光発生基質を用いてそのヒドロラーゼを検出することによって実現することもできる。この基質は、一般に、蛍光発生レポーター基に結合した1つ以上のアミノ酸を含んでいる。この蛍光発生レポーター基は、ヒドロラーゼという酵素によってペプチド基から開裂して初めて蛍光を出す。残念なことに、この方法だと、蛍光発生基質を用いてヒドロラーゼの活性をテストする前に、面倒なポリアクリルアミド・ゲル電気泳動を実行するステップが必要とされる。さらに、基質の加水分解は、紫外光で蛍光を発するバンドを電気泳動ゲルで調べないとわからない。ゼラチン-消化法と蛍光発生基質法の両方が膣トリコモナスの細胞内ヒドロラーゼと分泌ヒドロラーゼの研究がなされたことが、Northらによって報告されている（Mol. Biochem. Parasitol.、第39巻、183ページ、1990年）。トリコモナスのヒドロラーゼを検出するのに使用できる蛍光発生基質がいくつか同定された。残念なことに、この研究で用いられた方法は、治療現場で診断テストを行なう上で実用的ではない。というのも、ゲル電気泳動は時間がかかる上に面倒で、しかも蛍光の観測には、装置または暗室と紫外光照明装置が必要とされるからである。問題は、膣液がさまざまな発生源から分泌された多数の異なるヒドロラーゼを含んでいることである。発生源としては、極めて高レベルで存在している細菌や、白血球細胞、膣上皮細胞などが挙げられる。それぞれの方法では、電気泳動による分離に頼ってトリコモナスのヒドロラーゼを選択的に検出している。電気泳動による分離なしには、加水分解活性のあるバンドがトリコモナス原虫に由来するものか、膣液サンプル中の加水分解活性を有する他の発生源に由来するものかを判定することができなかった。

したがって、患者が待っている間に、その患者に対応している医師が、迅速に、簡単に、安価に、正確に実行することのできるトリコモナス症のテスト法が必要とされている。安価であり、使用が簡単で、正確な結果が迅速に得られる使い捨て装置を用いてテストを行なえると非常に有益であろう。

一連の発見がなされたことで、膣液サンプルに膣トリコモナスが存在しているかどうかを迅速に、正確に、効率的にテストできるようになった。こうした発見は、酵素全般の存在を検出する方法とテスト装置にもつながる。酵素としては、例えば、さまざまな生理学的状態を示すさまざまなタイプのヒドロラーゼが挙げられる。検出を行なう対象となるサンプルはどのような体液でもよく、一例として膣液がある。

1つの発見は、トリコモナス原虫が、低pHで、限られた範囲の基質を活発に加水分解する特別なヒドロラーゼを膣液中に放出しているというものである。その際、トリコモナス症とは関係がないが、膣液中にも存在している、あるいは存在していることがしばしばある他のヒドロラーゼからの干渉を受けることはない。したがってトリコモナス症の診断は、膣液において低pHでこのタイプの1つ以上の基質に対する加水分解活性を調べることによって可能になる。基質の加水分解は、機械で読み取ることが可能な信号、または肉眼で検出できる信号に容易に変換することができる。

この発見は、さまざまな診断法とテスト材料に具体化することが可能である。一例は、個々のアッセイ法ごとに必要に応じて異なる領域にアッセイ成分を堆積させた固体支持体を、液体とともに保持できる器具を使用することである。この器具は表面に付着させることができ、アッセイ結果は、この器具の表面または内部に直接読み取ることができる。このような器具としては、例えばスワブ、スポイト、ピペット、あるいはこれ以外の液体移送装置などが可能であり、堆積されるアッセイ成分としては、基質や指示薬が挙げられる。スワブは特に便利な器具である。というのも、スワブは、サンプルで濡らした後に固体支持体の表面にこすりつけることで、その表面に堆積されているアッセイ成分をスワブに付着させることが容易だからである。このようにすると、ユーザーは、検出可能な変化（色彩変化が好ましい）がスワブの表面に起こったかどうかに注意しているだけで、結果を判定することができる。

さらに別の発見は、低pHにすることなく、サイズ排除によってトリコモナスのヒドロラーゼの活性を、体液中の他の発生源のヒドロラーゼの活性から分離できるというものである。例えば体液サンプル（特に膣液）から、所定の閾値よりも大きなサイズの粒子状物質が含まれていない分画を抽出し、加水分解による基質の開裂が起こったかどうかを判定することにより、そのサンプル中にトリコモナス症が存在しているかどうかを検出することができる。トリコモナスのヒドロラーゼの活性に対する選択性は、サイズ排除を限られたタイプのヒドロラーゼ・インヒビターと組み合わせて使用することでさらに向上させうる。したがって、この発見の好ましい実施態様では、所定の閾値よりも大きなサイズの粒子状物質が含まれていない分画を膣液サンプルから抽出し、これらインヒビターのうちの1種以上の存在下でこの抽出された分画を適切な基質と接触させることにより、ヒドロラーゼの活性を検出する。基質を狭い範囲のタイプのものに限定すると、トリコモナスのヒドロラーゼの活性に対する選択性がさらに大きくなる。

すぐ上の段落で説明した発見に関係しているのは、付着させた体液サンプルが毛管力によって移動する経路を含むテスト装置である。この装置は、所定の閾値よりも大きなサイズの粒子状物質を排除するため、移動経路に沿って多孔性材料を備えている。この装置は、細胞または体液中の他の粒子状物質に付着していないあらゆる可溶性酵素を検出するのに役立つ。この装置を使用できる体液としては、膣液、尿、血液、唾液や、それ以外のさまざまな体液が挙げられる。この装置は、興味の対象である酵素が作用する基質と、この酵素がこの基質に作用した結果として信号を発生させる指示薬も含んでいる。例えばトリコモナス症のアッセイでは、基質は、トリコモナスのヒドロラーゼの活性によって加水分解されるものになろう。基質-指示薬の組み合わせに代わるのは、興味の対象である酵素が作用した直接的な結果として色彩変化を起こすクロモゲンを含む基質である。基質を開裂させる酵素の場合、クロモゲンは、基質の残りの部分から切断されたときに色彩変化をすることができる。ヒドロラーゼ（トリコモナスのヒドロラーゼも含まれる）は、そのような酵素の具体例である。基質-指示薬の組み合わせを用いるか、酵素が作用したときに色彩が変化するクロモゲンを含む基質を用いるかに関係なく、基質、指示薬（存在している場合）、またはその両方は移動経路に沿って離れた位置にあるため、視覚的信号は、濾過された液体中の加水分解活性にのみ帰することができる。このような好ましい装置には、アッセイの感度を向上させるため、上記のインヒビターのうちの1つも含まれている。

これらの発見、方法、組成物、装置によってもたらされる利点としては、膣トリコモナスを診断する精度と選択性が向上すること、最少の訓練と装置で素早くテストが行なえること、すべての試薬が含まれた自己完結式であって液体状テスト・サンプルを付着させるだけでよいテスト装置を用いてテストを行なえることが挙げられる。本発明のこれらの目的、特徴、側面、利点ならびにそれ以外の目的、特徴、側面、利点や、さまざまな発見の基礎となる原理を具体化したさまざまな実施態様は、以下の説明から明らかになろう。

発明の詳細な説明
低pHにおいて膣液サンプルの加水分解活性を選択されたタイプのヒドロラーゼの基質を用いて調べる本発明の実施態様では、低pHは、2〜3.5の範囲であることが好ましい。より好ましい範囲は2.3〜2.4である。この範囲にあるpHでアッセイを行なうためには、膣液サンプルを酸性化してpHの値をこの範囲にする必要がある。というのも、最初に採取されたサンプルのpHは約3.8〜約6.5の範囲内のどれかの値になっている可能性があるからである。酸性化は、さまざまな段階を経て実現することができる。例えばサンプルを酸性化した後に基質と接触させたり、サンプルと基質を接触させたまま、サンプルと基質のいずれか、または両方を酸性化したりする。酸性化するための1つの方法は、サンプルを酸性バッファの水溶液で希釈してそのサンプルを望むpH値にした後、その酸性化したサンプルを基質と接触させるというものである。酸性バッファは、液体の形態でも固体の形態でもよく、酸性バッファの具体例は、リンゴ酸、グリシン、リシン、トレオニンである。これらのうち、リンゴ酸とトレオニンが好ましい。特に好ましいバッファは、pH値を2.3または2.4にした200mMのトレオニンである。

本発明のさまざまな実施態様では、基質は、レポーター基と共有結合した残基からなる複合体である。この共有結合は、加水分解酵素の活性によって開裂可能である。“レポーター基”という用語は、この明細書では、残基から切断されたときに検出可能な信号を発生させる任意の基を表わす。前の段落で説明した実施態様に関しては、好ましい複合体は、C末端がアルギニンまたはリシンになったペプチドを基質残基として含んでおり、レポーター基が、加水分解によって開裂したときにそのペプチドから検出可能な変化を生じさせる化学種になっているものである。なお加水分解によって開裂可能な共有結合は、このペプチドのC末端に位置する。加水分解によって開裂可能な結合を含む結合の具体例は、アミド結合とエステル結合である。したがってレポーター基は、これら2つの結合のいずれかを介して基質残基に結合することができる。検出可能な変化は、レポーター基そのものにおいて、あるいはアッセイ中にレポーター基が接触する別の指示薬において起こる。ペプチドは、長さが1〜6個のアミノ酸であることが好ましく、長さが2〜3個のアミノ酸が最も好ましい。C末端に存在する好ましいアミノ酸はアルギニンである。C末端で加水分解が確実に起こるようにするため、ペプチドのN末端はNブロック基でブロックすることが好ましい。Nブロック基の具体例は、カルボベンゾキシ、ベンゾイル、t-ブトキシカルボニル、D-アミノ酸である。他の具体例は、当業者には明らかであろう。

検出可能な変化としては、テストを行なう臨床家が目で読み取ることのできるもの、あるいは自分に対するテストを実施している人が自分で読み取ることのできるもの、あるいは変化を検出し、必要に応じて別の機能を実行する機械で読み取れるものが可能である。機械が実行する別の機能としては、例えば、結果を対照値または較正されたスケールと比較すること、結果を定量化すること、1つのサンプルに対して2つ以上の異なったテストを行なうこと、複数のサンプルに対して同じテストを同時に行なうこと、結果から統計データを作り出したり結果を単に整理されたやり方で記憶させたりすることが挙げられる。

基質残基からレポーター基が開裂することによって起こり、検出可能な変化に至る変換としては、化学的変化と空間的再配置のいずれかが可能である。検出可能な変化が化学的変化によって起こる実施態様では、基質残基と結合したときに検出可能な信号を発生させるレポーター基の不安定性は、例えば、レポーター基の表面の残基で化学的中和効果が起こった結果として生じる可能性がある。この効果は、結合が開裂したときに消える。検出可能な変化が空間的再配置によって起こる実施態様の一例は、残基がテスト装置の不活性な表面に常に結合している基質と、テスト装置の不活性な表面にやはり常に結合しているが、基質残基とは空間的に離れた位置にある指示薬を利用することである。興味の対象である酵素を含んでいて基質と指示薬の両方を濡らす液体サンプルを添加する場合、レポーター基が基質残基から開裂し、液体サンプルを通って指示薬のほうに移動し、検出可能な変化を起こす。他の具体例は、当業者には明らかであろう。これら具体例のすべてにおいて、基質残基とレポーター基の間の結合の開裂は、トリコモナスのヒドロラーゼが結合に直接作用することによって、あるいはトリコモナスのヒドロラーゼと他のヒドロラーゼの作用が組み合わさって起こる可能性がある。

肉眼で検出可能な色彩変化を起こすレポーター基が好ましい。肉眼で検出可能な色彩変化を起こすレポーター基の1つのタイプは、指示薬と反応してその指示薬に色彩変化を起こす化合物である。色彩変化が、加水分解による開裂でレポーター基が基質の残り部分（すなわち基質残基）から切断された結果として生じるようにするため、テスト装置において基質と指示薬を、サンプル中に溶け出さないようにして空間的に離れた場所に固定化し、レポーター基が基質残基から開裂した後に初めてレポーター基が基質残基のほうに移動する、あるいは流れていくようにする。色彩変化を起こす別のタイプのレポーター基は、基質残基から切断されたときに、すなわちレポーター基を基質残基と結合させている共有結合が開裂したときに、自分自身の色彩が変化するものである。レポーター基は、加水分解によって基質残基から切断された後、化学的手段または機械的手段によって束縛または固定化し、色彩信号を装置内の限定された領域に閉じ込めることができる。

適切なレポーター基と反応したときに色彩が変化する指示薬としては、パラ-ジメチルアミノ-シンナムアルデヒド（pDMAC）、ジアゾニウム塩、テトラゾニウム塩などが挙げられる。これらのタイプに属する具体的な染料としては、ファースト・ガーネットGBC、ファースト・ダーク・ブルーG、ファースト・レッドB、ファースト・レッドRL、ファースト・コリンスV、ファースト・ボルドーGB、ファースト・バイオレットB、ファースト・ブラックKがある。それぞれの指示薬は、未反応状態では無色であるかわずかに着色しており、レポーター基と反応したときに強く着色した誘導体を形成する。レポーター基としては、フェノール、ナフトール、芳香族アミン、あるいはこのようなレポーター基の構造アナログなどが挙げられる。ジアゾニウム塩とテトラゾニウム塩のさらに別の具体例とその使用法の説明は、Conn, H.J.、『生物学的染色』、医学博士R.D. Lillie編、バルチモア、ウイリアムズ＆ウィルキンス社、第9版、1977年、200〜224ページに掲載されている。ジアゾニウム染料は、特に有効な実例である。

上記のように、ヒドロラーゼによって開裂させることが可能なレポーター基と基質残基の結合の具体例は、アミド結合とエステル結合である。したがってレポーター基としては、アミン、またはアミンに似たヒドロキシル化合物が可能である。この目的で役に立つアミンの具体例は、4-メトキシ-2-ナフチルアミン、β-ナフチルアミン、7-アミノ-4-メチルクマリンである。この目的で役に立つヒドロキシル化合物の具体例は、α-ナフトール、β-ナフトール、3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、6-ヒドロキシ-２-ナフトエ酸、6-ヒドロキシ-２-ナフタレンスルホン酸、1-ナフトール-3,6-ジスルホン酸、6-ブロモ-2-ナフトール、6-ヒドロキシ-２-ナフチルジスルフィド、4-ヒドロキシ-1-ナフタレンスルホン酸である。

アミノ酸は、さまざまな指示薬において検出可能な変化を直接または間接に発生させることのできるレポーター基として機能することができる。間接的に発生する色彩変化の具体例は、アミノ酸オキシダーゼの存在下でアミノ酸レポーター基が酸素と反応して過酸化水素を発生させ、今度は酸化還元触媒の存在下でこの過酸化水素が還元されたクロモゲンと反応して発色するという発色システムである。この場合に使用可能なクロモゲンとしては、グアヤク、2,2'-アジノ-ビス(3-エチル-ベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)、テトラメチルベンジジン、フェノールと4-アミノアンチピリンの混合物、4,5-ジヒドロキシ-ナフタレンなどが挙げられる。酸化還元触媒の具体例は、ペルオキシダーゼ、鉄プロトポルフィリン、金属鉄である。アミノ酸オキシダーゼの存在下で酸素を用いて酸化させることによって過酸化水素を発生させることのできる任意のアミノ酸を用いることができる。具体例は、アラニン、ロイシン、セリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、チロシンである。

上記の記述に合致するレポーター基を備えた基質の具体例は、カルボベンゾキシ-L-バリン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、カルボベンゾキシ-L-アルギニン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、カルボベンゾキシ-L-アルギニン-L-アルギニン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、カルボベンゾキシ-L-ロイシン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、カルボベンゾキシ-L-バリン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、D-バリン-L-ロイシン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミンである。これらのうちで最も好ましいのは、カルボベンゾキシ-L-アルギニン-L-アルギニン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミンと、D-バリン-L-ロイシン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミンである。

基質残基から切断されたときに直接色彩変化を起こすレポーター基としては、インドキシルなどの化学種、クロロフェノールレッドやテトラブロモフェノールフタレインエチルエステルなどのpH指示薬が挙げられる。例えばインドキシルは、基質残基に付着して無色の複合体を形成し、その残基から切断されたときに大気中の酸素と反応して濃い青色（インジゴ）になる。クロロフェノールは、pHがクロロフェノールレッドの転移点よりも大きくなったときに残基から切断されて赤くなる。テトラブロモフェノールフタレインエチルエステルは、pHが転移点よりも大きくなったときに残基から切断されて青くなる。他の具体例は、pH指示薬を使用した経験のある人には明らかであろう。pH指示薬の選択は、どのpHで酵素の活性を検出するかにも関係することになろう。すなわち低pHが必要とされる実施態様では、適切なpH指示薬は、転移点がアッセイを行なうのと同じ低い範囲にあるものになろう。pHが小さな値に限定されない実施態様では、より大きな転移点を有するpH指示薬を用いることができる。

トリコモナスのヒドロラーゼの活性を検出するのにサイズ排除を利用する本発明の実施態様では、粒子状物質を除去することで、膣トリコモナスの存在に帰することのできる可溶性または非粒子状のヒドロラーゼの活性を除去することなく、流体中にあって干渉する酵素の活性の大部分が除去される。サイズの閾値、すなわちサイズ排除によって流体から除去される最小の粒子は、20ミクロンであることが好ましいが、より好ましいのは直径10ミクロンであり、最も好ましいのは直径1ミクロンである。したがってサイズ排除により、直径が20ミクロンよりも大きな粒子がまったく存在していない分画が得られることが好ましい。さらに好ましいのは、直径が10ミクロンよりも大きな粒子がまったく存在していない分画が得られることであり、最も好ましいのは、直径が1ミクロンよりも大きな粒子がまったく存在していない分画が得られることである。サイズ排除は、従来法で実現することができ、例えば遠心分離、濾過（加圧濾過と真空濾過の両方）、沈降分離、沈殿などの方法がある。サイズ排除を実現するための特に便利な方法は、濾過媒体として機能する不活性な多孔性材料を含むテスト装置を使用することである。この多孔性材料は、液体サンプルが多孔性材料を通過してから、サンプルの酵素活性をテストするためのテスト領域に到達するように装置内に配置する。したがってテスト装置は、サンプルを入れるための付着部位と、酵素活性が発生したり検出されたりするテスト部位と、サンプルを毛管作用、圧力差、重力による流れ、あるいは他の任意の駆動力によって移動させるために付着部位とテスト部位をつないでいる通過流路とを含むように設計するとよい。この通過流路には、多孔性材料を満たすか、この通過流路を塞ぐように多孔性材料を設置する。多孔性材料の特に好ましい1つの構成は、連続的な細長いストリップを、毛管作用によってサンプルがこのストリップに沿って長さ方向に吸引されるようにしたものである。

トリコモナスのヒドロラーゼ、または他のヒドロラーゼに帰することのできない酵素活性をさらに排除するというのがアッセイが目指す方向であるゆえ、そのためには、興味の対象であるヒドロラーゼが分離されるように特別に選択した1種類以上のヒドロラーゼ・インヒビターの存在下でアッセイを行なうとよい。トリコモナスのヒドロラーゼの活性を検出するためのアッセイにおけるそのようなインヒビターとしては、アンチパイン、キモスタチン、トランス-エポキシスクシニル-L-ロイシルアミド-(4-グアニジノ)ブタン、さまざまなポリペプチドとジペプチド（例えばリシン-プロリン-グルタミン-ロイシン-トリプトファン-プロリン、アルギニン-リシン-アスパラギン-バリン-チロシン、リシン-プロリン）などが挙げられる。場合によっては、存在するインヒビターの量が、そのインヒビターの持つ選択性に影響を与える。すなわちインヒビターの量が、このインヒビターにおいてトリコモナスその他の標的とするヒドロラーゼに帰することのできない酵素（ヒドロラーゼも含まれる）の活性を、標的とするヒドロラーゼの活性を抑制することなしに抑制する性能に影響を与える。これは一般には程度の問題である。というのも、あらゆるヒドロラーゼの活性がある程度抑制され、しかもヒドロラーゼごとに抑制の程度が異なることがあるため、有効なアッセイとして標的とするヒドロラーゼの活性がある程度抑制されることが許容されるからである。標的としないヒドロラーゼの活性を、信頼できるアッセイとなるのに十分な程度に選択的に抑制する特定のインヒビターの量は、そのインヒビターが何であれ、実験室の技術者の一般的な能力の範囲で一般的な実験によって容易に決定することができる。トリコモナスのヒドロラーゼでない干渉性ヒドロラーゼの活性を選択的に抑制するためには、例えばアンチパインを、好ましい濃度範囲（5μg/ml〜約40μg/ml）で用いる。キモスタチンの場合には、好ましい濃度範囲は約0.2mM〜約10mMである。

サイズ排除とヒドロラーゼ・インヒビターを用いる実施態様における基質は、低pHが必要とされる本発明の実施態様におけるのと同様、共有結合によって基質残基と結合したレポーター基からなる複合体にすることができる。この結合は、加水分解によって開裂させることができる。レポーター基は、指示薬と接触したときにその指示薬に検出可能な変化を起こす化学種である。このタイプの基質を用いる場合、基質と指示薬は、テスト装置内で互いに離れた領域に個別に配置し、サンプルがこの2つの領域に順番に接触して最終的には切断されたレポーター基が指示薬と接触するように構成する。このような配置の1つによれば、指示薬領域を流れの方向に関して基質領域の上流に配置し、指示薬はサンプル中に溶けるようなものにする一方で、基質は、所定の位置に固定してサンプルにはあまり溶けないようなものにするか、あるいは単に下流（例えばテスト装置を構成する多孔性ストリップの端部）に配置する。この構成では、指示薬だけがサンプル流とともに移動する。別の構成では、位置が逆転している。いずれの構成でも、指示薬としては、検出可能な信号を出す任意の化学種が可能である。信号は、機械での読み取りが可能な信号であっても、肉眼で検出可能な信号であってもよく、直接的に信号を出しても、または他の（中間）化学種を介して間接的に信号を出してもよい。好ましい指示薬は肉眼で検出可能な信号を出すものであり、そのような信号としては、例えば蛍光、化学発光、単なる色彩変化などが挙げられる。試薬も同様に、指示薬に変化を起こす任意の化学種が可能である。肉眼で検出可能な指示薬の具体例は、p-ジメチルアミノシンナムアルデヒド、ジアゾニウム染料、テトラゾニウム化合物である。しかし他の多くのものが当業者に知られており、それらを上記のアッセイにおいて用いることができる。上記の個々の指示薬は、ここでも使用することが可能な具体例である。好ましいレポーター基は、最も強くかつ最も効果的に指示薬と反応するものである。この目的で有効なレポーター基の具体例は、4-メトキシ-２-ナフチルアミン、β-ナフチルアミン、7-アミノ-4-メチルクマリン、これら物質のアナログおよび誘導体、α-ナフトール、β-ナフトール、3-ヒドロキシ-２-ナフトエ酸、6-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、6-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸、1-ナフトール-3,6-ジスルホン酸、6-ブロモ-２-ナフトール、6-ヒドロキシ-２-ナフチルジスルフィド、4-ヒドロキシ-1-ナフタレンスルホン酸である。

サイズ排除と選択的ヒドロラーゼ・インヒビターを用いる実施態様で使用可能な別のタイプの基質は、加水分解による開裂が可能な共有結合によって結合メンバーに結合したクロモゲンの複合体である。クロモゲンは、結合メンバーから切断されたときにそれ自身が検出可能な変化をする化学種である。低pHでの加水分解活性に焦点を当てた本発明の実施態様に関して上に説明したクロモゲンの記述は、これら実施態様にも当てはまる。

サイズ排除と上記の1つ以上のインヒビターを用いる本発明の実施態様におけるトリコモナスのヒドロラーゼの活性に対する選択性は、前段落で説明した複合体の結合メンバーが、C末端が試薬に結合したペプチドであるときにも実現される。なおC末端のアミノ酸は、リシンまたはアルギニンである。好ましいペプチドは、1〜6個のアミノ酸からなり、最も好ましいペプチドは、2〜3個のアミノ酸からなる。このペプチドのN末端がNブロッキング基によって加水分解から保護されていることも好ましい。Nブロッキング基の具体例は、すでに提示した。

本発明のいくつかの実施態様では、テストの性能は、体液サンプルをテスト装置に付着させる前にこのサンプルを水溶液で希釈することによって向上する。サンプルの希釈によってサンプルの粘性を低下させることができるため、流動特性が向上する。テスト結果がサンプルのpHによって異なる可能性のある場合には、希釈剤を、サンプルのpHを制御する手段にすることもできる。したがって、多くの場合に好ましい希釈剤は、バッファ剤の水溶液、中でも希釈されたサンプルのpHを約6.5〜約7.5で安定化させるバッファ剤の水溶液である。そのようなバッファ剤の1つがイミダゾールである。これ以外のものは、当業者には明らかであろう。

上の説明は主として膣液サンプルのアッセイに関するものであるが、本発明の方法は、さまざまなヒドロラーゼの検出や、別の体液（例えば血液、尿、唾液、脳脊髄液）中で検出することのできるそれ以外の標的酵素の検出に有効である。膣トリコモナスのアッセイは、膣液サンプルにおいて最もうまく行なうことができる。

上記のアッセイおよび実施態様のそれぞれを特徴づける特徴を含むように装置を設計することは容易である。好ましいテスト装置は、アッセイの全成分を乾燥した固体の形態で含んでいて、体液サンプルと最低限の追加の試薬または成分を付着させるだけでよいものである。特に好ましい実施態様では、テスト装置は完全に自己完結式になっていて、サンプルを付着させるだけでよい。サンプルは、そのままで、あるいはバッファ水溶液で希釈して付着させる。サンプルは、適切な移送器具（例えば、スワブ、指サック、頸部ブラシ、スポイト、ピペット、別のタイプの吸引管のほか、一般にサンプルを採取して移送するのに使用できる任意の装置）を用いて、あるいは膣洗浄などの方法で付着させることができる。スワブは、プラスチック、木、またはこれ以外の固い材料でできた柄に固定した綿、ダクロン、あるいはこれ以外の天然または合成のあらゆる吸収性材料で構成することができる。

テスト装置は、ヒドロラーゼの活性が存在していることを示す変化を、サンプルの付着に対する即時反応または迅速な反応として検出できるように設計する。ある場合には、検出可能な変化を、サンプルを付着させるのに用いる器具上で読み取ったり、観察したり、望むのであれば定量化したりすることが可能である。別の場合には、変化をテスト装置上で読み取ったり、観察したり、定量化したりすることが可能である。個々のテストに応じ、装置は、組み込まれた酸性化剤または濾過材料を含むことや、ストリップ、帯域、限定領域に堆積されたアッセイ成分を含むことができる。サンプルを添加するまで別々に保持する必要があるこれら成分は、空間的に分離するためのギャップまたは障壁によって隔離する。多くの場合、アッセイ成分のいくつかは、サンプル液体に溶けないマトリックスと結合させることにより、装置の内面に固定させる。他のアッセイ成分は可溶性であり、サンプル液体と接触したときにサンプル液体中に容易に分散し、装置内をサンプル液体とともに移動する。

すでに指摘したように、本発明のアッセイは、アッセイ成分を取り込むスワブやそれ以外の移送器具を用いて実施することができる。ユーザーは、アッセイの結果をこの器具の表面に直接読み取ることができる。移送器具は、上記の両方のタイプの基質とともに用いることができる。両方のタイプの基質とは、レポーター基が、基質残基から切断されることの直接的な結果として検出可能な変化が起こるクロモゲンまたはそれ以外の化学種になっている基質と、レポーター基が、別の指示薬中で検出可能な変化をする試薬になっている基質である。別の指示薬中で変化するレポーター基を使用する場合、器具をまず最初に基質に付着させ、その後に指示薬に付着させるとよい。ある場合には、基質に接触させてから30秒以内に指示薬に接触させることにより、適切な結果が生まれる可能性がある。別の場合には、最良の結果が得られるのは、2つの接触の間に時間差があって、酵素が基質に作用する時間があると同時に、指示薬が酵素に及ぼす可能性のあるあらゆる効果が回避できる、あるいは最少にできる場合であろう。この場合には、好ましい時間差は少なくとも2分間であり、最も好ましいのは約5分〜約30分である。

固相試薬が装置の内面に接したフィルム中に存在しているテスト装置では、フィルムは、液体形態の試薬を付着させた後に乾燥させること、または固体化することによって形成可能である。液体形態の試薬は、例えば、試薬を溶液や懸濁液にしたもの、あるいは未硬化の液体状支持体マトリックスであってその内部に試薬を保持するものが可能である。したがって固体化ステップは、溶媒または懸濁液の蒸発や、マトリックス前躯体の硬化により実現することが可能である。さまざまな目的で別の材料をフィルムの中に含めることが可能である。目的としては、例えば、
（1）液体の粘性を変化させて液体が表面に付着しやすくするため、
（2）均一なままに留まり、時間が経過したり最初の層の上に別の層を付着させたりしたときに分解したり粒子化したりしない連続的で滑らかな固体層の形成を助長するため、
（3）層の溶解性を、この層の上に付着させる層の中で使われている溶媒を用いて変化させるため、あるいは層を、その下に付着している層を溶かさない溶媒に溶けるようにするため、
あるいはこれらの目的の組み合わせが挙げられる。ポリマー材料は、これらの目的のうちの1つまたはすべてを実現するのに使用することができる。セルロースとさまざまなセルロース誘導体は特に役に立つ。誘導体を適切に置換すると、望む溶解特性が実現する。

これらテスト装置内の試薬フィルムには、安定性と有効期間を向上させる添加物のほか、基質や、触媒活性のあるヒドロラーゼや、溶液中で最も機能を発揮する他の成分の溶解を助ける添加物が含まれていてもよい。試薬の安定性を向上させる添加物の具体例は、バッファ（例えば、ブチル化されたヒドロキシトルエン（BHT）、ブチル化されたヒドロキシアニソール（BHA）、アスコルビン酸塩、ジチオトレイトール（DTT））のほか、金属結合成分やキレータ（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)（EGTA））である。さまざまな成分の溶解、可溶化、分散を助ける添加物の具体例は、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール、ラクトース、温和な洗剤である。洗剤またはそれ以外の溶解剤は、トリコモナス原虫を溶解させてその内部のヒドロラーゼをトリコモナス原虫から液体中に放出させる目的にも用いることができる。

本発明による好ましいテスト装置は、上に説明したアッセイ成分の帯域に加え、組み込み式のポジティブ・コントロールを備えている。さらに好ましいテスト装置は、組み込み式のポジティブ・コントロールとネガティブ・コントロールを備えている。ポジティブ・コントロールは、装置上の物質または領域であって、標的とするヒドロラーゼの活性を示す実際のサンプルを付着させたときにその装置が出すであろう信号と同じ検出可能な信号を出させるもの、あるいはその信号と似た検出可能な信号を出させるもの、と定義される。ただしポジティブ・コントロールは、どのようなサンプルまたはそれに代わる流体を付着させても、それがそのような活性を示すかどうかに関係なく信号を出す。したがってポジティブ・コントロールは、検出可能な信号そのものが適切に機能していること、検出可能な信号を出しうることをユーザーに示す。そのため、実際のサンプルを付着させたときに偽陰性の読み取りが生じないことが保証される。好ましいポジティブ・コントロールは、装置上で実際のテスト（基質と指示薬）帯域とは離れた位置にある追加の試薬帯域によって構成されている。このポジティブ・コントロールとしては、指示薬と反応して検出可能な応答をするあらゆる化学物質が可能である。例えば、上記のペプチド基質に組み込まれたレポーター基の1つや、そのようなレポーター基のアナログが挙げられる。好ましいポジティブ・コントロール材料は、アミノナフトエ酸ナトリウムである。アミノナフトエ酸ナトリウムは、上記のレポーター基と同様、指示薬と反応して検出可能な応答を発生させるが、安定性と有効期間がより優れている。

ネガティブ・コントロールは、付着させたサンプルが標的とするヒドロラーゼの活性を持たないためにテスト装置が信号を発生させないことをユーザーに示す。したがってネガティブ・コントロールは、実際のサンプルを付着させたときに装置が偽陽性の結果が生じさせないことをユーザーに保証する。ネガティブ・コントロールは、標的とするヒドロラーゼの活性のテストを行なうのと同じ体液によって、あるいはテスト・サンプルとともに用いる希釈剤などの代替流体によって、活性化させることができる。ネガティブ・コントロールの1つのタイプは、指示薬テスト帯域におけるのと同じ指示薬を含むが、装置上で、基質帯域や、指示薬テスト帯域や、ポジティブ・コントロール帯域とは別の場所に位置する帯域である。まず最初にサンプルを基質に付着させることなくこのネガティブ・コントロール帯域に付着させた、この帯域に位置する指示薬に変化が観察されるかをチェックする。変化があると、サンプルが、指示薬に直接変化を起こす干渉体であって標的とするヒドロラーゼの活性に由来しないものを含んでいることを示している。そのような干渉体の一例は、ある種の膣生成物中に存在していて、それ自身がジアゾニウム塩の色を変化させるレゾルシノールである。別のタイプのネガティブ・コントロールは、指示薬と、標的とするヒドロラーゼのインヒビターの両方を含むものである。サンプルをまず最初に基質に付着させ、その後にこのネガティブ・コントロール帯域に付着させたとき、このネガティブ・コントロール帯域に何らかの色やそれ以外の信号が発生したのであれば、指示薬に変化を起こさせるがインヒビターの影響は受けない干渉体（すなわち、標的とするヒドロラーゼ以外の干渉体で指示薬に変化を起こさせるもの）がサンプル中に存在していることを示している。

検出可能な信号を移送器具そのものの表面で読むというネガティブ・コントロール・テストの1つの実施法によると、ユーザーは、ネガティブ・コントロール試薬帯域または清潔な器具の上に希釈剤を1滴または2滴たらした後、この器具をネガティブ・コントロール帯域にこすりつける。検出可能な応答が器具の表面に見られない場合には、このネガティブ・コントロール・テストから、実際のサンプルをテスト帯域に付着させても偽陽性の結果が生じないであろうことがわかる。器具が検出可能な応答を示す場合には、このネガティブ・コントロール・テストから、実際のサンプルをテスト帯域に付着させると偽陽性の結果が生じる危険性のあることがわかる。ユーザーは、ネガティブ・コントロール・テストが成功した後、同じ器具をポジティブ・コントロール帯域にこすりつけ、ポジティブ・コントロール・テストを実施する。そのとき器具が検出可能な応答を示さないのであれば、ポジティブ・コントロール・テストは失敗であると解釈される。すなわち、テスト・サンプルを付着させたときに偽陰性の結果が生じる危険性がある。しかし器具がポジティブ・コントロール・テストにおいて検出可能な応答を示すのであれば、ポジティブ・コントロール・テストは成功である。これは、装置がうまく働かないために偽陰性の結果が生じることはないであろうことを示している。ポジティブ・コントロール・テストとネガティブ・コントロール・テストは、指示薬の状態をチェックできるようにすることを主に考えて設計する。この指示薬は、多くの場合、このタイプのテスト装置で最も不安定な試薬になろう。これらコントロール・テストは、サンプル中に干渉体が存在していることを検出するのにも使用できる。

別のポジティブ・コントロール・テストは、指示薬の状態を調べるとともに、テスト・サンプル中に干渉物質が存在しているかどうかも調べるテストである。このコントロール・テストは、トリコモナスのヒドロラーゼの活性をテストする実際のサンプルを含む器具を用いて行なうことができ、別の器具は用いない。まず最初に、トリコモナスのヒドロラーゼの活性の診断テストを行なう。この診断テストの結果が陽性であった場合には、ポジティブ・コントロール・テストを行なう必要はない。というのも、診断テストそのものにより、指示薬が機能していることが明らかにされるからである。この診断テストの結果が陰性であった場合には、直後にポジティブ・コントロール・テストを行ない、同じサンプルを含む器具をポジティブ・コントロール試薬帯域にこすりつける必要がある。ポジティブ・コントロール帯域に検出可能な応答が発生した場合には、このポジティブ・コントロール・テスト、したがって診断テストは有効であると解釈される。検出可能な陽性の応答が発生しない場合には、すなわち結果が陽性ではなく陰性である場合には、このポジティブ・コントロール・テストは失敗であると解釈され、以前の診断テストは無効であると考えられる。同一の人から採取した第2の体液サンプルを用いてネガティブ・コントロール・テストを行ない、サンプル自体からの陽性の干渉を検出することもできる。このネガティブ・コントロール・テストにおいて検出可能な信号が発生しない場合には、このネガティブ・コントロール・テスト、したがって実際の診断テストは有効であると解釈される。また、体液サンプルに曝露したときにネガティブ・コントロール・テストにおいて検出可能な信号が発生した場合には、すなわちコントロール・テストが陰性ではなく陽性であった場合には、ネガティブ・コントロール・テストは失敗であると解釈され、以前の診断テストは無効であると考えられる。

さらに別のポジティブ・コントロール・テストは、アミノナフトエ酸ナトリウム、または指示薬と直接反応するそれ以外の試薬の代わりに、対照のヒドロラーゼを用いるテストである。このタイプのポジティブ・コントロール・テストでは、基質複合体、指示薬、反応条件が機能しているかどうかをテストする。上記のポジティブ・コントロール・テストと同様、対照のヒドロラーゼは、別の帯域に存在している。ユーザーは、陰性のテスト結果が診断テストで得られた直後、器具をこの帯域にこすりつける。次に、ヒドロラーゼが陽性の結果を生むのに十分な時間が経過した後、この結果を以前のコントロール・テストと同様にして解釈する。この追加の待機時間は、使用するヒドロラーゼの性質と濃度によって異なる。ヒドロラーゼは、装置を使用するpHにおいて基質に対して活性でなくてはならない。したがって、低pHテストに関しては、ポジティブ・コントロール帯域における好ましいヒドロラーゼはブロメラインである。ブロメラインは、乾燥形態で安定であり、低pHにおいて活性で安価なチオールヒドロラーゼである。ブロメラインを乾燥フィルムのポジティブ・コントロール試薬帯域に十分な量だけ堆積させることで、2分以内にポジティブ・コントロール結果を得ることができる。

要約すると、ポジティブ・コントロール・テストとネガティブ・コントロール・テストによってわかる機能は以下の通りである。

（a）ユーザーは、ポジティブ・コントロール・テストにより、すべてのテスト要素（基質複合体、指示薬、反応条件）が正確に動作していることを確認できる。したがってポジティブ・コントロール・テストは、サンプル中にトリコモナスまたはそれ以外の標的とするヒドロラーゼの活性が存在している場合にその活性を検出する上で信頼できる。ネガティブ・コントロール・テストは、トリコモナスまたはそれ以外の標的とするヒドロラーゼの活性が存在していない場合にテスト試薬が陽性の結果を生じさせないという点に関して信頼できることを保証する。ポジティブ・コントロール・テストとネガティブ・コントロール・テストは、これらの機能を果たすことにより、テスト装置内の試薬の品質をチェックする手段として機能する。

（b）ポジティブ・コントロール・テストにより、テストしているサンプルが、トリコモナスまたはそれ以外の標的とするヒドロラーゼを抑制することのできる干渉体、あるいはトリコモナスまたはそれ以外の標的とするヒドロラーゼが陽性のテスト結果を生じさせる能力を他の手段によって抑制することのできる干渉体を含んでいないことが保証される。同様に、ネガティブ・コントロール・テストにより、テストしているサンプルが、ヒドロラーゼが存在していないのに陽性の応答を発生させる可能性のある干渉体を含んでいないことが保証される。ポジティブ・コントロール・テストとネガティブ・コントロール・テストは、これらの機能を果たすことにより、サンプルそのものの品質をチェックする手段として機能する。

（c）テスト装置とそのコントロールが、テスト装置上の位置、または装置にサンプルを付着させるプロトコルが理由で、テスト装置のうちでサンプルを接触させる最後の部分であるように設計・構成されている場合には、適切に機能するポジティブ・コントロール・テストにより、テスト装置がサンプルで満たされていること、あるいは適切に濡らされていることが示される。したがって、ポジティブ・コントロール・テストは、この機能を果たすことで、テストの手続きをチェックする手段として機能する。このタイプの制御は、しばしば“手続き制御”と呼ばれる。この手続きをチェックすることは、サンプルを少量を含む設計の装置の中や、サンプルの流路が一部見えなくなっている装置の中にある透明または無色のサンプルに関して特に重要である。

本発明の考え方を具現化しているテスト装置の一例を図1に示す。この装置ならびに本発明の範囲に含まれる他の装置は、サイズも形状も任意でよいが、一般的なクレジット・カードとサイズおよび形状が同じような装置を用いるのが特に好都合である。図1に示したのは、装置を水平に保持し、操作面を上に向けて示した縦断面図である。装置はこの状態で使用することが最も多い。

この装置の土台は、不活性な非多孔性材料からなる堅固なシート11である。その上面に、セルロースまたは同様の多孔性材料からなるストリップ12を固定させる。ストリップ12は、接着剤によって、あるいはストリップを固定する任意の方法によって、下にあるシートに固定する。多孔性ストリップは、長さ方向に沿って分離された2つの試薬帯域13、14を備えている。それぞれの帯域は、ピペット、ステンシル、ペイント、プリント、スプレーなどの技術、あるいは他の任意の堆積法によって付着させてある。スワブ15も図示されている。スワブ15をまず最初に膣液サンプルで濡らし、次いでテスト装置の多孔性ストリップ12の一端に付着させることで、サンプルを多孔性ストリップへと移動させる。すでに指摘したように、サンプルは、サンプルを移動させることのできる任意の器具を用いて多孔性ストリップに付着させることができる。サンプルが付着すると、サンプルは毛管作用によって多孔性ストリップの長さ方向に沿って（図の左から右に）移動する。

移動するサンプルが出会う第1の試薬帯域13は、指示薬を含む帯域である。インヒビターが関係するテストでは、指示薬とインヒビターの両方が固体混合物としてこの第1の試薬帯域に存在している。第2の試薬帯域14は、トリコモナスのヒドロラーゼの活性に敏感な基質を含んでいる。指示薬とインヒビター（存在している場合）は第1の試薬帯域13に配置し、サンプルが移動するにつれてこれらがサンプル内に分散されるようにすることが好ましい。その場合にはサンプルが指示薬とインヒビターを伴うことになり、これら3つの成分が一緒になって第2の試薬帯域14に向けて移動する。2の試薬帯域14にある基質は、指示薬に検出可能な変化を起こさせる試薬と共有結合によって結合した結合メンバーからなる複合体であることが好ましい。別の似た装置では、2つの試薬帯域の相対位置が逆転している。

図2の装置は図1の装置の変形例であり、指示薬の変化を検出する能力を向上させるため、独立した発色試薬を使用できるように設計されている。図1の場合と同様にして図1のスワブ（図示せず）を用いてサンプルをテスト装置に付着させる。図2のテスト装置は、接着剤によって第1のシートに固定された不活性な非多孔性固体支持体材料からなる第2のシート16を含んでいるために第2の試薬帯域14の上方に延びてフラップを形成していること以外は、図1のテスト装置と同じである。フラップで下側のシートと対向する面には、通常はギャップ18によって第2の試薬帯域14から隔てられた発色試薬層17が存在している。サンプルが第2の試薬帯域14に到達すると、フラップをこの装置の下部に押しつけ、発色試薬を第2の試薬帯域と接触させる。次にフラップを持ち上げ、第2の試薬帯域を観察して検出可能な変化が起こったかどうかを判断する。

さらに別の変形例が、図3a、図3b、図3c、図3dに示した装置である。この装置は図2の装置と似ているが、フラップ16が中間シートまたはシールド20によって装置下部（すなわち土台シート）の試薬帯域14から隔てられている点が異なっている。この中間シート20は、少なくとも一部が透明である。サンプルの付着は、図3bからわかるように、濡らしたスワブを土台シート11と中間シート20の間に挿入することで実現される。中間シート20は、これら2枚のシートの長手方向の縁に沿って接合その他の方法で固定するが、それは図面では見ることができない。というのも、図面は長手方向に垂直な断面図だからである。2枚のシートは左端が互いに接合されておらず、スワブ15を挿入するため開口状態にされている。その様子が図3b、図3c、図3dからわかる。スワブは十分に深くまで挿入し、その頭部が多孔性ストリップ12の最も近い端部と接触して前の図面の装置と同様にサンプルの移動が起こるようにする。サンプルが（基質を含む）第2の試薬帯域14まで到達するのに十分な時間が経過した後、図3cに示したようにして装置を手で折り曲げ、フラップ16が土台シート11および中間シート20から離れるようにする。中間シート20には弾性があるため、中間シート20が土台シート11から離れ（て接触していない状態にな）る。次にこの装置を再び平坦な状態にする（図3d）。装置が十分に弾性を有するのであれば、これは、単に装置に手で圧力を加えるのを止めるだけでこの状態にすることができる。再びこの状態になると、フラップ16が多孔性シート12と直接接触し、発色試薬17が指示薬帯域14と接触する。

図1、図2、図3a〜図3dに示したさまざまなシートは、あらゆるサンプル、試薬、希釈剤に対して、さらにアッセイの間にシートと接触する他のあらゆる材料に対して化学的に不活性な固体材料で製造する。さらにシートは、弾性を有する半堅固なものであることが好ましい。すると（例えば図3cに示したように）変形可能でありながら、変形力を取り除いたときに再び元の形を取り戻すことができる。試薬帯域は、任意のシート上の特定の領域に試薬を従来の堆積法（プリント、結合、フォイルの付着、紙製の円板の付着など）によって付着させることで形成することができる。認印もシート上に同様にして表示することができる。中間シート20とフラップ16を透明にしてテスト結果を示す領域が見えるようにすることや、スタンプ、パンチ、刻印によって透明でないシートに意図的に配置した穴を通じて結果を観察できるようにすることが可能である。1枚以上のシートを不透明にすることができる。というのも、テスト結果はたいていの場合装置の一方の側からしか見えないからである。透明な材料として適切なものは、ポリエチレンテレフタレート（例えばマイラー（登録商標））である。多孔性ストリップ12は、水性液体で簡単に濡らすことができて望む吐出力と粒子保持力を有するが、タンパク質と強く結合したりタンパク質を吸着したりはしないセルロース材料または合成材料で製造することができる。適切な材料の具体例は、アールストローム237グレードの濾紙と、ホワットマン・グランド44濾紙である。試薬帯域は、乾燥した堆積物またはコーティングとして多孔性ストリップに付着させることができる。その幾何学的パターンまたは空間配置パターンは、異なる帯域の試薬が、ストリップを濡らすまで直接互いに接触しないようなものにする。

2枚または3枚のシートを備えるテスト装置は、さまざまな方法で形成することができる。好ましい方法としては、ポリマー材料からなるシートを接着剤または熱融着によって互いに固定する、あるいはラミネート化する方法が挙げられる。ラミネートにされたシートは、薄くて平坦なカードにすることができる。あるいは1枚以上のシートを加圧成形し、スワブを簡単に挿入できる開口ポケット（図3a〜図3d）を形成することができる。ポケットは、スワブを多孔性ストリップの端部に保持しておくための単なる便利な手段である。別の手段も容易に考え出すことができる。

本発明の考え方を具現化したさらに別のタイプのテスト装置を図4に示す。この装置は、異なる試薬帯域31、32、33、34を表面に有する1枚のシート30と、スワブ35とで構成されている。この装置を使用する場合には、単純に、（図面に示したスワブ35などの）器具をサンプルで濡らした後、この濡れた器具をさまざまな試薬帯域にあらかじめ決めた順番でこすりつけ、最後にテスト結果を器具そのものの表面で読み取る。図4に示した構成では、最も左側にある帯域31に基質が含まれており、この基質帯域の右側にある試薬帯域32には指示薬が含まれている。基質と指示薬の両方とも、すでに説明したものである。場合によっては、標的となるヒドロラーゼでないヒドロラーゼの1種類以上のインヒビターを試薬帯域31に組み込むことができる。濡れた器具をまず最初に基質帯域31にこすりつけると、基質（存在している場合にはそれに加えてインヒビター）が器具に付着し、次に器具を指示薬帯域32にこすりつけると、指示薬が同様にして器具に付着する。器具を基質帯域にこすりつけてから次に指示薬帯域にこすりつけるまでの時間間隔は、標的とする個々のヒドロラーゼに関する特定の要求に合致するように変えることができる。他のテスト装置ならびに上記の一般的な説明におけるように、サンプルがトリコモナスその他の標的とするヒドロラーゼの活性を有する場合には、この加水分解活性によって基質が開裂し、その結果として、器具に付着している指示薬、あるいは別の方法により器具で採取した指示薬に、目に見える変化が起こることになる。残っている帯域は、ネガティブ・コントロール帯域33と、ポジティブ・コントロール帯域34であり、両方とも、（指示薬帯域および基質複合体帯域とは独立に、しかも互いに独立に）サンプルで濡らした器具（またはサンプル以外の流体で濡らした器具）をこすりつけるのに用いる。このようにして、ネガティブ・コントロール用の器具に色の変化（またはそれ以外の検出可能な変化）が現われないことと、ポジティブ・コントロール用の器具に色の変化（またはそれ以外の検出可能な変化）が現われることを確認する。この両方とも、サンプルにトリコモナスのヒドロラーゼの活性があるかどうかとは独立である。

以下の実施例は、単なる例示を目的としたものである。アミノ酸は、一般的な3文字コードまたは1文字コードで表記する。さらに、以下の略号を追加して用いる。
CBZまたはZ カルボベンゾキシ
BZ ベンゾイル
BOC t-ブトキシカルボニル
MNA 4-メトキシ-2-ナフチルアミン
βNA β-ナフチルアミン
AMC 7-アミド-4-メチルクマリン

材料の調製
A．トリコモナスのヒドロラーゼ
材料：膣トリコモナス培養物（ATCC30001）と、pHが約6.5の採取用バッファ（14mMのマルトース、6mMのL-システイン、10mMのHEPESを含むリン酸緩衝溶液）。

手順：採取用バッファの中で一度遠心分離することによって後期対数増殖期培養物中のトリコモナス原虫を洗浄し、トリコモナス原虫を10⁷匹/mlの割合で採取用バッファの中に再び分散させ、35℃にて4時間にわたってインキュベートし、遠心分離によってペレット化し、0.45ミクロンのポア・フィルタで濾過することにより、生きたトリコモナス原虫が分泌したヒドロラーゼを回収した。濾液のアリコートをマイクロフュージ管に入れ、使用するときまで-80℃で保管した。

B．濃縮されたトリコモナスのヒドラーゼ
材料と手続きは、トリコモナス原虫の密度を10倍にした点以外は、トリコモナスのヒドラーゼの調製におけるのと同じである。採取用バッファの中で一度遠心分離することによって後期対数増殖期培養物中のトリコモナス原虫を洗浄し、トリコモナス原虫を10⁸匹/mlの割合で採取用バッファの中に再び分散させ、35℃にて4〜5時間にわたってインキュベートし、遠心分離によってペレット化した。上清のアリコートをマイクロフュージ管に入れ、使用するときまで-80℃で保管した。

C．溶解した膣トリコモナス細胞から得られたトリコモナスの可溶性ヒドラーゼ
材料：膣トリコモナス培養物（ATCC30001）と、pHが約6.5の洗浄用バッファ（14mMのマルトースを含むリン酸緩衝溶液）。

手順：冷やした（4℃）洗浄用バッファの中で一度遠心分離することによって後期対数増殖期培養物中のトリコモナス原虫を洗浄し、トリコモナス原虫を10⁸匹/mlの割合で脱イオン水の中に再び分散させ、室温にて1時間放置してトリコモナス原虫を増殖させ、2分間にわたって撹拌することによりトリコモナス原虫を溶解させ、遠心分離によってペレット化することにより、溶解したトリコモナス原虫からヒドロラーゼを回収した。次に、上清のアリコートをマイクロフュージ管に入れ、使用するときまで-80℃で保管した。

D．溶解した膣トリコモナス細胞から得られたトリコモナスの全ヒドラーゼ（可溶性ヒドラーゼと粒子状ヒドラーゼ）
上記のCと同じ材料を用い、同様の手続きを行なった。ただし、ヒドロラーゼは別の膣トリコモナス単離物から回収し、上清だけでなく全ライセートを用いた。冷やした（4℃）洗浄用バッファの中で一度遠心分離することによって後期対数増殖期培養物中のトリコモナス原虫を洗浄し、トリコモナス原虫を10⁸匹/mlの割合で脱イオン水の中に再び分散させ、3〜4時間にわたって4℃に維持することによりトリコモナス原虫を増殖させ、短時間撹拌することによりトリコモナス原虫を溶解させ、分散液のアリコートをマイクロフュージ管に入れ、使用するときまで-80℃で保管した。

E．ZRRR-MNA基質フィルム
材料：CBZ-Arg-Arg-Arg-MNA三酢酸塩（ZRRR-MNA）と、200mMのL-システインヒドロクロリドを含む水と、25％（w/w）ヒドロキシプロピルセルロースを含むエタノール。

手順：ZRRR-MNAをエタノールに溶かすことにより、400mMのZRRR-MNA貯蔵溶液を作った。200mMのZRRR-MNA、20mMのL-システイン、5％のヒドロキシプロピルセルロースを含むエタノール溶液にするため、400mMのZRRR-MNAを100μlと、200mMのL-システインを20μlと、エタノールを40μlと、ヒドロキシプロピルセルロースを40μl含む混合物を作った。より濃度の低いZRRR-MNAを含む溶液にするため、ZRRR-MNAの体積を対応して減らし、その体積差を、エタノールを追加することで補った。マイラー・シート上で直径が約1/4インチ（0.64cm）の円形になった領域にこの混合物1μlをピペットで移し、乾燥した窒素流のもとで乾燥させることにより、基質フィルムを作った。乾燥したこのフィルムは、使用するときまで、乾燥剤を入れた容器の中に保管した。

F．VLR-MNA基質フィルム
材料：D-Val-Leu-Arg-MNA（VLR-MNA）と、200mMのL-システインヒドロクロリドを含む水と、25％（w/w）ヒドロキシプロピルセルロースを含むエタノール。

手順：80％(v/v)のエタノールと20％(v/v)の3M塩酸からなる混合物の中にVLR-MNAを溶かすことにより、400mMのVLR-MNA貯蔵溶液を作った。200mMのVLR-MNAエタノール溶液を用いて作ったフィルムにするため、400mMのVLR-MNAを100μl、200mMのL-システインを20μl、エタノールを64μl、ヒドロキシプロピルセルロースを16μl含む混合物を作った。マイラー・シート上で直径が約1/4インチ（0.64cm）の円形になった領域にこの混合物1μlをピペットで移し、乾燥した窒素流のもとで乾燥させることにより、基質フィルムを作った。乾燥したこのフィルムは、使用するときまで、乾燥剤を入れた容器の中に保管した。

G．ジアゾニウム染料を含む指示薬フィルム
材料：ファースト・レッドRLまたはファースト・ガーネットGBC、10％w/wのエチルセルロースを含むメタノールのほか、マイヤー・ロッド、またはゴムローラー、または液体の薄膜をプラスチック・シートに付着させるための他の装置。

手順：ファースト・レッドRLまたはファースト・ガーネットGBCをジメチルホルムアミドに溶かし、メタノールで希釈した後、同体積の10％エチルセルロースと混合して、10％v/vのジメチルホルムアミドと、5％w/wのエチルセルロースと、望む濃度のジアゾニウム染料（10mMのファースト・ガーネットまたは64〜100mMのファースト・レッドRL）とを含む最終溶液を得た。#10マイヤー・ロッド、またはローラー、またはその他の手段を用いてこの染料溶液を薄いコーティングとしてマイラー・シートに付着させ、暖かい空気流に当てて急速に乾燥させた。乾燥したこのフィルムは、使用するときまで、乾燥剤を入れた容器の中に保管した。

実験1
この実験では、pHが2.8〜9.2の範囲においてトリコモナスのヒドロラーゼに基質CBZ-Arg-Arg-Arg-MNA（ZRRR-MNA）とD-Val-Leu-Lys-MNA（VLK-MNA）を加水分解させ、膣液が各pHにおいてヒドロラーゼの活性に及ぼす影響を調べる。

材料：
200mMの緩衝液：
グリシル-グリシン（Gly-gly）、pH2.8、
酢酸ナトリウム、pH5.1、
2-(N-モルホリノ)プロパン-スルホン酸（MOPS）、pH7.0、
N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸（HEPES）、pH7.5、
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（TRIS）、pH8.0、
ホウ化ナトリウム、pH9.5。
プールした正常な膣液の上清（NVS）。これは以下のようにして調製する：正常な未感染の女性からダクロン製スワブに採取した膣液サンプルを遠心分離してスワブから膣液を抽出し、このプールした膣液を使用するときまで凍結させておく。解凍した膣液を遠心分離して粒子状物質をペレット化し、粒子状物質と上清を分離し、それぞれを酢酸バッファで10倍に希釈する。
2mMのCBZ-Arg-Arg-MNA酢酸塩（ZRR-MNA）。まず最初にジメチルホルムアミドを用いて100mMの溶液として調製し、次に脱イオン水を用いて2mMの溶液に希釈する。
2mMのD-Val-Leu-Lys-MNA（VLK-MNA）。まず最初にジメチルホルムアミドを用いて100mMの溶液として調製し、次に脱イオン水を用いて2mMの溶液に希釈する。
指示薬溶液。25mMのパラ-ジメチルアミノシンナムアルデヒドを含むエタノールを100μl、10％w/vの2％ドデシル硫酸ナトリウムを900μl、100mMのクエン酸を1.35ml、200mMのリン酸二ナトリウムを450μl、水を3.5mlからなるできたての混合物。
100mMの酢酸バッファ、pH3.7。

手順
正常な膣液の上清が存在していない状態でのアッセイ：6個のウエルが2セットあるマイクロタイター・プレートを用意した。各ウエルには、6種類ある200mMのバッファのうちの1つを80μlと、水10μlと、希釈したトリコモナスのヒドロラーゼ10μlを入れた。第1のウエル・セットの各ウエルにZRR-MNAを10μl添加し、第2のウエル・セットの各ウエルにVLK-MNAを10μl添加した。15分後、各ウエルに指示薬溶液を100μl添加した。高pHだと指示薬溶液によって生じる色の濃さを薄くする可能性があるため、各ウエルに100mMの酢酸バッファ（pH3.7）を50μl添加した。ただしpHが2.8のウエルは別で、酢酸の代わりに水を添加した。さらに15分後、ウエル内の溶液の吸光度を540nmの波長にてマイクロタイター・プレート読み取りセットで測定した。

正常な膣液の上清（NVS）が存在している状態でのアッセイ：前段落の手続きに従った。ただしウエルには、水10μlの代わりに希釈したNVSを10μl添加した。

結果
正常な膣液の上清が存在していない状態でのアッセイ：トリコモナスの酵素が持つ加水分解活性は、色がピンクまたは明るい紫紅になることと、540nmにおける吸光度が上昇することに反映されるが、以下の表1.1に示すように、この酵素の活性は、非常に広い範囲のpHで大きかった。ZRR-MNAを基質として用いた場合には、酵素活性はpH2.8〜pH8.0の間でほんのわずかしか変化せず（吸光度の読みは0.631〜0.738であった）、pHが9.2になって初めて低下した（吸光度が0.172に下がった）。異なるpHプロファイルが、VLK-MNAを基質として用いた場合に観察された。活性のピークはpHが5.1のとき（吸光度が1.622）であり、pHが9.2でも高い活性を有する（吸光度は1.459）。テストしたすべてのpHの範囲において、ZRR-MNAよりもVLK-MNAで濃い色が現われた。

正常な膣液の上清（NVS）が存在している状態でのアッセイ：以下の表1.2からわかるように、少量の膣液が存在しているとトリコモナスのヒドロラーゼの加水分解活性は大きく低下した。NVSの存在下におけるZRR-MNAの加水分解は、pHが2.8、5.1、9.2のときに少なく（吸光度の読みは0.082〜0.089）、NVSの存在下におけるVLK-MNAの加水分解は、テストしたすべてのpHで少なかった（吸光度の読みは0.062〜0.094）。基質がZRR-MNAだと、酵素活性はpHが8のTRISバッファの中で最高であった（吸光度の読みは0.403）。このpHにおいて、色の発生は、膣液が存在していないときに観察された値の60％であった（0.403/0.667）。

解釈
これらの結果から、トリコモナスのヒドロラーゼは広い範囲のpHで活性であるが、ヒドロラーゼの活性が最大になる最適pHは、使用する基質によって異なることがわかる。最適pHは、強い抑制要因となる可能性のある膣液の上清が存在していることによる影響も受ける。例えば、膣液がアッセイ混合物中に存在していない場合には、ZRR-MNAがトリコモナスの酵素によって加水分解されて発生するピンク色は、pHが2.8と低かろうがpHが8と高かろうが同程度である。しかし膣液の存在下では、色の発生が抑制される程度は、pHが2.8または5.1のときよりもpHが7または8のときのほうがはるかに小さい。アッセイ混合物中に膣液の上清が存在していると、トリコモナスの酵素によって特定の基質が容易に加水分解されるかどうかに強い影響を及ぼす可能性がある。このことは、特にVLK-MNAに当てはまる。VLK-MNAは、膣液が存在していないとトリコモナスの酵素によって容易に加水分解されるが、ほんのわずかでも膣液が存在していると、ほとんど加水分解されない。膣液の存在下でトリコモナスのヒドロラーゼの活性に基づいた有効なテスト・システムを生み出すには、実験室で調製したトリコモナスのヒドロラーゼと膣液の上清の混合物、あるいはトリコモナス症の患者からの膣液サンプルを用い、最適な基質とpHを明らかにすることが重要である。トリコモナスのヒドロラーゼによって容易に加水分解する適切な基質を最初に選択するには、膣液全体ではなく膣液の上清を用いることが好ましい。というのも、膣液全体は粒子状物質に関係した非トリコモナス由来のヒドロラーゼを含んでいるからである（そのことを以下の実験で明らかにする）。

実験2
この実験では、トリコモナスのヒドロラーゼと膣液のヒドロラーゼに基質CBZ-Arg-Arg-MNA（ZRR-MNA）、BOC-Leu-Arg-Arg-AMC（BLRR-AMC）、BOC-Leu-Lys-Arg-AMC（BLKR-AMC）、CBZ-Lys-Lys-Arg-AMC（ZKKR-AMC）を加水分解させる。

材料
バッファ。200mMの酢酸ナトリウム（pH5）、または200mMのトリス-(ヒドロキシメチル)アミノメタン（TRIS）（pH8）からなる。
100mMのCBZ-Arg-Arg-MNA酢酸塩（ZRR-MNA）を含むエタノール。
100mMのBOC-Leu-Arg-Arg-AMC（BLRR-AMC）を含むジメチルホルムアミド。
100mMのBOC-Leu-Lys-Arg-AMC（BLKR-AMC）を含むジメチルホルムアミド。
100mMのCBZ-Lys-Lys-Arg-AMC（ZKKR-AMC）を含む水。
6.3mMのL-システインヒドロクロリドを含む水。
プールした正常な膣液の上清（NVS）。正常な未感染の女性から膣液サンプルをダクロン製スワブに採取し、遠心分離してスワブから未希釈の膣液を抽出し、粒子状物質をペレット化し、上清をプールすることによって調製する。
正常な未感染の1人のドナーからの正常な全膣液（NVF）。膣液サンプルを含むダクロン製スワブを遠心分離してスワブから未希釈の膣液を抽出した後、粒子状物質を膣液中に再び分散させることによって調製する。
容量が200μlのマイクロウエルを備えた96ウエルのマイクロタイター・プレート。
容量が20μlの円錐形マイクロウエルを備えた60ウエルのマイクロウエル・ミニトレイ。
指示薬溶液。0.4mMのパラ-ジメチルアミノシンナムアルデヒドと、1.4％(w/v)のドデシル硫酸ナトリウムと、100mMのクエン酸（pH4）からなる。

手順
2種類あるバッファ（酢酸塩、TRIS）のうちの1つに、4種類ある基質（ZRR-MNA、BLRR-AMC、BLKR-AMC、ZKKR-AMC）のうちの1つが8mM含まれる基質溶液を調製した。その際、100mMの基質4μlを、6.3mMのL-システイン6μl、200mMのバッファ14μl、水26μlと混合した。トリコモナスのヒドロラーゼの活性を調べるアッセイを、NVSを添加した場合としない場合について、200μlのマイクロウエルの中で行なった。1つのマイクロウエル・セットでは、それぞれの基質／バッファの組み合わせ10μlを、未希釈のトリコモナスのヒドロラーゼと混合した。第2のマイクロウエル・セットでは、それぞれの基質／バッファの組み合わせ10μlを、90％v/vのトリコモナスのヒドロラーゼと10％のNVSからなる混合物10μlと混合した。15分後、指示薬溶液を各ウエルに50μl添加した。さらに15分後、ウエル内の各溶液の吸光度をマイクロタイター・プレート読み取りセットを用いて540nmの波長において測定した。

全膣液中の細胞とそれ以外の粒子状物質が一部不透明であったため、全膣液中に存在するヒドロラーゼの活性のアッセイを20μlの円錐形マイクロウエルの中で行ない、肉眼により点数化した。正常な未感染の1人のドナーからの膣液を撹拌して粒子状物質を再び分散させ、膣液のアリコート2μlを、それぞれの基質／バッファの組み合わせ2μlと混合した。ウエルからの蒸発を遅らせるため、トレイのカバーを交換する前に、ウエルに隣接するミニトレイにピペットで水を添加した。15分後、指示薬溶液を各ウエルに2μl添加した。さらに15分後、各ウエルの色を、肉眼で、表2.1に示した0〜6までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
テストした全部で4つのペプチド基質について、pH5（以下の表2.2）とpH8（以下の表2.3）の両方において、トリコモナスのヒドロラーゼよるヒドロラーゼの活性を検出した。pH5では、全部で4つある基質は、膣液を添加したとき、活性が急激に低下した。膣液の上清に由来するトリコモナスのヒドロラーゼは、ZRR-MNAの場合に抑制が最大になり、吸光度が、pH5では0.420から0.068に低下し、pH8では0.385から0.182に低下した。膣液の上清に由来するトリコモナスのヒドロラーゼは、BLRR-AMC、BLKR-AMC、ZKKR-AMCではpH8のときに抑制されなかった。ZRR-MNAをpH5で用いた場合、あるいはどの基質であれpH8で用いた場合には、大きな加水分解活性が（粒子状物質を含む）全膣液において検出された。しかしBLRR-AMC、BLKR-AMC、ZKKR-AMCは、pH5では、正常な全膣液に存在するヒドロラーゼに対して相対的に低い感度しか示さなかった。

解釈
実験1より、トリコモナスのヒドロラーゼが、短いペプチド上のリシン基またはアルギニン基と結合した4-メトキシ-2-ナフチルアミド（MNA）レポーター基を有するペプチド基質を開裂させうることと、加水分解が広いpHの範囲で起こりうることがわかった。他方、実験2により、トリコモナスのヒドロラーゼが、短いペプチド上のリシン基またはアルギニン基と結合した7-アミド-4-メチルクマリン（AMC）レポーター基を有するペプチド基質を開裂させうることがわかる。

実験3
この実験では、正常な未感染の女性から採取した膣液中に存在するほとんどの干渉性加水分解活性が、粒子状物質の中に存在していることと、遠心分離によってその大部分を除去できることを示す。

材料
スワブ（ドナー1人につき2個）。正常な未感染の女性から1〜2日の間隔で採取した膣液を含む。
基質溶液。8mMのCBZ-Arg-Arg-MNA酢酸塩（ZRR-MNA）と、0.8mMのL-システインと、100mMの酢酸ナトリウム（pH5）または100mMのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（TRIS）（pH8）とからなる。
指示薬溶液。0.4mMのパラ-ジメチルアミノシンナムアルデヒドと、1.4％(w/v)のドデシル硫酸ナトリウムと、100mMのクエン酸（pH4）からなる。

手順
ドナーから3つの異なる日（1日目、3日目、4日目）に膣液サンプルのペアを取得し、採取した日にテストした。膣液は、それぞれのスワブから遠心分離によって抽出した。遠心分離中にマイクロフュージ管の底にペレットを形成した粒子状物質を再び分散させることはせず、各ドナーから得た第1のスワブからの膣液の上清を使用した。各ドナーから得た第2のスワブからの膣液は激しく混合して粒子状物質を再び分散させ、“全”膣液にした。各ドナーにつき、パラフィルム・シート上で、膣液の上清2μlをpH5の基質溶液2μlと混合し、膣液の上清2μlをpH8の基質溶液2μlと混合した。同様にして、各ドナーにつき、全膣液2μlをpH5の基質溶液2μlと混合し、全膣液2μlをpH8の基質溶液2μlと混合した。パラフィルム・シートを湿潤ボックスに入れ、液滴の蒸発を遅らせた。15分後、指示薬溶液2μlを各液滴に添加した。10分後、各液滴の色を、肉眼で、上記の表2.1に示した0〜6までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
pH5とpH8における結果をそれぞれ表3.1と表3.2に示す。

正常な未感染の女性の膣液に存在している干渉性ヒドロラーゼの活性は、日ごとに予測不能な大きな変化をする可能性がある。例えばドナーBからの全膣液のpH5における加水分解活性は、1日目には検出不能であり、2日後にはかなり大きく（点数が3になった）、その翌日には検出不能になった（表3.1）。全体として、膣液中のヒドロラーゼの活性は、pH5よりもpH8で高かった（表3.1と表3.2を比較のこと）。たいていの場合、加水分解活性は膣液中の粒子状物質と関係しており、膣液の上清部分では活性がないか、活性が大きく低下していた。例えば、ドナーDからの全膣液の加水分解活性は、pH8で3日目と4日目に測定すると非常に大きかったが、上清中では検出不能であった（表3.2）。稀なケースとして、ドナーCの4日目には、加水分解活性が上清中でも大きかった（表3.2）。このドナーからの膣液の粒子状物質の一部が処理中に偶然に再び分散されて上清中に存在していた可能性がある。

解釈
これらの結果は、正常な未感染の女性の膣液に存在している干渉性加水分解活性の大部分が、膣液中の粒子状物質（例えば細菌、膣細胞、その他の細胞の残骸）と関係していることを示している。遠心分離その他の方法によって粒子状物質を除去すると、膣液サンプル中に存在するトリコモナスのヒドロラーゼでないヒドロラーゼの量が大きく低下するため、アッセイがトリコモナスのヒドロラーゼの活性に対する選択性を持つようになる。

実験4
この実験では、正常な未感染の女性から採取した膣液に存在している干渉性加水分解活性の大部分が、粒子状物質に存在していることのさらに別の証拠を提供する。この実験では、粒子状ヒドロラーゼが濾過（特に遠心濾過）によって除去される。

材料
スワブ（ドナー1人につき2個）。正常な未感染の女性から採取した膣液サンプルを含む。
トリコモナスのヒドロラーゼ。上記の調製法Cに記載したようにして調製する。
希釈溶液。20mlのドロッパ・ボトルに入れた50mMのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（TRIS）バッファ（pH8.3）からなる。
1.5mlのポリスチレン製キュベット。
0.2ミクロンのポアを有する複数のナノセップMF遠心濾過装置（ポール・フィルトロン社）。それぞれには上部チェンバーの内側に粗い円板状濾紙が取り付けられていて、それがプレフィルタとして機能する。
基質溶液。2mlのドロッパ・ボトルに入れた4mMのCBZ-Arg-Arg-MNA酢酸塩（ZRR-MNA）と1mMのL-システインからなる。
指示薬溶液。2mlのドロッパ・ボトルに入れた0.8mMのパラ-ジメチルアミノシンナムアルデヒドと、2％w/vのドデシル硫酸ナトリウムからなる。
2mlのドロッパ・ボトルに入れた400mMのリンゴ酸（pH3.4）。

手順
それぞれのダクロン製スワブから膣液を抽出するため、バッファを10滴（約400μl）キュベットに入れた後、スワブをキュベットに挿入し、何回か回転させた。スワブが回転すると先細になったキュベットの狭い部分がスワブの頭部を締め付けるため、スワブの内容物が希釈溶液中に完全に混合した。スワブを取り出して廃棄した。各ドナーからの両方のスワブに対してここまでは同じ処理を行なった。次に、トリコモナスのヒドロラーゼ30μlを各ペアからのキュベットの1つに添加した。使い捨てのスポイトを用い、未濾過の膣液を1滴、各キュベットからマイクロタイター・プレートの別々のマイクロウエルに移した。各キュベットに残った膣液は、別々の遠心濾過装置に注ぎ込んだ。これら濾過装置をマイクロフュージの中に配置し、5分間にわたって遠心分離した。使い捨てのスポイトを用い、濾液を1滴、各濾過装置からマイクロタイター・プレートの別々のマイクロウエルに移した。基質溶液を1滴、各マイクロウエルに添加した。マイクロタイター・プレートを軽く数回叩いてウエルの中身を混合した。10分後、指示薬溶液を1滴とリンゴ酸を1滴、各ウエルに添加した。マイクロタイター・プレートを再び軽く数回叩いてウエルの中身を混合した。5分後、各ウエルの色を、肉眼で、上記の表2.1に示した0〜6までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
この実験では、9人のドナーのうちの2人（ドナーFとドナーH）からの膣液においてのみ、トリコモナスのヒドロラーゼを添加しない状態でヒドロラーゼの活性が陽性であった。以下の表4.1から、濾過によってこれらサンプルから加水分解活性が完全に失われていることがわかる（この表の第2列と第3列を比較のこと）。膣液にトリコモナスのヒドロラーゼを添加した場合には、すべての膣液サンプルでヒドロラーゼが高いレベルの活性を示した。未濾過の溶液と濾過した溶液で差はほとんどなかった（この表の第4列と第5列）。

解釈
この実験では、実験3におけるよりも検出可能なヒドロラーゼの活性を有する膣液サンプルの数が少なかった。これは、おそらく、この実験では膣液がより希釈されていたからであろう。加水分解活性を有する2つのサンプルに存在する干渉性の膣液ヒドロラーゼは、濾過によって検出不能なレベルに減少した。これは、干渉性の膣液ヒドロラーゼが水にほとんど溶けないことを意味する。抽出した膣液サンプルにトリコモナスのヒドロラーゼを添加したとき、トリコモナスのヒドロラーゼはフィルタを簡単に通過した。その結果として、濾過した溶液と未濾過の溶液で差はほとんどなかった。これは、トリコモナスのヒドロラーゼが水に溶けることを示唆している。上記の多数の実験に関しては、トリコモナスのヒドロラーゼを単独でテストするのではなく、膣液に添加し、膣液の存在下で活性なヒドロラーゼだけが検出されるようにした。

実験5
この実験では、正常な未感染の女性から採取した膣液に存在している干渉性加水分解活性の大部分が、粒子状物質に存在していることのさらに別の証拠を提供する。この実験では、粒子状のヒドロラーゼが濾過によって除去される。濾過は、サンプルを多孔性材料からなるストリップの長さ方向に沿って流すことによって実現される。

材料
トリコモナスのヒドロラーゼ。上記の調製法Bに記載したようにして調製する。
多孔性材料：SMW50ファイバー、マンニウエブ・フィルトレーション・システムズ・プロダクツ社。
プラスチック製の飲み物用ストロー。長さ2インチに切断し、一端を熱融着により閉じる。
バッファ。100mMのイミダゾール溶液（pH7.3）からなる。
ダクロン製スワブ。正常な未感染の1人の女性から採取した膣液サンプルを含む。
基質溶液。4mMのCBZ-Arg-Arg-MNA酢酸塩（ZRR-MNA）を含む100mMのイミダゾール（pH7.3）からなる。
発色溶液。以下の指示薬溶液と酸溶液の新鮮な等量混合物からなる。
a．指示薬溶液：25mMのパラ-ジメチルアミノシンナムアルデヒドを含むエタノール160μlと、10％w/vのドデシル硫酸ナトリウム1mlと、水8.8mlからなる。
b．1Mのリンゴ酸（pH3）。

手順
幅が3mmで長さが45〜50mmのストリップを3本、多孔性材料から切り出した。各ストリップをパラフィルム・シートの上に置き、幅が3mmのベルト状テープを2本、各ストリップを横断するように固定させた。第1のベルト状テープはストリップの末端から5mmに位置させ、第2のベルト状テープは第1のベルト状テープから5mmのところに位置させることで、各ストリップを3つの区画に分割した。すなわち開始端にある長さが5mmの上流区画と、長さが5mmの中間区画と、長さが約30〜35mmの下流区画である。同じドナーからの膣液サンプルを異なった3つの方法で処理した。

1．抽出した全膣液：ダクロン製スワブの頭部から膣液を抽出するため、熱融着させたストローの中にピペットを用いてバッファ250μlを入れ、スワブをこのストローの中に挿入した。圧力をストローの側部から加えながらスワブをストローの中で回転させ、スワブの内容物がバッファの中に完全に入って混合するようにした。ストローの側部を締め付けながらスワブをストローからゆっくりと取り出し、スワブの頭部から液体の大部分が滲み出すようにした。

抽出した膣液25μlを、長さが45mmある多孔性ストリップのうちで2本のバンド状テープで挟まれた中間区画に、ピペットでゆっくりと移した。抽出した膣液が完全にストリップの中に吸収された後、バッファ50μlを一滴ずつストリップの上流区画（出発端）に付着させ、1つの液滴を付着させてから次の液滴を付着させるまでの間にバッファがストリップの内部に吸収されるようにした。バッファがすべてストリップに吸収されてストリップ全体が濡れていることが見てわかる状態になった後、ストリップの下流区画を横断方向に切断して長さが3〜5mmの小さなスライスにした。各スライスを順番に96ウエルのマイクロタイター・プレートの別々のマイクロウエルに移した後、基質溶液25μlで覆った。10分後、ピペットを用いて発色溶液25μlを各マイクロウエルに移した。5分後、各ウエルに現われた色を、肉眼で、上記の表2.1に示した0〜6までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

2．ブロットした全膣液：ストローを用いて膣液を抽出する代わりに、同じドナーからの膣液サンプルを含むスワブを、長さが45mmの別の多孔性ストリップの中間区画に数回押しつけた。スワブが平坦になり、目で見て膣液で濡れていることがわかるようになるまで、スワブの頭部をストリップにブロットした。バッファ5μlをストリップの上流区画にピペットを用いて一滴ずつ移し、このストリップを上記のようにして処理した。

3．ブロットした全膣液+トリコモナスのヒドロラーゼ：トリコモナスのヒドロラーゼが多孔性ストリップを移動することを示すため、パート2で説明したようにしてスワブを長さが50mmのストリップの中間区画にブロットした後、トリコモナスのヒドロラーゼ4μlを同じ区画に、ピペットを用いて移した（この追加流体4μlを収容するため、より長いストリップを用いた）。バッファ5μlをこのストリップの上流区画にピペットを用いて一滴ずつ移し、このストリップを上記のようにして処理した。

結果
結果を以下の表5.1に示す。区画Aは上流区画であり、区画Bは中間区画であり、区画C1〜区画C8は、より長い下流区画の8つの下部区画である。

これらの結果から、抽出した膣液に関しては、予期された通り、バッファを多孔性ストリップに付着させた上流区画では加水分解活性が検出されなかったことがわかる。かなり大きな加水分解活性が中間区画で検出された。ここは、膣液を付着させた場所である。ストリップの下流区画から切断したスライスのうちで中間区画に最も近い最初の4つのスライス（下部区画C1〜C4）では活性が検出されず、下流区画から切断された残る2つのスライスで低レベルの加水分解活性が検出された。ブロットした膣液に関する結果は、抽出した膣液についての結果と同じであった。膣液にトリコモナスのヒドロラーゼを加えた場合の結果は、区画Aおよび区画Bと、区画Cの最初の4つの下部区画に対する結果と同様であった。しかし他のストリップとは異なり、区画Cの遠位端から切断したスライス（下部区画C6〜C8）ではかなり大きな加水分解活性が存在していた。ここでもう一度指摘しておくが、このストリップはより長いために下部区画を2つ余計に含んでいることに注意されたい。

解釈
正常な全膣液に存在しているほとんどの加水分解活性は、多孔性ストリップ上で膣液を付着させた区画Bで検出された。出発端のある区画から中間区画を通って下流区画へとバッファが流れても、加水分解活性がバッファとともに流れることはあまりなかった。これは、このアッセイによって検出される膣液のヒドロラーゼの大部分が、多孔性材料の内部または表面に捕捉された粒子状物質と結合している、あるいはその粒子状物質と関係していることの強力な証拠となっている。膣液のヒドロラーゼの非常にわずかの割合だけが明らかに可溶形態になっている。可溶性のヒドロラーゼは、バッファ流とともにストリップの端部まで運ばれた。膣液をスワブから紙製ストリップに移すこれら2つの方法は、このストリップに捕捉されるヒドロラーゼの量には影響を及ぼさない。

ストリップに付着させた膣液にトリコモナスのヒドロラーゼを添加する場合には、追加サンプルを添加した中間区画で検出される活性は増加しなかったが、ストリップの本当の末端ではヒドロラーゼの活性が大きく増加した。これは、トリコモナスのヒドロラーゼが可溶性であり、ストリップ内の液体流により、多孔性ストリップを通じて横方向に容易に移動できることを示している。この観察結果から、膣液サンプルを移した後にバッファで横方向に洗浄する多孔性ストリップを含むテスト装置が、トリコモナスのヒドロラーゼに対する選択性を有することがわかる。トリコモナスのヒドロラーゼはストリップの末端に到達するが、膣液の（粒子状）ヒドロラーゼはほとんど到達しない。基質をストリップの端部に配置すると、トリコモナスの（可溶性）ヒドロラーゼがサンプル中に存在している場合にのみ基質の加水分解が起こる。

実験6
この実験では、ある種のプロテアーゼ・インヒビターが、トリコモナスのヒドロラーゼの活性を調べるアッセイの選択性をさらに高めることを示す。この実験で使用するインヒビターは、アンチパイン（チオール・プロテアーゼのインヒビター）とキモスタチン（セリン・プロテアーゼであるキモトリプシンのインヒビター）である。これらインヒビターは、全膣液サンプルに対して行なうアッセイにある程度の選択性を与えるが、特に有効なのは、濾過または遠心分離によって粒子状ヒドロラーゼを除去した膣液サンプルに対してである。正常ないくつかの膣液サンプル中にいろいろな割合で存在する少量の可溶性ヒドロラーゼを除去するには、比較的低濃度のインヒビターで十分である。上記インヒビターは、この実験で使用する濃度では、トリコモナスのヒドロラーゼの活性を実質的に抑制しなかった。

材料
スワブ（ドナー1人につき2個）。正常な未感染の女性から採取した膣液サンプルを含む。
トリコモナスのヒドロラーゼ。上記の調製法Bに記載したようにして調製する。
希釈溶液。10mMのL-システインを含む水からなる。
0.2ミクロンのポアを有する濾過膜を備えた0.5mlの遠心濾過ユニット。
20μlの円錐形マイクロウエルを備えた60ウエルのマイクロウエル・ミニトレイ（元々は血清型の分類を目的として設計された）。
100mMのCBZ-Arg-Arg-MNA酢酸塩（ZRR-MNA）を含むエタノール。
1MのN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸（HEPES）、pH7.6。
200μg/mlのアルパインを含む水。
10mMのキモスタチン。DMSO中に作った330mMの貯蔵溶液に脱イオン水を添加することによって調製する。
発色溶液。以下の溶液の新鮮な等量混合物からなる。
a．指示薬溶液：25mMのパラ-ジメチルアミノシンナムアルデヒドを含むエタノール320μlと、10％w/vのドデシル硫酸ナトリウム1mlと、水7.7mlからなる。
b．400mMのリンゴ酸（pH3.4）。

手順
1．正常な膣液の上清に存在する非トリコモナス由来のヒドロラーゼを強く抑制することの証明：
100mMのZRR-MNAを4μlと、1MのHEPESバッファ20μlと、脱イオン水56μlと、アンチパインまたはキモスタチンまたは脱イオン水20μlを混合することにより、基質／インヒビターのさまざまな組み合わせを調製した。濾過した膣液を各サンプルから以下のようにして調製した：希釈剤を200μl含むキュベットにスワブを入れ、この希釈剤の中でスワブを回転させてスワブの内容物を希釈剤の中に完全に混合した。スワブを取り出し、スワブの頭部をちぎってマイクロフュージ管に入れ、スワブの頭部に残っている液体を遠心分離によって強制的に放出させた。スワブから抽出した液体をキュベットの中の液体と合体させ、遠心濾過ユニットを用いて全量の液体を濾過して粒子状物質を除去した。

各サンプルについて、膣液の濾液4μlを、3種類ある基質／インヒビターの組み合わせのうちの1つの4μl分と、別々のマイクロウエルの中で混合した。1つのウエルには20μg/mlのアンチパインを入れ、別のウエルには1mMのキモスタチンを入れ、さらに別のウエルにはインヒビターを入れなかった。10分後、発色溶液4μlを各ウエルに添加した。10分後、各ウエルの色を、肉眼で、上記の表2.1に示した0〜6までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

2．トリコモナスのヒドロラーゼを弱く抑制することの証明：
濾過した各膣液サンプルにトリコモナスのヒドロラーゼを添加し（トリコモナスのヒドロラーゼの調製物10μlを膣液の濾液90μlに添加した）、上記の実験を繰り返した。

結果
正常な未感染の女性から採取した膣液の上清に関する結果を表6.1に示す。膣液の上清にトリコモナスのヒドロラーゼを添加した結果を表6.2に示す。

1．膣液の上清に存在するヒドロラーゼを強く抑制することの証明（表6.1）：
表6.1の結果は、正常な6つの膣液サンプルのうちの5つが、ZRR-MNAを加水分解することのできるヒドロラーゼを含んでいたことを示している（表の第2列）。アンチパインは、これら5つのサンプルすべてでヒドロラーゼを完全に抑制した（第3列）。キモスタチンは、これら5つのサンプルのうちの4つでヒドロラーゼを完全に抑制し、酵素活性が最大のサンプルでヒドロラーゼを一部抑制した（第4列）。

2．トリコモナスのヒドロラーゼを弱く抑制することの証明（表6.2）：
表6.2の結果は、トリコモナスのヒドロラーゼで増強した場合にはサンプルの加水分解活性が上昇することを示している（第2列）。アンチパインもキモスタチンも、インヒビターを含まないウエル（第2列）と比べ、トリコモナスのヒドロラーゼによる色の濃さを0.5単位を超えて低下させることはなかった（第3列と第4列）。

解釈
この実験は、適切な濃度のヒドロラーゼ・インヒビターが、正常な膣液サンプルに天然の状態で存在する干渉性ヒドロラーゼを選択的に抑制するのに対し、トリコモナスのヒドロラーゼのほうは活性なままにしておくことをはっきりと示している。このことを利用すると、トリコモナスのヒドロラーゼを特異的に検出する能力をさらに向上させることができる。この実験で使用したインヒビターは、異なる2つのクラスからのものであった。すなわち、アンチパインはチオール・プロテアーゼのインヒビターであり、キモスタチンは、セリン・プロテアーゼであるキモトリプシンのインヒビターである。しかしそれぞれが干渉性ヒドロラーゼを選択的に抑制した。

実験7
この実験では、STD（性感染病）治療のクリニックに通っている女性から採取した膣液サンプルにおいて、2種類のチオール・プロテアーゼ（E64とアンチパイン）が非トリコモナス由来の水溶性ヒドロラーゼを選択的に抑制する能力を比較する。

材料
スワブ（ドナー1人につき2個）。STD治療のクリニックに通っている女性から採取した膣液サンプルを含む。これら女性の多くは細菌性膣炎、膣酵母感染症、あるいは他の膣炎を患っており、膣トリコモナスを5日間培養することにより、トリコモナス陽性（膣が膣トリコモナスに感染している）またはトリコモナス陰性であると判定された。
飲み物を飲むためのプラスチック製ストロー。長さ2インチに切断し、一端を熱融着によって閉じる。
0.2ミクロンのポアを有する濾過膜を備えた0.5mlの遠心濾過ユニット。
250μlの丸底ウエルを有する96ウエルのマイクロウエル・プレート。
基質試薬溶液。4mMのCBZ-Arg-Arg-MNA酢酸塩（ZRR-MNA）と、400mMのイミダゾール・バッファ（pH7.3）と以下の2つのインヒビターのうちの1つを含む：
0.4mMのトランス-エポキシスクシニル-L-ロイシルアミド-(4-グアニジノ)ブタン（E64）
5μg/mlのアンチパイン。
発色溶液。以下の溶液の新鮮な等量混合物からなる。
a．指示薬溶液：25mMのパラ-ジメチルアミノシンナムアルデヒドを含むエタノール160μlと、10％w/vのドデシル硫酸ナトリウム2mlと、水7.8mlからなる。
b．400mMのリンゴ酸（pH3.4）。

手順
通院患者からの各膣液サンプルを、脱イオン水250μlを含む熱融着したプラスチック製ストローの中に入れた。ストローをつまみながらスワブを回転させてスワブの内容物を完全に水の中に混合させた後、ストローを締め付けながらスワブを取り出し、スワブの頭部から液体の大部分が滲み出すようにした。粒子状物質を除去するため、抽出した膣液を濾過ユニットに移し、小さな携帯用遠心分離器を用いて最長で5分間の時間をかけて遠心分離した。E64を含む基質溶液25μlをピペットを用いて丸底のマイクロウエルに移した。アンチパインを含む基質溶液25μlをピペットを用いて第2のウエルに移した。濾過した膣液25μlを2つのウエルのそれぞれに添加した。10分後、発色溶液25μlを各ウエルに添加した。5分後、各ウエルの色を、肉眼で、表2.1に示した0〜6までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
結果を表7.1に示す。

培養でトリコモナス陽性だった5つのサンプルのうちの3つが、テスト・ウエルでピンク色を示した（表7.1の上半分）。これらのサンプルについては、インヒビターが異なっても色の点数が異なることはなかった。すなわちE64を含むウエルの点数は、アンチパインを含む対応するウエルの点数とほぼ同じ（差が0.5点まで）であった。培養で陽性だったサンプルのうちでピンク色にならなかった2つのサンプルは、トリコモナス原虫の数が少なかった。顕微鏡によるウエット・マウント試験において、一方のサンプルではほんの数匹のトリコモナス原虫しか見られず、他方のサンプルでは一匹も見つからなかった。培養で陰性だった全部で21個のサンプルは、E64を含むウエルの点数がゼロであった。これら21個のサンプルのうちの17個は、アンチパインを含むウエルの点数がゼロであった（表7.1の下半分）。

解釈
この実験は、2つのインヒビターの効果を調べるために設計した。このクリニックの各ドナーからは2つのサンプルしか利用できなかった。そのため、インヒビターの不在下でヒドロラーゼの活性もテストしながら2種類のインヒビターを比較することは不可能だった。しかし実験6で証明したように、濾過後に非トリコモナス由来のヒドロラーゼが膣液にある程度の量残っている可能性がある。だがアンチパインを用いると、この非トリコモナス由来のヒドロラーゼを選択的に抑制できる。この実験7は、別のチオール・ヒドロラーゼ・インヒビターであるE64も、膣液サンプル中に存在している可能性のある非トリコモナス由来のヒドロラーゼを選択的に抑制するのに非常に効果的である可能性があることを示している。テストしたインヒビターの濃度では、トリコモナスのヒドロラーゼを活性な状態にしたまま、膣にトリコモナスが感染していない通院患者からの膣液サンプルに存在している非トリコモナス由来のヒドロラーゼを選択的に抑制する上で、E64がアンチパインよりも効果的であった。

実験8
この実験では、ある種のポリペプチドを用いると、膣液中に存在する非トリコモナス由来のヒドロラーゼを選択的に抑制できるが、トリコモナスのヒドロラーゼは比較的わずかしか抑制せず、他のポリペプチドにはこのような効果がないことを示す。

材料
スワブ。正常な未感染の4人の女性から採取した膣液サンプルを含む。
トリコモナスのヒドロラーゼ。上記の調製法Aに記載したようにして調製する。
20μlの円錐形マイクロウエルを備えた60ウエルのマイクロウエル・ミニトレイ。
基質／ポリペプチド溶液。8mMのCBZ-Arg-Arg-MNA酢酸塩（ZRR-MNA）と、0.8mMのL-システインと、56mMの酢酸塩バッファ（pH5）またはTRISバッファ（pH8）と、以下のポリペプチドのうちの1つを10mM含む：
Lys-Arg-Gln-His-Pro-Gly（KRQHPG）
Lys-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro（KPQLWP）
Arg-Lys-Asn-Val-Tyr（RKNVY）
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met（RPKPQFFGLM）
ポリペプチドなし（対照）。
指示薬溶液。0.4mMのパラ-ジメチルアミノシンナムアルデヒドと、1.4％w/vのドデシル硫酸ナトリウムと、100mMのクエン酸（pH4）からなる。

手順
膣液を遠心分離により各スワブから抽出した後、粒子状物質と混合して粒子状物質を再び分散させた。各ドナーにつき、膣液2μlを10個のマイクロウエルのそれぞれにピペットで移した後、10種類ある基質／バッファ／ポリペプチドの組み合わせのうちの1つを2μl、各ウエルに添加した。さらに、トリコモナスのヒドロラーゼ2μlを、10ウエルのセットの中で、基質／ポリペプチドのそれぞれ2μlと混合した。15分後、指示薬溶液2μlを各ウエルに添加した。10分後、各ウエルの色を、肉眼で、表2.1に示した0〜6までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
pH5でテストした結果を表8.1に示す。pH8でテストした結果は表8.2に示す。

これらの表は、アッセイをpH5で行なった場合に、4人のドナーのうちの3人からの膣液が、色彩スコアが3となるのに十分な加水分解活性を持っていたことを示している（表8.1の“ポリペプチドなし”の行）。トリコモナスのヒドロラーゼもこのアッセイで3点になった。KPQLWPまたはRKNVYが存在している場合、膣液のヒドロラーゼはほとんど色を生じさせることがなく、1つのウエルを除いてすべて0点であった。一方、トリコモナスのヒドロラーゼはその影響を受けなかった。アッセイをpH8で行なった場合に、4人のドナー全員からの膣液とトリコモナスのヒドロラーゼの色彩スコアが2.5または3になった。ここでもKPQLWPとRKNVYは、このpHにおけるトリコモナスのヒドロラーゼによる発色を抑制したが、pH5のときほどではなかった。ポリペプチドKRQHPGは、テストしたどちらのpHでも、膣液のヒドロラーゼによる発色をわずかに抑制する効果を持っていた。これとは対照的に、最大のポリペプチドRPKPQFFGLMは、膣液のヒドロラーゼによる発色とトリコモナスのヒドロラーゼによる発色の両方を抑制し、点数が1を超えるウエルはなかった。

解釈
ポリペプチドRPKPQFFGLMは、トリコモナスのヒドロラーゼによる基質（ZRR-MNA）の加水分解と正常な膣液のヒドロラーゼによる基質（ZRR-MNA）の加水分解の両方を減少させたため、膣液中の非トリコモナス由来のヒドロラーゼを選択的に抑制するという望む特性を示さなかった。調べた他の3つのペプチドは、トリコモナスのヒドロラーゼによる発色を低下させなかった。そのうちの1つKRQHPGは、膣液のヒドロラーゼに対する抑制効果がほとんどなかったが、残る2つのポリペプチド（KPQLWPとRKNVY）は、膣液のヒドロラーゼを特にpH5において選択的に抑制した。

実験9
この実験では、いくつかのジペプチドについて、全膣液と膣液の上清に存在しているトリコモナスのヒドロラーゼは相対的にわずかしか抑制しない状態で、非トリコモナス由来のヒドロラーゼを選択的に抑制する能力を比較する。

材料
スワブ。正常な未感染の4人の女性から採取した膣液サンプルを含む。
トリコモナスのヒドロラーゼ。上記の調製法Aに記載したようにして調製する。
20μlの円錐形マイクロウエルを備えた60ウエルのマイクロウエル・ミニトレイ。
基質／ポリペプチド溶液。8mMのCBZ-Arg-Arg-MNA酢酸塩（ZRR-MNA）と、0.8mMのL-システインと、56mMの酢酸塩バッファ（pH5）またはTRISバッファ（pH8）と、以下のポリペプチドのうちの1つを10mM含む：
Lys-Pro
Lys-Val
Lys-Lys
ジペプチドなし（対照）。
指示薬溶液。0.4mMのパラ-ジメチルアミノシンナムアルデヒドと、1.4％w/vのドデシル硫酸ナトリウムと、20mMのリンゴ酸（pH3.4）からなる。

手順
各サンプルについて、膣液を遠心分離によってスワブから抽出し、膣液の上清2μlをマイクロフュージ管から取り出し、残りの膣液は粒子状物質と混合して粒子状物質を再び分散させた。各サンプルについて、このようにして再構成した膣液2μlをピペットを用いて4つのマイクロウエルに移した後、各ウエルに対し、4種類ある基質／ジペプチドの組み合わせのうちの1つを2μl添加した。別の4つのウエル・セットの中で、各サンプルからの膣液の上清2μlをトリコモナスのヒドロラーゼ18μlと混合し、この混合物2μlを、それぞれの基質／ジペプチドの組み合わせ2μlと混合した。15分後、指示薬溶液2μlを各ウエルに添加した。10分後、各ウエルの色を、肉眼で、表2.1に示した0〜6までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
全膣液に対して行なったテストの結果を表9.1に示す。膣液の上清に対して行なったテストの結果は表9.2に示す。

これらの表は、4つある全膣液サンプルのうちの3つが、測定可能な加水分解活性を有していたことを示している（表9.1の“ジペプチドなし”の行）。リシン-プロリンというジペプチドは、これら3つの全膣液サンプルによる発色をどの場合も完全に抑制した。テストした他の2つのジペプチド（リシン-バリンとリシン-リシン）は、全膣液サンプルによる発色にほとんど影響を与えなかった。これらのペプチドのいずれかを含むウエルの点数はすべて、各ドナーの膣液に関する対応する対照ウエルと0.5点の範囲で一致した。正常な膣液の上清とトリコモナスのヒドロラーゼの混合物は、点数が1〜2.5であった（表9.2の“ジペプチドなし”の行）。リシン-プロリンが存在していると、トリコモナスのヒドロラーゼによって生じる色の点数がわずかに小さくなったのに対し、リシン-バリンおよびリシン-リシンは、抑制効果をほとんど持たないか、まったく持たなかった。

解釈
テストした3つのジペプチドのうちの2つ（リシン-バリンとリシン-リシン）は、膣液のヒドロラーゼまたはトリコモナスのヒドロラーゼによる発色に対してほとんど影響を及ぼさなかった（色彩スコアの差がわずかに0.5であるということは、各ウエルにピペットで移した粒子状材料の量の違いが原因である可能性がある）。しかしリシン-プロリンは、トリコモナスのヒドロラーゼはほんのわずかしか抑制しない状態で、膣液のヒドラーゼを選択的に抑制した。

実験10
この実験は、STD治療のクリニックに通っている女性から採取した膣液サンプルに関するテストにおいて、指示薬であるパラ-ジメチルアミノ-シンナムアルデヒドと、基質複合体であるCBZ-Arg-Arg-MNA（ZRR-MNA）と、酵素インヒビターE64とを染み込ませたストリップ状の濾紙を含むテスト装置をどのように使用するかを示している。

材料
スワブ（ドナー1人につき2個）。STD治療のクリニックに通っている女性から採取した膣液サンプルを含む。これら女性の多くは細菌性膣炎、膣酵母感染症、あるいは他の膣炎を患っており、膣トリコモナスを5日間培養することにより、トリコモナス陽性（膣が膣トリコモナスに感染している）またはトリコモナス陰性であると判定された。
100mMのイミダゾール・バッファ、pH7.1。
40mMのCBZ-Arg-Arg-MNA（ZRR-MNA）と、0.2mMのトランス-エポキシスクシニル-L-ロイシルアミド-(4-グアニジノ)ブタン（E64）を含むエタノール。
24mMのパラ-ジメチルアミノ-シンナムアルデヒド（pDMAC）と、5％(w/w)のヒドロキシ-プロピルセルロース（HPC）を含むエタノール。
3Mのリンゴ酸、2％(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム、6％(w/v)のヒドロキシプロピルセルロースを含む水。

手順
図3a〜図3dを参照すると、テスト装置は以下のように組み立てられたことがわかる。長さが1インチの2本のストリップ状両面テープを、互いに3/4インチ離した状態で、厚さが5ミルのマイラー・シート11に平行に固定した。3/16インチ×5/8インチのストリップにしたアールストローム237濾紙12を、このストリップ状濾紙の一端（“上方”端、すなわち図面の右端）が2本のストリップ状テープの端部と揃うようにして、マイラー・シートに固定した。約1μlのpDMAC混合物をコーティング13としてストリップ状濾紙の上方側の半分に付着させ、乾燥させた。2μlのZRR-MNA混合物14をストリップ状濾紙の反対側の端部に均等に1/4インチの厚さにピペットで移し、乾燥させた。第2のマイラー・シート20を最初のシートに固定し、2本のストリップ状両面テープで一体化することにより、平坦なスリーブを形成した。ストリップ状濾紙12は、2枚のマイラー・シートの間でスリーブを形成している部分に沿って存在していた。乾燥したリンゴ酸混合物の薄膜17であらかじめ被覆してある第3のマイラー・シート16を最初のマイラー・シート11に固定し、被覆した表面がストリップ状濾紙12の上に来るようにした。ただし第2のマイラー・シート20によって濾紙とはしばらくの間接触しないようにした。

クリニックの患者からの膣液サンプルを含む各スワブを、テスト装置のスリーブ区画に入れた。テスト装置を水平に保持した状態でピペットをスリーブ区画に挿入し、バッファ140μlを注意深くスワブの頭部に移した。スワブを10回回転させてバッファをスワブの頭部に均等に染み込ませた。スワブをスリーブ区画のさらに奥まで挿入し、頭部がストリップ状濾紙の端部としっかりと接触するようにした。これは、スワブから液体が濾紙にゆっくりと滲み出すようにするためである。15分後、テスト装置の端部を折り曲げ、次いで元に戻した。すると酸性フィルムがストリップ状濾紙と接触した。酸性フィルムに含まれる試薬により、パラ-ジメチルアミノ-シンナムアルデヒドと、サンプル中に存在するヒドロラーゼによって基質が加水分解して生じるあらゆる生成物（MNA）との間での指示薬反応が容易になる。5分間待機した後、テスト装置のストリップ状濾紙で基質が位置する領域にピンク色の線が現われたかどうかをを調べる。

結果を表10.1に示す。

テストした9個の膣液サンプルのうちの3つは、トリコモナス症の女性から採取した。この表は、その3つのサンプルすべてが陽性であり、テスト装置のストリップ状濾紙にピンク色の線を形成したことを示している。トリコモナス症にかかっていない女性からの6つのサンプルのうちの5つでは、ピンク色が現われず、これら6つのサンプルのうちの1つだけで淡いピンク色が現われた。

解釈
この実験から、基質と指示薬とインヒビターを染み込ませたストリップ状濾紙を備える簡単な装置を用いると、膣液サンプル中のトリコモナスのヒドロラーゼを正確に検出できることがわかる。バッファ溶液を除くすべての試薬は、装置内で乾燥した形態であった。膣液サンプルをバッファで希釈する、膣液サンプルを濾過する、基質を加水分解する、指示薬と反応させて目に見える色を出させるといったすべてのステップが、この装置内で実行された。バッファと混合した膣液は、スワブから滲み出させることによって濾紙に移した。膣液が多孔性支持体を横方向に移動するにつれ、粒子状物質が濾過されて除かれると同時に、指示薬が混入する。この混合物が基質とインヒビターを含む帯域に到達すると、膣液中にトリコモナスのヒドロラーゼが存在している場合には基質の加水分解が起こった。15分待つと、膣液がストリップを流れていき、十分な量の基質がトリコモナス陽性のサンプルによって加水分解された。酸をストリップに付着させた後、基質の加水分解による生成物を指示薬と反応させたところ、ストリップにはっきりと目に見えるピンク色の線が現われた。これは陽性であることを示している。

実験11
この実験では、トリコモナスのヒドロラーゼによるCBZ-Arg-Arg-Arg-MNA（ZRRR-MNA）の加水分解を、1.9〜3.4の範囲のさまざまなpH値で比較する。この実験では、スワブを乾燥した基質フィルムに押しつけ、その10分後に指示薬に押しつけ、結果を直接スワブの表面に読み取る方法も示す。

材料
トリコモナスのヒドロラーゼ。調製法Dに記載したようにして調製した後、トリコモナスのヒドロラーゼ50μlに100mMのL-システインヒドロクロリド5μlと水445μlを混合することによって10％v/vに希釈する。
100mMのDL-リンゴ酸溶液。HClを用いてpHを1.3、1.6、1.9、2.2、2.5、2.8、3.1、3.4のいずれかの値に調整する。
200mMのCBZ-Arg-Arg-Arg-MNA三酢酸塩（ZRRR-MNA）を含むエタノール。
25％(w/w)ヒドロキシプロピルセルロースを含むエタノール。
指示薬フィルム。100mMのファースト・レッドRL染料を用い、調製法Gに記載したようにして調製する。

手順
200mMのZRRR-MNA溶液を25％のヒドロキシプロピルセルロース溶液と混合し、エタノールを追加して、最終濃度が80mMのZRRR-MNAと5％のヒドロキシプロピルセルロースになるようにした。マイラー・シート上の直径約1/4インチの円形領域に混合物1μlをピペットで移し、乾燥した窒素流のもとで乾燥させることにより、基質フィルムを作った。上記の各pH値になったリンゴ酸バッファ溶液のアリコート80μlを、マイクロタイター・プレート上の別々の8つの丸底ウエルのそれぞれに、ピペットを用いて移した。トリコモナスのヒドロラーゼの10％溶液80μlを各ウエルに添加し、完全に混合した。次に各ウエル（80μl）の半分の体積を8つのウエルからなる第2のセットに移し、その中にスワブを挿入した。各ウエルからの液体80μlをそれぞれのスワブに吸収させた後、各スワブを基質フィルムにこすりつけた。スワブを基質に曝露した10分後、各スワブを指示薬（ファースト・レッド）フィルムにこすりつけた。1分後に各スワブに現われたピンク色の濃さを、肉眼で、以下の表11.1に示した0〜9までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。トリコモナスのヒドロラーゼとバッファの8通りの混合物の最終pHを明らかにするため、8つのウエルからなる第1のセットに残っている液体のpHを、pHメーターを用いて測定した。pH値が最小のウエルとpH値が最大のウエルを取り除き、以上の操作を繰り返した。

結果
結果を表11.2に示す。pHがほぼ2.4のときに加水分解活性が最大になることがわかる。

解釈
表11.2のデータは、トリコモナスのヒドロラーゼ溶液に存在している酵素が低pHでZRRR-MNAを加水分解しうることを示している。活性のピークはpHがほぼ2.4のときである。トリコモナスのヒドロラーゼが持つこの特徴は、トリコモナス症に対する選択性を持つ簡単な診断テストの開発に応用できる。というのも、ほとんどのヒドロラーゼは、このような低pHでは働きが非常に弱いからである。

実験12
この実験では、pHが2.0〜2.6の4つの異なるバッファにおいて、トリコモナスのヒドロラーゼがCBZ-Arg-Arg-Arg-MNA（ZRRR-MNA）を加水分解する能力を比較する。

材料
トリコモナスのヒドロラーゼ。調製法Dに記載したようにして調製した後、トリコモナスのヒドロラーゼ100μlに100mMのL-システインヒドロクロリド10μlと水890μlを混合することによって10％v/vに希釈する。
100mMのL-システインヒドロクロリド
100mMのバッファ溶液群。各バッファ溶液は、pHが2.0、2.2、2.4、2.6である。
a．DL-リンゴ酸
b．グリシン
c．L-トレオニン
d．L-リシン
8mMのCBZ-Arg-Arg-Arg-MNA酢酸塩（ZRRR-MNA）。200mMの貯蔵溶液を含むエタノールを水で希釈することによって調製した。
指示薬フィルム。100mMのファースト・レッドRL染料を用い、調製法Gに記載したようにして調製した。

手順
各バッファ溶液（pHは2.0、2.2、2.4、2.6の4通り）50μlを、ピペットを用いてマイクロタイター・プレートの別々のウエルに移した。8mMのZRRR-MNAを25μlと、トリコモナスのヒドロラーゼの10％溶液25μlを各ウエルに添加した後、各ウエルから最終pHの測定用に20μlを取り出した。この混合物を作製した10分後、ダクロン製スワブを各ウエルに挿入して液体を吸収させ、次いで各スワブをファースト・レッドRLフィルムにこすりつけた。5分後に各スワブの表面に現われたピンク色の濃さを、肉眼で、前の実施例の表11.1に示した0〜9までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
結果を表12.1に示す。各ウエルの最終pHは、使用したバッファに関係なく、100mMの各バッファ貯蔵溶液よりも値にして0.3〜0.5大きかったことがわかる。トレオニンで全体的なpH値の制御が最もうまくいき、バッファ溶液のpHとウエル内の混合物の最終pHとの差が最小だった。最終pHがどのような値であれ、色彩スコアはバッファとしてトレオニンを用いた場合に最高であった。すなわち、pH2.4ではトレオニンのウエルで点数が6.0であるのに対してグリシンでは5.0、リンゴ酸では4.5であり、pH2.7ではトレオニンのウエルで点数が6.5であるのに対してグリシンでは6.0、リンゴ酸では5.5であり、pH2.9ではトレオニン、グリシン、リンゴ酸のウエルで点数がすべて6.0であった。

解釈
実験11により、pH2.4でトリコモナスのヒドロラーゼの酵素活性が最大になることがわかった。この理想的なバッファは、このpHでバッファとしての十分な性能を提供しつつ、トリコモナスのヒドロラーゼによる最大の酵素活性を支えるであろう。バッファ能力が不十分だと、結果としてpHが高くなるため、トリコモナスのヒドロラーゼによる活性が低下したり、非トリコモナス由来のヒドロラーゼによる活性が増加したりする可能性がある。さらに、バッファの濃度が大きいと、トリコモナスのヒドロラーゼの活性が抑制される可能性がある。

この実験は、pH2.4でテストした4種類のバッファすべてで、トリコモナスのヒドロラーゼの活性が同程度であったことを示している。ただしリシンでは、酵素活性が他の3つのバッファほど大きくはなかった。このテストを行なった条件下で最大のバッファ能力を示したのはトレオニンとリンゴ酸であった。これら2つのバッファを比べると、トレオニンでpH制御が最もうまくいき、最大のヒドロラーゼ活性を支えた。

実験13
この実験では、一連のペプチド基質複合体について、トリコモナスのヒドロラーゼが低pHで基質を加水分解する能力を比較する。

材料
トリコモナスのヒドロラーゼ。調製法Dに記載したようにして調製する。
200mMのL-トレオニン・バッファ、pH2.4。
2mMのL-システインヒドロクロリドを含む水。
プールした正常な膣液の上清（NVS）。これは、正常な未感染の女性からダクロン製スワブに採取した膣液サンプルを遠心分離してスワブから未希釈の膣液を抽出し、粒子状物質をペレット化することによって調製する。上清をプールし、使用するときまで凍結させておく。
0.2mg/mlのファースト・ガーネットGBC硫酸塩。水に溶かしてから1時間以内に使用する。
2％ドデシル硫酸ナトリウムを含む500mMの酢酸塩バッファ（pH5）（SDS／酢酸塩）。
後出のリストに示した一連の基質のそれぞれをトレオニン・バッファに溶かした2mMの溶液。
まず疎水性ペプチド基質を少量のDMSOに溶かした後、トレオニン・バッファの中に希釈して2mMにした。

手順
1．膣液が存在しない状態でのアッセイ
それぞれの基質40μlを、マイクロタイター・プレートのペアになったウエルにピペットを用いて移した。このプレートをテープで覆い、25℃のインキュベータに入れて温めた。解凍したばかりのトリコモナスのヒドロラーゼの溶液1部(v/v)を2mMのL-システイン溶液9部と混合することにより、希釈した酵素混合物を調製した。この混合物40μlをペアになったウエルの一方に添加した。ネガティブ・コントロールのため、2mMのL-システイン40μlをペアになったウエルのもう一方に添加した。プレートをインキュベータに戻し、10分間にわたってインキュベートした。SDS／酢酸塩溶液40μlを各ウエルに添加した後、ファースト・ガーネット溶液を40μl添加した。5分後に各ウエルに現われた色の濃さを、肉眼で、表13.1に示した色彩スケールを用いて評価した。

結果
1．膣液が存在していない状態でのアッセイ。
61種類のペプチド基質についての結果を表13.2に示す。これらの基質のうち、13種類だけがトリコモナスのヒドロラーゼによって加水分解された。加水分解されたその13種類の基質のうち、9種類だけが適切な濃さの色であった（評価が++または+++）。

2．膣液の上清が存在している状態でのアッセイ。
膣液の上清なしでトリコモナスのヒドロラーゼによって加水分解されて濃いピンク色になった（評価が++または+++）9種類の基質のうち、4種類だけが膣液の上清の存在下で濃いピンク色になった。その結果を表13.3に示す。

解釈
テストした61種類のペプチド基質のうちで13種類だけが、トリコモナスのヒドロラーゼの存在下で非常に小さなpHにて発色した。これらのうち、9種類だけが十分に発色した。その9種類の基質のうちで4種類が、膣液の存在下でトリコモナスのヒドロラーゼによって加水分解された。すなわち、D-Val-Leu-Arg-MNA（VLR-MNA）、CBZ-Leu-Arg-MNA（ZLR-MNA）、CBZ-Arg-Arg-Arg-MNA（ZRRR-MNA）、CBZ-Val-Arg-MNA（ZVR-MNA）である。

実験14
この実験では、正常な未感染の女性の膣液サンプルを、トリコモナスのヒドロラーゼを添加した膣液サンプルと比較し、これらのサンプルが低pHで4つのペプチド基質に及ぼす作用について調べる。この実験では、サンプルを含むスワブを基質と指示薬に付着させた後、結果を直接スワブの表面に読み取る方法も示す。

材料
トリコモナスのヒドロラーゼ。調製法Dに記載したようにして調製する。
綿製スワブ（ドナー1人につき2個）。正常な未感染の女性から採取した膣液サンプルを含む。
200mMのL-トレオニン・バッファ、pH2.4。
ペプチド基質：
400mMのD-Val-Leu-Arg-MNA（VLR-MNA）と6MのHClを10％(v/v)含むエタノール
400mMのCBZ-Leu-Arg-MNA（ZLR-MNA）と10％(v/v)のジメチルホルムアミドを含むエタノール
400mMのCBZ-Arg-Arg-Arg-MNA（ZRRR-MNA）を含むエタノール
400mMのCBZ-Val-Arg-MNA（ZVR-MNA）と10％(v/v)のジメチルホルムアミドを含むエタノール
2mMのL-システインヒドロクロリドを含む水。
25％（v/v）ヒドロキシプロピルセルロースを含むエタノール。
指示薬フィルム。10mMのファースト・ガーネット・ジアゾニウム染料または70mMのファースト・レッドRLジアゾニウム染料を用い、調製法Gに記載したようにして調製する。

手順
1．基質フィルムの調製
400mMの基質貯蔵溶液と、25％ヒドロキシプロピルセルロース溶液と、200mMのL-システインの混合物にエタノールを追加し、最終的に150〜320mMの基質、20mMのL-システイン、2〜5％のヒドロキシプロピルセルロースという濃度にした。マイラー・シート上の直径約1/4インチの円形領域に混合物1μlをピペットで移し、乾燥した窒素流のもとで乾燥させることにより、基質フィルムを作った。乾燥したこのフィルムは、使用するまで乾燥剤入りの容器の中に保管した。

2．綿製スワブ上の膣液サンプルを用いた場合の基質の比較
ドナーから採取した膣液サンプルの各ペアについて、一方のスワブを1つの基質フィルムにこすりつけ、他方のスワブを別の基質フィルムにこすりつけ、これら2つの基質を同時に比較した。溶液中に150mM〜320mMの濃度で含まれる基質を用いて基質フィルムを作ったが、（以下に示す表14.1、表14.2、表14.3に記載したように）個々の比較は等しいモル濃度の基質で行なった。スワブ内で膣液とバッファを用いて基質を希釈し、スワブの頭部における基質の最終濃度を、フィルムを作るのに用いた溶液中での基質の濃度の1/60にした。各スワブを基質フィルムにこすりつけた直後、1滴（35μl）のトレオニン・バッファをプラスチック上で基質フィルムがある位置に付着させ、スワブを再び同じスポットにこすりつけてバッファをスワブに吸収させた。スワブをプラスチックの上に10分間放置した後、各スワブをファースト・レッドまたはファースト・ガーネット・フィルムにこすりつけた。ZLRとZVRの比較およびVLR-MNAとZRRR-MNAの比較を行なうため、10mMのファースト・ガーネットで作ったフィルムを使用した。ZVRとVLR-MNAの比較を行なうため、70mMのファースト・レッドで作ったフィルムを使用した。2分後に各スワブに現われたピンク色の濃さを、肉眼で、上記の表11.1に示した0〜9までのスケールを用いて点数化した。1.3など小数表記の点数は、スワブ間で色の濃さがわずかに異なっている場合に使用した。

3．綿製スワブ上の膣液サンプルにトリコモナスのヒドロラーゼを添加して用いた場合の基質の比較
実験のこの部分では、アッセイの直前に、膣液を含む各スワブの先端部にトリコモナスのヒドロラーゼ20μlを、付着させた。その点を除き、手続きは、膣液だけを含むスワブの場合とまったく同じであった。

結果
結果を以下の表に示す。表14.1では320mMでZLR-MNAとZVR-MNAを比較し、表14.2では150mMでVLR-MNAとZVR-MNAを比較し、表14.3では200mMでVLR-MNAとZRRR-MNAを比較する。

表14.1からは、320mMでZLRをZVRを比較すると、膣液とトリコモナスのヒドロラーゼを含むスワブ内でZLRによって生じる色は薄すぎ、点数がわずか1以下であったことがわかる。ZVRは、ヒドロラーゼを添加したすべてのサンプルで点数が1以上であったが、ヒドロラーゼを添加しない正常な膣液サンプルでは点数が1.5以下であった。

表14.2では、正常な膣液に存在する内在性ヒドロラーゼに対するZVRの感度が低下するよう、濃度を320mMから150mMに下げた。この表の結果からは、ZVRがやはり正常なサンプルでピンク色を生じさせた（今回は点数が2を超える）が、VLR-MNAは、正常なサンプルでは点数が0であり、トリコモナスのヒドロラーゼを添加したサンプルでは点数が2以上であったことがわかる。

表14.3では、トリコモナスのヒドロラーゼからの色を濃くするために濃度を200mMに大きくし、VLR-MNAをZRRR-MNAと比較する。両方の基質は、膣液だけを含むスワブには点数が0〜痕跡の色を生じさせ、膣液とトリコモナスのヒドロラーゼを含むスワブには点数が1以上の色を生じさせた。

解釈
臨床で使用する際に重要なのは、基質が、正常な未感染の女性からの膣液を含むサンプルには痕跡程度を超える色を生じさせず、膣液にトリコモナスのヒドロラーゼを添加したスワブに点数が1以上の濃さの色を生じさせることである。ZLRは、膣液にトリコモナスのヒドロラーゼを添加したスワブに点数が1未満の濃さの色をときどき生じさせたため、ZVRと比べて貧弱な基質であることがわかった。しかしZVRは、正常な膣液サンプルに存在するヒドロラーゼとの反応性が許容できないほど大きいため、VLR-MNAのほうが望ましい。VLR-MNAとZRRR-MNAの両方とも、この実験で好ましい結果を出した。

実験15
この実験では、スワブに含まれている膣液サンプルにトリコモナスのヒドロラーゼを添加したものを用い、2つのテスト手続きを比較した。その手続きとは、a）スワブを基質フィルムにこすりつけた直後にこのスワブにジアゾニウム染料を付着させる方法と；b）スワブを基質フィルムにこすりつけてから10分後にジアゾニウム染料を付着させる方法（スワブへの試薬の“2段階”付着）である。目的は、基質とジアゾニウム染料を“1ステップ”でほぼ同時に付着させた場合に、生じるピンク色の濃さに影響があるかどうかを明らかにすることであった。

材料
トリコモナスのヒドロラーゼ。調製法Dに記載したようにして調製する。
綿製スワブ（ドナー1人につき2個）。正常な未感染の女性から採取した膣液サンプルを含む。
200mMのL-トレオニン・バッファ、pH2.4。
基質フィルム。80mMのZRRR-MNAを用い、調製法Eに記載したようにして調製した。
指示薬フィルム。10mMのファースト・ガーネット・ジアゾニウム染料を用い、調製法Gに記載したようにして調製した。

手順
各アッセイを行なう直前にトリコモナスのヒドロラーゼ10μlをそれぞれの膣液サンプルに添加した。各サンプル・ペアからの一方のスワブを基質フィルムにこすりつけ、ファースト・ガーネット・フィルムにこすりつけ、1滴（35μl）のトレオニン・バッファにこすりつけた後、バッファをスワブに吸収させた（試薬の“1段階”付着）。それと同時に、各サンプル・ペアからの第2のスワブを同様にして処理した。ただし、ファースト・ガーネット・フィルムは省略した。10分後、各ペアからの第2のスワブをファースト・ガーネット・フィルムにこすりつけた（試薬の“2段階”付着）。さらに30秒後、両方のスワブに現われたピンク色の濃さを、肉眼で、表11.1に示した0〜9までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
結果を表15.1に示す。

表15.1のデータからは、ジアゾニウム染料と基質をほぼ同時に付着させた（試薬の“1段階”付着）5つのスワブすべてで10分後に点数1の色が生じたのに対し、ジアゾニウム染料を基質の10分後に付着させた（試薬の“2段階”付着）5つのスワブでは点数が2または3であったことがわかる。

解釈
両方の手順において、各ウエブに基質を付着させてから10.5分後、生じたピンク色の濃さを点数で評価した。しかしピンク色は、ジアゾニウム染料を最初に付着させた場合には、10分後に付着させたときよりも薄かった。いずれの手続きでもトリコモナスのヒドロラーゼを検出できるが、“2段階”手順のほうが濃い色が生じる。

実験16
この実験では、ペプチドをベースとした2つの基質が、STD治療のクリニックに通っている女性からのサンプルに対して低pHでどのように応答するかを比較した。サンプルには、トリコモナス陽性のサンプルとトリコモナス陰性のサンプルの両方が含まれている。

材料
ダクロン製スワブ（ドナー1人につき2個）。STD治療のクリニックに通っている女性から採取した膣液サンプルを含む。これら女性の多くは細菌性膣炎、膣酵母感染症、あるいは他の膣炎を患っており、膣トリコモナスを5日間培養することにより、トリコモナス陽性（膣が膣トリコモナスに感染している）またはトリコモナス陰性であると判定された。
200mMのL-トレオニン・バッファ、pH2.4。
基質フィルム。200mMのZRRR-MNAを用いたときには調製法Eに記載したようにして調製し、200mMのVLR-MNAを用いたときには調製法Fに記載したようにして調製した。
指示薬フィルム。10mMのファースト・ガーネット・ジアゾニウム染料を用い、調製法Gに記載したようにして調製した。

手順
通院患者から採取した膣液サンプルの各ペアにつき、一方のスワブをZRRR-MNAフィルムにこすりつけ、他方のスワブをVLR-MNAフィルムにこすりつけた。各スワブを基質フィルムにこすりつけた直後、スワブを1滴（35μl）のトレオニン・バッファにこすりつけ、バッファをスワブに吸収させた。スワブをプラスチックの上に10分間放置した後、各スワブをファースト・ガーネット・フィルムにこすりつけた。30秒後に各スワブの表面に現われたピンク色の濃さを、肉眼で、表11.1に示した0〜9までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
結果を表16.1に示す。

表16.1のデータからは、ZRRR-MNAとVLR-MNAの両方が、トリコモナス症の女性から採取した膣液サンプルに存在しているヒドロラーゼによって加水分解されたことがわかる。いずれかのペプチド基質によって生じるピンク色の濃さは、ペアになったこれらのサンプルでほとんど同じであった。いずれかの基質について、トリコモナス陽性の8個のスワブのうちの8個（100％）がピンク色を生じさせ、その点数は半数が1〜2、半数が3以上であった。トリコモナス症にかかっていない女性からのサンプルでは、ZRRR-MNAで処理した28個のスワブのうちの13個（46％）がピンク色を生じさせたのに対し、VLR-MNAで処理した28個のスワブのうちの5個（28％）がピンク色を生じさせた。

解釈
両方のペプチド基質が、トリコモナス症の女性から採取した膣液サンプルに存在しているヒドロラーゼによって効果的に加水分解されたが、VLR-MNAは、トリコモナス陰性のサンプルによって加水分解される程度がZRRR-MNAよりも少なかった。

実験17
この実験では、D-Val-Leu-Arg-MNA（VLR-MNA）の量を増やすことが、トリコモナスのヒドロラーゼを含む綿製スワブに生じるピンク色の濃さにどのような影響を及ぼすかを調べる。

材料
トリコモナスのヒドロラーゼ。調製法Dに記載したようにして調製する。
プールした正常な膣液の上清。正常な未感染の女性からダクロン製スワブに採取した膣液サンプルを遠心分離してスワブから未希釈の膣液を抽出し、粒子状物質をペレット化することによって調製する。上清をプールし、使用するときまで凍結させておく。
100mMのL-システインヒドロクロリドを含む水。
200mMのL-トレオニン・バッファ、pH2.4。
基質フィルムのドット。100mMのVLR-MNAを用い、調製法Fに記載したようにして調製した。
指示薬フィルム。10mMのファースト・ガーネット・ジアゾニウム染料を用い、調製法Gに記載したようにして調製した。

手順
トリコモナスのヒドロラーゼ20μlを100mMのL-システイン4μlおよび水176μlと混合することにより、10％v/vのトリコモナスのヒドロラーゼと2mMのL-システインを含む溶液Aを調製した。トリコモナスのヒドロラーゼ40μlを正常な膣液の上清10μl、100mMのL-システイン4μl、水176μlと混合することにより、20％v/vのトリコモナスのヒドロラーゼと、5％v/vの正常な膣液の上清と、2mMのL-システインを含む溶液Bを調製した。溶液A、溶液B、トレオニン・バッファそれぞれの液滴（35μl）を数滴、マイラー・シート上の別々の領域にピペットで別々に移した。個々の綿製スワブを溶液Aまたは溶液Bの液滴にこすりつけ、次いで1滴、または2滴、または3滴からなる基質のドットにこすりつけ、次いでバッファの液滴にこすりつけた。10分後、各スワブを指示薬フィルムにこすりつけた。30秒後に各スワブの表面に現われたピンク色の濃さを、肉眼で、表11.1に示した0〜9までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
結果を表17.1に示す。

表17.1のデータからは、膣液が存在しているかどうかに関係なく、基質の量を増やすにつれてトリコモナスのヒドロラーゼによって生じるピンク色が濃くなることががわかる。トリコモナスのヒドロラーゼを含むが膣液は含まない溶液Aは、スワブにVLR-MNAフィルムのドットを1つ付着させたとき、点数が5.5の中程度に濃いピンク色を生じさせ、3倍量のVLR-MNAをスワブに付着させたとき、点数が9の非常に濃いピンク色を生じさせた。同様に、トリコモナスのヒドロラーゼと膣液を含む溶液Bによって生じたピンク色の濃さは、VLR-MNAのドットを1つ付着させたとき点数が2.5であり、VLR-MNAのドットを2つ付着させたとき点数が4であり、VLR-MNAのドットを3つ付着させたとき点数が5.5であった。

解釈
トリコモナスのヒドロラーゼによって生じるピンク色は、膣液が存在しているかどうかに関係なく、基質の量を増やすにつれて濃くなった。したがって、スワブの膣液サンプル中に存在するトリコモナスのヒドロラーゼを検出する感度を最大にするためには、高濃度の基質を使用する必要がある。乾燥フィルムは、基質をスワブに移すのに非常に効果的な手段である。

実験18
この実験では、基質をスワブに付着させた10分後の発色に関し、正常な膣液サンプルを含むスワブと、トリコモナスのヒドロラーゼを添加した正常な膣液サンプルを含むスワブを用い、2つのジアゾニウム染料を比較する。目的は、どのジアゾニウム染料が、トリコモナス陽性のスワブに生じさせるピンク色を最も濃くするかと、トリコモナス陰性のスワブに生じさせるピンク色を最も淡くするかを明らかにすることであった。

材料
トリコモナスのヒドロラーゼ。調製法Dに記載したようにして調製する。
綿製スワブ（ドナー1人につき2個）。正常な未感染の女性から採取した膣液サンプルを含む。
200mMのL-トレオニン・バッファ、pH2.4。
基質フィルム。200mMのVLR-MNAを用い、調製法Fに記載したようにして調製した。
指示薬フィルム。10mMのファースト・ガーネット・ジアゾニウム染料を用い、調製法Gに記載したようにして調製した。

手順
1．正常な未感染の女性から採取した膣液サンプルを利用した、ジアゾニウム染料の比較
それぞれの膣液サンプルを乾燥した基質フィルムにこすりつけた後、1滴（35μl）のトレオニン・バッファにこすりつけ、バッファをスワブに吸収させた。10分後、各ペアからの一方のスワブをファースト・レッドRLにこすりつけ、他方のスワブをファースト・ガーネット・フィルムにこすりつけた。30秒後に各スワブの表面に現われたピンク色の濃さを、肉眼で、表11.1に示した0〜9までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。0.3など小数表記の点数は、スワブ間で色の濃さがわずかに異なっている場合に使用した。

2．膣液サンプルにトリコモナスのヒドロラーゼを添加することによって作ったトリコモナス陽性のスワブを用いた、ジアゾニウム染料の比較
実験のこの部分では、アッセイを行なう直前に、トリコモナスのヒドロラーゼ20μlを、膣液サンプルを含む各スワブの先端に付着させた。それ以外は、膣液だけを含むスワブの場合とまったく同じ手続きにした。

結果
結果を表18.1に示す。

表18.1のデータからは、正常な未感染の女性からの膣液を含むスワブを基質とバッファで処理した10分後にファースト・レッドRLまたはファースト・ガーネットで処理した場合には、スワブがほとんどピンク色にならなかったことがわかる。ファースト・レッドRLで処理した5つのスワブのうちの4つと、ファースト・ガーネットで処理した5つのスワブのうちの5つは、ジアゾニウム染料を付着させた30秒後にスワブを調べた場合、目に見えるピンク色にならなかった。また、ファースト・ガーネットで処理した5つのスワブのうちの1つは、痕跡程度のピンク色になった。膣液サンプルにトリコモナスのヒドロラーゼを少量添加してトリコモナス陽性のサンプルを刺激した場合には、すべてのスワブが最低でも痕跡程度のピンク色になった。この刺激したトリコモナス陽性のサンプルをファースト・レッドRLで処理すると、ファースト・ガーネットで処理した場合よりも濃いピンク色になった。刺激後さらにファースト・レッドRLで処理したトリコモナス陽性の5つのサンプルのうち、2つは点数が3以上であり、2つは点数が1〜2であり、1つだけが痕跡程度のピンク色であった。刺激後さらにファースト・ガーネットで処理したトリコモナス陽性の5つのサンプルのうち、1つは点数が3以上であり、1つは点数が1〜2であり、3つはほんの痕跡程度のピンク色であった。

解釈
ファースト・レッドRLまたはファースト・ガーネットのいずれかを装置内で用いると、トリコモナスのヒドロラーゼを検出することができる。どちらの染料も、正常な未感染の女性からの膣液を含むスワブにはピンク色をほとんど、またはまったく生じさせず、膣液にトリコモナスのヒドロラーゼを添加したスワブにはピンク色を生じさせた。しかしファースト・レッドRLは、トリコモナスのヒドロラーゼを含むスワブにファースト・ガーネットよりも濃いピンク色を生じさせた。

実験19
この実験では、実験18で調べた2つのジアゾニウム染料をさらに調べる。ただし、STD治療のクリニックに通っている女性から実際に採取した膣液を使用する。

材料
ダクロン製または綿製のスワブ（ドナー1人につき2個）。STD治療のクリニックに通っている女性から採取した膣液サンプルを含む。これら女性の多くは細菌性膣炎、膣酵母感染症、あるいは他の膣炎を患っており、膣トリコモナスを5日間培養することにより、トリコモナス陽性（膣が膣トリコモナスに感染している）またはトリコモナス陰性であると判定された。
200mMのL-トレオニン・バッファ、pH2.4。
基質フィルム。200mMのVLR-MNAを用い、調製法Fに記載したようにして調製した。
指示薬フィルム。10mMのファースト・ガーネット・ジアゾニウム染料または70mMのファースト・レッドRLジアゾニウム染料を用い、調製法Gに記載したようにして調製した。

手順
各通院患者からの2つの膣液サンプルのそれぞれを基質フィルムにこすりつけた後、1滴（35μl）のトレオニン・バッファにこすりつけ、バッファをスワブに吸収させた。10分待機した後、各ペアからの一方のスワブをファースト・レッドRLフィルムにこすりつけ、他方のスワブをファースト・ガーネット・フィルムにこすりつけた。30秒後に各スワブの表面に現われたピンク色の濃さを、肉眼で、表11.1に示した0〜9までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
結果を表19.1に示す。

表19.1のデータから、トリコモナス症の12人の女性から採取した膣液を含むスワブは、ファースト・ガーネットではなくファースト・レッドRLを用いた場合のほうが濃い色を生じさせることがわかる。トリコモナス陽性のサンプルはすべて、どのジアゾニウム染料を用いるかに関係なく、ピンク色の点数が1以上であった。しかしファースト・レッドRLで処理したスワブのうちの4つは点数が4を超えていたのに対し、ファースト・ガーネットで処理したスワブは1つしか点数が4を超えなかった。トリコモナス症にかかっていない39人の女性からの膣液サンプルを含むスワブのほとんどは、どちらのジアゾニウム染料でも痕跡程度の色しか生じさせなかった。

解釈
実験18の結果と一致していることだが、ファースト・レッドRLは、（トリコモナス症の女性からの膣液を含む）トリコモナス陽性のスワブにおいて、ファースト・ガーネットよりも濃いピンク色を生じさせた。

実験20
この実験では、STD治療のクリニックに通っている女性から採取した膣液サンプルを含むスワブを用い、2つの手続きを比較した。その手続きとは、（a）スワブを基質フィルムにこすりつけた後にバッファを付着させる方法と；（b）バッファを基質フィルムに付着させた後にスワブをフィルムにこすりつける方法である。目的は、どのジアゾニウム染料が、トリコモナス陽性のスワブに生じさせるピンク色を最も濃くするかと、トリコモナス陰性のスワブに生じさせるピンク色を最も淡くするかを明らかにすることであった。

材料
綿製スワブ（ドナー1人につき2個）。STD治療のクリニックに通っている女性から採取した膣液サンプルを含む。これら女性の多くは細菌性膣炎、膣酵母感染症、あるいは他の膣炎を患っており、膣トリコモナスを5日間培養することにより、トリコモナス陽性（膣が膣トリコモナスに感染している）またはトリコモナス陰性であると判定された。
200mMのL-トレオニン・バッファ、pH2.4。
基質フィルム。200mMのVLR-MNAを用い、調製法Fに記載したようにして調製した。
指示薬フィルム。10mMのファースト・ガーネット・ジアゾニウム染料または70mMのファースト・レッドRLジアゾニウム染料を用い、調製法Gに記載したようにして調製した。

手順
各通院患者からの2つの膣液サンプルのうちの1つを基質フィルムにこすりつけた後、1滴（35μl）のトレオニン・バッファにこすりつけ、バッファをスワブに吸収させた（基質の後にバッファという手続き）。1滴（35μl）のトレオニン・バッファを基質フィルムに付着させた直後、各ペアからの第2のスワブを基質フィルムにこすりつけ、バッファと基質の両方がスワブに同時に混合するようにした（同時に基質とバッファという手続き）。10分待機した後、各スワブをファースト・レッドRLにこすりつけた。30秒後に各スワブの表面に現われたピンク色の濃さを、肉眼で、表11.1に示した0〜9までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
結果を表20.1に示す。

表20.1のデータから、基質の後にバッファという手続きで処理したトリコモナス陽性の12個のサンプルのうち9個が何らかのピンク色になり、5個で点数が3以上になったことがわかる。同時に基質とバッファという手続きで処理したトリコモナス陽性の12個のサンプルのうち8個が何らかのピンク色になり、6個で点数が3以上になった。これらの処理方法の効果は、トリコモナス陰性のサンプルでのほうが大きかった。トリコモナス陰性のサンプルのうち、同時に基質とバッファという手続きで処理した31個のサンプルすべてで点数が0になった（ネガティブ・テストにおける望ましい結果）が、基質の後にバッファという手続きで処理すると、点数が0だったのは25個だけであった。

解釈
同時に基質とバッファという手続きでは、基質の後にバッファという手続きの場合と比べると、トリコモナス陽性のサンプルによるピンク色の望ましい発生が維持された状態で、トリコモナス陰性のサンプルからのテスト結果が偽陽性になる場合の数が減った。

実験21
この実験では、STD治療のクリニックに通っている女性から採取した膣液サンプルを含むスワブを用い、テスト時間を10分から数分へと短くする効果を調べた。

材料
綿製スワブ（ドナー1人につき2個）。STD治療のクリニックに通っている女性から採取した膣液サンプルを含む。これら女性の多くは細菌性膣炎、膣酵母感染症、あるいは他の膣炎を患っており、膣トリコモナスを5日間培養することにより、トリコモナス陽性（膣が膣トリコモナスに感染している）またはトリコモナス陰性であると判定された。
200mMのL-トレオニン・バッファ、pH2.4。
基質フィルム。200mMのVLR-MNAを用い、調製法Fに記載したようにして調製した。
指示薬フィルム。10mMのファースト・ガーネット・ジアゾニウム染料または70mMのファースト・レッド・ジアゾニウム染料を用い、調製法Gに記載したようにして調製した。

手順
1滴（35μl）のトレオニン・バッファを基質フィルムに付着させた直後、各通院患者からの2つの膣液サンプルのうちの1つを基質フィルムにこすりつけた。5分間待機した後、一方のスワブをファースト・レッドRLフィルムにこすりつけた。さらに5分経過した後、第2のスワブをファースト・レッドRLフィルムにこすりつけた。30秒後に各スワブの表面に現われたピンク色の濃さを、肉眼で、表11.1に示した0〜9までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
結果を表21.1に示す。

表21.1のデータから、5分間テストと10分間テストのそれぞれにおいて、トリコモナス症の女性から採取した膣液を含む17対のサンプルのうち、15のケースで発色した（スワブの点数が1以上）ことがわかる。しかしピンク色は、5分間テストを行なったスワブのほうが薄かった。10分間テストを行なった17個のトリコモナス陽性のスワブのうちの12個の点数が3点以上であったのに対し、5分間テストを行なった17個のトリコモナス陽性のスワブでは、7個だけが3点以上であった。しかし5分間テストでは、テスト結果が偽陽性になるケースが10分間テストよりも少なかった。テストした53対のトリコモナス陰性のサンプルのうち、5分間テストでは、49のケースでテスト結果が陰性（スワブの先端がイエロー）、4つのケースで痕跡程度であったのに対し、10分間テストでは、43のケースでテスト結果が陰性、8つのケースで痕跡程度、1つのケースで弱い陽性という結果になった。

解釈
この実験により、膣トリコモナス症の検出を目的として、スワブを利用した“こすりつけて読み取る”正確に5分間のテストを、pH2.4のバッファと、2枚のはがれて取れる乾燥フィルムとを用いて構成できることが明らかになった。

実験22
この実験では、STD治療のクリニックに通っている女性から採取した膣液サンプルを含むスワブを用い、ピンク色の濃さに関して綿製スワブをダクロン製スワブと比較した。

材料
スワブ（ドナー1人につき2個で、1個は綿製、1個はダクロン製）。STD治療のクリニックに通っている女性から採取した膣液サンプルを含む。これら女性の多くは細菌性膣炎、膣酵母感染症、あるいは他の膣炎を患っており、膣トリコモナスを5日間培養することにより、トリコモナス陽性（膣が膣トリコモナスに感染している）またはトリコモナス陰性であると判定された。
200mMのL-トレオニン・バッファ、pH2.4。
基質フィルム。200mMのVLR-MNAを用い、調製法Fに記載したようにして調製した。
指示薬フィルム。10mMのファースト・ガーネット・ジアゾニウム染料を用い、調製法Gに記載したようにして調製した。

手順
1滴（35μl）のトレオニン・バッファを基質フィルムに付着させた直後、各通院患者からの2つの膣液サンプル（一方が綿製スワブで、他方がダクロン製スワブ）のそれぞれを基質フィルムにこすりつけた。5分間待機した後、一方のスワブをファースト・レッドRLフィルムにこすりつけた。30秒後に各スワブの表面に現われたピンク色の濃さを、肉眼で、表11.1に示した0〜9までのスケールを用い、0.5点単位で点数化した。

結果
結果を表22.1に示す。

表22.1のデータから、トリコモナス症の女性から採取した膣液を含むスワブの表面に現われるピンク色は、サンプルをダクロン製スワブの表面に採取したときのほうが綿製スワブの表面に採取したときよりも幾分か濃いことがわかる。ダクロン製スワブの表面に採取した22個のトリコモナス陽性のサンプルのうちで12個の点数が3点以上であったのに対し、綿製スワブの表面に採取した22個のトリコモナス陽性のサンプルでは、10個が3点以上であった。テスト結果が偽陽性（トリコモナス陰性のサンプルの点数が1点以上）になることはどちらのタイプのスワブでも稀であったが、綿製スワブは、トリコモナス陰性のサンプルからのピンク色が痕跡程度になることさえ、ダクロン製スワブよりも少なかった。綿製スワブの表面に採取したトリコモナス陰性の49個のサンプルのうち、45個がまったくピンク色にならず（スワブの先端がイエローだった）、4個で痕跡程度のピンク色になった（スワブの先端がピーチまたはオレンジだった）。ダクロン製スワブの表面に採取したトリコモナス陰性の49個のサンプルのうち、41個がまったくピンク色にならず、7個で痕跡程度のピンク色になり、1個で弱い陽性の結果（淡いピンクで点数は1点）が出た。

解釈
トリコモナス症の診断を目的として膣液サンプルを採取する際には、ダクロン製スワブと綿製スワブのいずれを用いることもできる。このテストがサンプル採取用の特別なタイプのスワブに限定されることはない。

本発明によるテスト装置の縦断面図であり、テスト結果がテスト装置そのものから読み取られる。 本発明によるテスト装置の縦断面図であり、図1のテスト装置の変形例を示している。 本発明による3番目のテスト装置の縦断面図であり、図1と図2のテスト装置のさらに別の変形例を示している。 本発明による3番目のテスト装置の縦断面図であり、図1と図2のテスト装置のさらに別の変形例を示している。 本発明による3番目のテスト装置の縦断面図であり、図1と図2のテスト装置のさらに別の変形例を示している。 本発明による3番目のテスト装置の縦断面図であり、図1と図2のテスト装置のさらに別の変形例を示している。 本発明による4番目のテスト装置の斜視図であり、スワブを膣液サンプルで濡らした後にこの装置に付着させると、このスワブの表面にテスト結果が現われる。

Claims (10)

1. 膣液中で膣トリコモナス（Trichomoniasis vaginalis）を検出する方法であって、
   （a）pHが2〜3.5の範囲で膣液サンプルを基質に接触させるステップ、ただしこの基質は、ある1つのペプチドのC末端に共有結合によって結合した化学種を含んでおり、加水分解による開裂でこの化学種がこのペプチドから切断されたときに検出可能な変化を生じさせ、上記ペプチドは、C末端にリシン及びアルギニンから成る群から選ばれる構成員を有する；及び
   （b）上記の検出可能な変化が起こったかどうかを観察するステップを含み、この検出可能な変化の発生が、上記膣液中に膣トリコモナスが存在していることを示している方法。
2. 上記化学種が、4-メトキシ-2-ナフチルアミン、β-ナフチルアミン、7-アミノ-4-メチルクマリン、α-ナフトール、β-ナフトール、3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、6-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、6-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸、1-ナフトール-3,6-ジスルホン酸、6-ブロモ-２-ナフトール、6-ヒドロキシ-2-ナフチルジスルフィド、4-ヒドロキシ-1-ナフタレンスルホン酸からなるグループの中から選択した化合物であり、ステップ（b）がさらに、上記サンプルと接触させた結果として上記ペプチドから切断される上記化合物のうちの任意のものをジアゾニウム染料と接触させる操作を含んでいる、請求項1に記載の方法。
3. 上記基質が、カルボベンゾキシ-L-バリン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、カルボベンゾキシ-L-アルギニン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、カルボベンゾキシ-L-アルギニン-L-アルギニン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、カルボベンゾキシ-L-ロイシン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、カルボベンゾキシ-L-バリン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、D-バリン-L-ロイシン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミンからなるグループの中から選択したメンバーである、請求項1に記載の方法。
4. 膣液中で膣トリコモナスを検出する方法であって、
   （a）液体を保持することのできる器具を、pHが2〜3.5の範囲において膣液で濡らし、この濡れた器具を、ある1つのペプチドのC末端に存在するリシンまたはアルギニンに共有結合によって結合した試薬を含む固相複合体に付着させるステップ、ただしこの試薬は、開裂してこのペプチドから切断されたときに濡れた上記器具によって保持され、上記リシンまたはアルギニンから離れて指示薬と接触したときにこの指示薬に検出可能な変化を起こさせる；
   （b）上記器具を、固相複合体に付着させた後に、固相形態になった上記指示薬に付着させるステップ；
   （c）上記器具の表面に検出可能な変化が起こったかどうかを検出するステップを含み、この検出可能な変化の発生が、上記膣液中に膣トリコモナスが存在していることを示している方法。
5. 上記固相複合体が、カルボベンゾキシ-L-バリン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、カルボベンゾキシ-L-アルギニン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、カルボベンゾキシ-L-アルギニン-L-アルギニン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、カルボベンゾキシ-L-ロイシン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、カルボベンゾキシ-L-バリン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミン、D-バリン-L-ロイシン-L-アルギニン-4-メトキシ-2-ナフチルアミンからなるグループの中から選択したメンバーであり、上記指示薬がジアゾニウム染料である、請求項4に記載の方法。
6. 膣液中で膣トリコモナスを検出する方法であって、
   （a）液体を保持することのできる器具を、pHが2〜3.5の範囲において膣液で濡らし、この濡れた器具を、ある1つのペプチドのC末端に存在するリシンまたはアルギニンに共有結合によって結合した試薬を含む固相複合体に付着させるステップ、ただしこの試薬は、開裂してこのペプチドから切断されたときに濡れた上記器具によって保持され、上記リシンまたはアルギニンから離れたときに検出可能な変化を起こす；
   （b）上記器具の表面に検出可能な変化が起こったかどうかを検出するステップを含み、この検出可能な変化の発生が、上記膣液中に膣トリコモナスが存在していることを示している方法。
7. 膣液中で膣トリコモナスを検出する方法であって、
   （a）膣液サンプルを採取するステップと；
   （b）この膣液サンプルから、直径が20ミクロンを超える粒子状物質を含まない上清を抽出するステップと；
   （c）この上清を、加水分解によって開裂したときに検出可能な変化を生じさせる基質と接触させるステップと；
   （d）上記の検出可能な変化が起こったかどうかを観察するステップを含み、この検出可能な変化の発生が、上記膣液中に膣トリコモナスが存在していることを示している方法。
8. 体液サンプル中に水溶性ヒドロラーゼが存在しているかどうかを調べるためのテスト装置であって、
   体液サンプルを付着させるための所定の付着部位を有する流路と；
   上記流路内に保持されていて、直径が20ミクロンを超える粒子状物質を捕捉する一方で水性液体は通過させる多孔性固体材料と；
   上記流路内に固体形態で堆積されていて、活性化した試薬と接触したときに検出可能な変化を生じさせる水溶性の指示薬と；
   固体形態で上記流路に堆積されている複合体とを備え、だたしこの複合体は、共有結合によって結合メンバーに結合した上記試薬を含んでおり、この試薬は、酵素を通じた加水分解による開裂作用によってこの結合メンバーから切断されて活性化される；
   上記指示薬における検出可能な変化が、上記粒子状物質を上記多孔性固体材料によってサンプルから除去した後に残っている分画における上記ヒドロラーゼの加水分解活性によってのみ生じるようにするのに十分な距離だけ、上記指示薬と上記複合体のうちの少なくとも一方を、上記付着部位とは空間的に離してある装置。
9. 体液サンプル中に水溶性ヒドロラーゼが存在しているかどうかを調べるためのテスト装置であって、
   水性液体を通過させる一方で直径が20ミクロンを超える粒子状物質は捕捉する多孔性固体材料からなるストリップと；
   共有結合によって結合メンバーに結合していて、加水分解によってこの結合メンバーから切断されるクロモゲンを含む複合体とを備え、このクロモゲンは、加水分解によってこの結合メンバーから切断されたときに検出可能な変化を起こす化学種であり、上記複合体は、上記ストリップ上で、この複合体が存在していない所定の距離だけ付着部位から空間的に離れた領域に堆積されており、上記付着部位に付着させた体液サンプルが上記距離を通じて移動して複合体に到着するまでに、上記粒子状物質が除去されるテスト装置。
10. 体液サンプル中に加水分解酵素が存在しているかどうかを調べるためのテスト装置であって、
    （a）空間的に互いに離れた複数の領域にテスト材料を堆積させるための表面を有する不活性な固体支持体、ただし、これら複数の領域には、
    （i）共有結合によって結合メンバーに結合していて、加水分解による開裂を通じてこの結合メンバーから解放されて活性化することが可能な試薬を含む複合体が堆積される第1の領域と、
    （ii）活性化した形態の上記試薬と接触したときに検出可能な変化を起こす指示薬が堆積される第2の領域とが含まれ；
    （b）吸収性であるために体液で濡らすことができ、濡らして上記第1の領域と上記第2の領域にこすりつけたとき、第1の領域と第2の領域に存在しているテスト材料が付着する器具とを備える装置。

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