JP4740486B2 - 新規の細菌分析方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規の細菌分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の臨床検査及び食品検査における細菌の検出において、臨床細菌検査では、分析対象対照細菌数を、直接分離培地に塗抹することにより検出可能であるが、食品細菌検査では、分析対象細菌数が少ない場合や、分析対象細菌が損傷を受けていることが多い場合があるため、非選択性培地での前増菌培養が必要である。また、分析対象細菌によっては、更に、前増菌培養の後の選択増菌培養が必要であり、選択増菌培養の後に、更に分離培養、確認培養、及び同定検査の手順を踏まなければならない。
確認培養及び同定検査は、多数の生化学的性状を組み合わせて行なうため、通常、１８時間〜７２時間、また検査項目によっては、１週間の培養が必要な場合もあり、結果が得られるまでに相当な日数と労力を要する。また、被検試料中の分析対象細菌数が少ない場合、被検試料の濃縮は、通常、濾過又は遠心により実施することが多く、それに必要な装置と手間がかかるのが現状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このように、或る特定の細菌を検出し、同定する操作は、あらゆる分野における細菌検査において極めて繁雑で、時間を要する。或る特定の細菌の検出及び同定は、培養検査と種々の生化学的性状検査により行われる。それらの性状は、それぞれの酵素反応の現れで、一つの性状検査の結果は、複数の酵素反応の最終産物で判定させる場合が多く、このことが操作の繁雑性及び長時間かかる要因である。また、細菌検査は、培養が根本的な骨格になっているため、数日を要する原因の一つである。更に、被検試料中の分析対象細菌数が少ない場合は、被検試料の濃縮が必要で、これには濾過法や遠心法等があるが、専用の装置や機器が必要で、大容量試料の処理には手間もかかるのが現状である。
本発明の課題は、より簡便且つ迅速に分析対象細菌を分析する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、
（１）分析対象細菌を含む可能性のある液状被検試料を、その分析対象細菌を担持可能な支持体と接触させる工程；
（２）前記分析対象細菌検出用の発色酵素基質又は発光酵素基質液を、発色又は発光酵素基質用支持体に接触させて発色酵素基質又は発光酵素基質を担持させる工程；及び
（３）前記工程（１）で得られた、液状被検試料を接触させた分析対象細菌用支持体と、前記工程（２）で得られた、発色又は発光酵素基質を担持させた発色又は発光酵素基質用支持体とを接触させ、前記発色又は発光酵素基質担持発色又は発光酵素基質用支持体における発色又は発光を分析する工程
を含むことを特徴とする、細菌の分析方法により解決することができる。
本明細書における「分析」には、分析対象細菌の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象細菌の数を定量的又は半定量的に決定する「測定」との両方が含まれる。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の細菌分析方法は、
（１）分析対象細菌を担持可能な支持体（以下、「分析対象細菌用支持体」、あるいは、単に「細菌用支持体」と称する）に、分析対象細菌を含む可能性のある液状被検試料を接触させる工程（以下、液状被検試料接触工程と称する）；
（２）発色又は発光酵素基質用支持体（以下、単に「基質用支持体」と称することがある）に、前記分析対象細菌検出用の発色酵素基質又は発光酵素基質の液（例えば、溶液又は分散液）を接触させ、発色酵素基質又は発光酵素基質を担持させる工程（以下、発色又は発光酵素基質担持工程と称する）；及び
（３）前記液状被検試料接触工程（１）で得られた、液状被検試料を接触させた分析対象細菌用支持体（液状被検試料接触分析対象細菌用支持体；以下、単に「試料接触細菌用支持体」と称することがある）と、前記発色又は発光酵素基質担持工程（２）で得られた、発色又は発光酵素基質を担持させた発色又は発光酵素基質用支持体（発色又は発光酵素基質担持発色又は発光酵素基質用支持体；以下、単に「基質担持基質用支持体」と称することがあります）とを接触させ、基質担持基質用支持体における発色又は発光を分析する工程（以下、分析工程と称する）
を含む。
【０００６】
本発明の細菌分析方法で分析可能な被検試料は、分析対象細菌を含む可能性のある被検試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、臨床材料（例えば、血液、尿、便、髄液、喀痰、又は咽頭拭い液など）、食品試料（例えば、飲料水、牛乳若しくは乳製品、卵若しくは卵製品、肉若しくは肉製品、魚介類若しくは魚介類製品、冷凍食品、日配食品、菓子類、又は香辛料等）、飼料若しくは飼料製品、工業用水、環境検査用試料、又は各種ふき取り検査試料を挙げることができる。
本発明の細菌分析方法では、これらの被検試料を液状で使用するので、前記被検試料が液体試料の場合は、そのままで、あるいは、適当な溶媒で希釈した希釈液を使用することができ、固形試料の場合には、乳化処理して得られた液、あるいは、適当な溶媒（例えば、水、生理食塩水、又は緩衝液等）で洗い出しを行なって得られた液を使用することができる。
【０００７】
液状被検試料接触工程で用いる細菌用支持体としては、例えば、メンブレンフィルターを挙げることができ、細菌用支持体上に前記分析対象細菌を担持することのできる限り、その材質、フィルター孔径、フィルター形状及び大きさ、並びに色などは、特に限定されるものではない。
【０００８】
また、発色又は発光酵素基質担持工程で用いる基質用支持体としては、例えば、メンブレンフィルター、濾紙、ガラスフィルター、又は焼結フィルターを挙げることができ、基質用支持体上に発色又は発光酵素基質を担持することができる限り、その材質、フィルター孔径、フィルター形状及び大きさ、並びに色などは、特に限定されるものではない。
【０００９】
細菌用支持体又は基質用支持体としてメンブレンフィルターを用いる場合には、その材質としては、例えば、セルロースアセテート、セルロース混合エステルセルロースナイトレート、ポリカーボネイト、セルローストリアセテート、又はポリスルフォン等を挙げることができる。メンブレンフィルターの孔径は、例えば、０．２μｍ〜３μｍであることができる。メンブレンフィルターの形状としては、例えば、円形若しくは楕円形、又は多角形（例えば、正方形又は長方形）を挙げることができ、円形である場合には、その直径は、例えば、５ｍｍ〜９０ｍｍであることができる。メンブレンフィルターの色は、分析工程において、発色又は発光酵素基質に由来する発色又は発光の分析を妨げない限り、特に限定されるものではない。また、周縁疎水性加工したメンブレンフィルターを使用すると、メンブレンフィルターの周縁から細菌試料液が漏れるのを防ぐことができるため、好ましい。
【００１０】
本発明の細菌分析方法で用いる発色酵素基質又は発光酵素基質として、分析対象細菌に特異的な酵素を検出するために用いることのできる公知の種々の発色酵素基質又は発光酵素基質を用いることができる。これらの発色酵素基質及び発光酵素基質は、酵素（例えば、分析対象細菌が特異的に有する酵素）に関する基質と、適当な発色物質又は発光物質とを、適当な手段により結合することにより合成される化合物であり、基質と発色物質又は発光物質とが結合されている状態では発色又は発光しないが、前記酵素により基質と発色物質又は発光物質とに切断されると、前記発色物質又は発光物質に由来する発色又は発光が生じる。
【００１１】
前記発色酵素基質における発色物質としては、例えば、４−ニトロフェノール、２−ニトロフェノール、５−ブロモ−４クロロ−３−インドリル、６−クロロ−３−インドリル、４−ニトロアニリン、若しくはβ−ナフチルアミン、又はこれらの各種発色物質の誘導体を挙げることができる。
【００１２】
前記発光酵素基質における発光物質としては、例えば、４−メチルウンベリフェロン、７−アミド−４−メチルクマリン、４−メトキシ−２−ナフチルアミン、若しくは７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン、又はこれらの各種発光物質の誘導体を挙げることができる。
【００１３】
前記発色物質又は発光基質と結合させる酵素基質としては、例えば、Ｌ−ピログルタミン酸、β−Ｄ−ガラクトピラノシド、α−Ｄ−ガラクトピラノシド、β−Ｄ−グルコピラノシド、α−Ｄ−グルコピラノシド、β−Ｄ−キシロピラノシド、α−Ｌ−アラビノピラノシド、β−Ｄ−セロピラノシド、β−Ｄ−グルクロニド、α−Ｄ−グルクロニド、β−Ｄ−フコピラノシド、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、α−Ｄ−マンノピラノシド、β−Ｄ−マンノピラノシド、ブチレイト、β−Ｎ−アセチルグルコサミニド、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニド、カルリル酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシル−プロリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、セリル−トリプシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェルアラニン、Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルギニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタリルグリシン−Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミル−Ｌ−リシン−Ｌ−リシン、Ｌ−リシン−Ｌ−アラニン、Ｌ−プログルタミン酸、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、リン酸、硫酸、Ｌ−ピロリドンカルボキシルリン酸、又はデオキシリボヌクレイン酸等を挙げることができる。
発色物質又は発光物質を酵素基質と結合するには、公知の手段を用いて、適当な結合、例えば、ペプチド結合、エステル結合、又はグリコシド結合により結合することができるし、あるいは、発色物質又は発光物質と酵素基質とが結合した状態で市販されている複合体をそのまま用いることもできる。
【００１４】
本発明の細菌分析方法における液状被検試料接触工程では、液状被検試料と細菌用支持体とを接触させ、液状被検試料中に分析対象細菌が含まれている場合には、分析対象細菌を細菌用支持体に担持させる。細菌用支持体に液状被検試料を接触させる方法は、特に限定されるものではなく、例えば、適当な容器（例えば、シャーレ）内に配置した細菌用支持体上に、液状被検試料を滴下することもできるし、あるいは、適当な容器に入れた液状被検試料中に、細菌用支持体を浸漬することもできる。
【００１５】
本発明の細菌分析方法では、液体吸収体（例えば、吸収パッド）上に前記細菌用支持体を配置した状態で、液状被検試料接触工程を実施することが好ましい。より具体的には、細菌用支持体の一方の面を、液体吸収体と接触させた状態で、前記細菌用支持体の反対側の面に、液状被検試料を加えることにより、細菌用支持体に液状被検試料を接触させることができる。液状被検試料接触工程において、液体吸収体を使用すると、細菌用支持体中を大量の液状被検試料を通過させることができ、その結果として、液状被検試料中に分析対象細菌が含まれている場合には、分析対象細菌を濃縮して細菌用支持体に担持させることができる。
【００１６】
液状被検試料接触工程で用いることのできる前記液体吸収体は、滅菌（例えば、高圧蒸気滅菌、エチレンオキサイド滅菌、又はγ線滅菌）可能な液体吸収体である限り、特に限定されるものではないが、例えば、多孔性フィルター、グラスファイバーフィルター、濾紙、又はスポンジ等を挙げることができる。液体吸収体の色、形状、又は大きさは、特に限定されるものではなく、例えば、液状被検試料の量に応じて適宜決定することができる。また、前記液体吸収体を２枚以上重ねて使用することもできる。
【００１７】
また、本発明の細菌分析方法では、両端が開口した筒状体（例えば、シリンダー）を細菌用支持体上に配置した状態で、液状被検試料接触工程を実施することが好ましい。より具体的には、細菌用支持体上に、両端が開口している筒状体を、一方の開口端と前記細菌用支持体とが接触するように配置した状態で、前記筒状体中に、液状被検試料を加えることにより、細菌用支持体に液状被検試料を供給することができる。液状被検試料接触工程において、筒状体を使用すると、接触操作を簡略化することができる。
【００１８】
液状被検試料接触工程で用いることのできる前記筒状体は、滅菌可能である限り、その材質は特に限定されるものではないが、例えば、プラスティック、ガラス、又はステンレススチール等を挙げることができる。
また、前記筒状体の形状及び大きさは、筒状体内に加えた液状被検試料を細菌用支持体に接触させることができる限り、特に限定されるものではなく、使用する細菌用支持体の大きさに合わせて適宜決定することができる。細菌用支持体と同形状且つ同サイズの筒状体を用いることが好ましい。
【００１９】
本発明の細菌分析方法では、液状被検試料接触工程を実施する際に、前記液体吸収体又は前記筒状体の一方のみを単独で使用することもできるし、あるいは、組み合わせて同時に使用することもできる。液体吸収体及び筒状体を組み合わせて使用すると、より大量の液状被検試料を、簡略化した操作で処理することができ、その結果、液状被検試料中に分析対象細菌が含まれている場合には、より多くの分析対象細菌を濃縮して細菌用支持体に担持させることができるため、好ましい。
液体吸収体及び筒状体を組み合わせて使用する場合には、前記筒状体は、細菌用支持体を液体吸収体に圧着するのに充分な重さがある材質（例えば、ステンレススチール又はガラス）からなることが好ましい。
また、充分な重さのないプラスチック等からなる筒状体を使用する場合には、細菌用支持体を液体吸収体に押しつけるように、手でシリンダーを抑えることができる。
【００２０】
本発明の細菌分析方法における発色又は発光酵素基質担持工程では、基質用支持体に発色又は発光酵素基質液を接触させ、発色酵素基質又は発光酵素基質を担持させる方法は、特に限定されるものではなく、例えば、発色酵素基質又は発光酵素基質を適当な溶媒に溶解又は分散させ、得られた溶液又は分散液を基質用支持体に含ませることにより実施することができる。より具体的には、適当な容器（例えば、シャーレ）内に配置した基質用支持体上に、発色又は発光酵素基質液を滴下することもできるし、あるいは、適当な容器に入れた発色又は発光酵素基質液中に、基質用支持体を浸漬することもできる。
【００２１】
発色酵素基質又は発光酵素基質を溶解又は分散させるのに用いる溶媒は、発色酵素基質又は発光酵素基質の性能に影響を与えない溶媒である限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド、エタノール、メタノール、アセトン、トルエン、ブタノール、塩酸、リン酸緩衝液、又は精製水等を挙げることができる。
発色又は発光酵素基質液における発色又は発光酵素基質の濃度は、特に限定されるものではないが、例えば、０．０１〜１０％であることができ、基質用支持体に接触させる発色又は発光酵素基質液の量も、特に限定されるものではないが、例えば、１０μＬ〜５００μＬであることができる。
【００２２】
発色又は発光酵素基質担持工程で得られた、発色又は発光酵素基質液を担持させた基質用支持体は、そのまま、次の分析工程に使用することもできるし、あるいは、次の分析工程に使用する前に、乾燥（例えば、自然乾燥、送風乾燥、減圧乾燥、真空乾燥、又は凍結乾燥等）させて、その状態で保存することもできる。発色又は発光酵素基質液を担持させた基質用支持体は、乾燥させても、試薬性能（発色性及び蛍光性）の劣化は見られず、保存温度に関わらず（例えば、４℃、１０℃、２５℃、又は３７℃）、長期間（約２年）安定であり、優れた保存安定性を有している。
【００２３】
本発明の細菌分析方法における分析工程では、液状被検試料接触工程で得られた試料接触細菌用支持体と、発色又は発光酵素基質担持工程で得られた基質担持基質用支持体とを接触させ、所定時間経過した後、基質担持基質用支持体における発色又は発光を分析する。
液状被検試料中に分析対象細菌が存在する場合には、試料接触細菌用支持体と基質担持基質用支持体とを接触させると、前記細菌が特異的に有する酵素により、発色又は発光酵素基質が、発色物質又は発光物質と酵素基質とに切断され、発色物質又は発光物質が遊離する。発色酵素基質を用いた場合には、発色物質の遊離により、基質担持基質用支持体が着色するので、例えば、肉眼判定により、発色物質の有無及び／又は発色物質量を分析することができる。発光酵素基質を用いた場合には、例えば、基質担持基質用支持体に長波長の紫外線（ＵＶ）ランプを照射すると、肉眼判定により、蛍光物質の有無及び／又は蛍光物質量を分析することができる。
発色物質に由来する発色、あるいは、蛍光物質に由来する発光の分析方法は、肉眼判定以外にも、使用する発色物質又は蛍光物質の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光測定機又は分光光度計を挙げることができる。
【００２４】
分析工程において、試料接触細菌用支持体と基質担持基質用支持体とを接触させる場合に、同時に、前記試料接触細菌用支持体と、分析対象細菌用培地含有担体とを更に接触させることが好ましい。
分析対象細菌用培地含有担体としては、例えば、分析対象細菌用培地を吸収させた吸収パッド、あるいは、分析対象細菌用培地を含む寒天培地（好ましくは、寒天平板培地）を挙げることができる。前記寒天培地としては、例えば、普通寒天培地、ハートインフュージョン寒天培地、トリプチケースソイ寒天培地、又は血液寒天培地等を挙げることができる。
【００２５】
分析工程において、試料接触細菌用支持体と分析対象細菌用培地含有担体とを接触させると、液状被検試料中に分析対象細菌が含まれている場合には、分析対象細菌の代謝を促進することができ、その結果として、酵素活性を高めることができる。
また、分析対象細菌用培地含有担体として寒天平板培地を用い、基質担持基質用支持体として、複数種類の分析対象細菌に特異的な酵素を検出するための、複数種類の基質担持基質用支持体を用いると、１枚の寒天平板培地上で、複数の分析対象細菌の分析を同時に行なうことができる。
【００２６】
本発明の細菌分析方法は、特に限定されるものではないが、例えば、図１に示す各工程（Ａ）〜（Ｉ）に従って実施することができる。図１に示す工程では、発光酵素基質を用いた場合の態様を示すが、発色酵素基質を用いた場合でも、後述するように、最後の工程（Ｉ）を除き、同様に実施することができる。
工程（Ａ）に示すように、蓋付きの適当な容器１［例えば、シャーレ（例えば、直径＝６０ｍｍ）］に、滅菌済みのプレフィルター２［例えば、吸収パッド（例えば、直径＝４７ｍｍ）］を入れた後、工程（Ｂ）に示すように、前記プレフィルター２の上に、滅菌済みの細菌用支持体３［例えば、メンブレンフィルター（例えば、孔径＝０．８μｍ、直径＝２５ｍｍ）］を載せる。工程（Ｃ）に示すように、前記細菌用支持体３上に、滅菌済みのシリンダー４（例えば、ステンレススチール製）をかぶせ、前記シリンダー４内に、液状被検試料５を入れ、細菌用支持体３上に液状被検試料５を供給する。液状被検試料５がプレフィルター２に吸収されるまで放置してから、シリンダー４を取り去ると、工程（Ｄ）に示すように、試料接触細菌用支持体３’及び液状被検試料吸収プレフィルター２’が得られる。
【００２７】
工程（Ｅ）に示すように、別の容器６［例えば、シャーレ（例えば、直径＝６０ｍｍ）］に、滅菌済みのプレフィルター（例えば、直径＝２５ｍｍ）を入れた後、適当量（例えば、６５０μＬ）の分析対象細菌用培地［例えば、ブレインハートインフュージョンブイヨン（ＢＨＩＢ）培地］を染み込ませることにより、分析対象細菌用培地吸収プレフィルター７が得られる。工程（Ｆ）に示すように、前記の分析対象細菌用培地吸収プレフィルター７上に、工程（Ｄ）で得られた試料接触細菌用支持体３’を重ねる。工程（Ｇ）に示すように、予め作製した、発光酵素基質を担持させた基質用支持体（例えば、メンブレンフィルター）８を、緩衝液（すなわち、分析対象細菌が特異的に有する酵素の至適ｐＨを維持可能な緩衝液）で湿らせた後、試料接触細菌用支持体３’の上に、更に重ねる。工程（Ｈ）に示すように、適当な温度（例えば、３７℃）でインキュベートした後、工程（Ｉ）に示すように、長波長の紫外線ランプ９を照射し、発光酵素基質担持基質用支持体８上の蛍光の有無を肉眼判定する。
発光酵素基質の代わりに、発色酵素基質を用いた場合には、工程（Ｈ）の後、発色酵素基質担持基質用支持体上の発色の有無を肉眼判定する。
【００２８】
本発明の細菌分析方法を用いて、例えば、大腸菌を分析する場合には、大腸菌を含む液状被検試料（例えば、尿路感染症の約７〜８割は大腸菌によるもので、尿中の大腸菌が１０4個／ｍＬ以上存在すれば、尿路感染症と診断することができる）を、吸収パッドの上に載せたメンブレンフィルター上に供給する。これとは別に、大腸菌に特異的なβ−Ｄ−グルクロニダーゼの発光酵素基質である、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを０．０１〜１％に染み込ませ、乾燥させた発光酵素基質担持メンブレンフィルターを、０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５〜９）で湿らせ、先に調製した液状被検試料接触メンブレンフィルターに重ねる。重ねたこれらのメンブレンフィルターを、培地を含ませた吸収パッド上に載せ、３７度℃で６時間反応させる。発光酵素基質担持メンブレンフィルターに含まれる４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドは、大腸菌の酵素により切断され、発光物質である４−メチルウンベロフェロンが遊離し、長波長のＵＶランプ（３６０〜３７０ｎｍ）を照射するだけで、発光酵素基質担持メンブレンフィルターが蛍光を発し、１０4個／ｍＬの大腸菌の存在を確認することができる。
【００２９】
また、本発明の細菌分析方法では、目的菌に特異的な複数の発色又は発光酵素基質を含ませた、複数の発色又は発光酵素基質担持基質用支持体を用いることにより、様々な菌の分析を同時に実施することができる。
例えば、飲料水や河川水、工業用水等においては、大腸菌群及び大腸菌の存在が問題になるが、この場合、前記の大腸菌検出用発光酵素基質を担持させた基質用支持体と、大腸菌群に特異的な酵素である、β−Ｄガラクトシダーゼに対する発光酵素基質である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを担持させた基質用支持体とを用い、同様の操作を行なうことにより、大腸菌群及び大腸菌をそれぞれ区別して検出することができる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《本発明の細菌分析方法による大腸菌の検出》
（Ａ）試験菌の調製
大腸菌ＪＣＭ１６４９株をハートインフュージョン寒天培地に接種し、３７℃で一晩培養した。その１集落をブレインハートインフュージョンブイヨンに接種し、３７℃で一晩培養した後、０．０６７ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で１０8個／ｍＬ〜１０3個／ｍＬとなるように段階的に希釈した希釈液を試験菌液とした。
【００３１】
（Ｂ）発光酵素基質担持メンブレンフィルターの作製
４ーメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）（ナカライ社）をＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミドに溶解した後、更に、０．０６７ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、ＭＵＧが最終濃度０．０５％になるように調整した。この発光酵素基質溶液１００μＬを、滅菌したメンブレンフィルター（セルロース混合エステル、直径＝２５ｍｍ、孔径＝０．８μｍ；ミリポア社）に染み込ませ、２５℃で一晩送風乾燥した。
【００３２】
（Ｃ）大腸菌の検出
本実施例における操作は、図１に示す手順で実施した。
すなわち、各々の希釈菌液毎に、滅菌したグラスファイバーフィルター（直径＝４７ｍｍ；ミリポア社）を滅菌プラスチックシャーレ内に４枚重ねて入れ、この上に、滅菌したメンブレンフィルター（セルロース混合エステル、直径＝２５ｍｍ、孔径＝０．８μｍ：ミリポア社）を１枚置き、ステンレススチール製滅菌シリンダー（外径＝２５ｍｍ、内径＝２１ｍｍ、高さ＝５ｃｍ）を前記メンブレンフィルターの上に置き、各種希釈菌液１０ｍＬをシリンダー内に入れた。シリンダー内の菌液がメンブレンフィルター上から見えなくなるまで放置し（約１分３０秒）、シリンダーを取り除いた。
別の滅菌プラスチックシャーレ（直径＝６０ｍｍ）に、滅菌したグラスファイバーフィルター（直径＝２５ｍｍ；ミリポア社）を入れ、ブレインハートインフュージョンブイヨン６５０μＬを染み込ませた。この上に、先の菌担持メンブレンフィルターを重ね、更にその上に、前項（Ｃ）で調製したＭＵＧ溶液を染み込ませたメンブレンフィルターを、予め０．０６７ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液１００μＬで湿らせてから重ねた。従って、菌液を供給したメンブレンフィルターは、培地を含ませた吸収パッドと、ＭＵＧ溶液を染み込ませたメンブレンフィルターとの間で、サンドイッチされた状態となる。シャーレの蓋を閉じ、３７℃で２時間〜６時間まで経時的に長波長（３６６ｎｍ）のＵＶランプを照射し、ＭＵＧ溶液を染み込ませたメンブレンフィルターの蛍光の有無を肉眼判定した。
【００３３】
結果を表１に示す。
表１における記号「−」は、蛍光がないことを表わし、「＋」は、蛍光強度が弱いことを表わし、「＋＋」は、蛍光強度が中程度であることを表わし、「＋＋＋」は、蛍光強度が強いことを表わす。また、「対照」は、培地を含む吸収パッド上に、直接、ＭＵＧ溶液担持メンブレンフィルターを重ねたもの（すなわち、菌担持メンブレンフィルターなしの場合）を意味する。
【００３４】
表１に示すとおり、大腸菌に特異的な酵素であるグルクロニダーゼが基質に作用し、ＭＵＧ溶液担持メンブレンフィルターに含まれるＭＵＧを切断し、遊離した蛍光物質により蛍光が肉眼で観察でき、１０3個／ｍＬの大腸菌が６時間後に検出することができた。このことにより、単純尿路感染症の原因菌の７〜８割を占める大腸菌が、その病因となる菌数である１０4個／ｍＬ以上存在することで、尿路感染症の診断が可能となることから、本発明方法によれば、培養せずともその検出が可能となった。
【００３５】
【００３６】
【実施例２】
《本発明方法における分析対象細菌用培地含有担体の効果の確認》
本実施例では、実施例１で用いた、ブレインハートインフュージョンブイヨン（ＢＨＩＢ）を染み込ませたグラスファイバーフィルターの効果を確認した。具体的には、ＢＨＩＢ含浸グラスファイバーフィルターの上に、菌担持メンブレンフィルターを重ね、更にその上に、ＭＵＧ溶液担持メンブレンフィルターを重ねる代わりに、ＢＨＩＢ含浸グラスファイバーフィルターを使用せず、菌担持メンブレンフィルターの上に、ＭＵＧ溶液担持メンブレンフィルターを重ねること以外は、実施例１（Ｃ）の操作を繰り返した。
【００３７】
結果を表２に示す。表２における各記号は、表１と同じ意味である。また、「対照」も、表１と同じ意味である。
表２に示すように、菌数が極めて多い場合には、蛍光を観察することができるが、１０7ｃｆｕ／ｍＬ以下になると、蛍光が観察されず、表１に示す、分析対象細菌用培地含有担体を用いた場合と比較すると、その検出菌数に明らかな差が見られ、分析対象細菌用培地含有担体の効果が確認された。
【００３８】
【００３９】
【発明の効果】
本発明の細菌分析方法によれば、臨床分野はもちろん、食品検査や環境検査における細菌検査において、今までの分離培養や同定操作の繁雑さを解消することができ、更に結果が得られるまで時間をも短縮することができ、細菌検査の抱える種々の問題点を一気に解決することができるものである。
すなわち、様々な分析対象細菌の有する特異的な酵素に対する発色又は発光酵素基質を基質用支持体（例えば、メンブレンフィルター）に含ませ、菌試料液を供給した細菌用支持体（例えば、メンブレンフィルター）上に重ね、所望により、更に培地を含ませた吸収パッドを重ね、あるいは、所望により、分析対象細菌用培地を吸収させた吸収パッド、又は寒天平板培地上に置くことにより、極めて簡単な操作だけで、分析対象細菌の分析を実施することができる。分析対象細菌用培地を吸収させた吸収パッド、又は寒天平板培地を用いることにより、菌の代謝を促進することができ、その結果として、酵素活性を高めることができる。
更に、本発明の好適態様によれば、被検試料接触工程において、液体吸収体（例えば、吸収パッド）とシリンダーを用いることで、大量の細菌試料液を特別な装置又は機器を必要とせずに、簡便に濃縮及び固定化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細菌分析方法による細菌分析操作法を模式的に示す説明図である。
【符号の説明】
１・・・シャーレ；２・・・プレフィルター；３・・・細菌用支持体；
４・・・シリンダー；５・・・液状被検試料；６・・・シャーレ；
７・・・分析対象細菌用培地吸収プレフィルター；
８・・・発光酵素基質担持基質用支持体；９・・・紫外線ランプ。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規の細菌分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の臨床検査及び食品検査における細菌の検出において、臨床細菌検査では、分析対象対照細菌数を、直接分離培地に塗抹することにより検出可能であるが、食品細菌検査では、分析対象細菌数が少ない場合や、分析対象細菌が損傷を受けていることが多い場合があるため、非選択性培地での前増菌培養が必要である。また、分析対象細菌によっては、更に、前増菌培養の後の選択増菌培養が必要であり、選択増菌培養の後に、更に分離培養、確認培養、及び同定検査の手順を踏まなければならない。
確認培養及び同定検査は、多数の生化学的性状を組み合わせて行なうため、通常、１８時間〜７２時間、また検査項目によっては、１週間の培養が必要な場合もあり、結果が得られるまでに相当な日数と労力を要する。また、被検試料中の分析対象細菌数が少ない場合、被検試料の濃縮は、通常、濾過又は遠心により実施することが多く、それに必要な装置と手間がかかるのが現状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このように、或る特定の細菌を検出し、同定する操作は、あらゆる分野における細菌検査において極めて繁雑で、時間を要する。或る特定の細菌の検出及び同定は、培養検査と種々の生化学的性状検査により行われる。それらの性状は、それぞれの酵素反応の現れで、一つの性状検査の結果は、複数の酵素反応の最終産物で判定させる場合が多く、このことが操作の繁雑性及び長時間かかる要因である。また、細菌検査は、培養が根本的な骨格になっているため、数日を要する原因の一つである。更に、被検試料中の分析対象細菌数が少ない場合は、被検試料の濃縮が必要で、これには濾過法や遠心法等があるが、専用の装置や機器が必要で、大容量試料の処理には手間もかかるのが現状である。
本発明の課題は、より簡便且つ迅速に分析対象細菌を分析する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、
（１）分析対象細菌を含む可能性のある液状被検試料を、その分析対象細菌を担持可能な支持体と接触させる工程；
（２）前記分析対象細菌検出用の発色酵素基質又は発光酵素基質液を、発色又は発光酵素基質用支持体に接触させて発色酵素基質又は発光酵素基質を担持させる工程；及び
（３）前記工程（１）で得られた、液状被検試料を接触させた分析対象細菌用支持体と、前記工程（２）で得られた、発色又は発光酵素基質を担持させた発色又は発光酵素基質用支持体とを接触させ、前記発色又は発光酵素基質担持発色又は発光酵素基質用支持体における発色又は発光を分析する工程
を含むことを特徴とする、細菌の分析方法により解決することができる。
本明細書における「分析」には、分析対象細菌の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象細菌の数を定量的又は半定量的に決定する「測定」との両方が含まれる。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の細菌分析方法は、
（１）分析対象細菌を担持可能な支持体（以下、「分析対象細菌用支持体」、あるいは、単に「細菌用支持体」と称する）に、分析対象細菌を含む可能性のある液状被検試料を接触させる工程（以下、液状被検試料接触工程と称する）；
（２）発色又は発光酵素基質用支持体（以下、単に「基質用支持体」と称することがある）に、前記分析対象細菌検出用の発色酵素基質又は発光酵素基質の液（例えば、溶液又は分散液）を接触させ、発色酵素基質又は発光酵素基質を担持させる工程（以下、発色又は発光酵素基質担持工程と称する）；及び
（３）前記液状被検試料接触工程（１）で得られた、液状被検試料を接触させた分析対象細菌用支持体（液状被検試料接触分析対象細菌用支持体；以下、単に「試料接触細菌用支持体」と称することがある）と、前記発色又は発光酵素基質担持工程（２）で得られた、発色又は発光酵素基質を担持させた発色又は発光酵素基質用支持体（発色又は発光酵素基質担持発色又は発光酵素基質用支持体；以下、単に「基質担持基質用支持体」と称することがあります）とを接触させ、基質担持基質用支持体における発色又は発光を分析する工程（以下、分析工程と称する）
を含む。
【０００６】
本発明の細菌分析方法で分析可能な被検試料は、分析対象細菌を含む可能性のある被検試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、臨床材料（例えば、血液、尿、便、髄液、喀痰、又は咽頭拭い液など）、食品試料（例えば、飲料水、牛乳若しくは乳製品、卵若しくは卵製品、肉若しくは肉製品、魚介類若しくは魚介類製品、冷凍食品、日配食品、菓子類、又は香辛料等）、飼料若しくは飼料製品、工業用水、環境検査用試料、又は各種ふき取り検査試料を挙げることができる。
本発明の細菌分析方法では、これらの被検試料を液状で使用するので、前記被検試料が液体試料の場合は、そのままで、あるいは、適当な溶媒で希釈した希釈液を使用することができ、固形試料の場合には、乳化処理して得られた液、あるいは、適当な溶媒（例えば、水、生理食塩水、又は緩衝液等）で洗い出しを行なって得られた液を使用することができる。
【０００７】
液状被検試料接触工程で用いる細菌用支持体としては、例えば、メンブレンフィルターを挙げることができ、細菌用支持体上に前記分析対象細菌を担持することのできる限り、その材質、フィルター孔径、フィルター形状及び大きさ、並びに色などは、特に限定されるものではない。
【０００８】
また、発色又は発光酵素基質担持工程で用いる基質用支持体としては、例えば、メンブレンフィルター、濾紙、ガラスフィルター、又は焼結フィルターを挙げることができ、基質用支持体上に発色又は発光酵素基質を担持することができる限り、その材質、フィルター孔径、フィルター形状及び大きさ、並びに色などは、特に限定されるものではない。
【０００９】
細菌用支持体又は基質用支持体としてメンブレンフィルターを用いる場合には、その材質としては、例えば、セルロースアセテート、セルロース混合エステルセルロースナイトレート、ポリカーボネイト、セルローストリアセテート、又はポリスルフォン等を挙げることができる。メンブレンフィルターの孔径は、例えば、０．２μｍ〜３μｍであることができる。メンブレンフィルターの形状としては、例えば、円形若しくは楕円形、又は多角形（例えば、正方形又は長方形）を挙げることができ、円形である場合には、その直径は、例えば、５ｍｍ〜９０ｍｍであることができる。メンブレンフィルターの色は、分析工程において、発色又は発光酵素基質に由来する発色又は発光の分析を妨げない限り、特に限定されるものではない。また、周縁疎水性加工したメンブレンフィルターを使用すると、メンブレンフィルターの周縁から細菌試料液が漏れるのを防ぐことができるため、好ましい。
【００１０】
本発明の細菌分析方法で用いる発色酵素基質又は発光酵素基質として、分析対象細菌に特異的な酵素を検出するために用いることのできる公知の種々の発色酵素基質又は発光酵素基質を用いることができる。これらの発色酵素基質及び発光酵素基質は、酵素（例えば、分析対象細菌が特異的に有する酵素）に関する基質と、適当な発色物質又は発光物質とを、適当な手段により結合することにより合成される化合物であり、基質と発色物質又は発光物質とが結合されている状態では発色又は発光しないが、前記酵素により基質と発色物質又は発光物質とに切断されると、前記発色物質又は発光物質に由来する発色又は発光が生じる。
【００１１】
前記発色酵素基質における発色物質としては、例えば、４−ニトロフェノール、２−ニトロフェノール、５−ブロモ−４クロロ−３−インドリル、６−クロロ−３−インドリル、４−ニトロアニリン、若しくはβ−ナフチルアミン、又はこれらの各種発色物質の誘導体を挙げることができる。
【００１２】
前記発光酵素基質における発光物質としては、例えば、４−メチルウンベリフェロン、７−アミド−４−メチルクマリン、４−メトキシ−２−ナフチルアミン、若しくは７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン、又はこれらの各種発光物質の誘導体を挙げることができる。
【００１３】
前記発色物質又は発光基質と結合させる酵素基質としては、例えば、Ｌ−ピログルタミン酸、β−Ｄ−ガラクトピラノシド、α−Ｄ−ガラクトピラノシド、β−Ｄ−グルコピラノシド、α−Ｄ−グルコピラノシド、β−Ｄ−キシロピラノシド、α−Ｌ−アラビノピラノシド、β−Ｄ−セロピラノシド、β−Ｄ−グルクロニド、α−Ｄ−グルクロニド、β−Ｄ−フコピラノシド、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、α−Ｄ−マンノピラノシド、β−Ｄ−マンノピラノシド、ブチレイト、β−Ｎ−アセチルグルコサミニド、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニド、カルリル酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシル−プロリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、セリル−トリプシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェルアラニン、Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルギニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタリルグリシン−Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミル−Ｌ−リシン−Ｌ−リシン、Ｌ−リシン−Ｌ−アラニン、Ｌ−プログルタミン酸、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、リン酸、硫酸、Ｌ−ピロリドンカルボキシルリン酸、又はデオキシリボヌクレイン酸等を挙げることができる。
発色物質又は発光物質を酵素基質と結合するには、公知の手段を用いて、適当な結合、例えば、ペプチド結合、エステル結合、又はグリコシド結合により結合することができるし、あるいは、発色物質又は発光物質と酵素基質とが結合した状態で市販されている複合体をそのまま用いることもできる。
【００１４】
本発明の細菌分析方法における液状被検試料接触工程では、液状被検試料と細菌用支持体とを接触させ、液状被検試料中に分析対象細菌が含まれている場合には、分析対象細菌を細菌用支持体に担持させる。細菌用支持体に液状被検試料を接触させる方法は、特に限定されるものではなく、例えば、適当な容器（例えば、シャーレ）内に配置した細菌用支持体上に、液状被検試料を滴下することもできるし、あるいは、適当な容器に入れた液状被検試料中に、細菌用支持体を浸漬することもできる。
【００１５】
本発明の細菌分析方法では、液体吸収体（例えば、吸収パッド）上に前記細菌用支持体を配置した状態で、液状被検試料接触工程を実施することが好ましい。より具体的には、細菌用支持体の一方の面を、液体吸収体と接触させた状態で、前記細菌用支持体の反対側の面に、液状被検試料を加えることにより、細菌用支持体に液状被検試料を接触させることができる。液状被検試料接触工程において、液体吸収体を使用すると、細菌用支持体中を大量の液状被検試料を通過させることができ、その結果として、液状被検試料中に分析対象細菌が含まれている場合には、分析対象細菌を濃縮して細菌用支持体に担持させることができる。
【００１６】
液状被検試料接触工程で用いることのできる前記液体吸収体は、滅菌（例えば、高圧蒸気滅菌、エチレンオキサイド滅菌、又はγ線滅菌）可能な液体吸収体である限り、特に限定されるものではないが、例えば、多孔性フィルター、グラスファイバーフィルター、濾紙、又はスポンジ等を挙げることができる。液体吸収体の色、形状、又は大きさは、特に限定されるものではなく、例えば、液状被検試料の量に応じて適宜決定することができる。また、前記液体吸収体を２枚以上重ねて使用することもできる。
【００１７】
また、本発明の細菌分析方法では、両端が開口した筒状体（例えば、シリンダー）を細菌用支持体上に配置した状態で、液状被検試料接触工程を実施することが好ましい。より具体的には、細菌用支持体上に、両端が開口している筒状体を、一方の開口端と前記細菌用支持体とが接触するように配置した状態で、前記筒状体中に、液状被検試料を加えることにより、細菌用支持体に液状被検試料を供給することができる。液状被検試料接触工程において、筒状体を使用すると、接触操作を簡略化することができる。
【００１８】
液状被検試料接触工程で用いることのできる前記筒状体は、滅菌可能である限り、その材質は特に限定されるものではないが、例えば、プラスティック、ガラス、又はステンレススチール等を挙げることができる。
また、前記筒状体の形状及び大きさは、筒状体内に加えた液状被検試料を細菌用支持体に接触させることができる限り、特に限定されるものではなく、使用する細菌用支持体の大きさに合わせて適宜決定することができる。細菌用支持体と同形状且つ同サイズの筒状体を用いることが好ましい。
【００１９】
本発明の細菌分析方法では、液状被検試料接触工程を実施する際に、前記液体吸収体又は前記筒状体の一方のみを単独で使用することもできるし、あるいは、組み合わせて同時に使用することもできる。液体吸収体及び筒状体を組み合わせて使用すると、より大量の液状被検試料を、簡略化した操作で処理することができ、その結果、液状被検試料中に分析対象細菌が含まれている場合には、より多くの分析対象細菌を濃縮して細菌用支持体に担持させることができるため、好ましい。
液体吸収体及び筒状体を組み合わせて使用する場合には、前記筒状体は、細菌用支持体を液体吸収体に圧着するのに充分な重さがある材質（例えば、ステンレススチール又はガラス）からなることが好ましい。
また、充分な重さのないプラスチック等からなる筒状体を使用する場合には、細菌用支持体を液体吸収体に押しつけるように、手でシリンダーを抑えることができる。
【００２０】
本発明の細菌分析方法における発色又は発光酵素基質担持工程では、基質用支持体に発色又は発光酵素基質液を接触させ、発色酵素基質又は発光酵素基質を担持させる方法は、特に限定されるものではなく、例えば、発色酵素基質又は発光酵素基質を適当な溶媒に溶解又は分散させ、得られた溶液又は分散液を基質用支持体に含ませることにより実施することができる。より具体的には、適当な容器（例えば、シャーレ）内に配置した基質用支持体上に、発色又は発光酵素基質液を滴下することもできるし、あるいは、適当な容器に入れた発色又は発光酵素基質液中に、基質用支持体を浸漬することもできる。
【００２１】
発色酵素基質又は発光酵素基質を溶解又は分散させるのに用いる溶媒は、発色酵素基質又は発光酵素基質の性能に影響を与えない溶媒である限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド、エタノール、メタノール、アセトン、トルエン、ブタノール、塩酸、リン酸緩衝液、又は精製水等を挙げることができる。
発色又は発光酵素基質液における発色又は発光酵素基質の濃度は、特に限定されるものではないが、例えば、０．０１〜１０％であることができ、基質用支持体に接触させる発色又は発光酵素基質液の量も、特に限定されるものではないが、例えば、１０μＬ〜５００μＬであることができる。
【００２２】
発色又は発光酵素基質担持工程で得られた、発色又は発光酵素基質液を担持させた基質用支持体は、そのまま、次の分析工程に使用することもできるし、あるいは、次の分析工程に使用する前に、乾燥（例えば、自然乾燥、送風乾燥、減圧乾燥、真空乾燥、又は凍結乾燥等）させて、その状態で保存することもできる。発色又は発光酵素基質液を担持させた基質用支持体は、乾燥させても、試薬性能（発色性及び蛍光性）の劣化は見られず、保存温度に関わらず（例えば、４℃、１０℃、２５℃、又は３７℃）、長期間（約２年）安定であり、優れた保存安定性を有している。
【００２３】
本発明の細菌分析方法における分析工程では、液状被検試料接触工程で得られた試料接触細菌用支持体と、発色又は発光酵素基質担持工程で得られた基質担持基質用支持体とを接触させ、所定時間経過した後、基質担持基質用支持体における発色又は発光を分析する。
液状被検試料中に分析対象細菌が存在する場合には、試料接触細菌用支持体と基質担持基質用支持体とを接触させると、前記細菌が特異的に有する酵素により、発色又は発光酵素基質が、発色物質又は発光物質と酵素基質とに切断され、発色物質又は発光物質が遊離する。発色酵素基質を用いた場合には、発色物質の遊離により、基質担持基質用支持体が着色するので、例えば、肉眼判定により、発色物質の有無及び／又は発色物質量を分析することができる。発光酵素基質を用いた場合には、例えば、基質担持基質用支持体に長波長の紫外線（ＵＶ）ランプを照射すると、肉眼判定により、蛍光物質の有無及び／又は蛍光物質量を分析することができる。
発色物質に由来する発色、あるいは、蛍光物質に由来する発光の分析方法は、肉眼判定以外にも、使用する発色物質又は蛍光物質の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光測定機又は分光光度計を挙げることができる。
【００２４】
分析工程において、試料接触細菌用支持体と基質担持基質用支持体とを接触させる場合に、同時に、前記試料接触細菌用支持体と、分析対象細菌用培地含有担体とを更に接触させることが好ましい。
分析対象細菌用培地含有担体としては、例えば、分析対象細菌用培地を吸収させた吸収パッド、あるいは、分析対象細菌用培地を含む寒天培地（好ましくは、寒天平板培地）を挙げることができる。前記寒天培地としては、例えば、普通寒天培地、ハートインフュージョン寒天培地、トリプチケースソイ寒天培地、又は血液寒天培地等を挙げることができる。
【００２５】
分析工程において、試料接触細菌用支持体と分析対象細菌用培地含有担体とを接触させると、液状被検試料中に分析対象細菌が含まれている場合には、分析対象細菌の代謝を促進することができ、その結果として、酵素活性を高めることができる。
また、分析対象細菌用培地含有担体として寒天平板培地を用い、基質担持基質用支持体として、複数種類の分析対象細菌に特異的な酵素を検出するための、複数種類の基質担持基質用支持体を用いると、１枚の寒天平板培地上で、複数の分析対象細菌の分析を同時に行なうことができる。
【００２６】
本発明の細菌分析方法は、特に限定されるものではないが、例えば、図１に示す各工程（Ａ）〜（Ｉ）に従って実施することができる。図１に示す工程では、発光酵素基質を用いた場合の態様を示すが、発色酵素基質を用いた場合でも、後述するように、最後の工程（Ｉ）を除き、同様に実施することができる。
工程（Ａ）に示すように、蓋付きの適当な容器１［例えば、シャーレ（例えば、直径＝６０ｍｍ）］に、滅菌済みのプレフィルター２［例えば、吸収パッド（例えば、直径＝４７ｍｍ）］を入れた後、工程（Ｂ）に示すように、前記プレフィルター２の上に、滅菌済みの細菌用支持体３［例えば、メンブレンフィルター（例えば、孔径＝０．８μｍ、直径＝２５ｍｍ）］を載せる。工程（Ｃ）に示すように、前記細菌用支持体３上に、滅菌済みのシリンダー４（例えば、ステンレススチール製）をかぶせ、前記シリンダー４内に、液状被検試料５を入れ、細菌用支持体３上に液状被検試料５を供給する。液状被検試料５がプレフィルター２に吸収されるまで放置してから、シリンダー４を取り去ると、工程（Ｄ）に示すように、試料接触細菌用支持体３’及び液状被検試料吸収プレフィルター２’が得られる。
【００２７】
工程（Ｅ）に示すように、別の容器６［例えば、シャーレ（例えば、直径＝６０ｍｍ）］に、滅菌済みのプレフィルター（例えば、直径＝２５ｍｍ）を入れた後、適当量（例えば、６５０μＬ）の分析対象細菌用培地［例えば、ブレインハートインフュージョンブイヨン（ＢＨＩＢ）培地］を染み込ませることにより、分析対象細菌用培地吸収プレフィルター７が得られる。工程（Ｆ）に示すように、前記の分析対象細菌用培地吸収プレフィルター７上に、工程（Ｄ）で得られた試料接触細菌用支持体３’を重ねる。工程（Ｇ）に示すように、予め作製した、発光酵素基質を担持させた基質用支持体（例えば、メンブレンフィルター）８を、緩衝液（すなわち、分析対象細菌が特異的に有する酵素の至適ｐＨを維持可能な緩衝液）で湿らせた後、試料接触細菌用支持体３’の上に、更に重ねる。工程（Ｈ）に示すように、適当な温度（例えば、３７℃）でインキュベートした後、工程（Ｉ）に示すように、長波長の紫外線ランプ９を照射し、発光酵素基質担持基質用支持体８上の蛍光の有無を肉眼判定する。
発光酵素基質の代わりに、発色酵素基質を用いた場合には、工程（Ｈ）の後、発色酵素基質担持基質用支持体上の発色の有無を肉眼判定する。
【００２８】
本発明の細菌分析方法を用いて、例えば、大腸菌を分析する場合には、大腸菌を含む液状被検試料（例えば、尿路感染症の約７〜８割は大腸菌によるもので、尿中の大腸菌が１０4個／ｍＬ以上存在すれば、尿路感染症と診断することができる）を、吸収パッドの上に載せたメンブレンフィルター上に供給する。これとは別に、大腸菌に特異的なβ−Ｄ−グルクロニダーゼの発光酵素基質である、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを０．０１〜１％に染み込ませ、乾燥させた発光酵素基質担持メンブレンフィルターを、０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５〜９）で湿らせ、先に調製した液状被検試料接触メンブレンフィルターに重ねる。重ねたこれらのメンブレンフィルターを、培地を含ませた吸収パッド上に載せ、３７度℃で６時間反応させる。発光酵素基質担持メンブレンフィルターに含まれる４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドは、大腸菌の酵素により切断され、発光物質である４−メチルウンベロフェロンが遊離し、長波長のＵＶランプ（３６０〜３７０ｎｍ）を照射するだけで、発光酵素基質担持メンブレンフィルターが蛍光を発し、１０4個／ｍＬの大腸菌の存在を確認することができる。
【００２９】
また、本発明の細菌分析方法では、目的菌に特異的な複数の発色又は発光酵素基質を含ませた、複数の発色又は発光酵素基質担持基質用支持体を用いることにより、様々な菌の分析を同時に実施することができる。
例えば、飲料水や河川水、工業用水等においては、大腸菌群及び大腸菌の存在が問題になるが、この場合、前記の大腸菌検出用発光酵素基質を担持させた基質用支持体と、大腸菌群に特異的な酵素である、β−Ｄガラクトシダーゼに対する発光酵素基質である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを担持させた基質用支持体とを用い、同様の操作を行なうことにより、大腸菌群及び大腸菌をそれぞれ区別して検出することができる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《本発明の細菌分析方法による大腸菌の検出》
（Ａ）試験菌の調製
大腸菌ＪＣＭ１６４９株をハートインフュージョン寒天培地に接種し、３７℃で一晩培養した。その１集落をブレインハートインフュージョンブイヨンに接種し、３７℃で一晩培養した後、０．０６７ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で１０8個／ｍＬ〜１０3個／ｍＬとなるように段階的に希釈した希釈液を試験菌液とした。
【００３１】
（Ｂ）発光酵素基質担持メンブレンフィルターの作製
４ーメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）（ナカライ社）をＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミドに溶解した後、更に、０．０６７ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、ＭＵＧが最終濃度０．０５％になるように調整した。この発光酵素基質溶液１００μＬを、滅菌したメンブレンフィルター（セルロース混合エステル、直径＝２５ｍｍ、孔径＝０．８μｍ；ミリポア社）に染み込ませ、２５℃で一晩送風乾燥した。
【００３２】
（Ｃ）大腸菌の検出
本実施例における操作は、図１に示す手順で実施した。
すなわち、各々の希釈菌液毎に、滅菌したグラスファイバーフィルター（直径＝４７ｍｍ；ミリポア社）を滅菌プラスチックシャーレ内に４枚重ねて入れ、この上に、滅菌したメンブレンフィルター（セルロース混合エステル、直径＝２５ｍｍ、孔径＝０．８μｍ：ミリポア社）を１枚置き、ステンレススチール製滅菌シリンダー（外径＝２５ｍｍ、内径＝２１ｍｍ、高さ＝５ｃｍ）を前記メンブレンフィルターの上に置き、各種希釈菌液１０ｍＬをシリンダー内に入れた。シリンダー内の菌液がメンブレンフィルター上から見えなくなるまで放置し（約１分３０秒）、シリンダーを取り除いた。
別の滅菌プラスチックシャーレ（直径＝６０ｍｍ）に、滅菌したグラスファイバーフィルター（直径＝２５ｍｍ；ミリポア社）を入れ、ブレインハートインフュージョンブイヨン６５０μＬを染み込ませた。この上に、先の菌担持メンブレンフィルターを重ね、更にその上に、前項（Ｃ）で調製したＭＵＧ溶液を染み込ませたメンブレンフィルターを、予め０．０６７ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液１００μＬで湿らせてから重ねた。従って、菌液を供給したメンブレンフィルターは、培地を含ませた吸収パッドと、ＭＵＧ溶液を染み込ませたメンブレンフィルターとの間で、サンドイッチされた状態となる。シャーレの蓋を閉じ、３７℃で２時間〜６時間まで経時的に長波長（３６６ｎｍ）のＵＶランプを照射し、ＭＵＧ溶液を染み込ませたメンブレンフィルターの蛍光の有無を肉眼判定した。
【００３３】
結果を表１に示す。
表１における記号「−」は、蛍光がないことを表わし、「＋」は、蛍光強度が弱いことを表わし、「＋＋」は、蛍光強度が中程度であることを表わし、「＋＋＋」は、蛍光強度が強いことを表わす。また、「対照」は、培地を含む吸収パッド上に、直接、ＭＵＧ溶液担持メンブレンフィルターを重ねたもの（すなわち、菌担持メンブレンフィルターなしの場合）を意味する。
【００３４】
表１に示すとおり、大腸菌に特異的な酵素であるグルクロニダーゼが基質に作用し、ＭＵＧ溶液担持メンブレンフィルターに含まれるＭＵＧを切断し、遊離した蛍光物質により蛍光が肉眼で観察でき、１０3個／ｍＬの大腸菌が６時間後に検出することができた。このことにより、単純尿路感染症の原因菌の７〜８割を占める大腸菌が、その病因となる菌数である１０4個／ｍＬ以上存在することで、尿路感染症の診断が可能となることから、本発明方法によれば、培養せずともその検出が可能となった。
【００３５】
【実施例２】
《本発明方法における分析対象細菌用培地含有担体の効果の確認》
本実施例では、実施例１で用いた、ブレインハートインフュージョンブイヨン（ＢＨＩＢ）を染み込ませたグラスファイバーフィルターの効果を確認した。具体的には、ＢＨＩＢ含浸グラスファイバーフィルターの上に、菌担持メンブレンフィルターを重ね、更にその上に、ＭＵＧ溶液担持メンブレンフィルターを重ねる代わりに、ＢＨＩＢ含浸グラスファイバーフィルターを使用せず、菌担持メンブレンフィルターの上に、ＭＵＧ溶液担持メンブレンフィルターを重ねること以外は、実施例１（Ｃ）の操作を繰り返した。
【００３７】
結果を表２に示す。表２における各記号は、表１と同じ意味である。また、「対照」も、表１と同じ意味である。
表２に示すように、菌数が極めて多い場合には、蛍光を観察することができるが、１０7ｃｆｕ／ｍＬ以下になると、蛍光が観察されず、表１に示す、分析対象細菌用培地含有担体を用いた場合と比較すると、その検出菌数に明らかな差が見られ、分析対象細菌用培地含有担体の効果が確認された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の細菌分析方法によれば、臨床分野はもちろん、食品検査や環境検査における細菌検査において、今までの分離培養や同定操作の繁雑さを解消することができ、更に結果が得られるまで時間をも短縮することができ、細菌検査の抱える種々の問題点を一気に解決することができるものである。
すなわち、様々な分析対象細菌の有する特異的な酵素に対する発色又は発光酵素基質を基質用支持体（例えば、メンブレンフィルター）に含ませ、菌試料液を供給した細菌用支持体（例えば、メンブレンフィルター）上に重ね、所望により、更に培地を含ませた吸収パッドを重ね、あるいは、所望により、分析対象細菌用培地を吸収させた吸収パッド、又は寒天平板培地上に置くことにより、極めて簡単な操作だけで、分析対象細菌の分析を実施することができる。分析対象細菌用培地を吸収させた吸収パッド、又は寒天平板培地を用いることにより、菌の代謝を促進することができ、その結果として、酵素活性を高めることができる。
更に、本発明の好適態様によれば、被検試料接触工程において、液体吸収体（例えば、吸収パッド）とシリンダーを用いることで、大量の細菌試料液を特別な装置又は機器を必要とせずに、簡便に濃縮及び固定化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細菌分析方法による細菌分析操作法を模式的に示す説明図である。
【符号の説明】
１・・・シャーレ；２・・・プレフィルター；３・・・細菌用支持体；
４・・・シリンダー；５・・・液状被検試料；６・・・シャーレ；
７・・・分析対象細菌用培地吸収プレフィルター；
８・・・発光酵素基質担持基質用支持体；９・・・紫外線ランプ。
Claims (6)
- （１）分析対象細菌を含む可能性のある液状被検試料を、その分析対象細菌を担持可能な支持体と接触させる工程；
（２）前記分析対象細菌検出用の発色酵素基質又は発光酵素基質液を、発色又は発光酵素基質用支持体に接触させて発色酵素基質又は発光酵素基質を担持させる工程；及び
（３）前記工程（１）で得られた、液状被検試料を接触させた分析対象細菌用支持体と、前記工程（２）で得られた、発色又は発光酵素基質を担持させた発色又は発光酵素基質用支持体とを接触させ、そして前記液状被検試料接触分析対象細菌用支持体と、分析対象細菌用培地含有担体とを接触させ、前記液状被検試料接触分析対象細菌用支持体が、発色又は発光酵素基質担持発色又は発光酵素基質用支持体と分析対象細菌用培地含有担体とに挟まれた状態で、前記発色又は発光酵素基質担持発色又は発光酵素基質用支持体における発色又は発光を分析する工程
を含むことを特徴とする、細菌の分析方法。 - 前記の分析対象細菌用培地含有担体が、分析対象細菌用培地を吸収させた吸収パッドである、請求項１に記載の細菌分析方法。
- 前記の分析対象細菌用培地含有担体が、分析対象細菌用培地を含む寒天培地である、請求項１に記載の細菌分析方法。
- 前記工程（１）において、前記分析対象細菌用支持体の一方の面を、液体吸収体と接触させた状態で、前記分析対象細菌用支持体の反対側の面に、前記液状被検試料を供給することにより、前記分析対象細菌用支持体における一方の表面から反対側表面への前記液状被検試料の通過を促進させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌分析方法。
- 前記工程（１）において、前記分析対象細菌用支持体上に、両端が開口している筒状体を、一方の開口端と前記分析対象細菌用支持体とが接触するように配置した状態で、前記筒状体中に、前記液状被検試料を加えることにより、前記分析対象細菌用支持体に前記液状被検試料を供給する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌分析方法。
- 前記工程（２）において、前記発色又は発光酵素基質用支持体に前記発色又は発光酵素基質液を接触させることによって発色酵素基質又は発光酵素基質を担持させた後、前記発色又は発光酵素基質用支持体を乾燥させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌分析方法。
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