JPH08509601A - 迅速大腸菌検出系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 糞便大腸菌群細胞が試料中に存在するかどうかを決定する迅速な存在−不在法。原試料の一部を濾過して、微孔性フィルター上に保持し、これを蛍光原物質を含む作動媒質を有するインキュベーション容器に入れる。試料を、約２分〜６時間の所定時間インキュベーションする。ｐＨをアルカリ性の水準に調整した後、容器に、光線を照射し、放出される蛍光を測定する。測定値をバックグラウンド蛍光に対して調整し、無関係な蛍光源に対して補正する。補正した蛍光値が最も画定的な所定の基準である正であるときには、糞便大腸菌群細胞が原試料に存在する（すなわち、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞）と、結論される。

Description

【発明の詳細な説明】 迅速大腸菌検出系 関連出願に対するクロス・レファレンス 本出願は、１９８７年１１月５日に出願され、現在は放棄された米国特許出願 連続番号第０７／１１７，４８１号明細書の継続出願である１９９１年２月８日 出願の米国特許出願連続番号第０７／６５３，８６９号明細書の一部継続出願で ある。 背景 本発明は、ヒトが消費しまたは使用する製品中に微生物を検出する迅速な方法 に関し、更に詳細には、制限のためのものではないが、水資源中に糞便の大腸菌 群の存在または不在を検出する方法に関する。 飲料水によって媒介される疾患例が多数報告されているため、米国環境保護局 は１９９１年に飲料水の衛生品質の更に厳重な監視を必要とする新たな規則を交 付した。この問題は、世界的に同じものである。発展途上国では、罹患率の８０ ％および死亡率の３３％は、水の衛生品質が良くないことによるものと考えられ ている。この結果、水の衛生品質を検出する迅速な方法の市場が実質的に発展し た。 水品質を迅速に監視して制御することが緊急および即座に必要とされているに も拘らず、「大腸菌」が７０年前に指示菌として導入されて以来、ごく僅かな改 良しかなされていない。「大腸菌群」の検出に現在用いられている方法は、一般 的には未だに２４〜４８時間のインキュベーションを必要とするのである。 安全な水品質を用いまたは送り込むことに依存している諸産業（例えば、水、 食品、飲料、薬品およびエネルギー）は、衛生上の変化に素早く対応して、直ち に対策を採ることができるようにすることが必要なのは明らかである。 他の市場は、軍隊であり、ここでは安全な飲料水品質を連続的に監視し検証し 、且つ戦争および自然災害状況のいずれに関しても細菌学的な戦争から防御する 必要がある。これは、軍事作戦や、軍事関係者が公衆衛生に関与する軍事以外の 緊 急事態に対して特に重要である。 市場調査では、飲料水産業に対して下記のような市場規模があることを示して いる。 スカンディナヴィア： ６５０〜８５０，０００回の試験／年 ＥＥＣ： ６，０００〜８，０００，０００回の試験／年 世界中： ２０，０００，０００回の試験／年。 市場規模は、技術改良により及び水産業における内部的品質管理に対する関心 が高まってきたことにより増加することがある。 膜濾過（ＭＦ）または最確数（ＭＰＮ）の手法を用いる水の衛生品質を評価す るための標準的方法は、完了までに２４〜７２時間かかる。時間があまり長くか かり過ぎ、標準以下の品質について警告することも、衰弱を招きまたは生命に関 わる疾患を回避することもできないことが認められている。Standard Methods（ 米国公衆衛生協会、１９８９年、水及び廃水の標準的検査法(Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater) 、第１７版、米国公衆衛生協会 、ワシントン特別区）という文献によれば、様々な検出法に基づいた多数の迅速 法がある。しかしながら、これらの方法は、概して感度が良くなかったり、長時 間かかるので真に迅速測定の可能性は限定されている。従って、試料中の糞便大 腸菌群の存在を迅速に検出する系が必要とされている。「存在」という用語は、 本明細書で用いる場合には、試料１００ｍｌ当たり１個以上の糞便大腸菌群細胞 が存在するものと定義される。 発明の概要 本発明は、一態様では、原液体または液化した試料が１００ｍｌ当たりスクリ ーン１個の糞便大腸菌群細胞を含むかどうかを迅速に決定する方法を含んで成る 。原試料または液化試料を幾つか、例えば３個に分割し、それぞれの分割したも のを濾過して、試料中に存在する微生物をフィルター上に保持する。 この方法では、原試料の第一の分割した部分を第一のフィルターで濾過し、原 試料の第二の部分を第二のフィルターで濾過し、原試料の第三の部分を第三のフ ィルターで濾過し、などとする。蛍光生成物を生じる蛍光原基質を有する作動媒 質を設ける。また、第一、第二及び第三の試料に対して試料容器を、試料と同時 に実験を行うコントロールに対してコントロール容器を設ける。それぞれの容器 は、所定量の作動媒質が入っている。濾過段階の後、第一のフィルターを第一の 試料容器に入っている作動媒質に入れ、第二のフィルターを第二の試料容器に入 っている作動媒質に入れ、第三のフィルターを第三の試料容器に入っている作動 媒質に入れる。 伝熱媒質を含み、この媒質が配置されているそれぞれの容器と密接に物理的接 触を保持しているインキュベーターを設ける。第一の試料容器と第一のコントロ ール容器を第一の短時間インキュベーションする。ほぼ同時に開始して、第二の 試料容器と第二のコントロール容器を第二の時間インキュベーションし、第三の 試料容器と第三のコントロール容器を第三の時間インキュベーションする。 第一の短時間の後、第一の試料容器の内容物及び第一のコントロール容器の内 容物のｐＨを、アルカリ性ｐＨに調整する。同様に、第二の時間の後、第二の試 料容器の内容物及び第二のコントロール容器の内容物をアルカリ性ｐＨに調整し 、第三の時間の後、第三の試料容器の内容物及び第三のコントロール容器の内容 物をアルカリ性ｐＨに調整する。 試料容器及びコントロール容器のｐＨを調整した後、試料及びコントロール容 器に、所定の励起波長の光線を照射する。それぞれの照射段階の後、第一の試料 容器からの第一の試料の蛍光値を測定し、第一のコントロール容器からの第一の コントロール蛍光値を測定する。同様に、第二の試料の蛍光値を第二の試料容器 から測定し、第二のコントロール蛍光値第二のコントロール容器から測定し、第 三の試料の蛍光値を第三の試料容器から測定し、第三のコントロール蛍光値第三 のコントロール容器から測定する。 第一のコントロール蛍光値及び第一の試料の蛍光値を用いて、補正因子を得る 。次いで、第二のコントロール蛍光値を用いて第二の試料の蛍光値を調整し、調 整した第二の試料の蛍光値を得、第三のコントロール蛍光値を用いて第三の試料 の蛍光値を調整し、調整した第三の試料の蛍光値を得る。この後、補正因子を用 いて、調整した第二の試料の蛍光値を補正して、補正した第二の試料の蛍光値を 得て、補正因子を用いて、調整した第三の試料の蛍光値を補正して、補正した第 三の試料の蛍光値を得る。 補正した第二の試料の蛍光値が正であり、補正した第三の試料の蛍光値が正で あり且つ補正した第二の試料の蛍光値を上回るときには、原試料には１００ｍｌ 当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞が含まれると結論される。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の方法を用いて検出するため、試料を幾つかに分割し、濾過し 、４４．５℃でインキュベーションするやり方を図解的に示したものである。 図２は、本発明の７時間直接計数法と２４時間ｍＦＣ標準法とを比較したもの である。記号は、異なる水供給源を表す。（＋）：Nidelva（トロントハイム、 ノルウェー）、（●）：希釈した未処理下水（トロントハイム、ノルウェー）、 （■）：Akerselva（オスロー、ノルウェー）、（○）：上水道水（カトマンズ 、ネパール）。 図３は、４−メチル−ウンベリフェロン濃度と蛍光の単位との相関を示すグラ フである。 図４は、未処理下水が混入した（●）、ラクトースを添加してβ−Ｄ−ガラク トシダーゼの誘導が増強された（○）、及び洗剤であるラウリル硫酸ナトリウム を添加して活性を更に増強した（ ）飲料水での大腸菌群による４−ＭＵ−β− Ｄ−ガラクトシドからＭＵの産生を示すグラフである。酵素アッセイ温度は４１ ．５℃であった。 図５は、３種類の糞便大腸菌群細胞濃度の試料についてのインキュベーション 時間対蛍光の一例を示すグラフである。 図６は、３種類の糞便大腸菌群細胞濃度の試料についてのインキュベーション 時間対蛍光の一例を示すもう一つのグラフである。 好ましい態様の説明 本発明は、蛍光生成物（４−メチルウンベリフェロン）を生成する蛍光原基質 （４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシド及び４−メチルウンベリ フェロンーβ−Ｄ−グルクロニド）の一方または両方の酵素加水分解によるもの である。加水分解の速度または総蛍光量は、標準的蛍光分析装置を用いて定量す ることができる。 本発明の方法を適合させて、大腸菌による汚染を検出する三段階または逐次的 方法を用いることができる。この方法では、迅速スクリーニング段階で、約２０ 〜３０分以内に著しく汚染された水の試料を同定することができる。第二段階で は、余り汚染されていない水を、１〜６時間以内に１００ｍｌ当たり少なくとも １個の糞便大腸菌群細胞の濃度で含まれる糞便大腸菌を有するものとして同定す ることができる。第三に、コロニー数を約７時間で直接得て、初期の結果を確認 する。図１は、第二及び第三段階を用いる方法の模式図である。 実際には、通常は４〜１０個の反復試料であるが、２個程度の少ない試料を約 ４４．５℃±．２℃で濾過して、インキュベーションする。各種の所定のインキ ュベーション時間の後に、試料を順次取り出して、迅速スクリーニングまたは存 在−不在の結果を得る。好ましい態様では、複数のインキュベーション時間を同 時に設定する。初期の糞便細胞の存在が検出されなければ、約７時間のインキュ ベーションが経過するまで、微細集落を直接計数する目的での寒天培地上での試 料の継続インキュベーションの任意の第三の分析を行うことができる。直接計数 に要し、且つ試料濾過及びデーター獲得を包含する総経過時間は、通常は７時間 を超過しない。 図２は、本発明の方法を用いる６時間での直接計数と標準的方法の２４時間ｍ −ＦＣ法との間の相関を示している。データーのほとんどは、ノルウェーの表層 水を用いた試験から得たものである。手続きの例外は、ネパールのデーターであ って、これは濁りおよび／または塩素濃度が高かったため７時間のインキュベー ションを表している。７時間は、直接計数段階の好ましい態様のインキュベーシ ョン時間である。 本発明は、一態様では原液体または液化した試料が１００ｍｌ当たり少なくと も１個の糞便大腸菌群細胞を含むときの迅速な存在−不在検出法を含んで成る。 原試料または液化試料を幾つか、例えば３個に分割し、それぞれの部分を濾過し て、試料中に存在する微生物をフィルター上に保持する。この方法では、原試料 の第一の分割した部分を第一のフィルターで濾過し、原試料の第二の部分を第二 のフィルターで濾過し、原試料の第三の部分を第三のフィルターで濾過し、など とする。 蛍光生成物を生じる蛍光原基質を有する作動媒質を設ける。また、第一、第二 及び第三の試料に対して試料容器を、試料と同時に実験を行うコントロールに対 してコントロール容器を設ける。それぞれの容器は、所定量の作動媒質が入って いる。濾過段階の後、第一のフィルターを第一の試料容器に入っている作動媒質 に入れ、第二のフィルターを第二の試料容器に入っている作動媒質に入れ、第三 のフィルターを第三の試料容器に入っている作動媒質に入れる。 伝熱媒質を含み、この媒質が配置されているそれぞれの容器と密接に物理的接 触を保持しているインキュベーターを設ける。第一の試料容器と第一のコントロ ール容器を第一の短時間インキュベーションする。ほぼ同時に開始して、第二の 試料容器と第二のコントロール容器を第二の時間インキュベーションし、第三の 試料容器と第三のコントロール容器を第三の時間インキュベーションする。 第一の短時間の後、第一の試料容器の内容物及び第一のコントロール容器の内 容物のｐＨを、アルカリ性ｐＨに調整する。同様に、第二の時間の後、第二の試 料容器の内容物及び第二のコントロール容器の内容物をアルカリ性ｐＨに調整し 、第三の時間の後、第三の試料容器の内容物及び第三のコントロール容器の内容 物をアルカリ性ｐＨに調整する。 試料容器及びコントロール容器のｐＨを調整した後、試料及びコントロール容 器に、所定の励起波長の光線を照射する。それぞれの照射段階の後、第一の試料 容器からの第一の試料の蛍光値を測定し、第一のコントロール容器からの第一の コントロール蛍光値を測定する。同様に、第二の試料の蛍光値を第二の試料容器 から測定し、第二のコントロール蛍光値第二のコントロール容器から測定し、第 三の試料の蛍光値を第三の試料容器から測定し、第三のコントロール蛍光値第三 のコントロール容器から測定する。 第一のコントロール蛍光値及び第一の試料の蛍光値を用いて、補正因子を得る 。次いで、第二のコントロール蛍光値を用いて第二の試料の蛍光値を調整し、調 整した第二の試料の蛍光値を得、第三のコントロール蛍光値を用いて第三の試料 の蛍光値を調整し、調整した第三の試料の蛍光値を得る。この後、補正因子を用 いて、調整した第二の試料の蛍光値を補正して、補正した第二の試料の蛍光値を 得て、補正因子を用いて、調整した第三の試料の蛍光値を補正して、補正した第 三の試料の蛍光値を得る。 補正した第二の試料の蛍光値が正であり、補正した第三の試料の蛍光値が正で あり且つ補正した第二の試料の蛍光値を上回るときには、原試料には１００ｍｌ 当たりに少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞が含まれると結論される。 また、この方法は、更に寒天培地に原試料の濾過した第四の部分を接種し、寒 天培地は作動媒質を含み、次いで接種した培地をインキュベーターで約７時間イ ンキュベーターすることを含んで成る。この後に、培地に所定の励起波長を照射 し、培地上に見える微細集落の数を直接計数する。この段階は、更にアルカリ性 溶液を微細集落に適用して、蛍光を増強した後、微細集落を計数することを含ん で成る。 短時間は、通常は約５分未満であり、約２〜５分間であることができる。第二 の時間は、約１時間〜約５時間であることができる。第三の時間は、約２時間〜 約６時間であることができるが、但し第三の時間は第二の時間より約１時間以上 長い。 第一の時間は、約２分〜約５分の範囲にあることができ、第二の時間は約１時 間であり、第三の時間は約２時間であることができる。また、第一の時間は、約 ５分未満とし、第二の時間は約１時間、第三の時間を約２時間〜約６時間とする ことができる。 第一の時間は、約５分未満とし、第二の時間は約２時間、第三の時間を約４時 間とすることができる。第一の時間を約５分未満とし、第二の時間を約４時間、 第三の時間を約６時間とすることができる。第二の時間と第三の時間とは、少な くとも約１時間異なるようにすることができる。 補正因子を得る段階では、第一のコントロール蛍光値を第一の試料の蛍光値か ら引くことによって得ることができる。調整した試料の蛍光値は、コントロール 蛍光値を試料の蛍光値から引くことによって得ることができる。次いで、補正し た試料の蛍光値は、補正因子を調整した試料の蛍光値から引くことによって得ら れる。 本発明では、作動媒質は、生きている糞便大腸菌群細胞の代謝を支持するため の栄養、発蛍光生成物を産生するための蛍光原基質との反応において有効な酵素 の産生を誘導する誘発剤、及び蛍光を増強するのに有効な界面活性剤をも含むこ とができる。誘発剤はラクトースであることができ、蛍光を増強するのに有効な 界面活性剤はラウリル硫酸ナトリウムであることができ、酵素はβ−Ｄ−ガラク トシダーゼであることができ、蛍光原基質は４−メチルウンベリフェロン−β− Ｄ−ガラクトシドであることができ、蛍光性部分は４−メチルウンベリフェロン であることができる。作動媒質は、第二の蛍光原基質として４−メチルウンベリ フェロン−β−Ｄ−グルクロニドを含み、第二の基剤を分解する酵素としてβ− Ｄ−グルクロニダーゼを用いることができる。好ましくは、照射段階では、約３ ６５ｎｍの励起波長が用いられ、これによって蛍光性生成物から約４６５ｎｍの 発光波長を生じる。インキュベーターの伝熱媒質は、水または油などの液体でも 、または金属などの固体でもよい。容器のｐＨを調整するときには、ｐＨを約１ １以上、好ましくはｐＨを約１３に調整することができる。 本発明のもう一つの態様では、この方法は第一、第二及び第三の部分について 前記したのと同様に濾過して加工する原試料の第四の部分を含むことができる。 この態様では、原試料は、 （１）補正した第二の試料の蛍光値が正であり且つ補正した第三の試料の蛍光値 が対応する第二の試料の蛍光値を上回るか、または（２）補正した第三の試料の 蛍光値が正であり、且つ補正した第四の試料の蛍光値が補正した第三の試料の蛍 光値を上回るときには、 １００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞を含む、と結論される。 第四の部分を前記と同様に分析するときには、短時間は約５分未満であること ができ、且つ約２〜５分であることができる。第二の時間は、約１時間〜約４時 間であることができる。第三の時間は、約２時間〜約５時間であることができ、 但し第三の時間は第二の時間より約１時間以上長い。 第四の時間は、約３時間〜約５時間であることができるが、但し第四の時間は 第三の時間より約１時間以上長い。 好ましい態様では、第一の時間は約２分〜約５分の範囲にあることができ、第 二の時間は約２時間、第三の時間は約４時間、及び第四の時間は約６時間とする ことができる。 第一の時間は、約５分未満とすることができ、第二の時間は約１〜２時間、第 三の時間は約３時間〜約５時間の範囲とし、第四の時間は約４時間〜約５時間の 範囲とし、但し、第三の時間は第二の時間より少なくとも約１時間長く、第四の 時間は第三の時間より少なくとも約１時間長い。第二の時間及び第三の時間は、 少なくとも約１時間だけ異なるようにすることができ、第三の時間及び第四の時 間を少なくとも約１時間だけ、第二の時間と第四の時間を少なくとも約２時間だ け異なるようにすることができる。 前記と同様に、調整した試料の蛍光値は、対応するコントロール蛍光値を試料 の蛍光値から引くことによって得ることができ、補正した試料の蛍光値も、補正 因子を調整した試料の蛍光値から引くことによって得ることができる。 作動媒質を設けたときには、前記態様のいずれでも、作動媒質は、水、４−メ チル−ウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシド、ペプトン約．４６重量％〜． ５４重量％、酵母エキス約．２６重量％〜．３４重量％、酵素誘発剤約．４重量 ％〜．６重量％、塩約．７３重量％〜．７７重量％、ピルビン酸塩約．４８重量 ％〜．５２重量％、界面活性剤約．０１重量％〜．０３重量％、及び胆汁酸塩約 ．００９重量％〜．０１１重量％を含むものとして定義することもできる。 酵素誘発剤はラクトースでもよく、界面活性剤はラウリル硫酸ナトリウムでも よく、また塩はＮａＣｌでもよい。作動媒質は、４−メチルウンベリフェロン− β−Ｄ−グルクロニド約．００４重量％〜．００６重量％を含むこともできる。 前記に詳細に説明したように本発明のもう一つの態様では、第二の試料容器及 び第二のコントロール容器を、約２０〜３０分間インキュベーションする。補正 した第二の試料の蛍光値が正であるときには、原試料は１００ｍｌ当たり少なく とも１個の糞便大腸菌群細胞を含む（すなわち、「存在」が立証される）と、結 論される。また、この場合には、原試料は、１００ｍｌ当たり少なくとも２５個 の糞便大腸菌群細胞を含むと結論される。この態様では、短い第一の時間は約５ 分未満であることができ、約２〜約５分であることができる。 前記に詳細に説明したように本発明のもう一つの態様では、第二の試料容器及 び第二のコントロール容器を、約１時間インキュベーションすることができる。 補正した第二の試料の蛍光値が、少なくとも約０．０１マイクロモルの第二の試 料中の４−メチルウンベリフェロンのモル数に相当するときには、原試料は１０ ０ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むと結論することができる 。 本発明の総ての態様において、原液体または液化試料が１００ｍｌ当たり少な くとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むかどうかの測定に用いられる重要な組成物 は、水、４−メチル−ウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシド及び乾燥媒質の 水性混合物を含むことができる。この水性混合物は、ペプトン約．４６重量％〜 ．５４重量％、酵母エキス約．２６重量％〜．３４重量％、酵素誘発剤約．４重 量％〜．６重量％、塩約．７３重量％〜．７７重量％、ピルビン酸塩約．４８重 量％〜．５２重量％、洗剤約．０１重量％〜．０３重量％、及び胆汁酸塩約．０ ０９重量％〜．０１１重量％を含むこともできる。 ペプトンはプロテオースペプトンＮｏ．３であることができ、酵素誘発剤はラ クトース、塩はＮａＣｌ、洗剤はラウリル硫酸ナトリウムであることができる。 混合物に添加される媒質は、第二の蛍光原基質として４−メチルウンベリ−フェ ロン−β−Ｄ−グルクロニドを含むこともできる。この混合物は、４−メチルウ ンベリフェロン−β−Ｄ−グルクロニド約．００４重量％〜．００６重量％を含 むこともできる。 水と混合し且つ４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシドのある量 と混合するための組成物は、乾燥形態でペプトン約１７重量％〜２１重量％、酵 母エキス約１０重量％〜１４重量％、酵素誘発剤約１５重量％〜２４重量％、塩 約２８重量％〜３０重量％、ピルビン酸塩約１８重量％〜２１重量％、洗剤約０ ．３重量％〜１．２重量％、及び胆汁酸塩約０．３重量％〜０．５重量％を含む ことができる。ペプトンはプロテオースペプトンＮｏ．３であることができ、酵 素誘発剤はラクトース、塩はＮａＣｌ、洗剤はラウリル硫酸ナトリウムであるこ とができる。この媒質は、第二の蛍光原基質として４−メチルウンベリ−フェロ ン−β−Ｄ−グルクロニドを含むこともでき、４−メチルウンベリフェロン−β −Ｄ−グルクロニドは媒質の約．１重量％〜．３重量％であることができる。 例 図１は、本発明の図解的態様において、１０００ｍｌの原液体試料を１０個に ほぼ等しく分割することを表している。これらの１００ｍｌの部分のそれぞれを 、．４５μｍのMilliporeフィルターのような微孔性フィルターで濾過する。フ ィ ルターの２個を、本明細書に開示した作動媒質を含む栄養寒天培地上に置くこと ができる。他の８個のフィルターを、液体作動媒質約５〜１０ｍｌを含む容器に 入れる。８個の試料容器（及び使用した場合には培養プレート）を、約４４．５ ℃±．２℃の水槽のようなインキュベーターに入れる。作動または試薬媒質を含 むコントロールを、同時にインキュベーションする。同時に、ブランク容器（ブ ランク媒質のみを含む）及びキャリブレーション用の標準（ブランク媒質及び４ −メチルウンベリフェロンを含む）をインキュベーションする。 試料容器の対を、インキュベーション期間中に所定の間隔または時間で取り出 す。第一のインキュベーション時間は短時間であり、通常は約２〜５分間である 。これは、「ゼロ試料」とも表すことができる。この短期間に、フィルターまた は試料中の細胞に既に含まれている無関係な蛍光性物質を媒質中に浸出すること ができるが、糞便大腸菌群細胞には短すぎて、４−メチルウンベリフェロンを有 意に産生し始めることはできない。別の対の試料を、２、４及び６時間などの所 定の間隔のインキュベーションの後に取り出す。インキュベーションの後、Ｎａ ＯＨのようなアルカリ溶液を試料に加えて、４−メチルウンベリフェロンの検出 感度を増加させる。次いで、試料に光線を照射して、蛍光の放射について分析を 行う。ブランク容器、キャリブレーション標準及び試薬コントロールも、それぞ れの時間間隔で処理及び光線照射を行い、比較する。 総ての試料をインキュベーションし、光線を照射し、蛍光を検出した後、デー ターを解析する。蛍光分析装置は、ブランク容器及びキャリブレーション容器を 用いるそれぞれの段階で再度較正する。 試料蛍光値を、２個の試料対を平均することによって、それぞれの間隔または 時間について測定する。この特定の時間インキュベーションした試薬コントロー ル試料から得た蛍光値を試料蛍光値から引いて、調整した試料蛍光値を得る。こ のアルゴリズムを「ゼロ試料」について行うときには、調整した蛍光値は「補正 因子」であり、これを次に長時間インキュベーションした試料に適用する。それ ぞれの調整した試料の蛍光値を、これから補正因子を引くことによって補正して 、補正した試料または「真の」蛍光値を得る。 本発明のこの態様では、２時間の補正した蛍光（真の）値が正であるとき、及 び４時間の補正した蛍光値が正であり且つ２時間の値より大きいときには、糞便 大腸菌群細胞が原試料に存在する（すなわち、１個以上の糞便大腸菌群細胞／１ ００ｍｌ）と結論される。 ４時間の補正した蛍光値が正であるとき、及び６時間の補正した蛍光値が正で あり且つ４時間の値より大きいときには、糞便大腸菌群細胞が原試料に存在する （すなわち、１個以上の糞便大腸菌群細胞／１００ｍｌ）と結論される。 補正した試料の蛍光値が、補正した試料のいずれかの試料における４−メチル ウンベリフェロンの少なくとも約．０１マイクロモルのモル濃度に相当するとき には、糞便大腸菌群細胞が原試料中に存在する（すなわち、１個以上の糞便大腸 菌群細胞／１００ｍｌ）と結論される。図３は、標準の較正された蛍光尺度に対 してプロットした４−メチルウンベリフェロンのモル数の相関曲線を示す。２個 の連続増加する補正蛍光値がなく、または補正値が６時間後の４−メチルウンベ リフェロンの少なくとも約．０１マイクロモルのモル濃度に対応しない場合には 、糞便大腸菌群細胞は原試料中に存在しない（すなわち、糞便細胞の濃度は１０ ０ｍｌ当たり１個未満の糞便大腸菌群細胞である）と結論される。 培養プレート試料を、７時間インキュベーション期間の後に分析して、この結 論を確認することができる。 方法濾過 試験を行う液体の試料、例えば可能性のある飲料水の供給源、を提供する。こ の試料を、水及び廃水の標準的検査法（Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater） 、第１７版、米国公衆衛生協会、１９８９年、のSe ction9222Dに公表された膜濾過法に準じて濾過するのであり、この文献は、本明 細書では参考として引用されたものである。スクリーニングまたは存在−不在法 スクリーニング段階または存在−不在段階のため、フィルターを作動媒質を含 む試料容器に配置する。作動媒質は、ラクトースと、４−メチルウンベリフェロ ンの蛍光を増強することが本明細書で示されているラウリル硫酸ナトリウムであ る洗剤とを含んでいる（図４）。フィルターをインキュベーション管の壁に沿っ て置き、これが媒質中に浸されるようにする。 管を、約４４．５℃±．２℃の水槽などのインキュベーター中でインキュベー ションして、照射及び蛍光測定の直前に水槽から取り出す。試料を含む管を、所 定の波長にセットした紫外線光源を用いて照射する。存在−不在を測定する試料 を、１時間毎またはインキュベーションの開始から１、２、４及び６時間後の所 定の時間間隔で測定する。スクリーニングを行う試料は、約２０〜３０分間イン キュベーションした後、照射及び蛍光測定を行う。標準的な蛍光測定装置で測定 するため、３〜１０ｍｌの試料を、試薬１ｍｌ当たり１０Ｍ ＮａＯＨ約３３μ ｌと組み合わせる。 最初の読取りの前に、蛍光測定装置を準備して、最初にブランク及び内部キャ リブレーション標準（使用溶液）を４４．５℃に加温することによって較正する 。装置を、１００μｌの１０Ｍ ＮａＯＨと混合した３ｍｌのブランク媒質（Ｍ ＵＧａｌなし）で最初にゼロ（ゼロノブ）に調整した後、１００μｌの１０Ｍ ＮａＯＨと混合した３ｍｌの内部標準（０．２７μＭ ＭＵ）を用いて５００（ スパンノブ）に調整する。ゲインは１０００に設定する。Sequoia Turner社から 得た標準的蛍光測定装置、４５０−００３型、を用いた。 好ましい態様では、インキュベーターは水槽である。しかし、このインキュベ ーターは、安定なインキュベーション温度を維持することができ、容器表面と緊 密な物理的接触を保持する伝熱媒質を有するものであればどのような装置でもよ い。これには、水または油のような液体媒質を有するインキュベーター、及び固 体または金属伝熱媒質を有するブロックまたはシンクインキュベーターが挙げら れる。直接計数法 直接計数法では、フィルターを、直接計数板上の直接計数媒質の表面上に配置 する。調製した培養プレートを、防水プラスチックバッグに入れ、水槽に沈め、 ４４．５±０．２℃で約７時間±１５分間インキュベーションする。ペトリ皿を 沈めて、安定な温度条件が保持されるようにすることが重要である。 インキュベーション期間の後、培養プレートをインキュベーターから取り出し 、UVP．Inc．から市販されているような（UVL-21型）所定の波長の紫外線を照射 す る。次に、プレートを、蛍光を発している微細集落について観察する。好ましく は、ＮａＯＨのようなアルカリ性現像剤をフィルター上に噴霧し、青色蛍光コロ ニーの数を計数する。確認のため試験を行うことが所望な任意のコロニーは、ア ルカリ性現像剤の添加前に取り出さねばならない。装置及び供給物 ７時間直接計数法に用いる装置及び供給物としては、膜濾過装置（Sartorius 社から発売されているようなもの）、Haake社から発売されているSWB20型のよう な温度を約４４．５℃±０．２℃の一定に保持することができる水槽インキュベ ーター、超波長ＵＶ携帯ランプ（例えば、UVP．Inc．から発売されているUVL-21 ）、作動媒質、アルカリ性現像剤溶液、希釈水（例えば、０．１％滅菌ペプトン ）、プラスチックペトリ皿、膜フィルター（例えば、Millipore ０．４５μｍ、 グリッド付き）、４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシド （ＭＵＧａｌ）、９５％エタノール、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる 。 スクリーニングまたは存在−不在試験に用いられる装置及び供給物としては、 膜濾過装置、温度約４４．５℃の一定に保持することができる水槽インキュベー ター、超波長ＵＶ携帯ランプ、作動媒質、希釈水（例えば、０．１％滅菌ペプト ン）、膜フィルター（例えば、０．４５μｍ、グリッド付き）、４−メチルウン ベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＧａｌ）、９５％エタノール、ラウ リル硫酸ナトリウム、蛍光測定装置、ブランク媒質、１０Ｍ ＮａＯＨの溶液、 滅菌インキュベーション管、及び４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）が挙 げられる。０．０２％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）溶液の調製 ０．１ｇのラウリル硫酸ナトリウムを、５００ｍｌの蒸留水に溶解する。１２ ０℃で１５分間オートクレーブ処理を行う。４−ＭＵ−β−Ｄ−ガラクトシド基剤溶液の調製 １．５ｍｌの９５％エタノールを０．０３７５ｇｋＭＵＧａｌに加え、２分間 激しく振盪する。次に、２８．５ｍｌの０．０２％滅菌ＳＬＳ（ラウリル硫酸ナ トリウム）を加え、十分に混合する。管を基剤溶液と共に６０°〜８０℃に加熱 して、溶解する。好ましくは、これは、それぞれの試験について新たに調製する 。直接計数用のプレートの調製 １２．９２５ｇの作動媒質を、５００ｍｌの滅菌した蒸留水中で再水和する。 ｐＨを２０℃で７．３に調整する。５．０ｇの寒天を媒質に加え、沸点近くまで 加熱して、寒天を溶解する。加熱を中止して、約７０℃まで冷却し、２０ｍｌの ＭＵＧａｌ溶液を媒質に加える。媒質を４５〜５０℃に冷却する。５〜７ｍｌを プラスチックペトリ皿に分配して、直接計数プレートを生成する。完成した媒質 を４℃で保存し、好ましくは１４日後には未使用の媒質は総て廃棄する。液体作動媒質の調製 作動媒質（好ましい組成は表１に示す）の１２．９２５ｇを、５００ｍｌの滅 菌した蒸留水中で再水和する。ｐＨを２０℃で７．３に調整する。媒質を沸点近 くまで加熱し、加熱を中止する。約７０℃まで冷却し、ＭＵＧａｌ溶液２０ｍｌ を媒質に加える。媒質を４５℃以下に冷却する。媒質約１５ｍｌを滅菌試験管に 採取して、試料容器を生成する。 ブランク媒質の調製 ２５．８０ｇのブランク媒質（好ましい組成は表２に示す）を１０００ｍｌの 滅菌蒸留水に再水和する。ｐＨを２０℃で７．３に調整し、媒質を濾過滅菌する 。 内部キャリブレーション用標準の調製 最初に、４−ＭＵ ６ｍｇをブランク媒質（ＭＵＧａｌなし）５００ｍｌに溶 解することによって、６８．１μｍ ＭＵ保存溶液を調製する。新たな保存溶液 を、２週間毎に調製する。保存溶液１ｍｌを、ブランク媒質で２５０ｍｌに希釈 し、ワーキング溶液（０．２７μｍ ＭＵ）を調製する。これは、キャリブレー ション標準として用いる。新たなワーキング溶液は、１週間毎に調製するのが好 ましい。 スクリーニング、存在−不在及び直接計数法は、試験者が所望な情報によって 、別個、同時または逐次的に行うことができる。例えば、スクリーニング法は、 単独で用いて多数の水試料を高汚染についてスクリーニングすることができた。 存在−不在法を用いて、大腸菌濃度の疑問のある水試料を同定することもできた 。直接計数法を用いて、特定の水試料中の糞便大腸菌の存在を別個に確認するこ とができた。これらの方法は、組み合わせて用いることもできた。例えば、水試 料 は、スクリーニング法及び直接計数法によって、または存在−不在法及び直接計 数法によって、または存在−不在法及び直接計数法によって、同時に試験するこ とができた。最後に、試料は、スクリーニング法、存在−不在法及び直接計数法 を同時に行うことによって試験することができた。 本発明の結果を、下記のデーターセットによって示す。 データーセット１ 米国の表層水中の糞便大腸菌群の自然の存在数を、本発明の方法を用いて、及 び標準的方法ｍ−ＦＣ２４時間法を用いて評価した。モノカシー川、メリーラン ド、米国からの水を１９９２年３月２６日に収集して、本発明を用いて糞便大腸 菌について分析した。方法は、前記した通りであった。３種類の希釈液を、２回 ずつ試験した。試料は、前記と同様にしてインキュベーションした。ｍ−ＦＣ試 料は、２４時間で計数した。迅速検出法試料の蛍光を、「ゼロ時」、２、４及び ６時間後にTurner４５０−００３型蛍光測定装置を用いて測定した。励起及び発 光波長は、それぞれ３６５及び４６５ｎｍであった。結果及び討論 結果を、図５に示す。１、３及び３４ ＦＣ／１００ｍｌに相当する総ての希 釈液は、正（＋）の結果を生じ、糞便細菌の存在を示している。最低カウント数 、１ＦＣ／１００ｍｌは、６時間後に正として検出され、３ＦＣ／１００ｍｌは ２時間後に正として検出され、３４ＦＣ／１００ｍｌは≦２時間で検出された。 従って、この例では、最低カウント数では、存在は６時間で確認された。次に低 いカウント数（３ＦＣ／１００ｍｌ）では、存在は２時間後に確認され、最高の カウント数（３４ＦＣ／１００ｍｌ）では、存在は２時間で確認され、測定を行 っていたとしたならば、２０分程度でも恐らく確認されたであろう。 データーセット２ 下水汚染のある及び下水汚染のないノルウェーの表層水中の糞便大腸菌群の自 然の存在数を、この例では本発明の方法及び標準的ｍ−ＦＣ２４時間法を用いて 分析した。オルソーのアケール川、ノルウェー、を１９９２年４月３日に収集し 、本発明を用いて糞便大腸菌群について分析した。３種類の試料、河川水、及び 未処理の家庭排水の２段階の量を加えた河川水、を試験した。前記と同様にして 調 製した試料を、４４．５℃の水槽でインキュベーションした。ｍ−ＦＣ試料は、 ２４時間後に計数した。迅速検出法での蛍光を、「ゼロ時」、２、４及び６時間 後にTurner４５０−００３型蛍光測定装置を用いて測定した。励起及び発光波長 は、それぞれ３６５及び４６５ｎｍであった。結果を、図６に示す。１１、９０ 及びＴＮＴＣに相当する総ての３個の試料は、正（＋）の結果を生じ、糞便大腸 菌群の存在を立証した。総ての結果は、≦２時間以内で正となった。１時間のイ ンキュベーション間隔の後に測定を行ったならば、ＴＮＴＣ細胞／１００ｍｌ及 び９０細胞／１００ｍｌ試料は恐らく正となったであろう。１１細胞試料は、１ ．５時間のインキュベーション程度で正となったであろう。 データーセット３ 数種類の表層水中の糞便大腸菌群の自然存在数を、この例では本発明の方法及 び標準的ｍ−ＦＣ２４時間法を用いて分析した。モノカシー川、アケール川及び ロイザ川からの新鮮な試料を収集し、毎日分析した。また、「最悪事例」の１試 料も、EPA Guide，Standard and Protocol for Testing Microbiological Water Purifiers（1987）に準じて調製した。これらの試料の物理的パラメーター及び 組成を、表３に示す。 総ての試料は、２回ずつ試験した。試料を４４．５℃の水槽でインキュベーシ ョンし、前記のようにして調製した。ｍ−ＦＣ試料は２４時間後に計数した。迅 速検出法試料の蛍光を、「ゼロ時」、２、４及び６時間後にTurner４５０−００ ３型蛍光測定装置を用いて測定した。励起及び発光波長は、それぞれ３６５及び ４６５ｎｍであった。 結果を、表４にまとめてある。本発明の方法を用いる糞便大腸菌群の存在／不 在測定は、＋／−として示してある。補正蛍光値（０〜５００のスケール）及び 最も早い正の「存在」検出時間（２〜６時間）を記録している。 ＞１０ＦＣ／１００ｍｌを有する総ての試料に対する正の結果は、≦２時間で 測定した（試料１、４、７、１０、１１、１２及び１５）。１〜１０ＦＣ／１０ ０ｍｌを含む試料は、２〜６時間で正となった（試料２、５、６、８、１３及び １４）。また、７時間直接計数法は、総ての場合に標準的ｍ−ＦＣ２４時間法と 近い一致を示している。ＴＮＴＣとは、本明細書で用いるときには、「数が多す ぎて計測不能」を意味する。 本明細書に引用した総ての特許明細書または公表文献は、本明細書では参照す ることにより本明細書中に取り込まれるものである。 本明細書に記載の本発明の態様、または本明細書記載の態様の要素の一部、ま たは本明細書記載の方法の段階または段階の順序では、下記の請求の範囲に定義 される本発明の精神及び範囲から離反することなしに、変更を行うことができる 。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年６月２６日 【補正内容】 請求の範囲 １． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり１個未満または少なく とも１個の糞便大腸菌群細胞を含むことを結論するための迅速存在−不在法にお いて、 （ａ）原試料の第一の部分を第一のフィルター上で濾過して、第一の部分にお ける生きている糞便大腸菌群を濃縮し、原試料の第二の部分を第二のフィルター 上で濾過して、第二の部分における生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、 （ｂ）β−ガラクトシダーゼで代謝すると、蛍光原生成物を生じる蛍光原基質 を有する作動媒質を提供して、 （ｃ）第一の試料容器と第二の試料容器を提供して、 （ｄ）第一のフィルターを第一の試料容器中の作動媒質の第一の所定量に暴露 し、第二のフィルターを第二の試料容器中の作動媒質の第二の所定量に暴露し、 （ｅ）インキュベーション手段を提供し、 （ｆ）第一の試料容器を第一の時間、第二の試料容器を第二の時間インキュベ ーションし、第一の時間は約１〜５時間の範囲にあり、第二の時間は約２〜６時 間の範囲内であり、但し、第二の時間は第一の時間より少なくとも約１時間長く 、 （ｇ）第一の試料容器の内容物のｐＨを、第一の時間の後にアルカリ性ｐＨに 調整し、 （ｈ）ｐＨを調整した後、第一の試料容器に、所定の励起波長の光線を照射し 、 （ｉ）第二の時間の後、第二の試料容器の内容物のｐＨをアルカリ性ｐＨに調 整し、 （ｊ）ｐＨを調整した後、第二の試料容器に所定の励起波長の光線を照射し、 （ｋ）それぞれの照射段階の後、第一の試料容器からの第一の試料蛍光値及び 第二の試料容器からの第二の試料蛍光値を測定し、 （ｌ）第一の試料蛍光値を所定の方法で補正して、補正した第一の試料蛍光値 を得て、 （ｍ）第二の試料蛍光値を所定の方法で補正して、補正した第二の試料蛍光値 を得て、 （ｎ）補正した第一の試料蛍光値が正であり、補正した第二の試料蛍光値が正 であり且つ補正した第一の試料蛍光値以下であるときには、原試料は１００ｍｌ 当たり１個未満の糞便大腸菌群細胞を含むと結論し、補正した第一の試料蛍光値 が正であり、補正した第二の試料蛍光値が正であり且つ補正した第一の試料蛍光 値を上回るときには、原試料は、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便大腸菌 群細胞を含むと結論することを特徴とする、方法。 ２． 原試料の少なくとも第三の部分を、作動媒質を含む寒天媒質上で培養し 、培地をインキュベーション手段中で約７時間インキュベーションし、インキュ ベーション時間の後、培地に、所定の励起波長を照射し、培地上に見える微細集 落の数を計測することを含んでなる、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３． 微細集落の前に、アルカリ性溶液を微細集落に適用して蛍光を増強する ことをも含む、請求の範囲第２項に記載の方法。 ４． 作動媒質がさらに（１）生きている糞便大腸菌群細胞の代謝を支持する 栄養、 （２）蛍光原基質と反応して蛍光原生成物を生成するのに有効な酵素の産生を 誘発する誘発剤、及び （３）蛍光を増強するのに有効な界面活性剤 をも含む、請求の範囲第１項に記載の方法。 ５． 誘発剤がラクトースであり、蛍光を増強するのに有効な界面活性剤がラ ウリル硫酸ナトリウムであり、酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであり、蛍光原 基質が４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシドであり、蛍光性部分 が４−メチルウンベリフェロンである、請求の範囲第４項に記載の方法。 ６． 媒質が、第二の蛍光原基質として４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ −グルクロニドも含む、請求の範囲第５項に記載の方法。 ７． 照射段階が、約４６５ｎｍの発光波長を生じる約３６５ｎｍの励起波長 を用いる、請求の範囲第１項に記載の方法。 ８． インキュベーション手段を提供する段階が更に、液体伝熱媒質を提供す ることを含む、請求の範囲第１項に記載の方法。 ９． 液状伝熱媒質が水である、請求の範囲第８項に記載の方法。 １０． 液状伝熱媒質が油である、請求の範囲第８項に記載の方法。 １１． インキュベーション手段を提供する段階が更に、固体の伝熱媒質を提 供することを含む、請求の範囲第１項に記載の方法。 １２． インキュベーション手段の固形伝熱媒質が金属である、請求の範囲第 １１項に記載の方法。 １３． アルカリ性ｐＨが１１を上回る、請求の範囲第１項に記載の方法。 １４． アルカリ性ｐＨが約１３である、請求の範囲第１３項に記載の方法。 １５． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり１個未満または少な くとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むことを結論するための迅速存在−不在法に おいて、 （ａ）原試料の第一の部分を第一のフィルター上で濾過して、第一の部分中で 生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、原試料の第二の部分を第二のフィルター 上で濾過して、生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、及び原試料の第三の部分 を第三のフィルター上で濾過して、第二の部分中で生きている糞便大腸菌群細胞 を濃縮し、原試料の第三の部分を第三のフィルター上で濾過して、第三の部分中 で生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、 （ｂ）β−ガラクトシダーゼによって代謝されて蛍光生成物を生じる蛍光原基 質を有する作動媒質を提供して、 （ｃ）第一のコントロール容器と、第二のコントロール容器と、第三のコント ロール容器とを提供して、それぞれの容器が所定量の作動媒質をその中に含み、 （ｄ）第一のフィルターを第一の試料容器中の第一の所定量の作動媒質に暴露 し、第二のフィルターを第二の試料容器中の第二の所定量の作動媒質に暴露し、 第三のフィルターを第三の試料容器中の第三の所定量の作動媒質に暴露し、 （ｅ）インキュベーション手段を提供し、 （ｆ）第一の試料容器と第一のコントロール容器とを短時間の第一の時間イン キュベーションし、 （ｇ）第一の試料容器の内容物及び第一のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第一の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｈ）ｐＨを調整した後、第一の試料容器及び第一のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｉ）第二の試料容器と第二のコントロール容器とを第二の時間インキュベー ションし、 （ｊ）第二の試料容器の内容物及び第二のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第二の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｋ）ｐＨを調整した後、第二の試料容器及び第二のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｌ）第三の試料容器と第三のコントロール容器とを第三の時間インキュベー ションし、 （ｍ）第三の試料容器の内容物及び第三のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第三の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｎ）ｐＨを調整した後、第三の試料容器及び第三のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｏ）それぞれの照射段階の後、第一の試料容器からの第一の試料蛍光値及び 第一のコントロール容器からの第一のコントロール蛍光値、第二の試料容器から の第二の試料蛍光値及び第二のコントロール容器からの第二コントロール蛍光値 、及び第三の試料容器からの第三の試料蛍光値及び第三のコントロール容器から の第三のコントロール蛍光値を測定し、 （ｐ）第一のコントロール蛍光値と第一の試料蛍光値を用いて、補正因子を得 て、 （ｑ）第二のコントロール蛍光値を用いて第二の試料蛍光値を調整して、調整 した第二の試料蛍光値を得て、 （ｒ）第三のコントロール蛍光値を用いて、第三の試料蛍光値を調整して、調 整した第三の試料蛍光値を得て、 （ｓ）補正因子を用いて、調整した第二の試料蛍光値を補正して、補正した第 二の試料蛍光値を得て、 （ｔ）補正因子を用いて、調整した第三の試料蛍光値を補正して、補正した第 三の試料蛍光値を得て、 （ｕ）補正した第二の試料蛍光値が正であり、補正した第三の試料蛍光値が正 であり且つ補正した第二の試料蛍光値以下であるときには、原試料は１００ｍｌ 当たり１個末満の糞便大腸菌群細胞を含むと結論し、捕正した第二の試料蛍光値 が正であり、補正した第三の試料蛍光値が正であり且つ補正した第二の試料蛍光 値を上回るときには、原試料は１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群 細胞を含むと結論する、 ことを特徴とする、方法。 １６． 作動媒質を含む寒天培地上で原試料の第四の部分を培養し、インキュ ベーション手段中で培養基を約７時間インキュベーションし、インキュベーショ ン期間の後、培養基に所定の励起波長を照射し、培養基上に見える微細集落の数 を計測することも含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。 １７． アルカリ溶液を微細集落に適用して、蛍光を増強した後、微細集落を 計数することをも含む、請求の範囲第１６項に記載の方法。 １８． 短時間が約５分未満である、請求の範囲第１５項に記載の方法。 １９． 第一の時間が約２〜５分である、請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２０． 第二の時間が約１時間〜約５時間である、請求の範囲第１５項に記載 の方法。 ２１． 第三の時間が約２時間〜約６時間であり、但し、第三の時間は第二の 時間より約１時間以上長い、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２２． 第一の時間が約２分〜約５分の範囲にあり、第二の時間が約１時間で あり、第三の時間が約２時間である、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２３． 第一の時間が約５分未満であり、第二の時間が約１時間であり、第三 の時間が約２時間〜約６時間である、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２４． 第一の時間が約５分未満であり、第二の時間が約２時間であり、第三 の時間が約４時間である、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２５． 第一の時間が約５分未満であり、第二の時間が約４時間であり、第三 の時間が約６時間である、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２６． 第二の時間及び第三の時間が、少なくとも約１時間だけ異なる、請求 の範囲第１５項に記載の方法。 ２７． 補正因子を得る段階が、第一のコントロール蛍光値を第一の試料蛍光 値から引くことをも含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２８． 調整した第二の試料蛍光値を得る段階が、第二のコントロール蛍光値 を第二の試料蛍光値から引くことをも含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２９． 補正した第二の試料蛍光値を得る段階が、補正因子を調整した第二の 試料蛍光値から引くことをも含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ３０． 作動媒質が（１）生きている糞便大腸菌群細胞の代謝を支持する栄養 、 （２）蛍光原基質と反応して蛍光原生成物を生成するのに有効な酵素の産生を 誘発する誘発剤、及び （３）蛍光を増強するのに有効な界面活性剤 をも含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ３１． 誘発剤がラクトースであり、蛍光を増強するのに有効な界面活性剤が ラウリル硫酸ナトリウムであり、酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであり、蛍光 原基質が４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシドであり、蛍光性部 分が４−メチルウンベリフェロンである、請求の範囲第３０項に記載の方法。 ３２． 媒質が、第二の蛍光原基質として４−メチルウンベリフェロン−β− Ｄ−グルクロニドも含む、請求の範囲第３１項に記載の方法。 ３３． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり１個未満または少な くとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むことを結論するための迅速存在−不在法に おいて、 （ａ）原試料の第一の部分を第一のフィルター上で濾過して、第一の部分中で 生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、原試料の第二の部分を第二のフィルター 上で濾過して、第二の部分中で生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、原試料の 第三の部分を第三のフィルター上で濾過して、第三の部分中で生きている糞便大 腸菌群細胞を濃縮し、及び原試料の第四の部分を第四のフィルター上で濾過して 、第四の部分中で生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、 （ｂ）β−ガラクトシダーゼで代謝すると蛍光生成物を生じる蛍光原基質を有 する作動媒質を提供して、 （ｃ）第一の試料容器と、第二の試料容器と、第三の試料容器と、第四の試料 容器と、第一のコントロール容器と、第二のコントロール容器と、第三のコント ロール容器と、第四のコントロール容器とを提供して、それぞれの容器が所定量 の作動媒質をその中に含み、 （ｄ）第一のフィルターを第一の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第二 のフィルターを第二の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第三のフィルター を第三の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第四のフィルターを第四の試料 容器に含まれる作動媒質中に入れ、 （ｅ）インキュベーション手段を提供し、 （ｆ）第一の試料容器と第一のコントロール容器とを短時間の第一の時間イン キュベーションし、 （ｇ）第一の試料容器の内容物及び第一のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第一の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｈ）ｐＨを調整した後、第一の試料容器及び第一のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｉ）第二の試料容器と第二のコントロール容器とを第二の時間インキュベー ションし、 （ｊ）第二の試料容器の内容物及び第二のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第二の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｋ）ｐＨを調整した後、第二の試料容器及び第二のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｌ）第三の試料容器と第三のコントロール容器とを第三の時間インキュベー ションし、 （ｍ）第三の試料容器の内容物及び第三のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第三の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｎ）ｐＨを調整した後、第三の試料容器及び第三のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｏ）第四の試料容器と第四のコントロール容器とを、第四の時間インキュベ ーションし、 （ｐ）第四の時間の後、第四の試料容器の内容物と第四のコントロール容器の 内容物とのｐＨを調整して、アルカリ性ｐＨとし、 （ｑ）ｐＨを調整した後、第四の試料容器及び第四のコントロール容器を所定 の励起波長の光線で照射し、 （ｒ）それぞれの照射段階の後、第一の試料容器からの第一の試料蛍光値及び 第一のコントロール容器からの第一のコントロール蛍光値、第二の試料容器から の第二の試料蛍光値及び第二のコントロール容器からの第二コントロール蛍光値 、第三の試料容器からの第三の試料蛍光値及び第三のコントロール容器からの第 三のコントロール蛍光値、及び第四の試料容器からの第四の試料蛍光値及び第四 のコントロール容器からの第四のコントロール蛍光値を測定し、 （ｓ）第一のコントロール蛍光値と第一の試料蛍光値を用いて、補正因子を得 て、 （ｔ）第二のコントロール蛍光値を用いて第二の試料蛍光値を調整して、調整 した第二の試料蛍光値を得て、 （ｕ）第三のコントロール蛍光値を用いて、第三の試料蛍光値を調整して、調 整した第三の試料蛍光値を得て、 （ｖ）第四のコントロール蛍光値を用いて、第四の試料蛍光値を調整して、調 整した第四の試料蛍光値を得て、 （ｗ）補正因子を用いて、調整した第二の試料蛍光値を補正して、補正した第 二の試料蛍光値を得て、 （ｘ）補正因子を用いて、調整した第三の試料蛍光値を補正して、補正した第 三の試料蛍光値を得て、 （ｙ）補正因子を用いて、調整した第四の試料蛍光値を補正して、補正した第 四の試料蛍光値を得て、 （ｚ）（１）補正した第二の試料蛍光値が正であり、補正した第三の試料蛍光 値が正であり且つ補正した第二の試料蛍光値以下であるか、または （２）補正した第三の試料蛍光値が正であり、補正した第四の試料蛍光値が正 であり、且つ補正した第三の試料蛍光値以下であるときには、 原試料は、１００ｍｌ当たり１個未満の糞便大腸菌群細胞を含むと結論し、また は （１）補正した第二の試料蛍光値が正であり、補正した第三の試料蛍光値が正 であり且つ補正した第二の試料蛍光値を上回るか、または （２）補正した第三の試料蛍光値が正であり、補正した第四の試料蛍光値が正 であり且つ補正した第三の試料蛍光値を上回るときには、 原試料は、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むと結論す ることを特徴とする、方法。 ３４． 短時間が約５分未満である、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ３５． 第一の時間が約２〜５分である、請求の範囲第３４項に記載の方法。 ３６． 第二の時間が約１時間〜約４時間である、請求の範囲第３３項に記載 の方法。 ３７． 第三の時間が約２時間〜約５時間であり、但し、第三の時間は、第二 の時間より約１時間以上長い、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ３８． 第四の時間約３時間〜約５時間であり、但し第四の時間は、第三の時 間より約１時間以上長い、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ３９． 第一の時間が約２分〜約５分の範囲にあり、第二の時間が約２時間で あり、第三の時間が４時間であり、第四の時間が約６時間である、請求の範囲第 ３３項に記載の方法。 ４０． 第一の時間が約５分未満であり、第二の時間が約１〜２時間であり、 第三の時間が約３時間〜約５時間の範囲にあり、第四の時間が約４時間〜約６時 間の範囲にあり、但し、第三の時間は第二の時間より少なくとも約１時間長く、 第四の時間は第三の時間より少なくとも約１時間長い、請求の範囲第３３項に記 載の方法。 ４１． 第二の時間と第三の時間とが少なくとも約１時間だけ異なり、第三の 時間と第四の時間とが少なくとも約１時間だけ異なり、第二の時間と第四の時間 とが少なくとも約２時間だけ異なる、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４２． 補正因子を得る段階が、第一のコントロール蛍光値を第一の試料蛍光 値から引くことをも含む、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４３． 調整した試料蛍光値を得る段階が、対応するコントロール蛍光値を試 料蛍光値から引くことをも含む、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４４． 補正した試料蛍光値を得る段階が、補正因子を、調整した試料蛍光値 から引くことをも含む、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４５． 原試料の第二の部分を作動媒質を含む寒天培地上で培養し、この培地 をインキュベーション手段中で約７時間インキュベーションし、インキュベーシ ョン期間の後、この培地に所定の励起波長を照射し、培地上に見える微細集落の 数を計測することをも含む、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４６． 微細集落にアルカリ溶液を適用して蛍光を増強した後、微細集落を計 数することをも含む、請求の範囲第４５項に記載の方法。 ４７． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり１個未満または少な くとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むことを結論するための迅速存在−不在法に おいて、 （ａ）原試料の第一の部分を第一のフィルター上で濾過して、第一の部分中で 生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、原試料の第二の部分を第二のフィルター 上で濾過して、第二の部分中で生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、原試料の 第三の部分を第三のフィルター上で濾過して、第三の部分中で生きている糞便大 腸菌群細胞を濃縮し、 （ｂ）水、４−メチル−ウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシド、及び ペプトン約．４６重量％〜．５４重量％、 酵母エキス約．２６重量％〜．３４重量％、 酵素誘発剤約．４重量％〜．６重量％、 塩約．７３重量％〜．７７重量％、 ピルビン酸塩約．４８重量％〜．５２重量％、 界面活性剤約．０１重量％〜．０３重量％、及び 胆汁酸塩約．００９重量％〜．０１１重量％ を含んでなる作動媒質を提供して、 （ｃ）第一の試料容器と、第二の試料容器と、第三の試料容器と、第一のコン トロール容器と、第二のコントロール容器と、第三のコントロール容器とを提供 して、それぞれの容器が所定量の作動媒質をその中に含み、 （ｄ）第一のフィルターを第一の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第二 のフィルターを第二の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第三のフィルター を第三の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、 （ｅ）インキュベーション手段を提供し、 （ｆ）第一の試料容器と第一のコントロール容器とを短時間の第一の時間イン キュベーションし、 （ｇ）第一の試料容器の内容物及び第一のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第一の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｈ）ｐＨを調整した後、第一の試料容器及び第一のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｉ）第二の試料容器と第二のコントロール容器とを第二の時間インキュベー ションし、 （ｊ）第二の試料容器の内容物及び第二のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第二の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｋ）ｐＨを調整した後、第二の試料容器及び第二のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｌ）第三の試料容器と第三のコントロール容器とを第三の時間インキュベー ションし、 （ｍ）第三の試料容器の内容物及び第三のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第三の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｎ）ｐＨを調整した後、第三の試料容器及び第三のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｏ）それぞれの照射段階の後に、第一の試料容器からの第一の試料蛍光値及 び第一のコントロール容器からの第一のコントロール蛍光値、第二の試料容器か らの第二の試料蛍光値及び第二のコントロール容器からの第二のコントロール蛍 光値、及び第三の試料容器からの第三の試料蛍光値及び第三のコントロール容器 からの第三のコントロール蛍光値を測定し、 （ｐ）第一のコントロール蛍光値と第一の試料蛍光値を用いて、補正因子を得 て、 （ｑ）第二のコントロール蛍光値を用いて第二の試料蛍光値を調整して、調整 した第二の試料蛍光値を得て、 （ｒ）第三のコントロール蛍光値を用いて、第三の試料蛍光値を調整して、調 整した第三の試料蛍光値を得て、 （ｓ）補正因子を用いて、調整した第二の試料蛍光値を補正して、補正した第 二の試料蛍光値を得て、 （ｔ）補正因子を用いて、調整した第三の試料蛍光値を補正して、補正した第 三の試料蛍光値を得て、 （ｕ）補正した第二の試料蛍光値が正であり、補正した第三の試料蛍光値が正 であり且つ補正した第二の試料蛍光値以下であるときには、原試料は、１００ｍ ｌ当たり１個未満の糞便大腸菌群細胞を含むと結論し、及び補正した第二の試料 蛍光値が正であり、補正した第三の試料蛍光値が正であり且つ補正した第二の試 料蛍光値を上回るときには、原試料は、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便 大腸菌群細胞を含むと結論することを特徴とする、方法。 ４８． 原試料の第二の部分を作動媒質を含む寒天培地上で培養し、この培地 をインキュベーション手段中で約７時間インキュベーションし、インキュベーシ ョン期間の後、この培地に所定の励起波長を照射し、培地上に見える微細集落の 数を計測することをも含む、請求の範囲第４７項に記載の方法。 ４９． 微細集落にアルカリ溶液を適用して蛍光を増強した後、微細集落を計 数することをも含む、請求の範囲第４８項に記載の方法。 ５０． 酵素誘発剤がラクトースであり、界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウ ムであり、誘発材によって誘導される酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであり、 塩がＮａＣｌである、請求の範囲第４７項に記載の方法。 ５１．作動媒質が、４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−グルクロニド約． ００４重量％〜．００６重量％をも含む、請求の範囲第４７項に記載の方法。 ５２． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞 便大腸菌群細胞を含むことを結論するための迅速存在−不在法において、 （ａ）原試料の第一の部分を第一のフィルター上で、原試料の第二の部分を第 二のフィルター上で濾過して、生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、 （ｂ）蛍光原基質を有する作動媒質を提供して、蛍光生成物を生成させ、 （ｃ）第一の試料容器と、第二の試料容器と、第一のコントロール容器と、第 二のコントロール容器とを提供して、それぞれの容器が所定量の作動媒質をその 中に含み、 （ｄ）第一のフィルターを第一の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第二 のフィルターを第二の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、 （ｅ）伝熱媒質を有するインキュベーション手段であって、媒質がその中に配 置されたそれぞれの容器と緊密な物理的接触を保持するものを提供し、 （ｆ）第一の試料容器と第一のコントロール容器とを短時間の第一の時間イン キュベーションし、 （ｇ）第一の試料容器の内容物及び第一のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第一の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｈ）ｐＨを調整した後、第一の試料容器及び第一のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｉ）第二の試料容器と第二のコントロール容器とを、約２０〜３０分間の第 二の時間インキュベーションし、 （ｊ）第二の試料容器の内容物及び第二のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第二の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｋ）ｐＨを調整した後、第二の試料容器及び第二のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｌ）それぞれの照射段階の後に、第一の試料容器からの第一の試料蛍光値及 び第一のコントロール容器からの第一のコントロール蛍光値、及び第二の試料容 器からの第二の試料蛍光値及び第二のコントロール容器からの第二のコントロー ル蛍光値を測定し、 （ｍ）第一のコントロール蛍光値と第一の試料蛍光値を用いて、補正因子を得 て、 （ｎ）第二のコントロール蛍光値を用いて第二の試料蛍光値を調整して、調整 した第二の試料蛍光値を得て、 （ｏ）補正因子を用いて、調整した第二の試料蛍光値を補正して、補正した第 二の試料蛍光値を得て、 （ｐ）補正した第二の試料蛍光値が正であるときには、原試料は、１００ｍｌ 当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むと結論する、 ことを特徴とする、方法。 ５３． 糞便大腸菌群の存在／不在試験に用いる組成物であり、第一の試料蛍 光値が正であり、第一の試料より長い所定時間インキュベーションする第二の試 料が、正であり且つ第一の試料蛍光値以下である第二の試料蛍光値を有するとき には、１００ｍｌ当たり１個未満の糞便大腸菌群細胞が測定され、及び第一の試 料蛍光値が正であり、第一の試料より長い所定時間インキュベーションする第二 の試料が、正であり且つ第一の試料蛍光値を上回る第二の試料蛍光値を有すると きには、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞が測定され、水、 ４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシド及び媒質を含んでなる組成 物において、媒質が更に、 ペプトン約．４６重量％〜．５４重量％、 酵母エキス約．２６重量％〜．３４重量％、 酵素誘発剤約．４重量％〜．６重量％、 塩約．７３重量％〜．７７重量％、 ピルビン酸塩約．４８重量％〜．５２重量％、 洗剤約．０１重量％〜．０３重量％、及び 胆汁酸塩約．００９重量％〜．０１１重量％ を含んでなることを特徴とする、組成物。 ５４． ペプトンがプロテオースペプトンＮｏ．３であり、酵素誘発剤がラク トースであり、塩がＮａＣｌであり、洗剤がラウリル硫酸ナトリウムである、請 求の範囲第５３項に記載の方法。 ５５． 媒質が、第二の蛍光原基質として４−メチルウンベリフェロン−β− Ｄ−グルクロニドをも含む、請求の範囲第５３項に記載の方法。 ５６．作動媒質が、４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−グルクロニド約． ００４重量％〜．００６重量％をも含む、請求の範囲第５５項に記載の方法。 ５７． 糞便大腸菌群の存在／不在試験に用いる組成物であり、第一の試料蛍 光値が正であり、第一の試料より長い所定時間インキュベーションする第二の試 料が、正であり且つ第一の試料蛍光値以下である第二の試料蛍光値を有するとき には、１００ｍｌ当たり１個未満の糞便大腸菌群細胞が測定され、及び第一の試 料蛍光値が正であり、第一の試料より長い所定時間インキュベーションする第二 の試料が、正であり且つ第一の試料蛍光値を上回る第二の試料蛍光値を有すると きには、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞が測定され、水と 混合し、ある量の４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシドと組み合 わせると、存在／不在試験に用いる媒質を提供する組成物において、組成物が、 ペプトン約１７重量％〜２１重量％、 酵母エキス約１０重量％〜１４重量％、 酵素誘発剤約１５重量％〜２４重量％、 塩約２８重量％〜３０重量％、 ピルビン酸塩約１８重量％〜２１重量％、 洗剤約０．３重量％〜１．２重量％、及び 胆汁酸塩約０．３重量％〜０．５重量％ を含んでなることを特徴とする、組成物。 ５８． ペプトンがプロテオースペプトンＮｏ．３であり、酵素誘発剤がラク トースであり、塩がＮａＣｌであり、洗剤がラウリル硫酸ナトリウムである、請 求の範囲第５７項に記載の方法。 ５９． 媒質が更に、第二の蛍光原基質として４−メチルウンベリフェロン− β−Ｄ−グルクロニドを含む、請求の範囲第５８項に記載の方法。 ６０． 作動媒質が更に、４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−グルクロニ ド約．１重量％〜．３重量％を含む、請求の範囲第５９項に記載の方法。 ６１． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり１個未満または少な くとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むことを確認するための迅速直接計数法であ って、糞便大腸菌群の存在／不在試験で用いる迅速な直接計数法であり、第一の 試料蛍光値が正であり、第一の試料より長い所定時間インキュベーションする第 二の試料が、正であり且つ第一の試料蛍光値以下である第二の試料蛍光値を有す るときには、不在の決定がなされ、及び第一の試料蛍光値が正であり、第二の試 料が、正であり且つ第一の試料蛍光値を上回る第二の試料蛍光値を有するときに は、存在の決定がなされ、 （ａ）原試料の一部をフィルター上で濾過し、 （ｂ）ペプトン約．４６重量％〜．５４重量％、 酵母エキス約．２６重量％〜．３４重量％、 酵素誘発剤約．４重量％〜．６重量％、 塩約．７３重量％〜．７７重量％、 ピルビン酸塩約．４８重量％〜．５２重量％、 洗剤約．０１重量％〜．０３重量％、及び 胆汁酸塩約．００９重量％〜．０１１重量％ を含んでなり、更に４−メチルウンベリフェロンを蛍光生成物として生成するた め、ある量の４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシドを含んで成る 作動物質を含む培地を提供し、 （ｃ）フィルターを培地と接触させ、培地は容器内に入れられており、 （ｄ）伝熱媒質を有するインキュベーション手段であって、媒質がその中に配 置されたそれぞれの容器と緊密な物理的接触を保持するものを提供し、 （ｅ）培養容器を約７時間の時間インキュベーションし、 （ｆ）インキュベーション時間の後、培養容器に、所定の励起波長の光線を照 射し、 （ｇ）少なくとも１個の蛍光性微細集落が見えるときには、原試料は、１００ ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むと結論し、蛍光正微細集落 が培養容器上に見えないときには、１００ｍｌ当たり１個未満の糞便大腸菌群細 胞を含むと結論することを特徴とする、方法。 ６２． 原試料の第二の部分を作動媒質を含む寒天培地上で培養し、培地をイ ンキュベーション手段中で約７時間インキュベーションし、インキュベーション 時間の後、培地に所定の励起波長を照射し、培地上に見える微細集落の数を計測 することをも含む、請求の範囲第５９項に記載の方法。 ６３． アルカリ溶液を微細集落に適用し、蛍光を増強した後、微細集落を計 数することをも含む、請求の範囲第６２項に記載の方法。 ６４． 媒質が更に、４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−グルクロニドを 第二の蛍光原物質として含む、請求の範囲第５９項に記載の方法。 ６５． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり１個未満または少な くとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むことを結論するための迅速存在−不在法に おいて、 （ａ）原試料の第一の部分を第一のフィルター上で濾過して、第一の部分中で 生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、原試料の第二の部分を第二のフィルター 上で濾過して、生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、 （ｂ）β−ガラクトシダーゼによって代謝されると、蛍光性生成物を生じる蛍 光原基質を有する作動媒質を提供して、 （ｃ）第一の試料容器と、第二の試料容器とを提供して、 （ｄ）第一のフィルターを第一の試料容器中の作動媒質の第一の所定量に暴露 し、第二のフィルターを第二の試料容器中の作動媒質の第二の所定量に暴露し、 （ｅ）インキュベーション手段を提供し、 （ｆ）第一の試料容器を所定の第一の時間、及び第二の試料容器を、第一の時 間より長い所定の第二の時間インキュベーションし、 （ｇ）第一の試料容器の内容物のｐＨを、第一の時間の後にアルカリ性ｐＨに 調整し、 （ｈ）ｐＨを調整した後、第一の試料容器に、所定の励起波長の光線を照射し 、 （ｉ）第二の試料容器の内容物のｐＨを、第二の時間の後にアルカリ性ｐＨに 調整し、 （ｊ）ｐＨを調整した後、第二の試料容器及び第二のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｋ）それぞれの照射段階の後に、第一の試料容器からの第一の試料蛍光値、 及び第二の試料容器からの第二の試料蛍光値を測定し、 （ｌ）第一の試料蛍光値を所定の方法で補正して、補正した第一の試料蛍光値 を得て、 （ｍ）第二の試料蛍光値を所定の方法で補正して、補正した第二の試料蛍光値 を得て、 （ｎ）補正した第一の試料蛍光値が正であり、補正した第二の試料蛍光値が正 であり且つ補正した第一の試料蛍光値以下であるときには、原試料は、１００ ｍｌ当たり１個未満の糞便大腸菌群細胞を含むと結論し、補正した第一の試料蛍 光値が正であり、補正した第二の試料蛍光値が正であり且つ補正した第一の試料 蛍光値を上回るときには、原試料は、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便大 腸菌群細胞を含むと結論することを特徴とする、方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便 大腸菌群細胞を含むことを結論するための迅速存在−不在法において、 （ａ）原試料の第一の部分を第一のフィルター上で、原試料の第二の部分を第 二のフィルター上で濾過して、生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、 （ｂ）蛍光原基質を有する作動媒質を提供して、蛍光生成物を生成させ、 （ｃ）第一の試料容器と第二の試料容器を提供して、それぞれの容器が所定量 の作動媒質をその中に含み、 （ｄ）第一のフィルターを第一の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第二 のフィルターを第二の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、 （ｅ）伝熱媒質を有するインキュベーション手段であって、媒質がその中に配 置されたそれぞれの容器と緊密な物理的接触を保持するものを提供し、 （ｆ）第一の試料容器を第一の時間、第二の試料容器を第二の時間インキュベ ーションし、第一の時間は約１〜５時間の範囲内であり、第二の時間は約２〜６ 時間の範囲内であり、但し、第三の時間は第一の時間より少なくとも約１時間長 く、 （ｇ）第一の試料容器の内容物のｐＨを、第一の時間の後にアルカリ性ｐＨに 調整し、 （ｈ）ｐＨを調整した後、第一の試料容器及び第一のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｉ）第二の時間の後、第二の試料容器の内容物のｐＨをアルカリ性ｐＨに調 整し、 （ｊ）ｐＨを調整した後、第二の試料容器に所定の励起波長の光線を照射し、 （ｋ）それぞれの照射段階の後、第一の試料容器からの第一の試料蛍光値及び 第二の試料容器からの第二の試料蛍光値を測定し、 （ｌ）補正因子を得て、 （ｍ）第一の試料蛍光値を調整して、調整した第一の試料蛍光値を得て、 （ｎ）第二の試料蛍光値を調整して、調整した第二の試料蛍光値を得て、 （ｏ）補正因子を用いて、調整した第一の試料蛍光値を補正して、補正した第 一の試料蛍光値を得て、 （ｐ）補正因子を用いて、調整した第二の試料蛍光値を補正して、補正した第 二の試料蛍光値を得て、 （ｑ）補正した第一の試料蛍光値が正であり、補正した第二の試料蛍光値が正 であり且つ補正した第一の試料蛍光値を上回るときには、原試料は１００ｍｌ当 たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むと結論する、 ことを特徴とする、方法。 ２． 原試料の少なくとも第三の部分を、作動媒質を含む寒天媒質上で培養し 、培地をインキュベーション手段中で約７時間インキュベーションし、インキュ ベーション時間の後、培地に、所定の励起波長を照射し、培地上に見える微細集 落の数を計測することを含んでなる、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３． アルカリ性溶液を微細集落に適用して蛍光を増強した後、微細集落を計 測する、請求の範囲第２項に記載の方法。 ４． 作動媒質がさらに、（１）生きている糞便大腸菌群細胞の代謝を支持す る栄養、 （２）蛍光原基質と反応して蛍光原生成物を生成するのに有効な酵素の産生を 誘発する誘発剤、及び （３）蛍光を増強するのに有効な界面活性剤 をも含む、請求の範囲第１項に記載の方法。 ５． 誘発剤がラクトースであり、蛍光を増強するのに有効な界面活性剤がラ ウリル硫酸ナトリウムであり、酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであり、蛍光原 基質が４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシドであり、蛍光性部分 が４−メチルウンベリフェロンである、請求の範囲第４項に記載の方法。 ６． 媒質が、第二の蛍光原基質として４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ −グルクロニドも含む、請求の範囲第５項に記載の方法。 ７． 照射段階が、約４６５ｎｍの発光波長を生じる約３６５ｎｍの励起波長 を用いる、請求の範囲第１項に記載の方法。 ８． インキュベーション手段の伝熱媒質が液体である、請求の範囲第１項に 記載の方法。 ９． 液状伝熱媒質が水である、請求の範囲第８項に記載の方法。 １０． 液状伝熱媒質が油である、請求の範囲第８項に記載の方法。 １１． インキュベーション手段の伝熱媒質が固体である、請求の範囲第１項 に記載の方法。 １２． インキュベーション手段の固形伝熱媒質が金属である、請求の範囲第 １１項に記載の方法。 １３． アルカリ性ｐＨが１１を上回る、請求の範囲第１項に記載の方法。 １４． アルカリ性ｐＨが約１３である、請求の範囲第１３項に記載の方法。 １５． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞 便大腸菌群細胞を含むことを結論するための迅速存在−不在法において、 （ａ）原試料の第一の部分を第一のフィルター上で、原試料の第二の部分を第 二のフィルター上で、及び原試料の第三の部分を第三のフィルター上で濾過して 、生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、 （ｂ）蛍光原基質を有する作動媒質を提供して、蛍光原生成物を生成させ、 （ｃ）第一の試料容器と、第二の試料容器と、第三の試料容器と、第一のコン トロール容器と、第二のコントロール容器と、第三のコントロール容器とを提供 して、それぞれの容器が所定量の作動媒質をその中に含み、 （ｄ）第一のフィルターを第一の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第二 のフィルターを第二の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第三のフィルター を第三の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、 （ｅ）伝熱媒質を有するインキュベーション手段であって、媒質がその中に配 置されたそれぞれの容器と緊密な物理的接触を保持するものを提供し、 （ｆ）第一の試料容器と第一のコントロール容器とを短時間の第一の時間イン キュベーションし、 （ｇ）第一の試料容器の内容物及び第一のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第一の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｈ）ｐＨを調整した後、第一の試料容器及び第一のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｉ）第二の試料容器と第二のコントロール容器とを第二の時間インキュベー ションし、 （ｊ）第二の試料容器の内容物及び第二のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第二の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｋ）ｐＨを調整した後、第二の試料容器及び第二のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｌ）第三の試料容器と第三のコントロール容器とを第三の時間インキュベー ションし、 （ｍ）第三の試料容器の内容物及び第三のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第三の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｎ）ｐＨを調整した後、第三の試料容器及び第三のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｏ）それぞれの照射段階の後、第一の試料容器からの第一の試料蛍光値及び 第一のコントロール容器からの第一のコントロール蛍光値、第二の試料容器から の第二の試料蛍光値及び第二のコントロール容器からの第二コントロール蛍光値 、及び第三の試料容器からの第三の試料蛍光値及び第三のコントロール容器から の第三のコントロール蛍光値を測定し、 （ｐ）第一のコントロール蛍光値と第一の試料蛍光値を用いて、補正因子を得 て、 （ｑ）第二のコントロール蛍光値を用いて第二の試料蛍光値を調整して、調整 した第二の試料蛍光値を得て、 （ｒ）第三のコントロール蛍光値を用いて、第三の試料蛍光値を調整して、調 整した第三の試料蛍光値を得て、 （ｓ）補正因子を用いて、調整した第二の試料蛍光値を補正して、補正した第 二の試料蛍光値を得て、 （ｔ）補正因子を用いて、調整した第三の試料蛍光値を補正して、補正した第 三の試料蛍光値を得て、 （ｕ）補正した第二の試料蛍光値が正であり、補正した第三の試料蛍光値が正 であり且つ補正した第二の試料蛍光値を上回るときには、原試料は１００ｍｌ当 たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むと結論する、 ことを特徴とする、方法。 １６． 作動媒質を含む寒天培地上で原試料の第四の部分を培養し、インキュ ベーション手段中で培養基を約７時間インキュベーションし、インキュベーショ ン期間の後、培養基に所定の励起波長を照射し、培養基上に見える微細集落の数 を計測することも含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。 １７． アルカリ溶液を微細集落に適用して、蛍光を増強した後、微細集落を 計数することをも含む、請求の範囲第１６項に記載の方法。 １８． 短時間が約５分未満である、請求の範囲第１５項に記載の方法。 １９． 第一の時間が約２〜５分である、請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２０． 第二の時間が約１時間〜約５時間である、請求の範囲第１５項に記載 の方法。 ２１． 第三の時間が約２時間〜約６時間であり、但し、第三の時間は第二の 時間より約１時間以上長い、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２２． 第一の時間が約２分〜約５分の範囲にあり、第二の時間が約１時間で あり、第三の時間が約２時間である、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２３． 第一の時間が約５分未満であり、第二の時間が約１時間であり、第三 の時間が約２時間〜約６時間である、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２４． 第一の時間が約５分未満であり、第二の時間が約２時間であり、第三 の時間が約４時間である、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２５． 第一の時間が約５分未満であり、第二の時間が約４時間であり、第三 の時間が約６時間である、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２６． 第二の時間及び第三の時間が、少なくとも約１時間だけ異なる、請求 の範囲第１５項に記載の方法。 ２７． 補正因子を得る段階が、さらに第一のコントロール蛍光値を第一の試 料蛍光値から引くことを含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２８． 調整した第二の試料蛍光値を得る段階が、さらに第二のコントロール 蛍光値を第二の試料蛍光値から引くことを含む、請求の範囲第１５項に記載の方 法。 ２９． 補正した第二の試料蛍光値を得る段階が、さらに補正因子を調整した 第二の試料蛍光値から引くことを含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ３０． 作動媒質がさらに（１）生きている糞便大腸菌群細胞の代謝を支持す る栄養、 （２）蛍光原基質と反応して蛍光原生成物を生成するのに有効な酵素の産生を 誘発する誘発剤、及び （３）蛍光を増強するのに有効な界面活性剤 をも含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ３１． 誘発剤がラクトースであり、蛍光を増強するのに有効な界面活性剤が ラウリル硫酸ナトリウムであり、酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであり、蛍光 原基質が４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシドであり、蛍光性部 分が４−メチルウンベリフェロンである、請求の範囲第３０項に記載の方法。 ３２． 媒質が、第二の蛍光原基質として４−メチルウンベリフェロン−β− Ｄ−グルクロニドも含む、請求の範囲第３1項に記載の方法。 ３３． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞 便大腸菌群細胞を含むことを結論するための迅速存在−不在法において、 （ａ）原試料の第一の部分を第一のフィルター上で、原試料の第二の部分を第 二のフィルター上で、原試料の第三の部分を第三のフィルター上で、及び原試料 の第四の部分を第四のフィルター上で濾過して、生きている糞便大腸菌群細胞を 濃縮し、 （ｂ）蛍光原基質を有する作動媒質を提供して、蛍光原生成物を生成させ、 （ｃ）第一の試料容器と、第二の試料容器と、第三の試料容器と、第四の試料 容器と、第一のコントロール容器と、第二のコントロール容器と、第三のコント ロール容器と、第四のコントロール容器とを提供して、それぞれの容器が所定量 の作動媒質をその中に含み、 （ｄ）第一のフィルターを第一の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第二 のフィルターを第二の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第三のフィルター を第三の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第四のフィルターを第四の試料 容器に含まれる作動媒質中に入れ、 （ｅ）伝熱媒質を有するインキュベーション手段であって、媒質がその中に配 置されたそれぞれの容器と緊密な物理的接触を保持するものを提供し、 （ｆ）第一の試料容器と第一のコントロール容器とを短時間の第一の時間イン キュベーションし、 （ｇ）第一の試料容器の内容物及び第一のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第一の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｈ）ｐＨを調整した後、第一の試料容器及び第一のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｉ）第二の試料容器と第二のコントロール容器とを第二の時間インキュベー ションし、 （ｊ）第二の試料容器の内容物及び第二のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第二の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｋ）ｐＨを調整した後、第二の試料容器及び第二のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｌ）第三の試料容器と第三のコントロール容器とを第三の時間インキュベー ションし、 （ｍ）第三の試料容器の内容物及び第三のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第三の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｎ）ｐＨを調整した後、第三の試料容器及び第三のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｏ）第四の試料容器と第四のコントロール容器とを、第四の時間インキュベ ーションし、 （ｐ）第四の時間の後、第四の試料容器の内容物と第四のコントロール容器の 内容物とのｐＨを調整して、アルカリ性ｐＨとし、 （ｑ）ｐＨを調整した後、第四の試料容器及び第四のコントロール容器を所定 の励起波長の光線で照射し、 （ｒ）それぞれの照射段階の後、第一の試料容器からの第一の試料蛍光値及び 第一のコントロール容器からの第一のコントロール蛍光値、第二の試料容器から の第二の試料蛍光値及び第二のコントロール容器からの第二コントロール蛍光値 、 第三の試料容器からの第三の試料蛍光値及び第三のコントロール容器からの第三 のコントロール蛍光値、及び第四の試料容器からの第四の試料蛍光値及び第四の コントロール容器からの第四のコントロール蛍光値を測定し、 （ｓ）第一のコントロール蛍光値と第一の試料蛍光値を用いて、補正因子を得 て、 （ｔ）第二のコントロール蛍光値を用いて第二の試料蛍光値を調整して、調整 した第二の試料蛍光値を得て、 （ｕ）第三のコントロール蛍光値を用いて、第三の試料蛍光値を調整して、調 整した第三の試料蛍光値を得て、 （ｖ）第四のコントロール蛍光値を用いて、第四の試料蛍光値を調整して、調 整した第四の試料蛍光値を得て、 （ｗ）補正因子を用いて、調整した第二の試料蛍光値を補正して、補正した第 二の試料蛍光値を得て、 （ｘ）補正因子を用いて、調整した第三の試料蛍光値を補正して、補正した第 三の試料蛍光値を得て、 （ｙ）補正因子を用いて、調整した第四の試料蛍光値を補正して、補正した第 四の試料蛍光値を得て、 （ｚ）（１）補正した第二の試料蛍光値が正であり、補正した第三の試料蛍光 値が補正した第二の試料蛍光値を上回るとき、または （２）補正した第三の試料蛍光値が正であり、補正した第四の試料蛍光値が補 正した第三の試料蛍光値を上回るときには、 原試料は、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むと結論す る、 ことを特徴とする、方法。 ３４． 短時間が約５分未満である、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ３５． 第一の時間が約２〜５分である、請求の範囲第３４項に記載の方法。 ３６． 第二の時間が約１時間〜約４時間である、請求の範囲第３３項に記載 の方法。 ３７． 第三の時間が約２時間〜約５時間であり、但し、第三の時間は、第二 の時間より約１時間以上長い、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ３８． 第四の時間約３時間〜約５時間であり、但し第四の時間は、第三の時 間より約１時間以上長い、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ３９． 第一の時間が約２分〜約５分の範囲にあり、第二の時間が約２時間で あり、第三の時間が４時間であり、第四の時間が約６時間である、請求の範囲第 ３３項に記載の方法。 ４０． 第一の時間が約５分未満であり、第二の時間が約１〜２時間であり、 第三の時間が約３時間〜約５時間の範囲にあり、第四の時間が約４時間〜約６時 間の範囲にあり、但し、第三の時間は第二の時間より少なくとも約１時間長く、 第四の時間は第三の時間より少なくとも約１時間長い、請求の範囲第３３項に記 載の方法。 ４１． 第二の時間と第三の時間とが少なくとも約１時間だけ異なり、第三の 時間と第四の時間とが少なくとも約１時間だけ異なり、第二の時間と第四の時間 とが少なくとも約２時間だけ異なる、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４２． 補正因子を得る段階が、第一のコントロール蛍光値を第一の試料蛍光 値から引くことをも含む、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４３． 調整した試料蛍光値を得る段階が、対応するコントロール蛍光値を試 料蛍光値から引くことをも含む、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４４． 補正した試料蛍光値を得る段階が、補正因子を、調整した試料蛍光値 から引くことをも含む、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４５． 原試料の第二の部分を作動媒質を含む寒天培地上で培養し、この培地 をインキュベーション手段中で約７時間インキュベーションし、インキュベーシ ョン期間の後、この培地に所定の励起波長を照射し、培地上に見える微細集落の 数を計測することをも含む、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４６． 微細集落にアルカリ溶液を適用して蛍光を増強した後、微細集落を計 数することをも含む、請求の範囲第４５項に記載の方法。 ４７． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞 便大腸菌群細胞を含むことを結論するための迅速存在一不在法において、 （ａ）原試料の第一の部分を第一のフィルター上で、原試料の第二の部分を第 二のフィルター上で、原試料の第三の部分を第三のフィルター上で濾過して、生 きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、 （ｂ）水、４−メチル−ウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシド、及び ペプトン約．４６重量％〜．５４重量％、 酵母エキス約．２６重量％〜．３４重量％、 酵素誘発剤約．４重量％〜．６重量％、 塩約．７３重量％〜．７７重量％、 ピルビン酸塩約．４８重量％〜．５２重量％、 界面活性剤約．０１重量％〜．０３重量％、及び 胆汁酸塩約．００９重量％〜．０１１重量％ を含んでなる作動媒質を提供して、 （ｃ）第一の試料容器と、第二の試料容器と、第三の試料容器と、第一のコン トロール容器と、第二のコントロール容器と、第三のコントロール容器とを提供 して、それぞれの容器が所定量の作動媒質をその中に含み、 （ｄ）第一のフィルターを第一の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第二 のフィルターを第二の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第三のフィルター を第三の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、 （ｅ）伝熱媒質を有するインキュベーション手段であって、媒質がその中に配 置されたそれぞれの容器と緊密な物理的接触を保持するものを提供し、 （ｆ）第一の試料容器と第一のコントロール容器とを短時間の第一の時間イン キュベーションし、 （ｇ）第一の試料容器の内容物及び第一のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第一の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｈ）ｐＨを調整した後、第一の試料容器及び第一のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｉ）第二の試料容器と第二のコントロール容器とを第二の時間インキュベー ションし、 （ｊ）第二の試料容器の内容物及び第二のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第二の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｋ）ｐＨを調整した後、第二の試料容器及び第二のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｌ）第三の試料容器と第三のコントロール容器とを第三の時間インキュベー ションし、 （ｍ）第三の試料容器の内容物及び第三のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第三の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｎ）ｐＨを調整した後、第三の試料容器及び第三のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｏ）それぞれの照射段階の後に、第一の試料容器からの第一の試料蛍光値及 び第一のコントロール容器からの第一のコントロール蛍光値、第二の試料容器か らの第二の試料蛍光値及び第二のコントロール容器からの第二のコントロール蛍 光値、及び第三の試料容器からの第三の試料蛍光値及び第三のコントロール容器 からの第三のコントロール蛍光値を測定し、 （ｐ）第一のコントロール蛍光値と第一の試料蛍光値を用いて、補正因子を得 て、 （ｑ）第二のコントロール蛍光値を用いて第二の試料蛍光値を調整して、調整 した第二の試料蛍光値を得て、 （ｒ）第三のコントロール蛍光値を用いて、第三の試料蛍光値を調整して、調 整した第三の試料蛍光値を得て、 （ｓ）補正因子を用いて、調整した第二の試料蛍光値を補正して、補正した第 二の試料蛍光値を得て、 （ｔ）補正因子を用いて、調整した第三の試料蛍光値を補正して、補正した第 三の試料蛍光値を得て、 （ｕ）補正した第二の試料蛍光値が正であり、補正した第三の試料蛍光値が補 正した第二の試料蛍光値を上回るときには、原試料は、１００ｍｌ当たり少なく とも１個の糞便大腸菌群細胞を含むと結論する、 ことを特徴とする、方法。 ４８． 原試料の第二の部分を作動媒質を含む寒天培地上で培養し、この培地 をインキュベーション手段中で約７時間インキュベーションし、インキュベーシ ョン期間の後、この培地に所定の励起波長を照射し、培地上に見える微細集落の 数を計測することをも含む、請求の範囲第４７項に記載の方法。 ４９． 微細集落にアルカリ溶液を適用して蛍光を増強した後、微細集落を計 数することをも含む、請求の範囲第４８項に記載の方法。 ５０． 酵素誘発剤がラクトースであり、界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウ ムであり、誘発材によって誘導される酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであり、 塩がＮａＣｌである、請求の範囲第４７項に記載の方法。 ５１． 作動媒質が、４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−グルクロニド約 ．００４重量％〜．００６重量％をも含む、請求の範囲第４７項に記載の方法。 ５２． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞 便大腸菌群細胞を含むことを結論するための迅速存在−不在法において、 （ａ）原試料の第一の部分を第一のフィルター上で、原試料の第二の部分を第 二のフィルター上で濾過して、生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、 （ｂ）蛍光原基質を有する作動媒質を提供して、蛍光生成物を生成させ、 （ｃ）第一の試料容器と、第二の試料容器と、第一のコントロール容器と、第 二のコントロール容器とを提供して、それぞれの容器が所定量の作動媒質をその 中に含み、 （ｄ）第一のフィルターを第一の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第二 のフィルターを第二の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、 （ｅ）伝熱媒質を有するインキュベーション手段であって、媒質がその中に配 置されたそれぞれの容器と緊密な物理的接触を保持するものを提供し、 （ｆ）第一の試料容器と第一のコントロール容器とを短時間の第一の時間イン キュベーションし、 （ｇ）第一の試料容器の内容物及び第一のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第一の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｈ）ｐＨを調整した後、第一の試料容器及び第一のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｉ）第二の試料容器と第二のコントロール容器とを、約２０〜３０分間の第 二の時間インキュベーションし、 （ｊ）第二の試料容器の内容物及び第二のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第二の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｋ）ｐＨを調整した後、第二の試料容器及び第二のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｌ）それぞれの照射段階の後に、第一の試料容器からの第一の試料蛍光値及 び第一のコントロール容器からの第一のコントロール蛍光値、及び第二の試料容 器からの第二の試料蛍光値及び第二のコントロール容器からの第二のコントロー ル蛍光値を測定し、 （ｍ）第一のコントロール蛍光値と第一の試料蛍光値を用いて、補正因子を得 て、 （ｎ）第二のコントロール蛍光値を用いて第二の試料蛍光値を調整して、調整 した第二の試料蛍光値を得て、 （ｏ）補正因子を用いて、調整した第二の試料蛍光値を補正して、補正した第 二の試料蛍光値を得て、 （ｐ）補正した第二の試料蛍光値が正であるときには、原試料は、１００ｍｌ 当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むと結論する、 ことを特徴とする、方法。 ５３． 結論段階が、原試料が、１００ｍｌ当たり少なくとも２５個の糞便大 腸菌群細胞を含むと結論することをも含む、請求の範囲第５２項に記載の方法。 ５４． 短時間が約５分未満である、請求の範囲第５２項に記載の方法。 ５５． 短い第一の時間が約２〜約５分である、請求の範囲第５４項に記載の 方法。 ５６． 原試料の第二の部分を作動媒質を含む寒天培地上で培養し、この培地 をインキュベーション手段中で約７時間インキュベーションし、インキュベーシ ョン期間の後、この培地に所定の励起波長を照射し、培地上に見える微細集落の 数を計測することをも含む、請求の範囲第５２項に記載の方法。 ５７． 微細集落にアルカリ溶液を適用して蛍光を増強した後、微細集落を計 数することをも含む、請求の範囲第５６項に記載の方法。 ５８． 媒質が、第二の蛍光原基質として４−メチルウンベリフェロン−β− Ｄ−グルクロニドをも含む、請求の範囲第５２項に記載の方法。 ５９． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞 便大腸菌群細胞を含むことを結論するための迅速存在−不在法において、 （ａ）原試料の第一の部分を第一のフィルター上で、原試料の第二の部分を第 二のフィルター上で濾過して、生きている糞便大腸菌群細胞を濃縮し、 （ｂ）蛍光原基質を有する作動媒質を提供して、蛍光生成物を生成させ、 （ｃ）第一の試料容器と、第二の試料容器と、第一のコントロール容器と、第 二のコントロール容器とを提供して、それぞれの容器が所定量の作動媒質をその 中に含み、 （ｄ）第一のフィルターを第一の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、第二 のフィルターを第二の試料容器に含まれる作動媒質中に入れ、 （ｅ）伝熱媒質を有するインキュベーション手段であって、媒質がその中に配 置されたそれぞれの容器と緊密な物理的接触を保持するものを提供し、 （ｆ）第一の試料容器と第一のコントロール容器とを短時間の第一の時間イン キュベーションし、 （ｇ）第一の試料容器の内容物及び第一のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第一の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｈ）ｐＨを調整した後、第一の試料容器及び第一のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｉ）第二の試料容器と第二のコントロール容器とを、約１時間の第二の時間 インキュベーションし、 （ｊ）第二の試料容器の内容物及び第二のコントロール容器の内容物のｐＨを 、第二の時間の後にアルカリ性ｐＨに調整し、 （ｋ）ｐＨを調整した後、第二の試料容器及び第二のコントロール容器に、所 定の励起波長の光線を照射し、 （ｌ）それぞれの照射段階の後に、第一の試料容器からの第一の試料蛍光値及 び第一のコントロール容器からの第一のコントロール蛍光値、及び第二の試料容 器からの第二の試料蛍光値及び第二のコントロール容器からの第二のコントロー ル蛍光値を測定し、 （ｍ）第一のコントロール蛍光値と第一の試料蛍光値を用いて、補正因子を得 て、 （ｎ）第二のコントロール蛍光値を用いて第二の試料蛍光値を調整して、調整 した第二の試料蛍光値を得て、 （ｏ）補正因子を用いて、調整した第二の試料蛍光値を補正して、補正した第 二の試料蛍光値を得て、 （ｐ）補正した第二の試料蛍光値が、少なくとも約０．０１マイクロモルの第 二の試料中の４−メチルウンベリフェロンのモル数に相当するときには、原試料 は、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むと結論する、 ことを特徴とする、方法。 ６０． 短時間が約５分未満である、請求の範囲第５９項に記載の方法。 ６１． 第一の時間が約２〜約５分である、請求の範囲第６０項に記載の方法 。 ６２． 原試料の第二の部分を作動媒質を含む寒天培地上で培養し、この培地 をインキュベーション手段中で約７時間インキュベーションし、インキュベーシ ョン期間の後、この培地に所定の励起波長を照射し、培地上に見える微細集落の 数を計測することをも含む、請求の範囲第５９項に記載の方法。 ６３． 微細集落にアルカリ溶液を適用して蛍光を増強した後、微細集落を計 数することをも含む、請求の範囲第６２項に記載の方法。 ６４． 媒質が、第二の蛍光原基質として４−メチルウンベリフェロン−β− Ｄ−グルクロニドをも含む、請求の範囲第５９項に記載の方法。 ６５． 水、４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシド及び媒質を 含んでなる組成物において、原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり少 なくとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むかどうかを決定する試験に用い、媒質が 更に、 ペプトン約．４６重量％〜．５４重量％、 酵母エキス約．２６重量％〜．３４重量％、 酵素誘発剤約．４重量％〜．６重量％、 塩約．７３重量％〜．７７重量％、 ピルビン酸塩約．４８重量％〜．５２重量％、 洗剤約．０１重量％〜．０３重量％、及び 胆汁酸塩約．００９重量％〜．０１１重量％ を含んでなることを特徴とする、組成物。 ６６． ペプトンがプロテオースペプトンＮｏ．３であり、酵素誘発剤がラク トースであり、塩がＮａＣｌであり、洗剤がラウリル硫酸ナトリウムである、請 求の範囲第６５項に記載の方法。 ６７． 媒質が更に、第二の蛍光原基質として４−メチルウンベリフェロン− β−Ｄ−グルクロニドを含む、請求の範囲第６５項に記載の方法。 ６８． 作動媒質が更に、４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−グルクロニ ド約．００４重量％〜．００６重量％を含む、請求の範囲第６７項に記載の方法 。 ６９． 水と混合して、ある量の４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラ クトシドと組み合わせると、原液体または液化した試料が１００ｍｌ当たり少な くとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むかどうかを決定する試験に用いる媒質を提 供する組成物において、 ペプトン約１７重量％〜２１重量％、 酵母エキス約１０重量％〜１４重量％、 酵素誘発剤約１５重量％〜２４重量％、 塩約２８重量％〜３０重量％、 ピルビン酸塩約１８重量％〜２１重量％、 洗剤約０．３重量％〜１．２重量％、及び 胆汁酸塩約０．３重量％〜０．５重量％ を含んでなることを特徴とする、組成物。 ７０． ペプトンがプロテオースペプトンＮｏ．３であり、酵素誘発剤がラク トースであり、塩がＮａＣｌであり、洗剤がラウリル硫酸ナトリウムである、請 求の範囲第６９項に記載の方法。 ７１． 媒質が更に、第二の蛍光原基質として４−メチルウンベリフェロン− β−Ｄ−グルクロニドを含む、請求の範囲第７０項に記載の方法。 ７２． 作動媒質が更に、４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−グルクロニ ド約．１重量％〜．３重量％を含む、請求の範囲第７１項に記載の方法。 ７３． 原液体または液化した試料が、１００ｍｌ当たり少なくとも１個の糞 便大腸菌群細胞を含むことを結論するための迅速直接計数法において、 （ａ）原試料の一部をフィルター上で濾過して、生きている糞便大腸菌群細胞 を濃縮し、 （ｂ） ペプトン約．４６重量％〜．５４重量％、 酵母エキス約．２６重量％〜．３４重量％、 酵素誘発剤約．４重量％〜．６重量％、 塩約．７３重量％〜．７７重量％、 ピルビン酸塩約．４８重量％〜．５２重量％、 洗剤約．０１重量％〜．０３重量％、及び 胆汁酸塩約．００９重量％〜．０１１重量％ を含んでなり、更に４−メチルウンベリフェロンを蛍光生成物として生成するた め、ある量の４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトシドを含んで成る 作動媒質を含む培地を提供し、 （ｃ）フィルターを培地上に置き、培地は容器内に入れられており、 （ｄ）伝熱媒質を有するインキュベーション手段であって、媒質がその中に配 置されたそれぞれの容器と緊密な物理的接触を保持するものを提供し、 （ｅ）培養容器を約７時間の時間インキュベーションし、 （ｆ）インキュベーション時間の後、培養容器に、所定の励起波長の光線を照 射し、 （ｇ）培地上に見える微細集落の数を計測し、 （ｈ）少なくとも１個の蛍光性微細集落が見えるときには、原試料は、１００ ｍｌ当たり少なくとも１個の糞便大腸菌群細胞を含むと結論する、 ことを特徴とする、方法。 ７４． ペプトンがプロテオースペプトンＮｏ．３であり、酵素誘発剤がラク トースであり、塩がＮａＣｌであり、洗剤がラウリル硫酸ナトリウムである、請 求の範囲第７３項に記載の方法。 ７５． 作動物質が更に、４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−グルクロニ ド約．００４重量％〜．００６重量％を含む、請求の範囲第７３項に記載の方法 。 ７６． アルカリ溶液を微細集落に適用し、蛍光を増強した後、微細集落を計 数することをも含む、請求の範囲第７３項に記載の方法。