JPS5817598B2 - 微生物の迅速検出方法 - Google Patents
微生物の迅速検出方法Info
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- JPS5817598B2 JPS5817598B2 JP54140582A JP14058279A JPS5817598B2 JP S5817598 B2 JPS5817598 B2 JP S5817598B2 JP 54140582 A JP54140582 A JP 54140582A JP 14058279 A JP14058279 A JP 14058279A JP S5817598 B2 JPS5817598 B2 JP S5817598B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/10—Enterobacteria
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/06—Quantitative determination
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/20—Coumarin derivatives
- C12Q2334/22—4-Methylumbelliferyl, i.e. beta-methylumbelliferone, 4MU
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はラクトース分解性微生物、就中、大腸菌群を迅
速に検出する方法に関する。
速に検出する方法に関する。
近年、生鮮食品、加工食品を問わず、食品の微生物によ
る汚染を防止する必要性が社会的に強く求められるよう
になっており、食肉製品、清涼飲料、魚肉ねり製品など
の食品中には大腸菌群を含んではならないことが法的に
定められている。
る汚染を防止する必要性が社会的に強く求められるよう
になっており、食肉製品、清涼飲料、魚肉ねり製品など
の食品中には大腸菌群を含んではならないことが法的に
定められている。
従って加工食品を製造し、販売する場合には厳重な微生
物学的な品質管理が必要であり、これらの微生物を検査
することは極めて重要なこととなっている。
物学的な品質管理が必要であり、これらの微生物を検査
することは極めて重要なこととなっている。
しかし、加工食品の製造工程の微生物管理及び製品検査
のための微生物の検出には少なくとも２４時間以上を要
する。
のための微生物の検出には少なくとも２４時間以上を要
する。
もし、この検出のための時間が縮少出来れば食品衛生上
のトラブルの未然防止、食品製造工程の衛生管理上の問
題点の早期発見と早期対応等が可能となり、加工食品製
造の上でのメリットは極めて大きい。
のトラブルの未然防止、食品製造工程の衛生管理上の問
題点の早期発見と早期対応等が可能となり、加工食品製
造の上でのメリットは極めて大きい。
また、加工食品の製造に限らず化粧品や医薬品製造業お
よび多くの製造業での水質管理等、微生物検査を要する
分野が多いが何れの分野においても検査時間が短縮され
れば大きなメリットを生ずることは今更言うまでもない
。
よび多くの製造業での水質管理等、微生物検査を要する
分野が多いが何れの分野においても検査時間が短縮され
れば大きなメリットを生ずることは今更言うまでもない
。
従来行なわれている菌数検査法としては寒天平板塗抹法
、寒天平板混釈法、あるいは液体培地段階希釈法（最確
法）などが広く一般に用いられている。
、寒天平板混釈法、あるいは液体培地段階希釈法（最確
法）などが広く一般に用いられている。
これら従来法は何れも検体を一定の割合で希釈し栄養培
地に接種培養し、微生物の増殖が肉眼で判定出来るまで
生育させる必要がある為に、菌数測定に要する時間は最
低２４時間必要である。
地に接種培養し、微生物の増殖が肉眼で判定出来るまで
生育させる必要がある為に、菌数測定に要する時間は最
低２４時間必要である。
因みに食品衛生法で定められている大腸菌群の検査法は
食品により異なるが、乳糖ブイヨンまたはブリリアント
グリーン乳糖ブイヨン（ＢＧＬＥ）、デソキシコール酸
培地または遠藤培地などで２４時間（プラス・マイナス
２時間）培養し、そこで大腸菌群陽性と判定されないも
のはさらに４８時間（プラス・マイナス３時間）まで培
養を行って□判定を行なうと定められている。
食品により異なるが、乳糖ブイヨンまたはブリリアント
グリーン乳糖ブイヨン（ＢＧＬＥ）、デソキシコール酸
培地または遠藤培地などで２４時間（プラス・マイナス
２時間）培養し、そこで大腸菌群陽性と判定されないも
のはさらに４８時間（プラス・マイナス３時間）まで培
養を行って□判定を行なうと定められている。
また水質汚濁防止法では排水の大腸菌群数をデソキシコ
ール酸ナトリウムを含む寒天培地を用いて１８時間ない
し２０時間培養し出現した定型的集落数より求めること
が定められている。
ール酸ナトリウムを含む寒天培地を用いて１８時間ない
し２０時間培養し出現した定型的集落数より求めること
が定められている。
又、水質汚濁に係る環境、基準の保全のための大腸内細
菌群数を測定する方法としては昭和４６年１２月２８日
環境庁告示第５９号により最確法を用いて測定すること
が定められている。
菌群数を測定する方法としては昭和４６年１２月２８日
環境庁告示第５９号により最確法を用いて測定すること
が定められている。
この方法は１／１０に連続４段階希釈した検水を各々５
本ずつブＩＪ ＩＪアントグリーンラクトースブイヨン
（ＢＧＴ、Ｂ ）発酵管培地に移植し３５−３７℃で４
８時間（±３時間）培養後各希釈検体に何本ガスが発生
したかを調べ、最確数表を用いて検体１００ｍ１中の大
腸菌群を測定する方法で寒天平抹法などに比べて小数の
菌数を正確に測定する方法とされている。
本ずつブＩＪ ＩＪアントグリーンラクトースブイヨン
（ＢＧＴ、Ｂ ）発酵管培地に移植し３５−３７℃で４
８時間（±３時間）培養後各希釈検体に何本ガスが発生
したかを調べ、最確数表を用いて検体１００ｍ１中の大
腸菌群を測定する方法で寒天平抹法などに比べて小数の
菌数を正確に測定する方法とされている。
最近、微生物数を迅速に検出する方法としては、微生物
の増殖に併う培地のインピーダンスの変化。
の増殖に併う培地のインピーダンスの変化。
培養液のｐＨの変化、消費酸素量あるいは発生炭酸ガス
量等を測定し、これらと微生物数の相関から微生物数を
求める方法が研究されているが、何れの場合も、微生物
が培地１７ｒＬｌ当り１０５個以上にならないと検出が
出来ず、また、検体由来の非生物物質により上記の量は
変化することがあり、微生物の検出限界、検出精度の点
から満足出来る方法とはいえず実用化されるに至ってい
ない。
量等を測定し、これらと微生物数の相関から微生物数を
求める方法が研究されているが、何れの場合も、微生物
が培地１７ｒＬｌ当り１０５個以上にならないと検出が
出来ず、また、検体由来の非生物物質により上記の量は
変化することがあり、微生物の検出限界、検出精度の点
から満足出来る方法とはいえず実用化されるに至ってい
ない。
またこの他に、検体を直接顕微鏡観察し微生物数を求め
る方法もあるが、この場合、微生物の生死を識別出来な
いこと、検体由来の非微生物夾雑物と微生物の区別がつ
きにくいことなどから直接顕微鏡観察による微生物検出
方法も満足出来る方法とはいえない。
る方法もあるが、この場合、微生物の生死を識別出来な
いこと、検体由来の非微生物夾雑物と微生物の区別がつ
きにくいことなどから直接顕微鏡観察による微生物検出
方法も満足出来る方法とはいえない。
本発明者らはかかる事情に鑑み検体中の大腸菌群等のラ
クトース分解微生物を約８時間以内に検出する方法を開
発することを目的として鋭意研究を重ねた結果、ラクト
ース分解性微生物の生産する菌体内β−ガラクトシダー
ゼを４−ＭＵＧ（４−メチルーウンベリフエリルーβ−
Ｄ−ガラクトシド）に作用させ生ずる４−Ｍ’［Ｊ（４
−メチル−ウンベリフェロン）を検出又は測定すること
によりラクトース分解性微生物を迅速に測定できること
を見い出した。
クトース分解微生物を約８時間以内に検出する方法を開
発することを目的として鋭意研究を重ねた結果、ラクト
ース分解性微生物の生産する菌体内β−ガラクトシダー
ゼを４−ＭＵＧ（４−メチルーウンベリフエリルーβ−
Ｄ−ガラクトシド）に作用させ生ずる４−Ｍ’［Ｊ（４
−メチル−ウンベリフェロン）を検出又は測定すること
によりラクトース分解性微生物を迅速に測定できること
を見い出した。
更に研究を重ねた結果、培養液にβ−ガラクトシダーゼ
誘導物質を加えて培養するとβ−ガラクトシダーゼ活性
が増大すること、又微生物菌体を破壊又は溶菌させてβ
−ガラクトシダーゼを菌体外に溶出させることにより感
度が飛躍的に増大し、その結果として検体中に含まれる
１〜１０２個のラクトース分解性微生物を迅速に検出で
きることを見出し本発明を完成するに至った。
誘導物質を加えて培養するとβ−ガラクトシダーゼ活性
が増大すること、又微生物菌体を破壊又は溶菌させてβ
−ガラクトシダーゼを菌体外に溶出させることにより感
度が飛躍的に増大し、その結果として検体中に含まれる
１〜１０２個のラクトース分解性微生物を迅速に検出で
きることを見出し本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、一定量の検体を４−ＭＵ Ｇ溶液に加
えて反応するか、又はこれを栄養培地に加えて２〜６時
間培養してラクトース分解性を増殖せしめ、該微生物菌
体を４−Ｍ’ＵＧと反応し、反応液中の４−ＭＵの生成
の有無又はその生成量を測定することを骨子とするラク
トース分解性微生物の迅速検出方法である。
えて反応するか、又はこれを栄養培地に加えて２〜６時
間培養してラクトース分解性を増殖せしめ、該微生物菌
体を４−Ｍ’ＵＧと反応し、反応液中の４−ＭＵの生成
の有無又はその生成量を測定することを骨子とするラク
トース分解性微生物の迅速検出方法である。
本発明でラクトース分解性微生物と称しているのはラク
トースを分解する能力を有する一群の微生物で、ニジエ
リシャ属、シトロバククー属、サルモネラ属、クレブシ
ラ属、エンテロバクタ−属、セラチャ属などに分類され
るいわゆる大腸菌群にン属する微生物、ベチルス・メガ
テリウム等のグラム陽性桿菌、キャンタイダ・シードト
ロピカーリス等の酵母である。
トースを分解する能力を有する一群の微生物で、ニジエ
リシャ属、シトロバククー属、サルモネラ属、クレブシ
ラ属、エンテロバクタ−属、セラチャ属などに分類され
るいわゆる大腸菌群にン属する微生物、ベチルス・メガ
テリウム等のグラム陽性桿菌、キャンタイダ・シードト
ロピカーリス等の酵母である。
本発明で用いる栄養培地としては、従来から用いられて
いるラクトース分解性微生物の増殖に適フしたものであ
ればどのような培地でも良いが、生育速度の高い培地、
例えばバートインフュージョンブロス、ブイヨン培地等
が望ましい。
いるラクトース分解性微生物の増殖に適フしたものであ
ればどのような培地でも良いが、生育速度の高い培地、
例えばバートインフュージョンブロス、ブイヨン培地等
が望ましい。
検体中の特定の微生物、例えば大腸菌群のみを検出した
い時には、栄養培地にデソキシコール酸フナトリウム、
あるいは肝汁酸を添加し大腸菌群以外の微生物の生育を
抑制すれば良い。
い時には、栄養培地にデソキシコール酸フナトリウム、
あるいは肝汁酸を添加し大腸菌群以外の微生物の生育を
抑制すれば良い。
この他、培地に各種抗生物質又はアザイド類のような薬
剤を添加し、微生物のこれらに対する感受性又は抵抗性
の差を利用したり、更にこれらの手法を適宜組デ合せる
ことにより測定対象菌を選択的に測定することも可能で
ある。
剤を添加し、微生物のこれらに対する感受性又は抵抗性
の差を利用したり、更にこれらの手法を適宜組デ合せる
ことにより測定対象菌を選択的に測定することも可能で
ある。
検体中にラクトース分解性微生物が比較的多量例えば検
体１ｇ中に１０５個以上含まれている場合には、微生物
を増殖する操作は必要でなく、検ノ体を直接４−ＭＵＧ
と反応してラクトース分解性微生物を検出することがで
きる。
体１ｇ中に１０５個以上含まれている場合には、微生物
を増殖する操作は必要でなく、検ノ体を直接４−ＭＵＧ
と反応してラクトース分解性微生物を検出することがで
きる。
検体中の微生物含量が少ない場合には検体をそのまま又
は希釈して、検体が個形物であるか、又は固形物が含ま
れている場合にはホモゲナイズし５た後、上記培地に添
加して培養し微生物を増殖させる。
は希釈して、検体が個形物であるか、又は固形物が含ま
れている場合にはホモゲナイズし５た後、上記培地に添
加して培養し微生物を増殖させる。
培養は好気的条件下でも嫌気的条件下いずれでも良いが
、大腸菌群の場合には、好気的条件の方か生育速度が高
いので好気的条件の方が望ましい。
、大腸菌群の場合には、好気的条件の方か生育速度が高
いので好気的条件の方が望ましい。
培養温度は目的とするラクトース分解性微９生物が生育
できる範囲であれば良いが、目的とする微生物の生育至
適温度で培養することが望ましＧ）。
できる範囲であれば良いが、目的とする微生物の生育至
適温度で培養することが望ましＧ）。
又、病原性大腸菌を検出する目的の場合には生育温度の
差を利用して４３．５℃で培養すれば良い。
差を利用して４３．５℃で培養すれば良い。
ラクトース分解性微生物は上記培養によって菌体内にβ
−ガラクトシダーゼが生産されるが、検体中の微生物の
種類、状態あるいは存在数等によりβ−ガラクトシダー
ゼの生産が少ない場合が有るので、このような場合には
、β−ガラクトシダーゼ誘導物質、例えばラクトース・
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド（Ｉ
ＰＴＧ）、プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサ
イド（ＰＴＧ）あるいは４−Ｍ［ＪＧ等を培地に１０−
４Ｍ〜１０−２Ｍ程度添加すると良い。
−ガラクトシダーゼが生産されるが、検体中の微生物の
種類、状態あるいは存在数等によりβ−ガラクトシダー
ゼの生産が少ない場合が有るので、このような場合には
、β−ガラクトシダーゼ誘導物質、例えばラクトース・
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド（Ｉ
ＰＴＧ）、プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサ
イド（ＰＴＧ）あるいは４−Ｍ［ＪＧ等を培地に１０−
４Ｍ〜１０−２Ｍ程度添加すると良い。
短時間に高感度でラクトース分解性微生物を検出する本
発明の目的からこれら誘導物質を添加することが望まし
い。
発明の目的からこれら誘導物質を添加することが望まし
い。
β−ガラクトシダーゼは菌体内酵素であるが、菌体内に
β−ガラクトシダーゼが著量産生されている場合には本
酵素を菌体外に抽出する操作を行わなくても測定するこ
とができる。
β−ガラクトシダーゼが著量産生されている場合には本
酵素を菌体外に抽出する操作を行わなくても測定するこ
とができる。
しかし、本酵素を短時間内に高感度で測定又は検出する
ためには適当な手段を用いてβ−ガラクトシダーゼを菌
体外に溶出することが極めて効果的であり、β−ガラク
トシダーゼを菌体外に溶出することによって感度は１０
０倍以上に増大する。
ためには適当な手段を用いてβ−ガラクトシダーゼを菌
体外に溶出することが極めて効果的であり、β−ガラク
トシダーゼを菌体外に溶出することによって感度は１０
０倍以上に増大する。
β−ガラクトシダーゼを菌体外に溶出せしめる手段とし
ては公知の方法に従って行えば良く、菌体を物理的に破
壊するかあるいは自己消化法もしくは細胞壁溶解酵素を
用いる酵素分解法によって行われる。
ては公知の方法に従って行えば良く、菌体を物理的に破
壊するかあるいは自己消化法もしくは細胞壁溶解酵素を
用いる酵素分解法によって行われる。
物理的に破壊する方法としては超音波照射処理法やガラ
スピースを用いる細胞破砕法等が採用され、自己消化法
では培養液に０．５〜０．０％の自己消化促進剤、例え
ばソジウム・ラウリル・サルフェート等の界面活性剤、
トルエン、クロロホルム、酢酸エチル等の有機溶媒を加
えて３０〜５０℃で１０〜６０分間自己消化させる。
スピースを用いる細胞破砕法等が採用され、自己消化法
では培養液に０．５〜０．０％の自己消化促進剤、例え
ばソジウム・ラウリル・サルフェート等の界面活性剤、
トルエン、クロロホルム、酢酸エチル等の有機溶媒を加
えて３０〜５０℃で１０〜６０分間自己消化させる。
酵素分解法では、リゾチーム、細胞壁溶解酵素を加えて
３０〜５０℃で１０〜６０分間酵素反応を行うことによ
って行われる。
３０〜５０℃で１０〜６０分間酵素反応を行うことによ
って行われる。
本発明に用いられるβ−ガラクトシダーゼの基質として
は４−ＭＵ Ｇが用いられる。
は４−ＭＵ Ｇが用いられる。
本物質は非螢光性物質でβ−ガラクトシダーゼの作用に
より水解され、Ｄ−ガラクトースを遊離し４−Ｍ’［Ｊ
が生成される。
より水解され、Ｄ−ガラクトースを遊離し４−Ｍ’［Ｊ
が生成される。
４−Ｍ［Ｊは螢光性物質であり、３３０ ｎｍの波長で
励起されて、４５０ ｎｍの螢光を発する。
励起されて、４５０ ｎｍの螢光を発する。
４−ＭＵが１０−５Ｍ程度生成されれば、この螢光は肉
眼で充分認知できる。
眼で充分認知できる。
４−ＭＵの生成量がこれよりも少ない場合にはこれを螢
光光度計で測定することにより極めて高感度で４−ＭＵ
を検出することが出来る。
光光度計で測定することにより極めて高感度で４−ＭＵ
を検出することが出来る。
さらにこの際、測定系をアルカリ性にすることにより螢
光強度が増大しｐＨ１０，５ではｌＸ１０−８Ｍの４−
ＭＵを確実に検出することが出来る。
光強度が増大しｐＨ１０，５ではｌＸ１０−８Ｍの４−
ＭＵを確実に検出することが出来る。
β−ガラクトシダーゼの溶出と４−ＭＵＧとの反応は順
次別々に行われるが、これを同時に行うこともできる。
次別々に行われるが、これを同時に行うこともできる。
特に自己消化法や酵素分解法を採用する場合には反応に
時間を要するのでβ−ガラクトシダーゼの溶出と４−Ｍ
ＵＧとの反応を同時に行うことが望ましい。
時間を要するのでβ−ガラクトシダーゼの溶出と４−Ｍ
ＵＧとの反応を同時に行うことが望ましい。
４−ＭＵの検出限界は前述のように１０−” Ｍと極め
て微量であり、４−ＭＵＧの水解反応時間を長くすれば
更に微量酵素活性を測定できるが、酵素反応時間を延長
するよりも、培養時間を延長する方がトータルの測定時
間は短縮されるので、この氷解反応は短かい方が望まし
く通常３０〜６０分間で行われる。
て微量であり、４−ＭＵＧの水解反応時間を長くすれば
更に微量酵素活性を測定できるが、酵素反応時間を延長
するよりも、培養時間を延長する方がトータルの測定時
間は短縮されるので、この氷解反応は短かい方が望まし
く通常３０〜６０分間で行われる。
上記酵素反応に於て生成する４−ＭＵの量、即ち、β−
ガラクトシダーゼ活性は第１図に示すよ；うにラクトー
ス分解性微生物の菌数に良く比例している。
ガラクトシダーゼ活性は第１図に示すよ；うにラクトー
ス分解性微生物の菌数に良く比例している。
従ってβ−ガラクトシダーゼ活性から微生物の菌数を求
めることができる。
めることができる。
第１図に於てＡは酵素反応系にトルエンを０．５％添加
した時の４−Ｍ’Ｕと菌数の関係を示し、Ｂはトルエン
を添：加しない場合の関係を示す。
した時の４−Ｍ’Ｕと菌数の関係を示し、Ｂはトルエン
を添：加しない場合の関係を示す。
なお第１図の縦軸は４−ＭＵの生成量を示し横軸は大腸
菌（Ｋ−１２株）の菌数を示す。
菌（Ｋ−１２株）の菌数を示す。
第１図に示すように１０−７Ｍの４−ＭＵを生成せしめ
るβ−ガラクトシダーゼ活性は約１０３個の大腸菌に相
当する。
るβ−ガラクトシダーゼ活性は約１０３個の大腸菌に相
当する。
１ ｍｌの培ン地に１個のラクトース分解性菌が存在す
れば約５時間の培養で培養液１ｍｌ当り１０３個まで増
殖するから、本発明の方法では１個のラクトース分解性
菌を少くとも５時間の培養で測定でき、少くとも７時間
で検出することができる。
れば約５時間の培養で培養液１ｍｌ当り１０３個まで増
殖するから、本発明の方法では１個のラクトース分解性
菌を少くとも５時間の培養で測定でき、少くとも７時間
で検出することができる。
マ 上述のように、本発明は超微量の酵素活性を測定す
る螢光分析法を利用した微生物検出法であり、検体中の
微量のラクトース分解性菌の迅速な検出を可能ならしめ
るものである。
る螢光分析法を利用した微生物検出法であり、検体中の
微量のラクトース分解性菌の迅速な検出を可能ならしめ
るものである。
本発明の方法は食品、化粧品、医薬品あるいは環境保全
分野などで２広く利用できるものである。
分野などで２広く利用できるものである。
以下、実施例にて説明する。
実施例 １
大腸菌（ニジエリシャ・コＩＪＡＴｃｃ １０７９８に
−１２，）をブイヨン培地で３７℃、２０時間前培養し
、無菌水で５段階（１０〜１０５個／ ｍｌ ）に希釈
し、その各１．０ｍｌをイソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を１０−３Ｍ含有する
ブイヨン培地９．０ ｍｌに接種し、３７℃で１．０〜
６．０時間振盪培養した。
−１２，）をブイヨン培地で３７℃、２０時間前培養し
、無菌水で５段階（１０〜１０５個／ ｍｌ ）に希釈
し、その各１．０ｍｌをイソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を１０−３Ｍ含有する
ブイヨン培地９．０ ｍｌに接種し、３７℃で１．０〜
６．０時間振盪培養した。
この培養液２．０ｍｌに夫々、２０ μｉ）のトルエン
と２．０ｍｌの３×１０″Ｍの４−Ｍ’ＵＧを含むリン
酸緩衡液（０，０１Ｍ、ｐＨ７，０）を加え、３７℃で
６０分間反応を行った。
と２．０ｍｌの３×１０″Ｍの４−Ｍ’ＵＧを含むリン
酸緩衡液（０，０１Ｍ、ｐＨ７，０）を加え、３７℃で
６０分間反応を行った。
各反応液にｐＨ１１，０のＩＭグリシシン衡液を０．５
ｍｌ宛加え、３３０ ｎｍの波長の紫外線を照射して励
起させ、４５０ ｎｍに於ける螢光を螢光光度計で測定
し、β−ガラクトシダーゼの作用により生成した４−Ｍ
Ｕの量を測定した。
ｍｌ宛加え、３３０ ｎｍの波長の紫外線を照射して励
起させ、４５０ ｎｍに於ける螢光を螢光光度計で測定
し、β−ガラクトシダーゼの作用により生成した４−Ｍ
Ｕの量を測定した。
その結果を第１表に示す。
第１表中の大腸菌の菌数についてはブイヨン平板寒天培
地を用いる平板段階希釈法で４８時間培養して求めたも
のである。
地を用いる平板段階希釈法で４８時間培養して求めたも
のである。
第１表に示したように初発菌数が培地１０ｍ１当り１個
以上存在すれば２〜５時間の培養とその後、１時間のβ
−ガラクトシダーゼ酵素反応の合計６時間で検出が可能
である。
以上存在すれば２〜５時間の培養とその後、１時間のβ
−ガラクトシダーゼ酵素反応の合計６時間で検出が可能
である。
実施例 ２
ハート・インフュージョン・ブロス（ＨＩｔｍ地）、Ｈ
Ｉ培地に１０−３のＩＰＴＧ、ＰＴＧ又は１．０％のラ
クトースを添加した培地者１０ｍ１にニジエリシャ・コ
リＡＴＣＣ１０７９８を１０２個ずつ接種して５時間培
養し、夫々の培養液について菌数を調べたところ、１０
ｍＡ当りいずれも１．６Ｘ１０６個であった。
Ｉ培地に１０−３のＩＰＴＧ、ＰＴＧ又は１．０％のラ
クトースを添加した培地者１０ｍ１にニジエリシャ・コ
リＡＴＣＣ１０７９８を１０２個ずつ接種して５時間培
養し、夫々の培養液について菌数を調べたところ、１０
ｍＡ当りいずれも１．６Ｘ１０６個であった。
各培養液のβ−ガラクトシダーゼ活性を実施例１と同様
の方法で測定し、第２表の結果を得た。
の方法で測定し、第２表の結果を得た。
次に″、上記Ｈ１培地にＩＰＴＧを加えた培地を用いて
得られた培養液者２．０ ｍｌに２０μｌの酢酸エチル
を加え３５℃で６０分処理又は超音波処理（ＩＯＫＨ１
１０分間）し、これに２．０ ｍｌの４−Ｍ’［ＪＧ浴
溶液 ３Ｘ１０−３Ｍ、０．０１Ｍリン酸緩衡液）を加
え、３７°Ｃで６０分間反応し、生成する４−Ｍ’Ｕの
量を測定した。
得られた培養液者２．０ ｍｌに２０μｌの酢酸エチル
を加え３５℃で６０分処理又は超音波処理（ＩＯＫＨ１
１０分間）し、これに２．０ ｍｌの４−Ｍ’［ＪＧ浴
溶液 ３Ｘ１０−３Ｍ、０．０１Ｍリン酸緩衡液）を加
え、３７°Ｃで６０分間反応し、生成する４−Ｍ’Ｕの
量を測定した。
その結果を第３表に示す。
第２表および第３表の結果から、β−ガラクトシダーゼ
誘導物質無添加であっても、或は酵素の菌体外への抽出
操作を行なわなくとも初発菌数が多ければ測定すること
が出来るが、ＩＰＴＧやＰＴＧを加えることにより感度
が約１０倍に増大し、また、酢酸エチル処理や超音波処
理を加えることにより感度が１００倍に増大することか
ら初発菌数が少量の場合にはこれらの操作が有効である
ことがわかる。
誘導物質無添加であっても、或は酵素の菌体外への抽出
操作を行なわなくとも初発菌数が多ければ測定すること
が出来るが、ＩＰＴＧやＰＴＧを加えることにより感度
が約１０倍に増大し、また、酢酸エチル処理や超音波処
理を加えることにより感度が１００倍に増大することか
ら初発菌数が少量の場合にはこれらの操作が有効である
ことがわかる。
実施例 ３
河川水を夫々１０ｍ１．１ ｒｎｌ、 ０．１ ｍｌ！
、０．０１ ｍｌづつ各５本取りＩＰＴＧを１０＝Ｍと
デソキシコール酸ナトリウムを０．１％含有するハート
インフエージョン培地１０ｍ１に移植し３７℃で６時間
振盪培養し、実施例１に示した方法と同様の方法で４−
ＭＵの生成量を測定し４−ＭＵの生成の有無を調べ、そ
の結果を第４表に示した。
、０．０１ ｍｌづつ各５本取りＩＰＴＧを１０＝Ｍと
デソキシコール酸ナトリウムを０．１％含有するハート
インフエージョン培地１０ｍ１に移植し３７℃で６時間
振盪培養し、実施例１に示した方法と同様の方法で４−
ＭＵの生成量を測定し４−ＭＵの生成の有無を調べ、そ
の結果を第４表に示した。
また同じ河川水の大腸菌群数を前述した環境庁告示第５
９号に定められている段階希釈法（最確法）に基づいて
測定した結果を併記した。
９号に定められている段階希釈法（最確法）に基づいて
測定した結果を併記した。
※検水１０ｍ１を移植する時は２倍濃縮培地を使用した
。
。
第４表の結果を最確数表で検水１００ｍ１中の大腸菌群
数を求めると画法とも７９コ／１００ｍ１と完全に一致
した。
数を求めると画法とも７９コ／１００ｍ１と完全に一致
した。
このように、本発明によれば大腸菌群の検出は７時間で
測定出来、かつ従来から用いられている最確法の４８時
間で測定した結果と完全に一致するこさが確認された。
測定出来、かつ従来から用いられている最確法の４８時
間で測定した結果と完全に一致するこさが確認された。
実施例 ４
市販のポテトコロッケ１００ｇを一夜放置した後、１０
０ｍ１のリン酸緩衡液（ｐＨ７，０，０，１Ｍ ）に加
え、ホモジナイズし、この１ ｍｌ、 ０．１ ｍｌ
。
０ｍ１のリン酸緩衡液（ｐＨ７，０，０，１Ｍ ）に加
え、ホモジナイズし、この１ ｍｌ、 ０．１ ｍｌ
。
０．０１ｍＡ、０．００１ｍ１を実施例３に示したと同
じ方法で処理し、４−ＭＵの生成量を測定し４−Ｍ’Ｕ
の生成の有無を調べ、その結果を第３表に示した。
じ方法で処理し、４−ＭＵの生成量を測定し４−Ｍ’Ｕ
の生成の有無を調べ、その結果を第３表に示した。
また、従来法で測定した結果も併記した。
′ この第５表の結果を最確数表で検体１００ｍ１中の
大腸菌群を求めると画法とも４９コ／ｇと完全に一致す
ることが確認された。
大腸菌群を求めると画法とも４９コ／ｇと完全に一致す
ることが確認された。
実施例 ５
養豚場より豚糞を採取し、その１０ｇを水９０ｍ１に懸
濁し、無菌水に１０倍ずつ段階希釈し、それぞれ段階希
釈液について２ｍｌずつ２本を分収した。
濁し、無菌水に１０倍ずつ段階希釈し、それぞれ段階希
釈液について２ｍｌずつ２本を分収した。
これらの１方には２０μｌの水を、他方には同量のトル
エンを添加し、それぞれに４−ＭＵＧを３×１０″Ｍを
含むリン酸緩衡液（０，０１Ｍ。
エンを添加し、それぞれに４−ＭＵＧを３×１０″Ｍを
含むリン酸緩衡液（０，０１Ｍ。
ｐＨ７，０）を２ｍｌ加え、３７℃で１時間振盪した。
この液に０．５ ｍｌのｐＨ１１，０、ＩＭのグリシン
緩衝液を加え３３０ ｎｍの波長で励起させ、４５０ｎ
ｍの螢光を螢光光度計で測定しβ−ガラクトシダーゼに
より生成した４−ＭＵの有無を判定した。
緩衝液を加え３３０ ｎｍの波長で励起させ、４５０ｎ
ｍの螢光を螢光光度計で測定しβ−ガラクトシダーゼに
より生成した４−ＭＵの有無を判定した。
その結果を第６表に示した。
尚、原検体の豚糞の大腸菌群数は常法のデソキシコール
酸培地による平板希釈法により４８時間後に測定した結
果８．０Ｘ１０６コ／ｇであった。
酸培地による平板希釈法により４８時間後に測定した結
果８．０Ｘ１０６コ／ｇであった。
以上の結果から検体の大腸菌群数が１０７コ／ｇ程度存
在する場合は検体の増菌のための培養及びβ−ガラクト
シダーゼの溶出の操作を行なわなくとも直ちに大腸菌群
の検出が可能であった。
在する場合は検体の増菌のための培養及びβ−ガラクト
シダーゼの溶出の操作を行なわなくとも直ちに大腸菌群
の検出が可能であった。
また、検体の大腸菌群数が１０５コ／ｇ程度存在する場
合は検体の培養を行なわず、β−ガラクトシダーゼの溶
出の操作のみを加えれは大腸菌群の検出が可能であった
。
合は検体の培養を行なわず、β−ガラクトシダーゼの溶
出の操作のみを加えれは大腸菌群の検出が可能であった
。
第１図は大腸菌の菌数と４−Ｍ’Ｕ生成量の関係を示す
図である。
図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一定量の検体又はこれを栄養培地に加えて２時間以
上培養したものを４−ＭＵＧ（４−メチル−ウンベリフ
ェリル−β−Ｄ−ガラクトシド）と接触せしめ、４−Ｍ
Ｕ（４−メチル−ウンベリフェロン）の生成の有無又は
生成量を測定することからなるラクトース分解性微生物
の迅速検出方法。 シ２ 検体中又は培養液中の微生物菌体を４−ＭＵＧと
反応せしめる際に、あらかじめ又は同時に該微生物菌体
を破壊するか又は溶菌してβ／ガラクトシダーゼを菌体
外に溶出することを特徴とする特許請求範囲第１項記載
のラクトース分解性微生物。 の迅速検出方法。 ３ 栄養培地がβ−ガラクトシダーゼ誘導物質及び／又
はデソキシコール酸もしくは肝汁酸を含有する栄養培地
である特許請求範囲第１項又は第２項記載の大腸菌群の
迅速検出方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54140582A JPS5817598B2 (ja) | 1979-10-31 | 1979-10-31 | 微生物の迅速検出方法 |
| US06/521,460 US4591554A (en) | 1979-10-31 | 1983-09-16 | Rapid method for detecting microorganisms |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54140582A JPS5817598B2 (ja) | 1979-10-31 | 1979-10-31 | 微生物の迅速検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5664797A JPS5664797A (en) | 1981-06-02 |
| JPS5817598B2 true JPS5817598B2 (ja) | 1983-04-08 |
Family
ID=15272035
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP54140582A Expired JPS5817598B2 (ja) | 1979-10-31 | 1979-10-31 | 微生物の迅速検出方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4591554A (ja) |
| JP (1) | JPS5817598B2 (ja) |
Families Citing this family (64)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0611237B2 (ja) * | 1982-04-14 | 1994-02-16 | ラジオメーター コーポレイト ディベロップメント リミテッド | 微生物学的試験方法 |
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| US4925789A (en) * | 1986-06-30 | 1990-05-15 | Edberg Stephen C | Method and medium for use in detecting target microbes in situ in a specimen sample of a possibly contaminated material |
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